CN106606776A

CN106606776A - 一种用于预防和治疗猪腹泻的疫苗组合、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN106606776A
Application number: CN201510694625.7A
Authority: CN
Inventors: 田克恭; 高晓静; 孙进忠; 张许科
Original assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2015-10-23
Filing date: 2015-10-23
Publication date: 2017-05-03

Abstract

本发明提供了一种疫苗的组合，该疫苗组合包含猪流行性腹泻活疫苗或其组合物以及猪流行性腹泻灭活疫苗或其组合物。本发明还提供该疫苗组合在制备预防和/或治疗猪腹泻的药物中的应用。本发明采用活苗/灭活苗组合的疫苗组合，即便使用颈部肌肉接种免疫，也能够快速有效地刺激机体产生免疫力，抵抗PEDV的侵染，同时能够避免长期使用活苗造成的散毒、仔猪带毒等各种风险。本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒包括猪流行性腹泻活疫苗或其组合物和猪流行性腹泻灭活疫苗或其组合物。

Description

一种用于预防和治疗猪腹泻的疫苗组合、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种预防和治疗猪流行性腹泻的疫苗组合、试剂盒及其应用。

背景技术

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种以腹泻、呕吐和脱水为主要特征的猪肠道传染病。各种年龄的猪都易感,在感染后哺乳仔猪、架子猪或育肥猪的发病率可达100％,尤其哺乳仔猪受害最严重。自2012年开始该病在全球范围内呈大爆发趋势，给全球养殖业造成了巨大的损失。

采用疫苗进行免疫预防仍是国内外控制猪流行性腹泻的根本手段。目前，国内外猪流行性腹泻疫苗多为灭活苗或活苗。而灭活苗多为PEDV强毒株通过灭活制备疫苗，该疫苗能够刺激机体产生一定的免疫力，安全性好，且便于运输保存，但是只能诱导机体产生体液免疫，免疫反应水平较低，免疫持续期较短，免疫效果不理想。活苗是由PEDV强毒株致弱获得的减毒弱毒株制备而成。活苗能诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，并且活病毒可以持续刺激机体，从而获得较长的免疫持续期，然而，活疫苗的反复使用，增加活疫苗经过猪体后存在病毒毒力复壮的可能，而且有的活苗仍具有一定的毒力，在临床应用中存在散毒的风险，特别针对母猪带仔猪免疫时，极易感染仔猪。

现有技术中，针对猪腹泻临床症状往往采取猪流行性腹泻活疫苗或灭活疫苗提前免疫，以预防猪腹泻的发生。然而，无论是猪流行性腹泻活疫苗还是灭活疫苗，均需多次注射，灭活疫苗免疫反应较低，免疫持续期较短，效果不理想，而活疫苗多次注射，加剧了经过猪体后病毒毒力复壮的可能。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明通过活苗、灭活苗的交替使用，首免时使用活苗，以快速的刺激机体产生免疫反应；二免时采用灭活苗，刺激机体的免疫记忆细胞，保持较高的抗体水平，同时能够避免活苗散毒，并能在免疫母猪的同时保护仔猪不受活苗散毒的影响。

本发明一个方面涉及一种疫苗的组合，所述疫苗组合包含猪流行性腹泻活疫苗或其组合物以及猪流行性腹泻灭活疫苗或其组合物。

本发明的另一方面涉及一种试剂盒，所述试剂盒包括猪流行性腹泻活疫苗或其组合物以及猪流行性腹泻灭活疫苗或其组合物，其中，所述猪流行性腹泻活疫苗或其组合物与猪流行性腹泻灭活疫苗或其组合物分开保存。

本发明的另一方面涉及本发明的所述疫苗组合在制备预防和/或治疗猪腹泻的药物中的应用，其中，所述应用包括使用所述猪流行性腹泻活疫苗或其组合物首免猪，以及使用所述猪流行性腹泻灭活疫苗或其组合物二免所述猪。

本发明的另一发明涉及本发明的试剂盒在制备预防和/或治疗猪腹泻的药物中的应用，其中，所述应用包括使用所述猪流行性腹泻活疫苗或其组合物首免猪，以及使用所述猪流行性腹泻灭活疫苗或其组合物二免所述猪。

本发明所述疫苗组合用于制备预防猪腹泻的药物中的应用时，于母猪产前5-6周，用所述猪流行性腹泻活疫苗进行首免，两周后用所述猪流行性腹泻灭活疫苗对该母猪进行加强免疫。

本发明所述疫苗组合用于治疗猪腹泻的药物中的应用时，用所述猪流行性腹泻活疫苗进行首免猪，两周后用所述猪流行性腹泻灭活疫苗对该猪进行加强免疫。

同样地，本发明所述试剂盒用于制备预防猪腹泻的药物中的应用时，于母猪产前5-6周，用所述猪流行性腹泻活疫苗进行首免，两周后用所述猪流行性腹泻灭活疫苗对该母猪进行加强免疫。

本发明所述试剂盒用于治疗猪腹泻的药物中的应用时，用所述猪流行性腹泻活疫苗进行首免猪，两周后用所述猪流行性腹泻灭活疫苗对该猪进行加强免疫。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。

本发明的一个方面涉及一种疫苗的组合，所述疫苗组合包含猪流行性腹泻活疫苗或其组合物，以及猪流行性腹泻灭活疫苗或其组合物。“疫苗”指含有抗原的药物组合物，该药物组合物可诱导、刺激或增强动物机体针对相应病原的免疫反应。

对疫苗的“免疫反应或免疫学反应”为宿主对所施用的疫苗组合物产生的细胞免疫反应和/或抗体介导的免疫反应。通常，“免疫反应”包括(但不限于)一种或多种以下效应：产生或活化针对在感兴趣的疫苗组合物中包括的抗原的特异性抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制T细胞和/或细胞毒力T细胞。

“活疫苗”指以毒力已经减弱但仍可在宿主体内或细胞上复制的病毒制备的疫苗。“减毒”用于指以使病原丧失致病性、但保持免疫原性的方式对基因进行突变来人工降低病原体毒性。通常，通过UV辐射、化学处理或体外连续高阶继代培养实现减毒。人工的基因改变，例如将已知序列中的特定核苷酸缺失以使毒力减弱。

