CN111956798B - 用于猪伪狂犬灭活疫苗的复合免疫增强剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于猪伪狂犬灭活疫苗的复合免疫增强剂及其应用，涉及到疫苗制造领域。该复合免疫增强剂，含有羧甲基茯苓多糖、透明质酸和α‑GC。本发明还提供所述复合免疫增强剂在猪伪狂犬灭活疫苗中的应用。本发明复合免疫增强剂，能够提高伪狂犬灭活疫苗免疫后的抗体水平，显著提高对近年流行的伪狂犬变异毒株的保护力。

Description

用于猪伪狂犬灭活疫苗的复合免疫增强剂及其应用
技术领域
本发明涉及到疫苗制造领域，具体涉及用于猪伪狂犬灭活疫苗的复合免疫增强剂及其应用。
背景技术
伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)属于疱疹I型双股DNA病毒，其感染症状主要体现在神经、生殖系统两个方面。仔猪最容易遭受感染感染且表现最为敏感，容易发生中枢神经症状，伪狂犬病的死亡率可高达到100％。起初，仔猪食欲下降，精神沉郁，浑身乏力，24h内后表现出中枢神经症状，如共济失调、颤抖、流涎等，仔猪会出现后肢瘫痪，转圈、划水动作，仔猪一般在发病后36h内发生死亡。怀孕母猪感染PRV导致死胎或者流产，怀孕四个月到九个月的母猪感染PRV会发生流产，产生死胎和弱仔；怀孕三个月的母猪感染以后会在子宫内把胎儿吸收。伪狂犬病毒在宿主外周神经系统中建立潜在感染，当潜在病毒被重新激活或者受到压力刺激就会产生感染性病毒。在刺激因素的作用下潜伏感染的动物会激活并且释放病毒，刺激因素有饲养条件差，分群转栏，车辆运输，共感染其他病原等。
疫苗接种是该病常规的预防方法。伪狂犬灭活疫苗是将伪狂犬病毒在细胞上进行增殖，将病毒灭活后制成灭活疫苗。由于将病毒灭活就不存在潜伏感染和毒力返强的可能，因此安全性很高。但是，由于伪狂犬灭活疫苗的免疫原性差，灭活疫苗不能在体内复制，无法向宿主免疫系统递呈内源性蛋白抗原，也不可以诱导细胞毒性T细胞反应，因此免疫后抗体阳性率低、抗体水平低。
现有技术中，缺乏能够高效提升伪狂犬灭活疫苗免疫后抗体水平的免疫增强剂。
发明内容
本发明的目的是提供用于猪伪狂犬灭活疫苗的复合免疫增强剂，能够提高伪狂犬灭活疫苗免疫后的抗体水平，显著提高对近年流行的伪狂犬变异毒株的保护力。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
用于猪伪狂犬灭活疫苗的复合免疫增强剂，含有羧甲基茯苓多糖、透明质酸和α-GC。
在本发明中，该复合免疫增强剂中羧甲基茯苓多糖、透明质酸和α-GC的浓度比为1:3-10:1-40。
本发明还提供所述复合免疫增强剂在猪伪狂犬灭活疫苗中的应用。
本发明还提供含有所述复合免疫增强剂的猪伪狂犬灭活疫苗，所述猪伪狂犬灭活疫苗中含有1～20mg/mL羧甲基茯苓多糖、1～6μg/mL透明质酸和0.1～1000μg/mL的α-GC。
本发明还提供所述猪伪狂犬灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)将羧甲基壳聚糖、透明质酸和α-GC溶解于猪伪狂犬灭活病毒液中，得到水相溶液；
(2)将所述水相溶液与油相溶液混合、乳化，得到灭活疫苗。
在本发明中，步骤(2)中所述油相为ISA 206佐剂。
在本发明中，所述水相与油相的体积比为1:0.5-1.5。
在本发明中，所述水相溶液中羧甲基茯苓多糖、透明质酸和α-GC的浓度分别为2～40mg/mL、2～12μg/mL和0.2～2000μg/mL。
