CN1185806A - 诱发猪生殖和呼吸综合征(prrs)的病毒的新的减毒株,由其产生的疫苗和诊断试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述了诱发猪生殖和呼吸综合征(PRRS)的病毒的新的减毒株(CNCM巴斯德研究所Ⅰ－1642),同时也描述了用从猴肾细胞系MA－104(CNCM巴斯德研究所Ⅰ－1643)获得的一种新克隆对它进行减毒和复制的方法。由于该新的减毒株对猪无毒害作用且具有高度的免疫原性,因此可用它获得疫苗和诊断试剂盒,使PRRS的早期诊断和有效的预防性治疗成为可能。

Description

诱发猪生殖和呼吸综合征(PRRS)的病毒的新的减毒株， 由其产生的疫苗和诊断试剂盒及其制备方法
发明领域
本发明涉及一种能诱发猪生殖和呼吸综合征(PRRS)的病毒的新的减毒株。用来源于猴肾的新细胞克隆对毒性株进行减弱和复制的方法可用于制备疫苗和诊断试剂盒，以早期诊断PRRS，并对该疾病进行有效的预防性治疗。
现有技术
1987年，人们在北美首次发现一种猪的疾病，当时称为“神秘的猪病”或MSD，以后又称作“猪不育和呼吸综合征”或SIRS。1990年，在中欧首次发现相似的综合征，以后又传播到包括西班牙在内的其它欧洲国家。开始时，欧洲称此病为“流行性猪流产和呼吸综合征”或PEARS，最后称之为“猪生殖和呼吸综合征”或PRRS。这个名称逐渐被广泛接受。
已知PRRS的病原体是一种包围RNA的小病毒，它是在荷兰首次分离到的被称作Lelystad病毒。有人提出，该病毒属于动脉病毒(Arterviridae)。该病毒在专利申请PCT WO-92/21375及欧洲专利EP-B-05 87780(Stichting Centraal Diegeneeskundig Instituut)中已有描述，而后者来源于前者。为这些申请的目的，上述病毒的分离物被保藏于巴黎的巴斯德研究所，保藏号为I-1102。
如专利申请PCT WO-93/03760(Collins等)和欧洲专利申请EP-A-0529584(Boehringer Ing.)中所述，北美型病毒的分离几乎与欧洲型病毒的分离同时进行。为这些申请的目的，上述病毒的分离物被保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号为VR-2332。
欧洲型和北美型病毒有明显的不同，这不仅表现于血清学反应性而且涉及到主要RNA片段核苷酸序列的同源程度。在欧洲专利申请EP-A-0676467(Akzo)的前两页中对二者的不同进行了详细描述，且引用了大量的文献。在上述的专利申请中得出这样的结论，欧洲型病毒和美洲型病毒在很久以前就已明确地分离。因此可预料，对其中一个类型可能有效的疫苗对另外一个类型效果很小或根本无效。
从欧洲和美洲型病毒均分离到不同的毒株。每一毒株具有其独特性，有几种毒株已成为专利申请的目标。例如，专利申请PCT WO-93/07898(Akzo)描述了一种欧洲毒株，及由之产生的疫苗，保藏于CNCM(巴斯德研究所)，保藏号I-1140。来源于同一优先权申请的专利申请PCT WO-93/14196和欧洲专利申请EP-A-541418(Rhōne-Merieux)，描述了在法国分离到的一种新的毒株，保藏于CNCM(巴斯德研究所)，序号I-1153。欧洲专利申请EP-A-0595436(Solvay)描述了一种新的美洲毒株，其毒力强于开始时描述的毒株，其中还描述了其疫苗。该毒株保藏于ATCC，但在专利申请中没有详述其保藏号。最后，序号为ES-A-2074950(Cyanamid Ibērica)的西班牙专利申请描述一种叫做“西班牙毒株”的毒株，它不同于欧洲和美洲毒株，这种“西班牙毒株”保藏于欧洲动物细胞培养物保藏中心(EACCC)保藏号为V93070108。
总之，PRRS的病原体很明显地表现出一些多样性，并且为了有效地与该疾病作斗争，需要依感染猪的毒株类型而不同的疫苗。