“灭活疫苗”，也称作失活疫苗，指的是用作抗原以产生免疫力的灭活病毒的混悬液。灭活疫苗的例子包括全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易地产生灭活疫苗。例如，通过用甲醛溶液处理病毒可获得全病毒灭活疫苗。裂解型疫苗可在用醚处理后由病毒包膜制备得到。例如用本发明的强毒株HN1301可以通过灭活的方法制备成灭活疫苗。

本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的疫苗的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。

作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合中，所述猪流行性腹泻活疫苗包括猪流行性腹泻病毒ZJ08株、猪流行性腹泻病毒LW/L株、猪流行性腹泻病毒SD10株、猪流行性腹泻病毒CV777弱毒株的活疫苗、猪流行性腹泻病毒PEDV/CHGD01的致弱株、猪流行性腹泻病毒GDSJ/2012的致弱株、猪流行性腹泻病毒HN1303株的致弱株、猪流行性腹泻病毒HN1302株。

猪流行性腹泻病毒弱毒株ZJ08株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.7806，公开于中国专利申请CN104784686A；猪流行性腹泻病毒LW/L株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.6002，公开于中国专利申请CN103041385A；猪流行性腹泻病毒SD10株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.8503，公开于中国专利申请CN103820399A；猪流行性腹泻病毒CV777弱毒株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO.V200608，公开于中国专利申请CN101117627A；猪流行性腹泻病毒PEDV/CHGD01(公开于中国专利申请CN103992989A)的致弱株、猪流行性腹泻病毒GDSJ/2012保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.V201309，公开于中国专利申请CN103756974A；猪流行性腹泻病毒HN1303株(porcine epidemic diarrhea virus,strain HN1303)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.V201514，保藏日期为2015年3月4日，保藏地址为中国武汉·武汉大学；猪流行性腹泻病毒HN1302株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO.V201342，保藏日期为2013年9月16日，公开于中国专利申请CN104513827A。

作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合中，所述猪流行性腹泻灭活疫苗包括猪流行性腹泻病毒LW株的灭活苗、猪流行性腹泻病毒CV777强毒株的灭活苗、猪流行性腹泻病毒PEDV/CHGD01株的灭活苗、猪流行性腹泻病毒GDSJ/2012株的灭活苗、猪流行性腹泻病毒HN1303株的灭活苗、猪流行性腹泻病毒HN1301株的灭活苗。猪流行性腹泻病毒LW株公开于中国专利申请CN103041385A；猪流行性腹泻病毒HN1301株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO.V201341，保藏日期为2013年9月16日，公开于中国专利申请CN104513827A。

作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合中，所述猪流行性腹泻灭活疫苗为猪流行性腹泻病毒CV777强毒株的灭活疫苗。

作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合中，所述猪流行性腹泻灭活疫苗为猪流行性腹泻病毒HN1303株的灭活疫苗。

作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合中，所述猪流行性腹泻灭活疫苗为猪流行性腹泻病毒HN1301株的灭活疫苗。

作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合中，所述猪流行性腹泻活疫苗为猪流行性腹泻病毒CV777弱毒株的活疫苗。

作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合中，所述猪流行性腹泻活疫苗为猪流行性腹泻病毒HN1302株的活疫苗。作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合中，所述猪流行性腹泻活疫苗为猪流行性腹泻病毒CV777弱毒株的活疫苗，所述猪流行性腹泻灭活疫苗为猪流行性腹泻病毒CV777强毒株的灭活苗。

作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合中，所述猪流行性腹泻活疫苗为猪流行性腹泻病毒HN1302株活疫苗，所述猪流行性腹泻灭活疫苗为猪流行性腹泻病毒HN1301株灭活苗或猪流行性腹泻病毒HN1303株灭活苗。作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合中，制备所述猪流行性腹泻灭活疫苗的强毒株为制备所述猪流行性腹泻活疫苗的弱毒株的亲本强毒株。作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合中，制备所述猪流行性腹泻灭活疫苗的CV777强毒株为制备所述猪流行性腹泻活疫苗的CV777弱毒株的亲本强毒株。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合中，制备所述猪流行性腹泻灭活疫苗的HN1301强毒株为制备所述猪流行性腹泻活疫苗的HN1302弱毒株的亲本强毒株。

作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合中，所述猪流行性腹泻活疫苗抗原含量≥10^5.0TCID₅₀/ml。

作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合中，所述猪流行性腹泻活疫苗抗原含量为10^5.0TCID₅₀/ml～10^6.0TCID₅₀/ml。

作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合中，所述猪流行性腹泻灭活疫苗抗原含量为灭活前≥10^7.0TCID₅₀/ml。

作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合中，所述猪流行性腹泻灭活疫苗抗原含量为灭活前10^7.0TCID₅₀/ml～10^8.0TCID₅₀/ml。

作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合中，所述猪流行性腹泻活疫苗抗原含量为≥10^5.0TCID₅₀/ml；所述猪流行性腹泻灭活疫苗抗原含量为灭活前≥10^7.0TCID₅₀/ml。

作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合中，所述猪流行性腹泻活疫苗抗原含量为10^5.0TCID₅₀/ml～10^6.0TCID₅₀/ml；所述猪流行性腹泻灭活疫苗抗原含量为灭活前10^7.0TCID₅₀/ml～10^8.0TCID₅₀/ml。

作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合中，所述猪流行性腹泻活疫苗还包括冻干保护剂，所述猪流行性腹泻灭活疫苗还包括佐剂。

本发明的疫苗可使用本领域常规技术来调配，优选为兽医药学上可接受的载体一起调配。例如，油可有助于稳定调配物，且另外充当疫苗佐剂。因此，本发明中，所述可药用疫苗佐剂包括油佐剂，其选自白油、角鲨烷或角鲨烯、德雷克油(Drakeoil)，以及其他动物油、植物油或矿物油。上述油佐剂既可以是天然来源，也可以是经过人工合成获得的。本发明中，所述疫苗优选为水包油乳液、油包水乳液或双重乳液，所述双重乳液通常表现为水包油包水乳液。

在本发明的一个实施方式中，所述疫苗还包括助悬剂、表面活性剂、抗原灭活剂或防腐剂。所述助悬剂可包括，例如，硬脂酸铝，以及所属技术领域可用的其他助悬剂。所述表面活性剂可包括，例如，脱水山犁醇单油酸酯(TWEEN系列)，司本(SPAN)，以及所属技术领域可用的其他表面活性剂。所述抗原灭活剂包括(但不限于)，例如甲醛、β－丙内酯等等。所述防腐剂包括，例如硫柳汞。上述物质的使用方法及用量均为本领域技术人员所熟知。

