CN1653172A - 用于病毒培养的棉鼠肺细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了棉鼠细胞系，棉鼠细胞用于生长、繁殖、或培养生物体、病原体或病毒诸如PRRSV的用途，以及由此产生的生物体、病原体或病毒的用途。

Description

用于病毒培养的棉鼠肺细胞
                 相关申请/引入的参考文献
本申请要求2002年3月20日提交的美国临时申请号60/366,014的优先权，将其收入本文作为参考。由此将上述申请、其中或其申请过程中引用的所有文件(“申请引用的文件”)和申请引用的文件中引用或参考的所有文件、以及本文引用或参考的所有文件(“本文引用的文件”)和本文引用的文件中引用或参考的所有文件、以及本文或收入本文作为参考的任何文件中提及的任何产品的任何制造商说明、描述、产品说明书、和产品清单收入本文作为参考，而且可用于本发明的实践中。
                        发明领域
本发明涉及新的细胞系及其用途，包括用于生成生物体或病原体的方法，诸如病毒，诸如引起称为猪生殖和呼吸综合症(PRRS)的猪疾病的病毒。
更一般的说，本发明涉及生物体或病原体(诸如病毒，如有毒力的或减毒的病毒)的繁殖，即使用棉鼠肺细胞或依照本发明的细胞或细胞系(如保藏细胞或细胞系或具有其鉴定特征的细胞或细胞系)来生产生物体或病原体诸如病毒，如有毒力的或减毒的病毒，诸如通常不以啮齿类或大鼠或棉鼠或棉鼠肺细胞为天然宿主的生物体或病原体如病毒，或RNA病毒，例如正链单链RNA病毒，像Nidovirales目的病毒，例如arteviruses，或动脉炎病毒科(Arteriviridae)的病毒，如乳酸脱氢酶病毒(LDV)、马动脉炎病毒(EAV)、猿出血热病毒(SHFV)、和PRRS病毒(它的载体通常是节肢动物)；冠状病毒科的病毒，如冠状病毒，诸如传染性支气管炎病毒、犬冠状病毒、猫冠状病毒、人冠状病毒229E、猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪呼吸道病毒、牛冠状病毒、人冠状病毒OC43、小鼠肝炎病毒、猪血凝脑脊髓炎病毒、大鼠冠状病毒、涎泪腺炎病毒、禽传染性支气管炎病毒、火鸡冠状病毒、兔冠状病毒(也是载体通常为节肢动物的病毒)，以及Toroviruses，诸如马torovirus、猪torovirus、人torovirus、牛torovirus。
使用棉鼠肺细胞或依照本发明的细胞或细胞系有利繁殖的病毒包括犬副流感病毒(CPI)，如2型CPI(CPI-2)，腺病毒，诸如犬腺病毒(CAV)，如2型犬腺病毒(CAV-2)，猪腺病毒(PAV)，如3型和5型猪腺病毒(PAV-3、PAV-5)，牛疱疹病毒，如1型牛疱疹病毒(传染性牛鼻气管炎(IBR)的原因)，马疱疹病毒(EHV)，如1型(EHV-1)或4型(EHV-4)，牛轮状病毒(BRV)，3型牛副流感病毒(PI-3)，肠道和呼吸道牛冠状病毒(BCV)、猪生殖和呼吸综合症病毒(porcinereproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)。
更有利的是，病毒是PRRS病毒。
而且在相当有利的实施方案中，棉鼠肺细胞或细胞系指保藏于ATCC的PTA-3930、或者具有ATCC PTA-3930的所有鉴定特征的棉鼠肺细胞或细胞系、或者通过培养棉鼠肺细胞并建立细胞系而生成的棉鼠肺细胞或细胞系，其中培养棉鼠肺细胞长达至少10代，如长达至少21代或76代或100代，诸如10代或更多、或者21代或更多、或者76代或更多，如至少10代或21代或76代，而且有利的是长达且包括100代，其中建立细胞系使得棉鼠肺细胞基本上是上皮细胞，并在传代中维持形态学特征。
本发明因此涉及这些细胞或细胞系及其用途。
使用棉鼠肺细胞或依照本发明的细胞或细胞系繁殖的病毒可用于制备针对由病毒诸如PRRSV引起的疾病的免疫原性组合物和疫苗。同样，使用棉鼠肺细胞或依照本发明的细胞或细胞系繁殖的生物体或其它病原体可用于制备针对这些其它病原体或生物体的免疫原性和疫苗组合物。
本发明还涉及通过在依照本发明的细胞上传代而生长的病毒的用途，例如提供减毒的、灭活的和亚单位免疫原性组合物和疫苗；由此，本发明涉及这些减毒的、灭活的或亚单位免疫原性组合物和疫苗。
                       发明背景
1987年在美国北卡罗莱纳州首次描述了猪生殖和呼吸综合症(PRRS)。这种猪疾病当时称为“神秘的猪疾病”或MSD，稍后称为“猪不育和呼吸道综合症”或SIRS。它下次出现于1990年的欧洲中部。在欧洲，该疾病最初称为“猪流行性流产和呼吸道综合症”或PEARS，最后称为“猪生殖和呼吸综合症”或PRRS，这成为全世界接受的命名。
PRRS病毒是有包膜的单链RNA病毒，首次在荷兰分离，并命名为Lelystad病毒。它被分类归入Arterivirdae科的成员。动脉炎病毒科的病毒属于Nidovirales目。Nidovirales目的其它病毒有冠状病毒科的病毒，诸如冠状病毒和toroviruses。
PRRS已经描述于WO92/21375。一份分离物保藏于法国巴黎的巴斯德研究院的国立微生物保藏中心(Collection Nationale de Culture deMicro-organismes，CNCM)，保藏编号I-1102。还分离了病毒的北美型(WO93/03760)，并保藏于美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection，ATCC)，保藏编号VR-2332。
在母猪中，疾病PRRS的特征是生殖紊乱和呼吸症状。PRRS病毒的靶细胞是巨噬细胞。
阻碍获得针对PRRS病毒的免疫学产品的问题之一是用于病毒复制的稳定基质的可获得性有限。