在母猪中，该疾病的特征在于缺乏食欲，厌食，生殖性疾病(流产，早产，死产或产虚弱的小猪，胚胎死亡，有或没有干尸化)。有时感染的母猪会死亡。一种较少出现的症状是耳部、腹部或外阴部出现短暂的蓝色；因此该疾病起初在荷兰被称作“Abortus blauw”，在英国被称为“蓝耳”。在小猪中，这些症状是年龄依赖性的；在新生的小猪中，可观察到呼吸困难和肌肉震颤，而在较大些的小猪中，后部的麻痹和共济失调则更常见。在流行的高峰期，出生第1天的死亡率是有限的，但在10天大的小猪中可达到80％。感染的育肥猪出现短暂的少食和较多的呼吸系统的问题。
疾病的潜伏期变化很大，从5天至37天(I.B.RobertsonEurp.Comm.Seminar on PRRS，11：4-5，布鲁塞尔，1991)。有时，该疾病的传播非常慢，但是，当一个农场感染的时候，该疾病可持续数月(B.Thacker，Int.Symp.on SIRS，St.Paul/Minnesota，1992)。
抗这些病毒的抗体，在感染后6天，已用免疫过氧化物酶技术(免疫过氧化物酶单层法，以后称为IPMA)检测出来，如Wensvoort等所描述的(The Vet.Quart 13：121-130，1991。5天后抗体的滴度可达到1/20,000，通常能持续12个月以上。但是如V.Ohlinger等，Meredith，M.De.Pig Dis.Info.Center Cambridge，1992年12月所报道的，一些猪在4-5个月以后血清呈阴性。这些作者可以从感染后的不同器官中分离病毒，感染6周后，肺、血清、血浆及血细胞匀浆中病毒的滴度可达到106 TCID50(组织培养物感染剂量的50％)。这表明病毒和抗体一起可持续几周。此外，人们还认识到在疾病爆发中存活下来的动物对于敏感的猪是传染源。感染后1天可检测到病毒血症，这可持续56天，通常较之为短。
在病毒的血源性传播中，病毒可到达怀孕母猪的胎盘。已经证明，病毒可通过胎盘引起胚胎死亡。最高的胚胎敏感性发生于怀孕的倒数第三周(last third of gestation)中。此外，病毒可在胚胎中复制而不引起胚胎死亡。但是，从干尸化胚胎或自溶胚胎中还没有分离到该病毒。
在小猪中，当从初乳中获得的母体抗体减少时会发生这种疾病。在怀孕的倒数第三周(Iast third of pregnancy)中感染病毒的母猪所生下的活猪仔，其中一些可在初次哺乳前观察到抗病毒的抗体。通常，这些动物在出生时也可表现出病毒血症(C.Terpstra等，Vet.Q.13：131-136，1991)。
尽管大量巨噬细胞被破坏，但是还没有明确证实诱发PRRS的病毒的免疫抑制活性。但是经常出现与之相关的继发性感染，在养猪场中引起严重的经济损失。
现在，可在有大量猪群的大多数国家中发现PRRS病毒。
由于直接地或间接地因PRRS病毒感染而产生的继发性病因所造成的经济损失，如今，PRRS是影响养猪业的最重要疾病之一。
用猪的肺泡巨噬细胞(PAM)培养物制备的无活性疫苗在实验室中得到可接受的结果，但在农场环境中的效力部分依赖于环境状况及对接种动物进行的管理。
阻碍获得抗PRRS病毒免疫产物的问题之一是用于病毒复制的稳定底物的利用率很有限。
直到最近，PRRS病毒仅能在猪的肺泡巨噬细胞(PAM)培养物中扩增(Wensvoort G.等，The Vet.Quart.13：121-130，1991)。用一定年龄的无疾病的猪来获得这些巨噬细胞有一些缺点。此外，在回收的PAM中不能保证对病毒感染的敏感性，因为从不同动物得到的细胞底物经常不同。这就成为导致制备恒定和同质批量抗原的主要障碍，并且每一批量抗原均需对其进行评价以确定其敏感性。
由于所有这些原因，稳定和持续的细胞宿主利用率的降低严重地阻碍了获得突变物的研究进程，而该突变物是基于PRRS病毒在细胞底物中的复制和减毒变种的选择之上的。
待解决的主要问题之一是中和毒性病毒使之不能在PAM中复制，因为病毒复制会导致PAM的破坏。
因此，病毒对来源于转化细胞系的底物的适应性将会为获得减毒突变株和制备灭活疫苗提供适宜的手段，由此可排除PAM的依赖性和可变性。