本发明中复合免疫增强剂也可以用于猪圆环病毒、猪细小病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪口蹄疫病毒、猪蓝耳病毒等灭活病毒疫苗，具有一定的提高免疫效果的作用。
本发明相对于现有技术，具有以下优点：
1、本发明伪狂犬复合免疫增强剂可以显著缩短疫苗免疫后的抗体产生窗口期，显著提高伪狂犬疫苗免疫后的血清抗体水平和黏膜抗体水平。
2、本发明复合免疫增强剂配合伪狂犬灭活疫苗对仔猪只需要肌肉注射免疫一次，就可以保护到出栏，抗体持续期延长至6个月以上，显著降低养猪成本，减少猪群应激；攻毒实验结果表明复合免疫增强剂显著提高对伪狂犬新近流行变异株的保护力。
附图说明
图1显示了各疫苗的免疫效果，横坐标为免疫后时间(单位为天)，纵坐标为血清抗体几何平均效价。
图2显示了免疫后28天各疫苗免疫的试验猪的唾液中和抗体水平，横坐标为各组试验猪免疫的疫苗编号，纵坐标为抗体几何平均效价。
图3显示了各疫苗免疫后28天各组试验猪攻毒后体温变化，横坐标为攻毒后时间点，单位为天，纵坐标为平均体温(℃)，A-J为各疫苗编号。
图4显示了各疫苗免疫后28天各组试验猪攻毒后脑组织中病毒含量，横坐标为各组试验猪免疫的疫苗编号，纵坐标为脑组织中病毒含量。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的阐述，但不是对本发明的限定。
本发明实施例中未特别指明的组分均为市购产品，所有设备均为实验室常规设备。
实施例1制备猪伪狂犬灭活疫苗
1、实验材料
羧甲基茯苓多糖购自黄冈奈斯生物科技有限公司，多糖含量70％；α-GC(CAS:85305-88-0)购自上海惠城生物科技有限公司；透明质酸购自华熙生物科技股份有限公司，重均分子量500～800kDa；ISA 206佐剂购自SEPPIC公司；DMEM细胞培养液购自Gibco公司。
2、疫苗制备
灭活疫苗A配制方法如下：
(1)制备疫苗水相：将灭活的猪伪狂犬病毒液(毒株：Bartha-k61，灭活前毒价106TCID50/mL)作为水相。
(2)制备疫苗油相：将ISA 206佐剂高压灭菌后冷却，作为油相。
(3)将疫苗水相与油相按照体积比1:1混合、乳化，得油乳剂型灭活疫苗A。
灭活疫苗B配制方法如下：
(1)制备疫苗水相：在灭活的猪伪狂犬病毒液(毒株：Bartha-k61，灭活前毒价106TCID50/mL)中添加羧甲基茯苓多糖至终浓度为20mg/mL，充分混合均匀，无菌处理，得到水相。此处终浓度是指羧甲基茯苓多糖在水相中的终浓度。
(2)制备疫苗油相：将ISA 206佐剂高压灭菌后冷却，作为油相。
(3)将疫苗水相与油相按照体积比1:1混合、乳化，得油乳剂型灭活疫苗B。
灭活疫苗C配制方法如下：
(1)制备疫苗水相：在灭活的猪伪狂犬病毒液(毒株：Bartha-k61，灭活前毒价106TCID50/mL)中添加透明质酸至终浓度为6μg/mL，充分混合均匀，无菌处理，制成水相。此处终浓度是指透明质酸在水相中的终浓度。
(2)制备疫苗油相：将ISA 206佐剂高压灭菌后冷却，作为油相。
(3)将疫苗水相与油相按照体积比1:1混合、乳化，得油乳剂型灭活疫苗C。
灭活疫苗D配制方法如下：
(1)制备疫苗水相：在灭活的猪伪狂犬病毒液(毒株：Bartha-k61，灭活前毒价106TCID50/mL)中添加α-GC至终浓度为1mg/mL，充分混合均匀，无菌处理，制成水相。此处终浓度是指α-GC在水相中的终浓度。
(2)制备疫苗油相：将ISA 206佐剂高压灭菌后冷却，作为油相。
(3)将疫苗水相与油相按照体积比1:1混合、乳化，得油乳剂型灭活疫苗D。
灭活疫苗E配制方法如下：