基于油佐剂会对动物体带来一定的副反应，还可以选择本领域的其它佐剂，包括水佐剂、聚合物佐剂，例如氢氧化铝、磷酸铝及其它金属盐，来制备混悬液，减少免疫刺激。

可用于本发明的可药用载体或者稀释剂的其他实例包括稳定剂，如SPGA、糖类(例如，山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)、蛋白质，如白蛋白或者酪蛋白、含有蛋白质的物质，如牛血清或者脱脂乳和缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)。

特别当将这种稳定剂加入疫苗时，疫苗非常适于冷冻干燥。因此，在该实施方案的更优选的形式中，活的减毒疫苗是冷冻干燥的形式。

作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述猪流行性腹泻活疫苗包括猪流行性腹泻病毒ZJ08株、猪流行性腹泻病毒LW/L株、猪流行性腹泻病毒SD10株、猪流行性腹泻病毒CV777弱毒株的活疫苗、猪流行性腹泻病毒PEDV/CHGD01的致弱株、猪流行性腹泻病毒GDSJ/2012的致弱株、猪流行性腹泻病毒HN1303株的致弱株、猪流行性腹泻病毒HN1302株。

作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述猪流行性腹泻灭活疫苗包括猪流行性腹泻病毒LW株的灭活苗、猪流行性腹泻病毒CV777强毒株的灭活苗、猪流行性腹泻病毒PEDV/CHGD01株的灭活苗、猪流行性腹泻病毒GDSJ/2012株的灭活苗、猪流行性腹泻病毒HN1303株的灭活苗、猪流行性腹泻病毒HN1301株的灭活苗。

作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述猪流行性腹泻灭活疫苗为猪流行性腹泻病毒CV777强毒株的灭活疫苗。

作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述猪流行性腹泻灭活疫苗为猪流行性腹泻病毒HN1303株的灭活疫苗。

作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述猪流行性腹泻灭活疫苗为猪流行性腹泻病毒HN1301株的灭活疫苗。

作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述猪流行性腹泻活疫苗为猪流行性腹泻病毒CV777弱毒株的活疫苗。

作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述猪流行性腹泻活疫苗为猪流行性腹泻病毒HN1302株的活疫苗。

作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述猪流行性腹泻活疫苗为猪流行性腹泻病毒CV777弱毒株的活疫苗，所述猪流行性腹泻灭活疫苗为猪流行性腹泻病毒CV777强毒株的灭活苗。

作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述猪流行性腹泻活疫苗为猪流行性腹泻病毒HN1302株活疫苗，所述猪流行性腹泻灭活疫苗为猪流行性腹泻病毒HN1301株灭活苗或猪流行性腹泻病毒HN1303株灭活苗。

作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，制备所述猪流行性腹泻灭活疫苗的强毒株为制备所述猪流行性腹泻活疫苗的弱毒株的亲本强毒株。

作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述猪流行性腹泻活疫苗抗原含量≥10^5.0TCID₅₀/ml。

作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述猪流行性腹泻活疫苗抗原含量为10^5.0TCID₅₀/ml～10^6.0TCID₅₀/ml。

作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述猪流行性腹泻灭活疫苗抗原含量为灭活前≥10^7.0TCID₅₀/ml。

作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述猪流行性腹泻灭活疫苗抗原含量为灭活前10^7.0TCID₅₀/ml～10^8.0TCID₅₀/ml。

作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述猪流行性腹泻活疫苗还包括冻干保护剂，所述猪流行性腹泻灭活疫苗还包括佐剂。

本发明的另一方面涉及本发明所述疫苗组合在制备预防和/或治疗猪腹泻的药物中的应用，其中，所述应用包括使用所述猪流行性腹泻活疫苗或其组合物首免猪，以及使用所述猪流行性腹泻灭活疫苗或其组合物二免所述猪。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述疫苗组合在用于制备预防猪腹泻的药物中的应用时，于母猪产前5-6周，用所述猪流行性腹泻活疫苗进行首免，两周后用所述猪流行性腹泻灭活疫苗对所述母猪进行加强免疫。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述疫苗组合在用于制备预防猪腹泻的药物中的应用时，于母猪产前5-6周，用所述猪流行性腹泻病毒HN1302株活疫苗进行首免，两周后用所述猪流行性腹泻病毒HN1301株灭活疫苗对所述母猪进行加强免疫。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述疫苗组合在用于制备治疗猪腹泻的药物中的应用时，用所述猪流行性腹泻活疫苗进行首免猪，两周后用所述猪流行性腹泻灭活疫苗对所述猪进行加强免疫。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述疫苗组合在用于制备治疗猪腹泻的药物中的应用时，用所述猪流行性腹泻病毒HN1302株活疫苗进行首免猪，两周后用所述猪流行性腹泻病毒HN1301株灭活疫苗对所述猪进行加强免疫。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的应用中，所述猪流行性腹泻活疫苗或其组合物与所述猪流行性腹泻灭活疫苗或其组合物通过猪颈部施用。

本发明所述疫苗组合在制备预防和/或治疗猪腹泻的药物中的应用中，所述活疫苗和灭活疫苗施用方式包括经真皮内、经气管内或经直肠内施用。优选可经肌肉或后海穴施用，最优选为经肌内施用。在动物体内，可证明经由静脉内或藉由直接注射至目标组织中来施用所述上述疫苗组合物是有利的。对于全身施用，静脉内、血管内、肌内、鼻内、动脉内、腹膜内、口服是优选的。更局部施用可经皮下、经真皮内、经皮内、经心脏内、经髓内、经肺内或直接在或靠近拟治疗的组织(结蹄组织、神经组织、肌肉组织)实现。根据治疗所期望的持续时间及有效性，所述活疫苗和灭活疫苗施用次数为一次或数次，亦可间歇施用，例如以每日计投与数天、数周或数月且以不同剂量。“预防”指通过给予根据本发明的所述活疫苗和灭活疫苗抑制猪流行性腹泻病毒感染或推迟疾病发作的所有行为。“治疗”指通过给予根据本发明的所述活疫苗和灭活疫苗使猪流行性腹泻病毒感染引起的症状减轻或转好的所有行为。