专利申请PCT WO 94/18311(Miles)建议将某一PRRS病毒株在独特的称作克隆9009B的克隆中增殖，9009B来源于非洲绿猴肾细胞系，专利申请人称为MA-104(M)系，后者来源于名为MA-104的商品细胞系。在该专利申请中没有说明这一独特克隆的保藏，因此该专利难以实施和重现。
发明目的
本发明的目的是PRRS病毒的新的减毒株，该减毒株使得可以以稳定和可再现的方式得到无毒的猪疫苗，该疫苗对预防PRRS有高的有效性。
本发明的另一目的是来源于稳定的猴肾细胞系MA-104的细胞克隆及其制备方法，该细胞克隆能够维持PRRS病毒高滴度生长，使得能获得特定减毒株的稳定的病毒收获物。
本发明的另一目的是对PRRS疾病有效的疫苗及其制备方法，该疫苗可从新的减毒株及其突变株得到。
本发明的另一目的是PRRS疾病的诊断试剂盒及其制备方法，该试剂盒可从新的减毒株或其突变株得到。发明详述
本发明的PRRS病毒的减毒株是从一个西班牙农场的感染的猪中分离到的毒性株经减毒后得到的。为了满足说明的充分性，该减毒株保藏于巴斯德研究所的国家微生物培养物保藏中心(CNCM)，保藏号为1-1642。保藏日期为23/11/95。
毒性株的减毒和复制在细胞克隆中经过系列传代进行，这一细胞克隆也是本发明的目的，作者称之为Clon-8。该克隆从一名为MA-104的商品猴肾细胞系而来。也是为了满足说明的充分性，Clon-8于上述日期保藏于巴斯德研究所的CNCM，保藏号为I-1643。
以前，克隆商品细胞系MA-104用于筛选和分离Clon-8。克隆是这样进行的：把细胞悬浮在合适的生长培养基中(例如含胎牛血清(FBS)的Earle′s基本培养基)，以不同的浓度铺放悬液，筛选并用胰酶消化克隆，然后在培养瓶中扩展。用所描述的方法对所得到的克隆进行连续克隆，直到获得分化良好的克隆。
去除形状不规则或难以扩增的克隆，测定所选克隆对PRRS病毒起始毒性株感染的敏感性。由于Clon-8且对病毒复制的高敏感性(高TCID50)和所得病毒收获物的一级性和再现性，故选择了Clon-8。
毒性株通过在Clon-8培养物中进行连续复制而减毒，优选在34℃进行。测定感染的病毒颗粒含量以估计其复制能力，检测细胞病变的效果(CPE)以估计适应度。根据所得结果，病毒在Clon-8中可进行复制，至少在20代中没有生命力的丧失，减毒的结果是提供了一种实用的保存其抗原性的无毒病毒。
因此，本发明的PRRS病毒减毒株是以一种稳定和工业上可重复的分式获得的，从而便于用它来获得PRRS疫苗和PRRS诊断试剂盒。
感染了毒性株或感染了减毒株的猪群间进行的对比试验清楚地表明，减毒株对感染了它的动物无害。另外，本发明的减毒株在血清阴性的猪中表现出了高复制效率，并且以200 TCID50的小剂量肌肉内接种给动物时可诱导产生血清转化现象。这种方法诱导产生的抗体可至少持续80天。
因而本发明的减毒株是制备预防猪PRRS疫苗的良好基质。可用本领域中任何一种人们所熟知的方法来制备这种疫苗，可制成各种传统的形式，如分散液、乳油液、脂质体组合物、冻干形式等。疫苗组合物可用不同的佐剂完成，如免疫刺激物，乳化剂，稳定剂等。疫苗的施用可以是肌内的或皮下的，鼻内的，气管内的，皮的，经皮的或皮内的。
疫苗的有效剂量可有很大变化，优选范围为本发明减毒株的102-106 TCID50。
所得疫苗也可制备或多价疫苗，与另外的活的或灭活的猪病毒一起，或与活的或灭活的细菌一起，这也是本发明的一个目的。
如本领域的技术人员所熟知的，疫苗也可以制备成包含有来源于本发明病毒株的病毒抗原的疫苗，例如用热或化学方法等任何一种传统的方法使含有该毒株的疫苗以完全灭活的形式存在，如含有该毒株被膜或RNA片段的疫苗等等。
本发明的减毒株也可通过利用传统的技术用于制备诊断试剂盒，该试剂盒包含有能用于检测血清阳性动物中抗体的抗原成分。例如，用于检测PRRS抗体的IPMA过程包括下列步骤：a)使本发明的减毒病毒适应一种在培养微板中的稳定细胞培养物，优选克隆Clon-8，这种方式每孔中有20-40感染颗粒进行感染。b)用已知的固定剂把感染的细胞固定在固相载体上。c)检测猪的血清抗体，把血清抗体在微板中培养，随后用IPMA技术对微板中的抗体进行染色。