PRRS病毒只能在猪肺泡巨噬细胞(PAM)培养物中扩增(Wensvoort G.等人，The Vet.Quart.，13：121-130，1991)。获得这些巨噬细胞对使用某种年龄的无病猪的需要意味着几项缺点。此外，不能保证回收的PAM对病毒感染的易感性，因为衍生自不同动物的细胞基质总是易变的。这造成了生成恒定且均一品质的大量抗原时的主要缺点，而且每一批都需要评估以测定其易感性。
研究了其它细胞基质。由此，在美国专利号5,476,778中，对由多种物种(如牛、犬、猫、人、猪、猿)和多种组织(如肾、肺、睾丸)获得的15种细胞系测试了PRRS病毒培养。15种细胞系中只有一种容许PRRS病毒的生长。
将猴肾细胞系(例如VERO、MA-104、MARC-145，分别参阅美国专利号5,476,778和WO98/00165)用于PRRS病毒的培养和减毒。但是PRRS病毒在这些细胞上的滴度较低，因而生产成本较高。
尽管灭活的和减毒的PRRS疫苗现在已经商品化，然而用于生产PRRS病毒的候选细胞基质将是极有价值的，如用于生产疫苗或免疫原性组合物。而且，更一般的说，用于生产病原体(诸如病毒，例如RNA病毒，例如正链单链RNA病毒，像Nidovirales目的病毒，诸如arteviruses或动脉炎病毒科的病毒和冠状病毒科的病毒)的候选细胞基质将是极有价值的，如用于生产疫苗或免疫原性组合物。
此外，提供新的棉鼠肺细胞系将是有利的。
                       发明概述
本发明基于下面的发现，即尽管啮齿类不是PRRS病毒的天然宿主，然而来自棉鼠的肺细胞容许PRRS病毒生长或繁殖。还生成并保藏了由棉鼠肺组织衍生的新细胞系。
本发明还基于下面的发现，即来自棉鼠的肺细胞也容许其它病毒生长或繁殖，这些病毒不是啮齿类的天然病原体。这些病毒包括2型犬副流感病毒(CPI-2)、2型犬腺病毒(CAV-2)、1型马疱疹病毒(EHV-1)、4型马疱疹病毒(EHV-4)、牛轮状病毒(BRV)和牛冠状病毒(BCV)。
更一般的说，本发明涉及棉鼠肺细胞或者依照本发明的细胞或细胞系用于繁殖生物体或病原体像病毒的用途，所述病毒如有毒力的或减毒的病毒，诸如通常不以啮齿类或大鼠或棉鼠或棉鼠肺细胞作为天然宿主的病毒，或者是Nidovirales目的病毒，例如arteviruses，或动脉炎病毒科的病毒，如乳酸脱氢酶病毒(LDV)、马动脉炎病毒(EAV)、猿出血热病毒(SHFV)、和PRRS病毒(它的载体通常是节肢动物)；冠状病毒科的病毒，如冠状病毒，诸如传染性支气管炎病毒、犬冠状病毒、猫冠状病毒、人冠状病毒229E、猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪呼吸道病毒、牛冠状病毒、人冠状病毒OC43、鼠肝炎病毒、猪血凝性脑脊髓炎病毒、大鼠冠状病毒、涎泪腺炎病毒、禽传染性支气管炎病毒、火鸡冠状病毒、兔冠状病毒(也是载体通常为节肢动物的病毒)，以及Toroviruses，诸如马torovirus、猪torovirus、人torovirus、牛torovirus。
使用棉鼠肺细胞或依照本发明的细胞或细胞系有利繁殖的病毒包括犬副流感病毒(CPI)，如2型CPI(CPI-2)，腺病毒，诸如犬腺病毒(CAV)，如2型犬腺病毒(CAV-2)，猪腺病毒(PAV)，如3型猪腺病毒(PAV-3)，牛疱疹病毒，如1型牛疱疹病毒(传染性牛鼻气管炎(IBR)的原因)，马疱疹病毒(EHV)，如1型(EHV-1)或4型(EHV-4)，牛轮状病毒(BRV)，3型牛副流感病毒(PI-3或bPI-3)，牛冠状病毒(BCV)，和猪生殖和呼吸综合症病毒(PRRSV)。最有利的是，病毒是PRRS病毒。因此，本发明涉及这些病毒的繁殖或培养或生长。
有些病毒可以在来自棉鼠的肺细胞上生长，诸如1型牛疱疹病毒(BHV-1)(参阅Papp Z.等人，J.Gen.Virol.，1997，78，2933-2943，如第2935页)、3型牛副流感病毒(bPI-3)(参阅Breker-Klassen M.M.等人，J.Virol.，1995，69(7)，4308-4315)、和3型猪腺病毒(PAV-3)(参阅PCT专利申请WO-A3-99/53047)。这些文件未描述或提议这些细胞及由其生成的病毒用于制备灭活的、减毒的或亚单位免疫原性组合物或疫苗的用途及其对动物的施用以及免疫或接种的方法。
本发明还涉及以PTA-3930保藏于ATCC的棉鼠肺细胞或细胞系、或者具有ATCC PTA-3930的所有鉴定特征的棉鼠肺细胞或细胞系、或者通过培养棉鼠肺细胞并建立细胞系而生成的棉鼠肺细胞或细胞系，其中培养棉鼠肺细胞长达至少10代或21代或76代，诸如10代或更多、或者21代或更多、或者76代或更多，如至少10代或21代或76代，而且有利的是长达且包括100代，并且其中建立细胞系使得棉鼠肺细胞基本上是上皮细胞，并在传代中维持形态学特征。
本发明有利的涉及棉鼠肺细胞(CRL细胞)(如由这些细胞生成的细胞系)用于繁殖有毒力的或减毒的PRRS病毒的用途。
本发明还有利的涉及CRL细胞(如由这些细胞生成的细胞或细胞系，诸如本发明的细胞或细胞系，如保藏细胞系或具有其特征的细胞)用于繁殖生物体或病原体诸如病毒的用途，所述病毒例如有毒力的或减毒的病毒，诸如CPI-2、CAV-2、EHV-1、EHV-4、BRV、BCV。
由此，本发明包括用于培养或繁殖病毒的方法，所述病毒诸如PRRSV、CPI-2、CAV-2、PAV-5、EHV-1、EHV-4、BRV、BCV、LDV、EAV、SHFV、传染性支气管炎病毒、犬冠状病毒、猫冠状病毒、人冠状病毒229E、猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪呼吸道病毒、牛冠状病毒、人冠状病毒OC43、小鼠肝炎病毒、猪血凝性脑脊髓炎病毒、大鼠冠状病毒、涎泪腺炎病毒、禽传染性支气管炎病毒、火鸡冠状病毒、兔冠状病毒、马torovirus、猪torovirus、人torovirus、牛torovirus，所述方法包括在适于培养或繁殖的条件下使棉鼠肺细胞接触病毒。该方法还可包括收获由此生成的病毒。对于制备免疫原性或免疫学或疫苗组合物，可以任选将病毒灭活和/或由其分离蛋白质或抗原或表位(对于灭活的或亚单位组合物而言)，并将病毒或亚单位与合适的载体或稀释剂和/或佐剂，如兽医学可接受的或制药学可接受的载体或稀释剂和/或佐剂混合。