本发明的另一方面涉及本发明所述试剂盒在制备预防和/或治疗猪腹泻的药物中的应用，其中，所述应用包括使用所述猪流行性腹泻活疫苗或其组合物首免猪，以及使用所述猪流行性腹泻灭活疫苗或其组合物二免所述猪。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1猪流行性腹泻弱毒活疫苗(商品苗)组合免疫效力研究

采用市售的商业化猪流行性腹泻活苗分别免疫后备母猪和怀孕母猪，通过检测母猪分娩后乳汁中PEDV sIgA抗体水平，仔猪攻毒保护以及后备母猪血清中PEDV中和抗体水平，来评价该疫苗的免疫效力，即首免和加强免疫均为猪流行性腹泻弱毒活疫苗的组合的免疫效力。

1.免疫的疫苗猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(G5型)三联活疫苗(其中，各病毒抗原分别为弱毒华毒株+CV777弱毒株+NX株)(以下简称“胃腹轮三联活苗”)，批号2015002；哈尔滨维科生物技术开发公司。

2.检测试剂盒 PEDV sIgA抗体快速检测试剂盒(乳汁)，韩国安捷公司。

3.实验动物来自无腹泻历史的猪场的后备母猪和怀孕母猪，检测的PEDV抗原抗体均为阴性。

4.试验方法

4.1后备母猪的免疫试验

10头PEDV抗体抗原为阴性的后备母猪，随机分为2组，每组5头。免疫组母猪后海穴接种上述胃腹轮三联活苗，1ml/头；间隔2周后按相同的剂量和免疫方式进行免疫。对照组不接种。接种后连续观察14日，观察各组母猪精神、采食、饮水、粪便等方面的症状，并于二免后14d、21d、28d、35d分别采血，测定血清中PEDV中和抗体。接种后各组母猪精神、采食、饮食、粪便均未见异常。

母猪血清中和抗体检测结果显示，活苗免疫后抗体上升较慢，二免后21d时仅有1头达到1:32，在二免后28d时达到最高。虽然抗体上升较慢，但是能持续保持较高的抗体水平，第35d时仍有3/5达到1:32或以上。而对照组中和抗体则一直低于1:8(见表1)。

表1后备母猪免疫胃腹轮三联活苗后血清中PEDV中和抗体水平

4.2怀孕母猪的免疫试验

6头预产期相同、PEDV抗原抗体为阴性的健康待产母猪，随机分为2组，免疫组和对照组，每组各3头。免疫组母猪产前5周后海穴接种上述胃腹轮三联活苗，1ml/头；产前3周按相同剂量和免疫方式进行二免。对照组母猪不接种。免疫后，观察各组母猪精神、采食、饮水等临床症状。所有母猪在相同条件下生产，统计母猪产仔情况，并在分娩后第0d、7d、14d、21d分别采集母猪乳汁，比较乳汁中PEDV sIgA抗体水平。

免疫组母猪首免后均出现了一过性的食欲减退。免疫组与对照组产仔数量相当，但是活苗免疫组有1头死胎，且弱仔数较对照组多(见表2)。

表2怀孕母猪免疫胃腹轮三联活苗后产仔情况统计

用ELISA方法测定母猪分娩后第0d、7d、14d和21d的乳汁中PEDVsIgA抗体，结果显示，免疫组母猪均在分娩后7d乳汁中PEDV sIgA抗体水平最高，之后逐渐下降，21d时有1头母猪抗体已经转为阴性。对照组分娩后0d-21d，乳汁中PEDV sIgA抗体均为阴性。ELISA结果见表3。

表3怀孕母猪免疫胃腹轮三联活苗后乳汁中PEDV sIgA抗体检测结果

备注：背景值平均OD值：0.093；判断值＝0.35+0.093＝0.443。

判定标准：样品OD>0.443为阳性；样品OD<0.443为阴性。

4.3仔猪的攻毒试验

从实施例1的4.2中的免疫组和对照组中各母猪所产仔猪各随机选5头，母乳饲养。21日龄时所有仔猪均口服攻毒PEDV强毒(CV777强毒株组织毒，1000×MID)。攻毒后仔猪连续观察7日，观察仔猪发病情况，主要包括精神、采食、呕吐、腹泻，统计仔猪发病情况。

仔猪攻毒结果显示：免疫组仔猪最早在攻毒后第3天出现不同程度的腹泻，均呈现一过性，最长持续3天；期间仔猪表现出精神略沉郁、食欲下降；而对照组仔猪在攻毒后第2天全部表现出精神沉郁、食欲减退，并且在攻毒后第2天有4/5仔猪出现呕吐和水样腹泻，腹泻持续6天。攻毒保护结果见表4。

表4仔猪攻毒后发病情况统计

实施例2猪流行性腹泻灭活疫苗(商品苗)组合免疫效力研究

本研究采用后备母猪和怀孕母猪来评价猪流行性腹泻灭活疫苗组合的免疫效力，即首免和加强免疫均为猪流行性腹泻灭活疫苗的组合的免疫效力。

1.免疫的疫苗猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗(其中，各病毒抗原分别为华毒株+CV777强毒株灭活苗)，(以下简称“胃腹二联灭活苗”)批号201407，哈药集团生物疫苗有限公司。

3.实验动物来自无腹泻历史的猪场的后备母猪和怀孕母猪，PEDV抗原抗体均为阴性。

4.实验方法

4.1后备母猪的免疫试验

PEDV抗体抗原为阴性的后备母猪，10头，随机分为2组。免疫组5头，每头母猪后海穴接种上述胃腹二联灭活苗，2ml/头；间隔2周后进行相同剂量和免疫方式的接种。对照组5头，不接种。并于二免后14d、21d、28d、35d分别采血，测定血清中PEDV中和抗体。

母猪中和抗体检测结果显示，二免后第21日有2/5达到1:32以上，同样在二免28日达到最高，但是抗体下降较快，第35日有2/5达到1:32；而且整体抗体水平较活苗免疫后产生的抗体水平低。对照组仔猪中和抗体持续保持在1:8以下(见表5)。