(1)制备疫苗水相：在灭活的猪伪狂犬病毒液(毒株：Bartha-k61，灭活前毒价106TCID50/mL)中添加羧甲基茯苓多糖、透明质酸和α-GC至羧甲基茯苓多糖终浓度为2mg/mL、透明质酸终浓度为2μg/mL、α-GC终浓度为0.2μg/mL，充分混合均匀，无菌处理，得到水相。此处终浓度是各物质在水相中的终浓度。
(2)制备疫苗油相：将ISA 206佐剂高压灭菌后冷却，作为油相。
(3)将疫苗水相与油相按照体积比1:1混合、乳化，得油乳剂型灭活疫苗E。
灭活疫苗F配制方法如下：
(1)制备疫苗水相：在灭活的猪伪狂犬病毒液(毒株：Bartha-k61，灭活前毒价106TCID50/mL)中添加羧甲基茯苓多糖、透明质酸和α-GC至羧甲基茯苓多糖终浓度为20mg/mL、透明质酸终浓度为6μg/mL、α-GC终浓度为1mg/mL，充分混合均匀，无菌处理，得到水相。此处终浓度是指各物质在水相中的终浓度。
(2)制备疫苗油相：将ISA 206佐剂高压灭菌后冷却，作为油相。
(3)将疫苗水相与油相按照体积比1:1混合、乳化，得油乳剂型灭活疫苗F。
灭活疫苗G配制方法如下：
(1)制备疫苗水相：在灭活的猪伪狂犬病毒液(毒株：Bartha-k61，灭活前毒价106TCID50/mL)中添加羧甲基茯苓多糖、透明质酸和α-GC至羧甲基茯苓多糖终浓度为40mg/mL、透明质酸终浓度为12μg/mL、α-GC终浓度为2mg/mL，充分混合均匀，无菌处理，制成水相。此处终浓度是指各物质在水相中的终浓度。
(2)制备疫苗油相：将ISA 206佐剂高压灭菌后冷却，作为油相。
(3)将疫苗水相与油相按照体积比1:1混合、乳化，得油乳剂型灭活疫苗G。
灭活疫苗H配制方法如下：
(1)制备疫苗水相：在灭活的猪伪狂犬病毒液(毒株：Bartha-k61，灭活前毒价106TCID50/mL)中添加羧甲基茯苓多糖、透明质酸和α-GC至羧甲基茯苓多糖终浓度为2mg/mL、透明质酸终浓度为6μg/mL、α-GC终浓度为2mg/mL，充分混合均匀，无菌处理，得到水相。此处终浓度是指各物质在水相中的终浓度。
(2)制备疫苗油相：将ISA 206佐剂高压灭菌后冷却，作为油相。
(3)将疫苗水相与油相按照体积比1:1混合、乳化，得油乳剂型灭活疫苗H。
灭活疫苗I配制方法如下：
(1)制备疫苗水相：在灭活的猪伪狂犬病毒液(毒株：Bartha-k61，灭活前毒价106TCID50/mL)中添加羧甲基茯苓多糖、透明质酸和α-GC至羧甲基茯苓多糖终浓度为40mg/mL、透明质酸终浓度为6μg/mL、α-GC终浓度为0.2μg/mL，充分混合均匀，无菌处理，得到水相。此处终浓度是指各物质在水相中的终浓度。
(2)制备疫苗油相：将ISA 206佐剂高压灭菌后冷却，作为油相。
(3)将疫苗水相与油相按照体积比1:1混合、乳化，得油乳剂型灭活疫苗I。
灭活疫苗J配制方法如下：
(1)制备疫苗水相：将DMEM细胞培养液作为水相。
(2)制备疫苗油相：将ISA 206佐剂高压灭菌后冷却，作为油相。
(3)将疫苗水相与油相按照体积比1:1混合、乳化，得油乳剂型灭活疫苗J。
实施例2猪伪狂犬灭活疫苗的免疫效果
1、实验材料
50头40日龄PRV抗原抗体双阴性健康仔猪，购自镇江市丹徒区云立牧业有限公司。
BioCheck猪伪狂犬gB抗体检测试剂盒购自北京天之泰生物科技有限公司。
2、实验动物分组、免疫及检测
将50头40日龄健康实验猪(PRV抗原、抗体双阴性)随机分为10组，每组5头。将实施例1中制备的油乳剂型灭活疫苗A、B、C、D、E、F、G、H、I各免疫一组试验猪，免疫途径为颈部肌肉注射，免疫剂量为2mL/头，对照组试验猪注射同等剂量的疫苗J。免疫后观察猪群的采食情况，触摸注射部位有无肿块。