术语“免疫原性组合物”和“免疫学组合物”和“免疫原性或免疫学组合物”覆盖引发针对靶病原体的免疫应答的任何组合物；例如在施用或注射到动物(诸如猪)体内后引发针对靶病原体(如PRRS)的免疫应答。术语“疫苗组合物”和“疫苗”覆盖诱导针对靶病原体的保护性免疫应答或提供针对病原体的有效保护的任何组合物；例如在施用或注射到动物(如猪)体内后引发针对靶病原体的保护性免疫应答或提供针对病原体(如PRRS)的有效保护。病原体如病毒的亚单位，由病原体如病毒分离的抗原或免疫原或表位；和亚单位组合物包含由病原体如病毒分离的一种或多种抗体、免疫原或表位或者基本由其组成。
本发明还提供了通过在棉鼠肺细胞或本发明的细胞或细胞系上培养或繁殖获得的生物体或病原体如病毒的培养物，如灭活的、减毒的和亚单位培养物或制备物，所述病毒诸如通常不以啮齿类或大鼠或棉鼠或棉鼠肺细胞作为天然宿主的病毒，例如PRRSV、LDV、EAV、SHFV、传染性支气管炎病毒、犬冠状病毒、猫冠状病毒、人冠状病毒229E、猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪呼吸道病毒、牛冠状病毒、人冠状病毒OC43、小鼠肝炎病毒、猪血凝性脑脊髓炎病毒、大鼠冠状病毒、涎泪腺炎病毒、禽传染性支气管炎病毒、火鸡冠状病毒、兔冠状病毒、马torovirus、猪torovirus、人torovirus、牛torovirus、CPI-2、CAV-2、PAV-5、EHV-1、EHV-4、BRV或BCV，有利的是PRRS病毒、CPI-2、CAV-2、EHV-1、EHV-4、BRV或BCV。
这些培养物与以前的培养物不同，因为它们可不含在不同细胞上繁殖的培养物的污染物，而且可具有与在不同细胞上繁殖的培养物不同的滴度。例如，再次考虑在猪细胞中扩增的PRRS病毒；其培养物易于包含来自猪细胞的污染物，而在CRL细胞上培养的PRRSV很可能不含在猪细胞中发现的污染物。这种分析可以延伸至在用于繁殖PRRSV和其它病毒的其它细胞上培养的PRRSV和其它病毒培养物与本发明中在CRL细胞上培养的病毒培养物的比较，显然本发明的培养物不同于以前的培养物。
本发明还包括针对PRRS疾病或PRRSV的免疫原性组合物和疫苗，它可以由依照本发明的PRRS病毒培养物获得，有利的是活的减毒的免疫原性组合物和疫苗、灭活的免疫原性组合物和疫苗、以及亚单位免疫原性组合物和疫苗。
本发明还包括针对在CRL细胞或本发明的细胞系或细胞上培养或繁殖的其它病原体或生物体的免疫原性组合物和疫苗，如活的减毒的、灭活的、或亚单位组合物或疫苗。这些免疫原性组合物或疫苗可以针对在CRL细胞或本发明的细胞系或细胞上生长、培养、繁殖、诸如此类的任何生物体或病原体或病毒，例如针对任何本文提及的病毒或生物体或病原体，诸如CPI-2、CAV-2、BHV-1、EHV-1、EHV-4、BRV、bPI-3或BCV的免疫原性或疫苗组合物。
本发明包括包含细胞和要在其中培养的病毒或生物体或病原体的试剂盒，有利的是在分开的容器中；甚至更有利的是，分开的容器在相同的包装中；任选的是，试剂盒包括对培养、生长、养育细胞和/或病毒的说明书，且说明书任选包括对收获和/或灭活病毒和/或分离亚单位抗原或免疫原或表位的说明。
本发明还包括联合组合物；例如包含一种或多种本发明疫苗或免疫原性组合物、或者本发明疫苗或免疫原性组合物联合另一种疫苗或免疫原性组合物或活性成分(如灭活的或减毒的病毒或病原体或生物体或其亚单位抗原或免疫原或蛋白质或表位)的组合物。
由此，例如，本发明包括针对猪疾病的免疫原性组合物和疫苗，它包含依照本发明的PRRS和PAV-3病毒培养物的混合物，诸如活的减毒的免疫原性组合物和疫苗、灭活的免疫原性组合物和疫苗、或者亚单位免疫原性组合物和疫苗。PAV-3还可以是重组PAV-3，它包含编码一种或多种外来或异源或外源免疫原、抗原或表位(对于该腺病毒而言是外来、异源或外源的)的一种或多种核酸序列并表达之。可用于实践本发明的重组猪腺病毒载体的实例参见WO99/53047、WO99/08706、WO01/83737和WO00/47756。
另一个实例是本发明包括针对犬疾病的免疫原性组合物和疫苗，它包含依照本发明的CPI-2和CAV-2病毒培养物的混合物，诸如活的减毒的免疫原性组合物和疫苗、灭活的免疫原性组合物和疫苗、或者亚单位免疫原性组合物和疫苗。CAV-2还可以是重组CAV-2，它包含编码一种或多种外来或异源或外源免疫原、抗原或表位(对于该腺病毒而言是外来、异源或外源的)的一种或多种核酸序列并表达之。可用于实践本发明的重组犬腺病毒载体的实例参见美国专利号6,090,393。
又一个实例是本发明包括针对牛疾病的免疫原性组合物和疫苗，它包含依照本发明的至少两种或至少三种或所有四种病毒培养物的混合物，包括BHV-1、BRV、bPI-3和/或BCV，如BHV-1+BRV、BHV-1+BRV+bPI-3、BHV-1+BRV+bPI-3+BCV、BRV+bPI-3、BRV+bPI-3+BCV、bPI-3+BCV、BHV+bPI-3、BHV+bPI-3+BCV、BHV-1+BCV、BRV+BCV，诸如活的减毒的免疫原性组合物和疫苗、灭活的免疫原性组合物和疫苗、或者亚单位免疫原性组合物和疫苗。被认为有利的是针对牛呼吸道疾病的免疫原性组合物和疫苗，它包含包括BHV-1和bPI-3的依照本发明的至少两种病毒培养物的混合物，以及针对牛肠道疾病的免疫原性组合物和疫苗，它包含包括BCV和BRV的依照本发明的至少两种病毒培养物的混合物。
依照本发明的联合组合物的还有一个实例是针对马疾病的免疫原性组合物和疫苗，它包含依照本发明的EHV-1和EHV-4病毒培养物的混合物，诸如活的减毒的免疫原性组合物和疫苗、灭活的免疫原性组合物和疫苗、或者亚单位免疫原性组合物和疫苗。
本发明包括制备这些联合组合物；例如通过混合活性成分，有利是与载体或稀释剂和/或佐剂一起。