表5后备母猪接种胃腹二联灭活苗后血清中PEDV中和抗体水平

4.2怀孕母猪的免疫试验

6头预产期相同，PEDV抗原抗体为阴性的健康待产母猪，随机分为2组：免疫组和对照组，每组各3头。免疫组母猪产前5周后海穴接种上述胃腹二联灭活苗，2ml/头；产前3周后按相同剂量和免疫方法进行二免。对照组母猪不接种。免疫后，观察各组母猪精神、采食、饮水等症状，所有母猪在相同条件下生产，统计母猪产仔情况，并在分娩后第0d、7d、14d、21d分别采集母猪乳汁，比较乳汁中PEDV sIgA抗体水平。

用ELISA方法测定母猪分娩后第0d、7d、14d和21d乳汁中PEDVsIgA抗体，抗体变化趋势与活苗免疫后母猪乳汁抗体水平变化基本一致，均在分娩后7d达到最高，14d时开始出现弱阳性，21d时有2头母猪抗体为阴性。对照组分娩后0d-21d，乳汁中PEDV sIgA抗体均为阴性。ELISA结果见表6。

表6怀孕母猪免疫胃腹二联灭活苗后乳汁中PEDV sIgA抗体检测结果

备注：背景值平均OD值：0.084；判断值＝0.35+0.084＝0.434。

判定标准：样品OD>0.434为阳性；样品OD<0.434为阴性。

4.3仔猪的攻毒保护试验

从实施例2的4.2中免疫组和对照组母猪所产仔猪中各随机选5头，母乳饲养。21日龄时所有仔猪均口服攻毒PEDV强毒(CV777强毒株组织毒，1000×MID)。攻毒后仔猪连续观察7日，观察仔猪发病情况，主要包括精神、采食、呕吐、腹泻等。

仔猪攻毒结果显示：免疫组仔猪在攻毒后第2天表现出精神略沉郁、食欲下降和一过性水样腹泻，之后逐渐恢复，临床症状最长持续4天。而对照组仔猪在攻毒后第2天全部出现精神沉郁、食欲减退现象，多数仔猪出现严重的水样腹泻和呕吐，个别仔猪在攻毒后第7天仍有水样腹泻症状。攻毒保护结果见表7。

表7仔猪攻毒后发病情况统计

实施例3不同疫苗组合(商品苗)的免疫效力研究

1.免疫的疫苗猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗(其中，各病毒抗原分别为华毒株+CV777强毒株灭活苗。以下简称“胃腹二联灭活苗”)，批号201407，哈药集团生物疫苗有限公司；猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(G5型)三联活疫苗(其中，各病毒抗原分别为弱毒华毒株+CV777弱毒株+NX株，以下简称“胃腹轮三联活苗”)，批号2015002；哈尔滨维科生物技术开发公司，即首免和加强免疫分别为猪流行性腹泻弱毒活疫苗和灭活疫苗的组合的免疫效力。

3.实验动物来自无腹泻历史的猪场的怀孕母猪，PEDV抗原抗体均为阴性。

4实验方法

4.1不同疫苗组合免疫对怀孕母猪的免疫效力研究

5头PEDV抗体抗原为阴性的怀孕母猪，随机分为2组：免疫组3头，母猪产前5周后海穴接种胃腹轮三联活苗，1ml/头；产前3周后海穴接种胃腹二联灭活苗加强免疫，2ml/头。对照组2头，不接种。免疫后，观察各组母猪精神、采食、饮水等症状，所有母猪在相同条件下生产，统计母猪产仔情况，并在分娩后第0d、7d、14d、21d分别采集母猪乳汁，比较乳汁中PEDV sIgA抗体水平。

免疫母猪接种后均未观察到明显的异常临床症状，观察至分娩未见到流产、死胎、木乃伊胎等异常情况，母猪产仔情况与对照组无差异(见表8)。通过与实施例1中4.2结果对比，可以看出活苗/灭活苗组合免疫怀孕母猪，可以降低母猪产弱仔的数量(见表8)。

表8不同疫苗组合免疫怀孕母猪后产仔情况统计

母猪分娩后乳汁中PEDV sIgA抗体检测结果显示(结果见表9)，活苗/灭活苗接种母猪乳汁中的PEDV sIgA抗体均在分娩后7d达到最高，21d时有1头母猪抗体转为阴性。与实施例1的4.2中怀孕母猪抗体水平相当，但是综合产仔情况，活苗/灭活苗接种方式在提供足够保护的前提下更加安全。

表9不同疫苗组合免疫母猪后乳汁中PEDV sIgA抗体检测结果

备注：背景值平均OD值：0.079；判断值＝0.35+0.079＝0.429。

判定标准：样品OD>0.429为阳性；样品OD<0.429为阴性。

4.2仔猪攻毒保护试验

从实施例3的4.1中免疫组和对照组母猪所产仔猪中各随机选5头，母乳饲养。21日龄时所有仔猪均口服攻毒PEDV强毒(CV777强毒组织毒，1000×MID)。攻毒后仔猪连续观察7日，观察仔猪的精神、采食、呕吐、腹泻情况。

攻毒结果显示，免疫组仔猪在攻毒后第2天出现精神沉郁和食欲下降，在攻毒后第3天出现一过性水样腹泻，整个过程持续3天后逐渐恢复正常；而对照组仔猪在攻毒后第2天均表现出精神沉郁、食欲减退，且有4/5仔猪水样腹泻，腹泻持续6天。攻毒保护结果见表10。

表10仔猪攻毒后发病情况统计

实施例4猪流行性腹泻弱毒活疫苗制备

1.毒株PEDV HN1302株，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、保存的PEDV HN1301株，经Vero细胞传代致弱而得。

2.猪流行性腹泻活苗的制备过程：

2.1病毒繁殖

PEDV HN1302株传代培养用细胞为非洲绿猴肾细胞(Vero细胞，购自上海生化所)。取1ml病毒液进行1000倍稀释后，接种于长成良好单层的Vero细胞，37℃吸附2h后补加维持液至合适体积，置于37℃5％CO₂培养箱中培养20-32h，当细胞病变达80％以上时收获病毒液，冻于-20℃备用。