免疫后于第7天、14天、21天、28天、60天、90天、120天、150天、180天对各组试验猪采血，无菌分离血清，采用BioCheck猪伪狂犬gB抗体检测试剂盒检测血清中PRV抗体水平。
免疫后于第28天对各组试验猪收集唾液，无菌处理，用DMEM细胞培养液将其2倍比稀释，分别与200TCID50的PRV Bartha-K61株病毒液混合，37℃孵育1h；然后，分别接种铺有单层BHK-21细胞的96孔板，100ul/孔，每个样品设4个重复，观察细胞病变并记录病变孔数，按Reed-Mench法计算中和抗体效价。
检测结果如下：
免疫后各个时间点经试验猪前腔静脉采血，无菌分离血清，用BioCheck猪伪狂犬gB抗体试剂盒检测抗体，当检测结果S/P值≥0.5时，根据试剂盒提供的公式换算为抗体效价≥1071，判断为阳性。计算每组试验猪的抗体几何平均效价，比较不同疫苗之间的免疫效果。结果如图1，免疫后7d，同时含有羧甲基茯苓多糖、透明质酸和α-GC三种免疫增强剂的疫苗E-I所免疫试验猪的平均效价均为阳性，仅含有单一免疫增强剂的疫苗B-D和疫苗A免疫后试验猪的平均效价均呈阴性，因此含有三种免疫增强剂的疫苗E-I显著缩短疫苗免疫窗口期。免疫后14d，含有三种免疫增强剂的疫苗E-I所免疫试验猪的抗体水平为疫苗A免疫试验猪抗体水平的4倍以上，且维持高水平抗体至免疫后180天。含α-GC的疫苗D所免疫试验猪在免疫后14天达到合格线，到28天达到顶点，但抗体持续期短，免疫后90天平均效价低于合格线1071，为阴性，此后持续下降，因此免疫持续期不足90天。仅含羧甲基茯苓多糖的疫苗B所免疫试验猪在免疫后28天达到抗体合格线，此后显著下降低于合格线。仅含透明质酸的疫苗C与疫苗A所免疫试验猪的抗体几何平均效价在免疫后60天内无显著差异，但免疫60天后仅含透明质酸的疫苗C所免疫试验猪抗体维持在一定的抗体水平不再降低。试验结果表明：同时含有羧甲基茯苓多糖、透明质酸和α-GC的复方免疫增强剂能极显著提高猪PRV灭活疫苗免疫后的抗体效价，显著大于单一免疫增强剂对PRV灭活疫苗免疫后效价的提升效果，也就是说羧甲基茯苓多糖、透明质酸、α-GC之间产生了显著的协同增效作用。
免疫后28天采集各组试验猪唾液，无菌处理后进行中和抗体检测，计算每组试验猪的抗体几何平均效价，检测结果见图2。同时含羧甲基茯苓多糖、透明质酸和α-GC的疫苗E-I所免疫试验猪的唾液中和抗体水平显著高于仅含有单一免疫增强剂的疫苗B-D和疫苗A所免疫试验猪，提高抗体水平约3倍。含有羧甲基茯苓多糖或α-GC的单一免疫增强剂的疫苗B、D所免疫试验猪的唾液中和抗体水平虽然有所提升，但差异性分析不显著。仅含透明质酸的疫苗C与疫苗A所免疫试验猪的唾液中和抗体水平相似。试验结果表明：同时添加羧甲基茯苓多糖、透明质酸和α-GC能极显著地提高猪PRV灭活疫苗免疫后试验猪的唾液中和抗体效价，显著高于单一免疫增强剂对PRV灭活疫苗的提升效果，也就是说羧甲基茯苓多糖、透明质酸、α-GC之间产生了显著的协同增效作用。
上述实验结果表明：不同剂量的羧甲基茯苓多糖、透明质酸、α-GC复配能够极显著提高猪伪狂犬疫苗的免疫效果，具有明显的协同增效作用，与常规疫苗(疫苗A)、含有单一免疫增强剂的疫苗(疫苗B-D)相比，能够显著缩短疫苗免疫窗口期，延长抗体持续期；能够显著提高疫苗免疫后试验猪血清抗体水平和唾液黏膜中和抗体水平。
实施例3猪的免疫保护实验
1、实验材料
40日龄PRV抗原抗体双阴性健康仔猪80头，购自镇江市丹徒区云立牧业有限公司。