附图简述
作为其中的一部分，本说明书附有两页共4张图。图中，以下的描述是阐释性的，不是限制性的。
图1是一张二维图，表明了鼻内接种本发明的减毒株后，妊娠母猪的直肠温度的变化。
图2是一张二维图，表明了接种了本发明的减毒株的母猪所生小猪的体重变化。
图3是一张二维图，表明了用IPMA检测的接种本发明减毒株的母猪子代的乳液内抗体的动态图，母猪1和10的子代在出生时滴度较低，这是由于在抽血时一些猪仔还没有吃奶。
图4是一张三维图，表明了肌内接种本发明减毒株的200，2,000和20,000 TCID50的猪仔中体液应答的状况。
实施例
以下给出几个方法的实施例来更明确地对本发明进行阐述。这些实施例不应被认为是对发明范围的限制。实施例1从稳定的猴肾细胞系MA-104获得细胞克隆
用欧洲动物细胞培养物保藏中心提供的保藏号为85102918的稳定猴肾细胞系MA-104，对筛选的PRRS毒株传代6次，传代在塑料培养瓶中单层生长的静止的培养细胞中，在补充有10％胎牛血清(FBS)的Earle′s MEM培养基中，37℃没有CO2补充的情况下进行。每次传代中接种6-7天后收集病毒收获物。
为了检测病毒收获物的量，用不同感染量(此后称MOI)的毒株接种给该细胞系。所获得病毒收获物的量很低(103-104 TCID50/ml)，即使在四次适应传代后也不足以用于疫苗产物。
这些实验中可观察到仅仅有部分感染的细胞对毒性病毒敏感，而剩余的细胞对感染具有不感受性，出于这一原因，克隆这一细胞系，以选择那些全部对毒株敏感的细胞群。
克隆的筛选如下进行：
细胞系的悬液在含20％FBS的Earle′s MEM中稀释，把不同的稀释液加到96孔微板(NUNC)中。37℃，5％CO2培养8天。在第3天时，用显微镜观察筛选只有一个细胞的培养板，在第8天用胰蛋白酶消化。这样获得44个克隆。此后，所得克隆在培养瓶中扩增，直到达到5×107/ml。然后用同样的步骤对这些细胞进行第2次和第3次克隆。
第3次克隆后，将得到的44个克隆扩增到获得25ml每一克隆含6×106/ml的细胞悬液。整个过程所应用的培养基含20％FBS。
根据其生长和活力特征对这些克隆进行进一步筛选。实施例2细胞克隆Clon-8的筛选
根据其生长效力对前一实施例中所得的克隆进行评估，去除那些有繁殖问题，形态不规则或难以在37℃维持的。经过这一预选后，去除25个克隆，选出余下的9个克隆。
所筛选的克隆用在PAM培养物中第8代传代的PRRS病毒的毒性株悬液进行感染(如Bloemberg，M.等在Vet Microb.42，361-371，1994中所描述的)。预先进行细胞克隆的适应过程：病毒在37℃3次传代中进行复制，保持80-90％的融合单层与病毒悬液接触6天，然后在-80℃冷冻，24小时后融化。
用补充有10％FBS和庆大霉素(0.4mg/ml)的Earle′s MEM作感染培养基。抗真菌或抗酵母的化合物均不应用。这样所获得的每种病毒收获物在相应的细胞克隆中进行滴定。对结果进行分析后，可得出这样的结论：这9个克隆对病毒感染敏感，滴度大于等于104.2 TCID50/ml。结果见表I。
表I所得细胞克隆对特定毒性株的敏感性
克隆或细胞系 滴度TCID50/ml
未克隆的细胞系 102
克隆1 105.75
克隆2 102.5
克隆3 105.2
克隆4 105.3
克隆8 106
克隆29 105.75
克隆30 105.38
克隆41 105.38
克隆44 104.2
如表1中所看到的，未克隆的细胞系对病毒的敏感性很低，因此用它作抗原来获得有效的疫苗似乎是不可行的。表1也显示出一些克隆株，尤其是Clon-8，其对病毒的敏感性比未克隆的细胞系高得多，克隆Clon-8尤为显著，当滴度达到106 TCID50/ml的时候，可从Clon-8的病毒收获物中获得。
根据上述的结果，选择了Clon-8。用几种方法研究了该克隆的可靠性。在几种不同的方法中，病毒收获物的滴度有很好的重复性，其值在105-107TCID50/ml之间。实施例3减毒病毒株的获得