2.2病毒含量测定

取收获的病毒液，按照Reed-Mench法进行病毒含量测定，病毒含量不低于10^7.5TCID₅₀/ml。

2.3病毒纯净性检验

按照中华人民共和国兽用生物制品规程附录第50页进行细菌、霉菌检测，病毒株无细菌、霉菌、按附录第53页进行支原体检测，病毒株无支原体，按附录54页进行其他外源病毒检测，病毒株无其他外源病毒污染。

2.4活苗制备

取2.3中上述检验合格的病毒液按照1:1比例加入冻干保护剂进行冻干，使用时加入疫苗稀释液即为猪流行性腹泻活疫苗。

实施例5猪流行性腹泻灭活疫苗制备

1.毒株PEDV HN1301株，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、保存。

2.PEDV毒株纯净性检验

按照中华人民共和国兽用生物制品规程附录第50页进行病毒株细菌、霉菌检测，无细菌、霉菌；按第53页进行病毒株支原体检测，无支原体，按第54页进行病毒株其他外源病毒污染检测，无其他外源病毒污染。

3.PEDV HN1301株灭活苗的制备过程：

3.1PEDVHN1301株传代培养用细胞为非洲绿猴肾细胞(Vero细胞，购自上海生化所)。取1ml病毒液进行100倍稀释后，接种于长成良好单层的Vero细胞，37℃吸附2h后补加维持液至合适体积，置于37℃5％CO₂培养箱中培养36-48h，当细胞病变达80％以上时收获病毒液，冻于-20℃备用。

3.2对收获的HN1301株病毒液经浓缩后进行病毒含量和纯净性检验，病毒含量为10^9.0TCID₅₀/ml，纯净性检验合格，可用于配苗。

3.3将3.2中病毒含量和纯净性检验合格的HN1301株病毒液，用β-丙内酯进行灭活处理，并对灭活后的病毒液进行灭活检验。

3.4将3.3中灭活检验合格的抗原与ISA 206佐剂乳化配苗，即制备成猪流行性腹泻病毒HN1301株灭活疫苗。

实施例6猪流行性腹泻弱毒活疫苗组合免疫效力研究

采用实施例4制备的猪流行性腹泻活苗分别免疫后备母猪和怀孕母猪，通过检测母猪分娩后乳汁中PEDV sIgA抗体水平、哺乳仔猪攻毒保护试验及后备母猪血清中PEDV中和抗体水平，来评价该疫苗组合的免疫效力，即首免和加强免疫均为猪流行性腹泻弱毒HN1302株活疫苗的组合的免疫效力。

1.免疫的疫苗实施例4制备的猪流行性腹泻弱毒HN1302株活苗。

4.试验方法

4.1后备母猪的免疫试验

10头PEDV抗体抗原为阴性的后备母猪，随机分为2组：免疫组和对照组，每组5头。免疫组母猪颈部肌肉接种活苗，1ml/头；间隔2周后进行相同剂量和免疫方式的免疫。对照组不接种。接种后连续观察14日，观察各组母猪精神、采食、饮水、粪便等症状，并于二免后14d、21d、28d、35d分别采血，测定血清中PEDV中和抗体。接种后各组母猪精神、采食、饮食、粪便均未见异常。

中和结果显示，二免14d时整体抗体水平仍低于1:32，21d时有3头达到1:32，28d时达到高峰，35d时仍有4/5达到1:32以上。免疫组抗体产生较晚，但持续时间较长。对照组中和抗体则一直低于1:8(见表11)。

表11后备母猪免疫猪流行性腹泻活苗后血清中PEDV中和抗体水平

4.2怀孕母猪的免疫试验

5头健康待产母猪，PEDV抗原抗体阴性，随机分为2组。免疫组3头，母猪产前5周颈部肌肉接种上述猪流行性腹泻HN1302株活苗，1ml/头；产前3周后相同剂量和免疫方式进行二免。对照组2头，不接种。免疫后，观察各组母猪精神、采食、饮水等症状，所有母猪在相同条件下生产，统计母猪产仔情况，并在分娩后第0d、7d、14d、21d分别采集母猪乳汁，比较乳汁中PEDV sIgA抗体水平。

免疫组母猪首免后有1头出现短暂性食欲减退，其他未见异常。母猪妊娠正常，免疫组与对照组产仔情况差异不大(见表12)。

表12怀孕母猪免疫猪流行性腹泻HN1302株活苗后产仔情况统计

用ELISA方法测定母猪分娩后第0d、7d、14d和21d的乳汁中PEDVsIgA抗体，结果显示，免疫组母猪均在分娩后7d乳汁中PEDV sIgA抗体水平最高，之后逐渐下降，21d时有1头母猪抗体为弱阳性。对照组分娩后0d-21d，乳汁中PEDV sIgA抗体均为阴性。ELISA结果见表13。

表13怀孕母猪免疫猪流行性腹泻HN1302株活苗后乳汁中PEDV sIgA抗体检测结果

备注：背景值平均OD值：0.074；判断值＝0.35+0.074＝0.424。

判定标准：样品OD>0.424为阳性；样品OD<0.424为阴性。

4.3仔猪的攻毒试验

从实施例6的4.2中免疫组和对照组母猪所产仔猪中各随机选5头，母乳饲养。21日龄时所有仔猪均口服攻毒PEDV强毒。攻毒后仔猪连续观察7日，观察仔猪发病情况，主要包括精神、采食、呕吐、腹泻等。

仔猪攻毒结果显示：免疫组仔猪攻毒后第2天出现精神沉郁和食欲下降，攻毒后第2-3天出现水样腹泻，整个发病过程持续3天。对照组攻毒后第1天部分仔猪出现精神沉郁、食欲减退，攻毒后第2天全部表现出精神沉郁和食欲减退；仔猪在攻毒后第2-3天出现水样腹泻，持续4天以上，严重时呈喷射状。攻毒结果见表14。

表14仔猪攻毒后发病情况统计

实施例7猪流行性腹泻灭活疫苗组合免疫效力研究

本实施例使用猪流行性腹泻HN1301株灭活苗组合免疫效力研究，即首免和加强免疫均为猪流行性腹泻弱毒HN1301株灭活苗的组合的免疫效力。

1.免疫的疫苗实施例5制备的猪流行性腹泻HN1301株灭活苗。

4.试验方法

4.1后备母猪的免疫试验

10头PEDV抗体抗原为阴性的后备母猪，随机分为2组，每组5头。免疫组母猪颈部肌肉接种HN1301株灭活苗，2ml/头；间隔2周后进行相同剂量和免疫方式的免疫。对照组不接种。二免后14d、21d、28d、35d分别采血，测定血清中PEDV中和抗体。中和结果显示，灭活苗抗体消长趋势与免疫活苗后抗体变化基本相同，均在二免28d达到最高，但是灭活苗抗体水平整体较低。二免21d时有3头达到1:32，35d时有3/5达到1:32以上。对照组中和抗体则一直低于1:8(见表15)。