本发明还包括用于制备本发明的联合免疫原性或疫苗组合物的试剂盒；例如，在分开的容器中包含(a)生物体、病原体或病毒或其抗原或表位(有利的是本文提及的病毒)以及(b)与(a)不同的生物体、病原体或病毒或其免疫原、抗原或表位(有利的是病毒或其免疫原、抗原或表位，但是也包括本文提及的其它病原体)的试剂盒，任选在相同包装中，且任选附有对混合和/或施用的说明。
本发明还包括通过以足以诱导免疫应答的量对宿主(诸如易于患上由在棉鼠肺细胞或细胞系如本发明的棉鼠肺细胞或细胞系上繁殖的病原体或生物体或病毒如本文提及的病毒引起的疾病的宿主)施用本发明的免疫原性或疫苗组合物(其包含这种灭活的或减毒的病原体或生物体或病毒或其抗原或免疫原或表位)来诱导免疫应答的方法。
由此，本发明提供了以足以引发适当免疫应答的量使用本发明的免疫原性组合物和/或疫苗(如对宿主(如猪)施用免疫原性或疫苗组合物)来针对PRRS疾病或病毒免疫或接种或诱导免疫应答的方法。本发明还提供了以足以引发适当免疫应答的量使用本发明的免疫原性组合物和/或疫苗(如对宿主(如病毒的天然宿主)施用免疫原性或疫苗组合物)来针对CPI-2、CAV-2、BHV-1、EHV-1、EHV-4、BRV、bPI-3或BCV疾病或病毒免疫或接种或诱导免疫应答的方法。
例如在采用混合或联合组合物时，本发明涉及在宿主动物中针对两种或多种不同抗原、表位或病原体或生物体或病毒免疫或接种或引发免疫应答的方法，诸如在猪中针对PRRS和PAV-3疾病，包括施用有效量的本发明的免疫原性组合物和/或疫苗以引发应答。(所述免疫原性组合物和疫苗可以是复数，因为还可以通过顺序施用本发明的组合物或疫苗来实践该方法。)同样，作为另一个实例，本发明涉及使用或施用有效量的本发明的免疫原性组合物和/或疫苗来在犬中针对CPI-2和CAV-2疾病或病毒免疫或接种或引发免疫应答的方法。类似的，本发明提供了使用或施用有效量的本发明的免疫原性组合物和/或疫苗来在牛中针对至少两种或至少三种或至少四种牛疾病或病毒免疫或接种或引发免疫应答的方法。另外，本发明涉及使用或施用本发明的免疫原性组合物和/或疫苗来在牛中针对BHV-1和bPI-3疾病或病毒免疫或接种或引发免疫应答的方法。本发明还涉及使用或施用本发明的免疫原性组合物和/或疫苗来在牛中针对BCV和BRV疾病和病毒免疫或接种或引发免疫应答的方法。而且，本发明涉及使用或施用本发明的免疫原性组合物和/或疫苗来在马中针对EHV-1和EHV-4疾病或病毒免疫或接种或引发免疫应答的方法。
注意，在本公开书中，特别是在权利要求中，术语诸如“包含”、“包括”、“含有”等可以具有美国专利法中赋于它的含义；如它可以指“包括”；而且术语诸如“基本上由...组成”具有美国专利法中赋于它的含义，如它容许未明确叙述的成分，但排除在现有技术中找到的或影响本发明的基本的或新的特征的成分。
下文发明详述公开或启示和涵盖了这些和其它实施方案。
                        发明详述
本发明人开发了使用棉鼠肺细胞生产或繁殖病毒的方法，和新的细胞系；以及生物体或病原体或病毒在这些细胞上的繁殖或生产或培养或生长。
由棉鼠收集肺，并进行酶促消化(如用胰蛋白酶和/或胶原酶)。收集含有解离细胞的上清液，并培养成例如单层或悬浮液。有利的是将细胞在补充胎牛血清(FBS)和/或乳白蛋白水解物(LAH)的极限必需培养基(MEM)中培养成单层。有利的是培养基可以含有抗生素，例如庆大霉素、链霉素和/或青霉素。
在这种肺细胞培养物上培养PRRS病毒。还在这种肺细胞培养物上培养PAV-3、CPI-2、CAV-2、BHV-1、EHV-1、EHV-4、BRV、bPI-3或BCV病毒。
有利的是细胞培养物可以来自这些细胞的几代。有利的是这些细胞的传代容许生成可用于例如繁殖PRRS病毒的细胞系。例如，可以将细胞进行至少10次传代，如10-100次传代。有利的是这些细胞系在胎牛血清(FBS)缺乏的情况下持久生长，尽管单层的建立需要一些FBS或另一种适当的细胞生长因子。
依照本发明的CRL细胞培养物的另一个优点是细胞培养物作为健康单层或悬浮物可以持续至少一个月而无需更换耗尽的培养基或额外的营养补充。这种耐久性赋予了由相同细胞培养物多次收获病毒而无需启动时间(培养物建立)和细胞存量消耗的优势。由此有可能由相同细胞培养物多次收获病毒。在一个实施方案中，培养过程包括两次或多次收获病毒，经过或未经再次接种病毒和/或添加新鲜培养基。有利的是在每次收获后向细胞培养物中添加新鲜的培养基。
遵循该流程，已将棉鼠肺细胞培养了长达76代并建成细胞系。这些棉鼠肺细胞基本上是上皮细胞，并且在传代中维持形态学特征。第21代于2001年12月18日在布达佩斯条约的条款下保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209)，保藏编号ATCC PTA-3930。
在一个实施方案中，本发明涉及棉鼠上皮肺细胞、由其衍生的上皮细胞系诸如细胞系PTA-3930或具有其鉴定特征的细胞系用于生产有毒力的或减毒的PRRS病毒的用途。在其它实施方案中，本发明涉及棉鼠上皮肺细胞、由其衍生的上皮细胞系诸如细胞系PTA-3930或具有其鉴定特征的细胞系用于生产有毒力的或减毒的CPI-2、CAV-2、EHV-1、EHV-4、BRV或BCV病毒的用途。在其它实施方案中，本发明涉及细胞系PTA-3930或具有其鉴定特征的细胞系用于生产有毒力的或减毒的BHV-1或bPI-3病毒的用途。所述细胞系或具有其鉴定特征的细胞系还可用于本文提及的其它病毒。
由此，本发明的另一个方面是生产PRRS病毒的方法，包括在包含上皮细胞的棉鼠肺细胞培养物上，有利的是在棉鼠肺细胞系上培养PRRS病毒。例如，在细胞系PTA-3930或具有其鉴定特征的细胞系上进行病毒生产。这种生产病毒的方法还可用于CPI-2、CAV-2、BHV-1、EHV-1、EHV-4、BRV、bPI-3和BCV病毒，以及本文提及的其它病毒。
病毒可以是有毒力的病毒或减毒的病毒。