2、实验动物分组、免疫及攻毒
将80头40日龄健康实验猪(PRV抗原、抗体双阴性)随机分为8组，每组10头。将实施例1中制备的灭活疫苗A、B、C、D、E、F、G各免疫一组试验猪，免疫途径为颈部肌肉注射，免疫剂量2mL/头，对照组试验猪注射同等剂量的疫苗J。
在免疫后28天用新近流行的伪狂犬变异毒株PRVNJ株进行滴鼻攻毒，攻毒剂量为1mL(107TCID50/mL)。攻毒后每天定时观察仔猪发病情况，测量体温，收集病死猪脑组织存放-70℃待测；攻毒后第10天扑杀所有存活仔猪，取脑组织待测。将所有脑组织研磨处理后，提取DNA，Real-time PCR检测脑组织中的伪狂犬病毒含量(公开于中国动物传染病学报中的伪狂犬病毒实时荧光定量PCR方法的建立)。
伪狂犬疫苗接种后第28天用伪狂犬变异毒株攻毒后发病率、死亡率、保护率情况见表1，攻毒后各组试验猪平均体温见图3。攻毒后1d，疫苗J(阴性对照组)免疫的所有试验猪体温均在40℃以上，部分试验猪出现奇痒，倒地划水等神经症状，攻毒后5d所有试验猪发病死亡。含有单一免疫增强剂的疫苗B-D对试验猪的保护率分别为40、30、50％，发病猪均具有神经症状，未发病猪测得体温一过性升高；疫苗A对免疫试验猪的保护率为30％；含有三种免疫增强剂的疫苗E、F、G对试验猪的保护率达到100％，试验猪攻毒后无发热及神经症状。
表1伪狂犬变异毒株攻毒后各组保护率情况
Figure BDA0002666356280000081
Figure BDA0002666356280000091
攻毒后各组试验猪脑组织病毒含量检测见图4。各组试验猪死亡后及试验结束后存活试验猪全部扑杀，取脑组织检测PRV病毒含量。疫苗J(阴性对照组)所免疫试验猪的脑组织中病毒含量最高，其次为仅含有单一免疫增强剂的疫苗B-D和疫苗A所免疫试验猪。含有三种免疫增强剂的疫苗E所免疫试验猪中仅有一头试验猪测得极低含量的病毒核酸，但该试验猪攻毒后未发现体温升高和神经症状。含有三种免疫增强剂的疫苗F、G所免疫试验猪的脑组织中未检测到病毒。
上述实验结果表明：不同剂量的羧甲基茯苓多糖、透明质酸、α-GC复配能够显著提高猪伪狂犬灭活疫苗对近年流行的伪狂犬变异毒株的保护力。

Claims (6)

1.用于猪伪狂犬灭活疫苗的复合免疫增强剂，其特征在于含有羧甲基茯苓多糖、透明质酸和α-GC，所述羧甲基茯苓多糖、透明质酸和α-GC在猪伪狂犬灭活疫苗中的浓度依次为1～20 mg/mL、1～6 µg/mL和0.1～1000µg/mL。
2.权利要求1所述复合免疫增强剂在制备猪伪狂犬灭活疫苗中的应用。
3.权利要求1所述猪伪狂犬灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将羧甲基壳聚糖、透明质酸和α-GC溶解于猪伪狂犬灭活病毒液中，得到水相溶液；
（2）将所述水相溶液与油相溶液混合、乳化，得到灭活疫苗。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述油相为ISA 206佐剂。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于所述水相与油相的体积比为1:0.5-1.5。
6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于所述水相溶液中羧甲基茯苓多糖、透明质酸和α-GC的浓度分别为2～40 mg/mL、2～12µg/mL和0.2～2000µg/mL。
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