表15后备母猪免疫猪流行性腹泻HN1301株灭活苗后血清中PEDV中和抗体水平

4.2怀孕母猪的免疫试验

5头健康待产母猪，PEDV抗原抗体为阴性，随机分为2组。免疫组3头，母猪产前5周颈部肌肉接种腹泻HN1301株灭活苗，2ml/头；产前3周用相同剂量和免疫方式进行二免。对照组2头，不接种。所有母猪在相同条件下生产，统计母猪产仔情况，并在分娩后第0d、7d、14d、21d分别采集母猪乳汁，比较乳汁中PEDV sIgA抗体水平。

母猪分娩后第0d、7d、14d和21d的乳汁中PEDV sIgA抗体结果显示，免疫组母猪分娩后7d抗体水平最高，21d时有1头母猪抗体转为阴性。而对照组母猪乳汁中PEDV sIgA抗体一直为阴性。ELISA结果见表16。

表16怀孕母猪免疫猪流行性腹泻HN1301株灭活苗后乳汁中PEDVsIgA抗体检测结果

备注：背景值平均OD值：0.096；判断值＝0.35+0.096＝0.446。

判定标准：样品OD>0.446为阳性；样品OD<0.446为阴性。

4.3仔猪的攻毒试验

从实施例7的4.2中免疫组和对照组母猪所产仔猪中各随机选5头，母乳饲养。21日龄时所有仔猪均口服攻毒PEDV强毒。攻毒后仔猪连续观察7日，免疫组仔猪攻毒后第2天出现精神沉郁和食欲下降，攻毒后第3天出现不同程度的水样腹泻，第4天仅有1头仔猪出现轻微的腹泻。对照组攻毒后第2天全部表现出精神沉郁和食欲减退；攻毒后第2天出现严重的水样腹泻，且持续4天以上。攻毒结果见表17。

表17仔猪攻毒后发病情况统计

实施例8不同疫苗组合免疫的效力研究

本实施例使用采用活苗首免、灭活苗二免(活苗/灭活苗)的组合，来评价该免疫组合的效力。

1.免疫的疫苗实施例4制备的猪流行性腹泻弱毒HN1302株活疫苗、实施例5制备的猪流行性腹泻HN1301株灭活苗。

4.试验方法

4.1怀孕母猪的免疫试验

6头健康待产母猪，PEDV抗原抗体为阴性，随机分为2组：免疫组和对照组，每组3头。免疫组母猪产前5周颈部肌肉注射腹泻弱毒HN1302株活苗，1ml/头；产前3周颈部肌肉注射腹泻HN1301株灭活苗，2ml/头。对照组不接种。所有母猪在相同条件下生产，统计母猪产仔情况，并在分娩后第0d、7d、14d、21d分别采集母猪乳汁，比较乳汁中PEDV sIgA抗体水平。

免疫母猪接种后均未观察到明显的异常临床症状，观察至分娩未见到流产、死胎、木乃伊胎等异常情况，母猪产仔情况与对照组无差异(见表18)。

表18不同疫苗组合免疫怀孕母猪后产仔情况统计

母猪分娩后第0d、7d、14d和21d的乳汁中PEDV sIgA抗体结果显示，免疫组母猪分娩后7d抗体水平最高，21d时有2头母猪抗体为弱阳性。对照组抗体一直为阴性。ELISA结果见表19。

表19不同疫苗组合免疫怀孕母猪后PEDV sIgA抗体检测结果

备注：背景值平均OD值：0.069；判断值＝0.35+0.069＝0.419。

判定标准：样品OD>0.419为阳性；样品OD<0.419为阴性。

4.2仔猪的攻毒试验

从实施例8的4.1中免疫组和对照组母猪所产仔猪中各随机选5头，母乳饲养。21日龄时所有仔猪均口服攻毒PEDV强毒。攻毒后仔猪连续观察7日。仔猪攻毒结果显示：免疫组仔猪攻毒后第2天出现精神沉郁和食欲下降，且有不同程度的水样腹泻，整个病程持续2天。对照组攻毒后第2天表现出精神沉郁和食欲减退，并出现严重的水样腹泻，腹泻持续4天以上。攻毒结果见表20。

表20仔猪攻毒后发病情况统计

实施例9本发明试剂盒的制备

本实施例使用实施例4制备的猪流行性腹泻病毒HN1302弱毒株活疫苗和实施例5制备的猪流行性腹泻病毒HN1301株灭活疫苗制备试剂盒。

使用实施例4制备的猪流行性腹泻病毒HN1302弱毒株活疫苗或其组合物制备试剂盒的活疫苗组分，其组合物还可以包括冻干保护剂、载体、稳定剂。

本发明试剂盒的活疫苗组分优选形式为冷冻干燥的形式，当活疫苗部分为冷冻干燥形式时还可以包括稀释液，冷冻干燥活疫苗与稀释液可以使用不同药剂瓶或不同隔室存放。

使用实施例5制备的猪流行性腹泻病毒HN1301株灭活疫苗或其组合物制备试剂盒的灭活疫苗组分，其组合物还可以包括佐剂、载体、稳定剂、助悬剂、表面活性剂、灭活剂、防腐剂。

本发明试剂盒的活疫苗组分和灭活疫苗组分分开保存，可以使用不同药剂瓶或不同隔室存放。

实施例10不同的疫苗接种方法的免疫效力研究

本研究通过检测母猪乳汁中PEDV sIgA抗体及仔猪的攻毒保护，来比较不同接种方法的效力，选择最佳的疫苗接种方法。

4.试验方法

4.1怀孕母猪的免疫试验

9头健康待产母猪，PEDV抗原抗体为阴性，随机分为3组，第每组3头。第一组母猪产前5周颈部肌肉注射腹泻弱毒HN1302株活苗，1ml/头；产前3周颈部肌肉注射腹泻HN1301株灭活苗，2ml/头。第二组母猪产前5周后海穴注射腹泻弱毒HN1302株活苗，1ml/头；产前3周后海穴注射腹泻HN1301株灭活苗，2ml/头。对照组不接种。所有母猪在相同条件下生产，统计母猪产仔情况，并在分娩后第0d、7d、14d、21d分别采集母猪乳汁，比较乳汁中PEDV sIgA抗体水平。