病毒生产包括在细胞上接种和繁殖病毒的步骤。在接种前，可以在合适的培养基，例如补充FBS或另一种适当的细胞生长因子的MEM培养基中培养依照本发明的细胞。有利的是在35-39℃之间的温度进行细胞培养，有利的是37℃左右。有利的是细胞培养物是单层。或者细胞培养物是悬浮物。一般而言，在以单层培养的细胞汇合时接种病毒。胞外病毒可以由上清液直接回收。胞内病毒可以在适当破坏细胞后回收，例如通过冻融或超声处理。在悬浮细胞培养物的情况中，可以在例如过滤滤液后回收病毒。可以在接种后2-15天、诸如3-7天、更有利的是5-7天回收病毒。依照关于病毒生产领域熟练技术人员的一般知识进行病毒生产。此阶段获得病毒的粗培养物。
本发明中所使用的培养基可以补充抗生素。
如果需要，使病毒如PRRS病毒适应依照本发明的细胞上的生长。适应可以通过在依照本发明的细胞和猴肾细胞诸如MA-104上共培养来进行。众所周知，适应就是通过在逐渐增加依照本发明细胞的量的共培养物上连续传代来进行的。这种适应也可用于CPI-2、CAV-2、BHV-1、EHV-1、EHV-4、BRV、bPI-3或BCV病毒，以及本文提及的其它病毒。
粗培养物可以浓缩和/或纯化。
浓缩可以通过本领域熟练技术人员知道的任何常规方法来进行，例如选择性沉淀或超滤。纯化可以通过本领域熟练技术人员知道的任何常规方法来进行，例如超速离心或层析方法，如凝胶过滤。此阶段得到病毒的浓缩培养物、纯化培养物或浓缩且纯化的培养物。
在本发明的另一个方面，可以通过任何常规方法例如热和/或化学方法来灭活依照本发明的病毒培养物(粗的、浓缩的、纯化的、或浓缩且纯化的)。有利的方法是化学灭活，例如使用β-丙酸内酯、福尔马林、乙烯亚胺或其衍生物诸如二元乙烯亚胺(binary ethylenimine，BEI)以及这些灭活化合物的联合。此阶段得到灭活的PRRS病毒培养物。
在本发明的另一个方面，可以由依照本发明的病毒培养物(粗的、浓缩的、纯化的、或浓缩且纯化的，任选灭活的)中存在的病毒提取免疫原性部分像糖蛋白或蛋白质。病毒免疫原性部分的提取是依照本领域熟练技术人员的一般知识进行的。此阶段得到亚单位病毒制备物。
由此本发明的其它方面是本文描述的病毒粗培养物、浓缩培养物、纯化培养物、浓缩且纯化的培养物、灭活培养物、亚单位制备物。
在本发明的一个有利实施方案中，可以通过在依照本发明的细胞上足够次数的传代将有毒力的病毒减毒。本领域熟练技术人员能够通过常规实验来确定足以使病毒减毒的传代次数。得到减毒的病毒制备物。
本发明的另一个目标是提供用于预防病毒感染的免疫原性组合物和疫苗。这些免疫原性组合物或疫苗包含至少一种本文所述培养物或制备物。
术语“免疫原性组合物”在本文中覆盖一旦施用于动物如猪则能够引发针对病毒或抗原或免疫原或表位的免疫应答的任何组合物。术语“疫苗”在本文中覆盖一旦施用于动物如猪则能够诱导针对病毒的保护性免疫应答或给动物提供针对所述病毒的有效保护的任何组合物。
依照本发明的免疫原性组合物或疫苗可以包含病毒培养物或制备物或病毒的抗原或免疫原或表位，以及另一种病原体的至少一种免疫原、抗原或表位或另一种病原体(如灭活的或减毒的病原体)。这种免疫原、抗原或表位可以是例如细菌的、或寄生虫或病毒来源的，或者是病原体的灭活或减毒形式。本发明还包括用于制备这些联合组合物的试剂盒，以及用于生产这些联合组合物的方法和这些联合组合物的成分用于制备联合组合物的用途。因此，本发明涉及用于制备本发明的联合免疫原性或疫苗组合物的试剂盒；例如，在分开的容器中包含(a)生物体、病原体或病毒或其抗原或表位(有利的是本文提及的病毒)以及(b)与(a)不同的生物体、病原体或病毒或其免疫原、抗原或表位(有利的是病毒或其免疫原、抗原或表位，但是也包括本文提及的其它病原体)的试剂盒，任选在相同包装中，且任选附有对混合和/或施用的说明。
依照本发明的免疫原性组合物和/或疫苗可以包含PRRS病毒培养物或制备物(如灭活的或减毒的PRRSV或其免疫原或抗原或表位)，以及另一种猪病原体的至少一种免疫原、抗原或表位(包括但不限于灭活或减毒形式的病原体)。这种病原体可以选自但不限于下组：假狂犬病病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、传染性胃肠炎病毒(冠状病毒)、猪环状病毒诸如2型猪环状病毒、轮状病毒、3型猪轮状病毒、大肠杆菌(Escherichia coli)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、支气管败血性博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、梭菌(Clostridiumspp.)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、猪链球菌(Streptococcus suis)、猪肺炎枝原体(Mycoplasma hyopneumoniae)和大叶性肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)。有利的是，依照本发明的免疫原性组合物和疫苗可以包含在依照本发明的细胞或细胞系如PTA-3930细胞系或具有其所有鉴定特征的细胞系上生长和繁殖的PRRS病毒培养物或制备物和PAV-3病毒。猪病原体的免疫原可以包括假狂犬病病毒gB、假狂犬病病毒gC、假狂犬病病毒gD、猪流感HA、猪流感NA、猪流感NP、猪生殖和呼吸综合症病毒的ORF4、猪生殖和呼吸综合症病毒的ORF7、PRRSV的ORF5、PRRSV ORF3、PRRSVORF6、PRRSV开放读码框5(ORF5)和6(ORF6)、PRRSV开放读码框5(ORF5)和3(ORF3)和6(ORF6)、猪瘟病毒E1、猪瘟病毒E2基因、细小病毒VP2、2型猪环状病毒ORF1、或2型猪环状病毒ORF2。关于猪病原体的免疫原及编码它们的核酸分子和表达它们的构建物请参考美国专利号6,517,843、6,497,883、6,391,314、6,379,676、6,217,883、6,207,165和美国专利公开物2003003112和WO99/53047、WO99/08706、WO01/83737、和WO00/47756。由此，本发明还涉及用于生产这些组合物的方法以及试剂盒。