本发明减毒病毒株是通过在34℃复制Clon-8细胞培养物中特定的毒性株而得到的。
病毒感染的Clon-8细胞单层在34℃保持直至CPE形成。CPE的检测通常比在37℃保持的培养物中的晚24-48小时，但是，没有发现在两个温度下形成的CPE有明显的差异。
利用Clon-8细胞单层对收获的病毒收获物进行滴定。此外，用IPMA检测了病毒的一致性。
将病毒接种给75cm2接近融合的Clon-8细胞单层，然后在34℃吸附2小时。接着，把感染培养基加到单层细胞。感染培养基是调整了的Earle′s基本培养基，补充有10℃FBS，预先加热到34℃。
把75cm2的培养瓶放置到34℃的培养箱中，每天检查直到发现清楚地CPE。经常是在感染后第5天和第7天，当80-95％的细胞单层出现CPE时，收集病毒的收获物。然后将病毒收获物以2000rpm进行离心，并对悬液进行滴定以确定病毒的滴度(TCID50/ml)。
用上述的方法传代20次。在第1、5、10、15、20次传代的时候对病毒的含量进行评价。结果表明，病毒可于34℃在Clon-8细胞单层中复制。而无任何活力的丢失，至少传代20次是这样的(表II)。表II 34℃病毒在Clon-8中从P.1至P.20代的增殖的评价
    在Clon-8中传代     病毒含量TCID50/ml
P.1 105.5
    P.5     105.7
    P.10     105.3
    P.15     105.6
    P.20     106.2
进一步的结果证实，Clon-8细胞单层可在MOI为0.001时感染。
下面实施例中进行的实验表明，从P.20得到的强毒株对猪无害。实施例4减毒病毒株的生物学特性和用它接种的效果
开始时应用的用于获得本发明减毒株的病毒株是一毒性株。对妊娠母猪的主要作用为早产，产衰弱，死亡和/或干尸化的新生猪仔，被感染的母猪也可在感染后的4-5天出现3-5天的轻微呼吸困难和抑制。
用起始毒性株的106.6 TCID50鼻内感染四只妊娠的母猪(参考号01，02，03，06)。用两只未感染的母猪(参考号73和74)作对照。结果如表III所示。
表III妊娠母猪接种毒性株后对子代的影响
母猪参考号 接种毒性病毒     所产猪仔数存活                死亡             干尸化 断奶前死亡的猪仔数
    01     +     10     2     0     2
    02     +     15     0     0     4
    03     +     6     5     0     2
    06     +     6     6     0     1
    73     -     13     0     0     0
    74     -     10     0     0     0
仅有一只感染的母猪在预定的日期生产。感染的母猪分别产了2、0、5、6只死产的猪仔，2、4、2、1只衰弱的猪仔。衰弱的猪仔出生后几天死亡。断奶时，每只对照母猪平均有11只猪仔存活，而每只感染的母猪产的猪仔平均仅存活6.5只。断奶时，猪仔的平均重量为4621g(感染母猪的猪仔)和5363g(对照母猪的猪仔)。从衰弱猪仔的肺匀浆中分离出有毒的PRRS病毒。进行感染攻击后，感染的母猪及其子代均出现血清转化现象。
利用两种性别的猪：通过特异性试验实现本发明减毒病毒株的生物学表征。无害试验在3个PRRS血清阴性的妊娠母猪中进行，这些猪来源于一个从来没有流行过PRRS的小农场。在母猪怀孕的倒数第三周接种病毒，这时对病毒最敏感。在怀孕的第78天和第93天之间鼻内施用减毒病毒，每只母猪的剂量为106 TCID50。接种病毒后，3只母猪的生理常数保持未变，直肠的温度在正常参数内(见图1)。三只母猪也都在预定的日期生产。所得结果概括在表IV中。
表IV妊娠母猪接种减毒病毒后对后代的影响
母猪参考号 接种减毒病毒     产猪仔数存活              死亡              干尸化 断奶前PRRS引起的死亡数