所有免疫母猪接种后均未观察到明显的异常临床症状，观察至分娩未见到流产、死胎、木乃伊胎等异常情况，母猪产仔情况与对照组无差异(见表21)。

表21不同接种方法免疫怀孕母猪后产仔情况统计

母猪分娩后第0d、7d、14d和21d的乳汁中PEDV sIgA抗体结果显示，两个免疫组母猪乳汁中PEDV sIgA抗体均在分娩后7d达到最高，之后快速下降；颈部肌肉注射21d时有2头母猪抗体为弱阳性，后海穴注射组21d时有一头母猪抗体转为阴性。而对照组抗体一直为阴性。ELISA结果见表22。

表22不同接种方式免疫怀孕母猪后PEDV sIgA抗体检测结果

备注：背景值平均OD值：0.075；判断值＝0.35+0.075＝0.425。

判定标准：样品OD>0.425为阳性；样品OD<0.425为阴性。

4.2仔猪的攻毒试验

从实施例10的4.1中免疫组和对照组中各随机选5头仔猪，母乳饲养。21日龄时所有仔猪均口服攻毒PEDV强毒。攻毒后仔猪连续观察7日。仔猪攻毒结果显示：颈部肌肉接种组和后海穴接种组仔猪均在攻毒后第2天出现精神沉郁、食欲下降和水样腹泻；颈部肌肉接种组整个病程持续2天，后海穴接种组持续3天。对照组攻毒后第2天表现出精神沉郁和食欲减退，并出现严重的水样腹泻，腹泻持续4天以上。见表23。

表23仔猪攻毒后发病情况统计

备注：A表示仔猪出现精神沉郁、食欲减退和水样腹泻；

B表示仔猪出现精神沉郁、食欲减退；

-表示仔猪未见异常临床症状。

由表23结果可知，后海穴与颈部肌肉接种方式相比，颈部肌肉诱导母猪产生保护性抗体的能力略高于后海穴接种。另外，从操作的简便、快速及准确性上来看，颈部肌肉接种要优于后海穴接种，更容易在猪场中应用。

由上述实施例可见，本发明采用活苗/灭活苗组合、即便使用颈部肌肉接种免疫，也能够快速有效地刺激机体产生免疫力，抵抗PEDV的侵染，同时能够避免长期使用活苗造成的散毒、仔猪带毒等各种风险。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1.一种疫苗的组合，所述疫苗组合包含猪流行性腹泻活疫苗或其组合物，以及猪流行性腹泻灭活疫苗或其组合物。

2.根据权利要求1所述的疫苗组合，其中，所述猪流行性腹泻活疫苗包括猪流行性腹泻病毒ZJ08株、猪流行性腹泻病毒LW/L株、猪流行性腹泻病毒SD10株、猪流行性腹泻病毒CV777弱毒株的活疫苗、猪流行性腹泻病毒PEDV/CHGD01的致弱株、猪流行性腹泻病毒GDSJ/2012的致弱株、猪流行性腹泻病毒HN1303株的致弱株、猪流行性腹泻病毒HN1302株。

3.根据权利要求1所述的疫苗组合，其中，所述猪流行性腹泻灭活疫苗包括猪流行性腹泻病毒LW株的灭活苗、猪流行性腹泻病毒CV777强毒株的灭活苗、猪流行性腹泻病毒PEDV/CHGD01株的灭活苗、猪流行性腹泻病毒GDSJ/2012株的灭活苗、猪流行性腹泻病毒HN1303株的灭活苗、猪流行性腹泻病毒HN1301株的灭活苗。

4.根据权利要求1所述的疫苗组合，其中，所述猪流行性腹泻活疫苗为猪流行性腹泻病毒CV777弱毒株的活疫苗，所述猪流行性腹泻灭活疫苗为猪流行性腹泻病毒CV777强毒株的灭活苗。

5.根据权利要求1所述的疫苗组合，其中，所述猪流行性腹泻活疫苗为猪流行性腹泻病毒HN1302株活疫苗，所述猪流行性腹泻灭活疫苗为猪流行性腹泻病毒HN1301株灭活苗或猪流行性腹泻病毒HN1303株灭活苗。

6.根据权利要求1所述的疫苗组合，其中，制备所述猪流行性腹泻灭活疫苗的强毒株为制备所述猪流行性腹泻活疫苗的弱毒株的亲本强毒株。

7.根据权利要求1所述的疫苗组合，其中，所述猪流行性腹泻活疫苗抗原含量为≥10^5.0TCID₅₀/ml；所述猪流行性腹泻灭活疫苗抗原含量为灭活前≥10^7.0TCID₅₀/ml。

8.根据权利要求1所述的疫苗组合，其中，所述猪流行性腹泻活疫苗抗原含量为10^5.0TCID₅₀/ml～10^6.0TCID₅₀/ml；所述猪流行性腹泻灭活疫苗抗原含量为灭活前10^7.0TCID₅₀/ml～10^8.0TCID₅₀/ml。

9.根据权利要求1所述的疫苗组合，其中，所述猪流行性腹泻活疫苗还包括冻干保护剂，所述猪流行性腹泻灭活疫苗还包括佐剂。

10.一种试剂盒，所述试剂盒包括猪流行性腹泻活疫苗或其组合物以及猪流行性腹泻灭活疫苗或其组合物，其中，所述猪流行性腹泻活疫苗或其组合物与猪流行性腹泻灭活疫苗或其组合物分开保存。

11.权利要求1～9任一项所述疫苗组合在制备预防和/或治疗猪腹泻的药物中的应用，其中，所述应用包括使用所述猪流行性腹泻活疫苗或其组合物首免猪，以及使用所述猪流行性腹泻灭活疫苗或其组合物二免所述猪。

12.根据权利要求11所述的应用，其中，所述猪流行性腹泻活疫苗或其组合物与所述猪流行性腹泻灭活疫苗或其组合物通过猪颈部施用。