依照本发明的免疫原性组合物和疫苗可以包含CPI-2和/或CAV-2病毒培养物或制备物(如灭活的或减毒的CPI-2和/或CAV-2或其免疫原或抗原或表位)，以及另一种犬病原体的至少一种免疫原、抗原或表位(包括但不限于病原体的灭活或减毒形式)。这种病原体可以选自但不限于下组：犬瘟病毒、犬细小病毒、犬冠状病毒、犬疱疹病毒、莱姆病病原体、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)和狂犬病病毒。有利的是，依照本发明的免疫原性组合物和疫苗包含依照本发明的CPI-2病毒培养物或制备物和/或CAV-2病毒培养物或制备物。CPI-2免疫原可以是CPI-2F和/或HN。关于犬病原体的免疫原及编码它们的核酸分子和表达它们的构建物还可参阅美国专利号5,616,326、6,090,393、6,159,477、6,228,846。由此，本发明还涉及用于制备这些组合物的方法以及试剂盒。
依照本发明的免疫原性组合物和疫苗可以包含BHV-1、BRV、bPI-3和/或BCV病毒培养物或制备物(如灭活的或减毒的BHV-1、BRV、bPI-3和/或BCV或其免疫原或抗原或表位)，以及另一种牛病原体的至少一种免疫原、抗原或表位(包括但不限于病原体的灭活或减毒形式)。这种病原体可以选自但不限于下组：牛呼吸道合胞病毒和牛病毒性腹泻病毒。有利的是，依照本发明的免疫原性组合物和疫苗包含包括BHV-1、BRV、bPI-3或BCV的至少两种依照本发明的病毒培养物或制备物。BRSV免疫原可以是BRSV F或G或N，诸如BRSV F和/或G或N和/或G。BHV-1免疫原可以是gB和/或gC和/或gD。BVDV免疫原可以是E0蛋白质(gp48)和/或E2蛋白质(gp53)。BVDV可以是1型和/或2型。bPI-3免疫原可以是bPI-3 F和/或HN。关于牛病原体的免疫原及编码它们的核酸分子和表达它们的构建物还可参阅美国专利号6,451,770、6,376,473、6,224,878。由此，本发明还涉及用于制备这些组合物的方法以及试剂盒。
依照本发明的免疫原性组合物和疫苗可以包含EHV-1和/或EHV-4病毒培养物或制备物(如灭活的或减毒的EHV-1和/或EHV-4或其免疫原或抗原或表位)，以及另一种马病原体的至少一种免疫原、抗原或表位(包括但不限于病原体的灭活或减毒形式)。这种病原体可以选自但不限于下组：马流感病毒、东部脑脊髓炎病毒(EEV)、西部脑脊髓炎病毒(WEV)、委内瑞拉脑脊髓炎病毒(VEV)、莱姆病病原体、布氏疏螺旋体、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、马动脉炎病毒(EAV)和狂犬病病毒。有利的是，依照本发明的免疫原性组合物和疫苗可以包含依照本发明的EHV-1病毒培养物或制备物和EHV-4病毒培养物或制备物。EHV糖蛋白可以是gB、gD、gB+gD、gC、和gE。关于马病原体的免疫原及编码它们的核酸分子和表达它们的构建物请参考美国专利号6,207,166和6,368,603。由此，本发明还涉及用于制备这些组合物的方法以及试剂盒。
还包含这种额外免疫原性成分(额外的免疫原、抗原或表位)的依照本发明的免疫原性组合物或疫苗具有同时诱导针对几种传染或疾病或其病原体的免疫应答或保护作用的优点。这种额外免疫原性成分可以是减毒的或灭活的微生物、重组构建物或亚单位(如蛋白质、糖蛋白、多肽、或表位)。表位确定方法，诸如构建交叠肽库(Hemmer B.等人，Immunology Today，1998，19(4)：163-168)、Pepscan(Geysen H.M.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，1984，81(13)，3998-4002；GeysenH.M.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，1985，82(1)，178-182；Vander Zee R.等人，Eur.J.Immunol.，1989，19(1)，43-47；Geysen H.M.，Southeast Asian J.Trop.Med.Public Health，1990，21(4)，523-533；Multipin Peptide Synthesis Kits de Chiron)和算法(De Groot A.等人，Nature Biotechnology，1999，17，533-561)，可在本发明的实践中用于无需过多实验就确定免疫原、抗原、多肽、糖蛋白等的表位。根据该信息，可以构建编码这种表位的核酸分子；而且根据该知识和本领域的知识，可以构建表达免疫原、表位或抗原的载体或构建物如重组病毒或载体或质粒；都无需过多实验。
免疫原性组合物或疫苗组合物还包含制药学或兽医学可接受赋形剂、稀释剂或载体，以及任选的稳定剂和/或佐剂。合适制剂对于任何本领域熟练技术人员而言都是显然的。可以为任何合适施用途径开发制剂。
制药学可接受载体可以是水或盐水。
灭活的免疫原性组合物或灭活的疫苗有利包含至少一种佐剂。
可以将活的减毒的病毒冻干，有利的是与稳定剂一起。冻干可以依照众所周知的标准冻干流程进行。制药学可接受稳定剂可以是SPGA(蔗糖、磷酸盐、谷氨酸盐、清蛋白)(Bovarnik等人，J.Bacteriology，1950，59，509)、碳水化合物(如山梨醇、甘露醇、乳糖、蔗糖、葡萄糖、右旋糖苷、海藻糖)、谷氨酸钠(Tsvetkov T等人，Cryobiology，1983，20(3)，318-323；Israeli E等人，Cryobiology，1993，30(5)，519-523)、蛋白质诸如蛋白胨、清蛋白或酪蛋白、含蛋白质的物质诸如脱脂奶(Mills CK等人，Cryobiology，1988，25(2)，148-152；Wolff E等人，Cryobiology，1990，27(5)，569-575)、和缓冲剂(如磷酸盐缓冲剂、碱金属磷酸盐缓冲剂)。