    1     +     13     0     3     0
    2     +     4     1     0     0
    10     +     16     0     1     0
这三只母猪分别产13、4和16只猪仔。新生猪仔的生命力被认为正常。然而，在两只母猪的后代中发现几只干尸化的猪仔。猪仔的重量变化在所有的个体中都是正常的(见图2)，直到观察期末(45天)都在正常参数范围内。在任一猪仔中均未发现与PRRS病毒感染的有关的虚弱及紊乱。此外，在新生猪仔的血液或血清样品中均未检测到PRRS病毒。
病毒接种21-36天后，在妊娠母猪的血液和血清样品中均未检测到PRRS病毒。所有的事实证明妊娠母猪中的减毒PRRS株无毒害作用。很明确这是对野生型病毒感染的最敏感类型。当用传统的技术在PAM培养物中筛检PRRS病毒存在的时候发现接种后的妊娠母猪所产新生猪仔的血清样品为阴性。用减毒病毒接种的三只母猪产后45天体液中抗体的IPMA滴度为1/480，这一滴度很稳定，45天之后稍微有些变化。母猪在接种21天之后血清呈阳性，如图3中所能见到的，感染母猪所产猪仔在初次吸乳之后出现血清阳性，这种情况至少能持续到75天龄。
在一组12只怀孕至倒数第三周的母猪中进行了另外的无毒试验，八只母猪肌内接种39疫苗剂量(105 TCID50)剩余的四只作对照以评价减毒株对生殖参数的影响。接种的母猪的生理参数无变化，并且这些猪在预定日期生产。结果如表V所示。如在表中所能见到的。接种了的母猪和作为对照的四只母猪均产下正常数目的猪仔。猪仔也有正常的生命力。
表V接种减毒病毒对怀孕至倒数第三周的母猪的生殖参数的影响
母猪的参考号 接种的 与预产期的偏差(天) 存活的猪仔数 体重低于平均体重的猪仔数 衰弱猪仔的数量 死产猪仔的数目 干尸化猪仔的数量 猪仔总数
    85     是   1(+)     11     1     0     1     0     12
    94     是     0     9     0     0     0     1     10
    96 是   1(+)     13     2     1     0     0     13
    102     是   2(+)     13     1     0     1     2     16
    116 是     0     10     0     0     1     0     11
    121     是   1(+)     11     0     0     1     0     12
    143     是   1(-)     14     2     1     2     1     17
    151     是   2(+)     8     0     0     0     0     8
    76     非   2(+)     7     0     0     0     2     9
    79     非     0     13     2     1     1     0     14
    81     非   1(-)     9     0     1     0     0     9
    83     非   1(-)     10     1     0     1     1     12
    A包括B和C    F＝A+D+E
本发明的减毒株能在PRRS血清阴性的猪中进行有效的复制。这可由这样的事实证明，肌内施用小至200 TCID50的减毒株即可复制并能在猪内诱导血清转化。如在图4中所能见到的，在接种的动物中诱导的抗体至少能持续存在52天。
本发明的减毒病毒并不传播给与肌内接种的八只猪仔放在一起的那四只未接种的标记了的猪仔。病毒不传播给未接种的动物这一事实说明减毒株适宜用作疫苗。而且，在接种的猪中没有发现白细胞减少或任何其它临床症状，这表明当肌内施用时减毒病毒也无毒害作用。接种后11天就有平均86％的接种猪仔出现血清阳性。