佐剂可用于使冻干制剂可溶。
佐剂的实例是基于矿物油和/或植物油和非离子表面活性剂诸如嵌段共聚物、Tween、Span的水包油、水包油包水乳化液。其它合适佐剂是例如维生素E、皂角苷、Carbopol、氢氧化铝、磷酸铝或氧化铝(“Vaccine Design，The subunit and adjuvant approach”，Pharmaceutical Biotechnology(制药学生物技术)，第6卷，Michael F.Powell和Mark J.Newman编，1995，Plenum出版社，纽约)。这里引用的文件同样可用作佐剂以及赋形剂、稀释剂、载体和媒介的参考文献。
本发明的另一个方面是分别使用依照本发明的免疫原性组合物或疫苗组合物的免疫方法或接种方法。
该方法包括至少一次对动物施用有效量的依照本发明的免疫原性组合物或疫苗。动物可以是雄性、雌性、怀孕的雌性和新生的。这种施用特别可以是通过肌肉内(IM)、皮内(ID)或皮下(SC)注射或者通过鼻内或口服施用来进行的。可以通过注射器或无针装置(像例如Pigjet或Biojector(Bioject，俄勒冈，美国))来施用依照本发明的免疫原性组合物或疫苗。
对于减毒组合物，在新细胞培养物上生产的病毒或生物体或病原体的剂量可以在大约103-大约107 CCID50(中间细胞培养物感染剂量)之间，有利的是在大约104-大约106 CCID50之间，更有利的是大约105CCID50。体积是0.2-2.0ml，有利的是大约2.0ml。可以进行一次或多次施用；如两次注射，间隔2-4周，有利的是在首次注射后大约3周进行一次加强注射。
对于在新细胞培养物上生产的病毒或生物体或病原体的灭活组合物，可以在单剂剂量单位中对动物施用大约104-109当量CCID50(灭活前的滴度)，有利的是大约105-108当量CCID50。单剂剂量单位的体积可以是0.2-5.0ml，有利的是0.5-2.0ml，更有利的是大约2.0ml。可以进行一次或多次施用；如两次注射，间隔2-4周，有利的是在首次注射后大约3周进行一次加强注射。
对于亚单位组合物，如来自在新细胞培养物上生产的病毒或病原体或生物体，可以对动物施用大约5μg-500μg，有利的是20μg-50μg。体积是0.2-2.0ml，有利的是大约2.0ml。可以进行一次或多次施用；如两次注射，间隔2-4周，有利的是在首次注射后大约3周进行一次加强注射。
依照本发明的组合物还可以施用于其它哺乳动物，如小鼠或实验室动物，例如用于生成多克隆抗体或用于制备杂交瘤(为了单克隆抗体)。
通过下面的非限制性实施例将进一步描述本发明。
                           实施例
              实施例1：获得棉鼠肺(CRL)细胞
由无痛致死动物切下后，将肺置于含有极限必需培养基F-15(MEMF-15，Hyclone，目录编号SH30024.02)和30μg/ml庆大霉素的细胞培养基中。该培养基补充了2％v/v浓度的商品化抗生素(青霉素和链霉素)和抗真菌素(两性霉素(amphotercin)B)。将肺在装有25ml含有30μg/ml庆大霉素的MEM F-15的50ml圆锥形离心管中于37℃进行消化，溶液中胶原酶(Sigma，目录编号L-0130)和胰蛋白酶(Sigma，目录编号T-8003)的浓度分别为1mg/ml和1X强度(对应于2.5mg/ml的浓度)。消化30分钟后，添加胎牛血清(FBS)(Bio Whittaker)至终浓度10％v/v。使用移液管将细胞吹散并澄清后，收集含有解离细胞的上清液并涂布到装有MEM F-15培养基的25cm2烧瓶中，其中含有30μg/ml庆大霉素并补充FBS至终浓度10％v/v的。
                   实施例2：培养CRL细胞
用胰蛋白酶溶液漂洗除去实施例1中得到的CRL细胞汇合(铺满)单层上残余的FBS。将用0.1％(1X)猪胰蛋白酶与乙二胺四乙酸(EDTA)(JRH Biosciences，目录编号62244-79P)的混合物(75cm2烧瓶用3ml，150cm2烧瓶用5ml)覆盖的细胞置于37℃培养箱中，并密切监视直至完成细胞脱离。使用移液管吹散细胞，并收集3ml细胞悬浮液。此时，用含有MEM F-15、浓度30μg/ml庆大霉素、浓度10％FBS v/v的新鲜细胞培养基培养1∶4的收集细胞。
让CRL细胞在37℃、5％CO2分压的培养箱中生长。1∶4分割的汇合单层在大约4天后汇合，而1∶8的分割在大约7天内生成汇合单层。这构成一次传代。
然后将细胞繁殖2代-76代。
添加二甲亚砜(DMSO)防冻剂后，将直至76代的所有传代的小型库存冷冻。将库存保存于液氮中。
CRL细胞的21代保藏于美国典型培养物保藏中心，编号ATCCPTA-3930。
               实施例3：在CRL细胞上繁殖PRRS病毒
使用已知在猴肾细胞上繁殖的减毒PRRS病毒。
在装有50ml培养基的75cm2烧瓶(T75烧瓶)中在CRL细胞的单层上进行PRRS病毒的繁殖，其中培养基含有MEM F-15，庆大霉素浓度30μg/ml且FBS v/v浓度10％。接种病毒前，将细胞于37℃保温24小时，直至它们汇合。接种1ml PRRS病毒后，将接种后的细胞于37℃保温5-7天。通过间接免疫荧光抗体测试(IFA)和上清液滴定来检查病毒生长。冻融后，收获上清液。这构成PRRS病毒的粗培养物。
间接免疫荧光抗体测试(IFA)
为了IFA，将细胞进行胰蛋白酶消化、分散、收集和重悬于含有30μg/ml庆大霉素并补充FBS至浓度10％v/v的新鲜MEM F-15培养基中。以100μl/孔将细胞接种到96孔组织培养处理板中，并让其生长过夜至汇合。制备PRRS病毒的4倍连续稀释液。然后，将100μl或200μl稀释病毒加到96孔板的某一排的每个孔中。将板在37℃、5％CO2的培养箱中保温7天。通过间接免疫荧光抗体测试(IFA)使用抗PRRS病毒单克隆抗体(SDOW 17，得自USDA；Magar R.等人，Can J vet Res，1995，59(3)，232-234)测定含有受感染CRL细胞的孔。