本发明的减毒病毒能在接种的猪中诱导保护性免疫应答，这能防止PRRS毒性株感染的临床效应。因此当4周龄的接种猪仔感染毒性病毒时，其中75％没有发现临床症状。但从另一方面来说，如表VI中所能见到的，有80％的未接种的对照猪仔在进行实验性感染后出现直肠温度的显著升高，而且，实验性感染后19天进行尸检，接种猪仔的肺损伤明显低于未接种的对照组。以同样的方式实验性感染后仅在25％的接种动物中发现毒性病毒，而未接种的对照动物中有80％能在感染后至少12天检测到毒性病毒。
表VI感染后接种的对照的猪仔中的高热现象
出现高热的猪仔数/猪仔的总数 高热的天数
接种的猪仔(肌内) 1/4 1
未接种的猪仔 4/5 8
保藏的微生物的资料
根据布达佩斯协定，本发明的病毒毒株和细胞克隆Clon-8均保藏于(法国)巴黎巴斯德研究所的国家微生物培养物保藏中心(CNCM)的国际机构。
申请人识别号  CNCM号    保藏日期
VP-046-BIS    I-1642    23/11/95
Clon-8        I-1643    23/11/95
这些保藏品是在布达佩斯协议规定的状态下为公众可得到的。这并不能解释为允许实施本发明，因为这样将侵犯本发明申请人的权利。

Claims (20)

1.诱发被称作猪生殖和呼吸综合征(PRRS)的猪病的病毒的减毒株，它基本上与95年11月23日保藏于巴斯德研究所CNCM的保藏号为I-1642的保藏物一致。
2.一种保护猪免于被称作猪生殖和呼吸综合征(PRRS)的疾病的疫苗，其特征在于：该疫苗包含权利要求1的病毒株和/或至少一种可由它得到的病毒性抗原。
3.权利要求2的疫苗，其中病毒性抗原是灭活的病毒。
4.权利要求2的疫苗，其特征在于：该疫苗包含102-106TCID50的减毒病毒株。
5.权利要求2或3的疫苗，其中疫苗剂量包含一定的病毒性抗原量，该病毒性抗原量与102-106TCID50的减毒病毒株所产生的量相等。
6.权利要求2-5中任一权项的疫苗，其特征在于：该疫苗包含附加的免疫刺激性佐剂和/或乳化剂和/或稳定剂。
7.权利要求2-6中任一权项的疫苗，其特征在于：该疫苗以单独或组合的形式包含附加的活的或灭活的猪病毒。
8.权利要求2-6中任一权项的疫苗，其特征在于：该疫苗包含附加的活的或灭活的细菌。
9.来源于稳定的猴肾细胞系MA-104的细胞克隆，它基本上与95年11月23日保藏于巴斯德研究所CNCM的保藏号为I-1643的保藏物一致。
10.一种获得PRRS病毒的减毒株的方法，其特征在于：该方法主要包括通过在权利要求9的细胞克隆中连续传代而对毒性株进行修饰。
11.权利要求10的方法，其特征在于：在连续传代中温度保持在34℃。
12.一种制备抗PRRS的活性疫苗的方法，其特征在于：该方法主要包括将权利要求1的病毒株在权利要求9的细胞克隆中繁殖。
13.权利要求12的方法，其特征在于：该方法将病毒株在34℃进行繁殖。
14.权利要求12或13的方法，其特征在于：所获得的减毒株的制剂为水性分散液、油性乳液、脂质体组合物或冻干形式，带有或不带有权利要求6中的佐剂。
15.权利要求12-14中任一权项的方法，其特征在于：所得减毒株被热灭活或化学灭活，直到它被完全灭活。
16.一种PRRS诊断方法，其特征在于：该方法包括权利要求1的减毒株和/或至少一种来源于它的病毒性抗原。
17.一种检测PRRS抗体的方法，该方法包括下列步骤：a)使权利要求1的减毒病毒株适宜在培养微板中的稳定细胞培养物中生长，其方式为每孔用大约20-40个感染性颗粒感染；b)用已知的固定剂把感染的细胞固定在固相上；c)通过在微板中培养猪血清，用IPMA技术对其染色，来检测来自猪血清的抗体；
18.权利要求17的方法，其中稳定的细胞培养物是权利要求9的细胞克隆。
19.权利要求1中的减毒病毒株在制备抗被称作PRRS的猪病的疫苗中的应用。
20.权利要求1中的减毒病毒株在制备检测被称作PRRS的猪病的诊断试剂盒中的应用。
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