在CRL细胞上生长的PRRS病毒的表征
在含有CRL细胞的96孔板中滴定PRRS病毒。使用Spearman-Karber的50％终点测定法计算滴度，并以每ml为基础报告。结果表述成Log10(FAID50)/ml。以Log10(FAID50)/ml表示的滴定结果是4.3。
        实施例4：使PRRS病毒适应CRL上的生长和繁殖
使NADC 8 PRRS病毒适应在CRL细胞上的生长。NADC 8得自国家动物疾病中心(National Animal Disease Center，USDA)。
在MA-104细胞数量逐渐减少的CRL细胞与MA-104细胞(非洲绿猴肾细胞，MARC-145的亲本细胞系)的共培养物上连续繁殖病毒。首先于37℃在含乳白蛋白水解物(LAH，v/v浓度0.1％)、庆大霉素(浓度30μg/ml)和FBS(v/v浓度10％)的MEM F-15中以1∶9的比例接种CRL细胞与MA-104细胞(20,000个CRL细胞/ml∶180,000个MA-104细胞/ml)。当这些共培养物汇合后，接种PRRS病毒(每个T75烧瓶1ml)，无需补充任何培养基。通过间接免疫荧光抗体测试(IFA，如实施例3中所述)和上清液滴定来检查病毒生长。将接种后的细胞于37℃保温5-7天。传代包括冻融、收获上清液、及随后连续共培养T75烧瓶接种1ml，即收获的上清液的大约10％。通过将接种物在比例分别为2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、和9∶1的CRL∶MA-104共培养物上传代来重复这一过程。
最后，在装有含MEM F-15、庆大霉素(浓度为30μg/ml)和FBS(v/v浓度为10％)(不含LAH)的50ml培养基的T75烧瓶中使病毒在只由CRL细胞组成的单层上生长。将接种后的CRL细胞于37℃保温5-7天。冻融后，收获上清液。这构成PRRS病毒的粗培养物。
IFA显示NADC 8感染了CRL细胞。
在CRL培养物上生长的PRRS病毒的鉴定：
在含有CRL细胞的96孔板中滴定PRRS病毒NADC 8株。如上所述进行培养。使用Spearman-Karber的50％终点测定法计算滴度，并以每ml为基础报告。结果表述成Log10(FAID50)/ml。
以Log10(FAID50)/ml表示的滴定结果是4.12。
可以采用本文所述技术或本文关于PRRS所述的那些技术的类似技术使其它病毒适应在棉鼠肺细胞，有利的是本发明的棉鼠肺细胞或细胞系(如保藏的那些)上生长，病毒诸如Nidovirales目的其它病毒，例如arteviruses，或动脉炎病毒科的病毒，如乳酸脱氢酶病毒(LDV)、马动脉炎病毒(EAV)、猿出血热病毒(SHFV)，冠状病毒科的病毒，如冠状病毒诸如传染性支气管炎病毒、犬冠状病毒、猫冠状病毒、人冠状病毒229E、猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪呼吸道病毒、牛冠状病毒、人冠状病毒OC43、鼠肝炎病毒、猪血凝性脑脊髓炎病毒、大鼠冠状病毒、涎泪腺炎病毒、禽传染性支气管炎病毒、火鸡冠状病毒、兔冠状病毒，Toroviruses诸如马torovirus、猪torovirus、人torovirus、牛torovirus、和通常不以啮齿类或大鼠或棉鼠为宿主的其它病毒。
                     实施例5：灭活方法
收获在CRL上繁殖的PRRS病毒(实施例3或4)。在大约5℃超声处理病毒悬浮液。在大约5℃将病毒悬浮液滤过50-100μm孔径的滤膜。
向病毒悬浮液中添加β-丙酸内酯至终浓度1/3000(v/v)。搅匀后，将悬浮液转移到另一个无菌烧瓶中。
在大约5℃搅动24小时而进行灭活。添加1M NaOH，将pH调至大约7.2。
通过大约50次超滤来浓缩灭活的病毒悬浮液。将浓缩的病毒悬浮液保存于-40℃。
      实施例6：制备基于矿物油的乳状液形式的灭活疫苗
依照下面的配方，使用实施例5中获得的灭活PRRS病毒(融化并稀释后)制备疫苗：
-灭活PRRS病毒的悬浮液：             167ml
-油相：                             83ml
油相：7％质量体积(w/v)脱水甘露醇油酸酯、8％w/v乙氧基化油酸(11氧化乙烯)、和85％v/v轻液体石蜡油(依照欧洲药典)。
分别将水相和油相过滤除菌。借助Silverson涡轮乳化器，通过将各种成分混合并匀浆来制备乳状液。
一个疫苗剂量含有大约107.5CCID50(灭活前的滴度)。对于肌肉内途径的施用，一个疫苗剂量的体积是2.0ml。
               实施例7：在CRL细胞上繁殖病毒
使用CRL细胞滴定在测定中常规用作参照病毒且可获得荧光抗体(FA)试剂的病毒储液。因为这些参照病毒已经使用标准细胞系进行了常规滴定，所以每一种都具有各种变化程度的已知滴度。使用标准滴定方法，将这些参照病毒的每一种病毒的10倍或4倍稀释液用于接种96孔板中的CRL细胞。保温7天后，将平板用丙酮固定，并用适当的FA试剂染色。将荧光阳性培养物的滴度与由标准细胞培养物获得的滴度进行比较。结果如下：
参考病毒 滴度/CRL  滴度/标准细胞系
2型犬副流感病毒(CPI-2) 4.96  5.6/MDCK细胞
2型犬腺病毒(CAV-2) 1.72  5.8/MDCK细胞
1型牛疱疹病毒(BHV-1) 3.64  7.1/MDBK细胞
1型马疱疹病毒(EHV-1) 5.74  未测定滴度
4型马疱疹病毒(EHV-4) 5.44  6.13/Vero细胞
牛轮状病毒(BRV) 5.32  6.0/MA-104细胞
3型牛副流感病毒(bPI-3) 6.46  7.0/MDBK细胞
牛冠状病毒(BCV) 3.52  4.79/MDBK细胞
猪生殖和呼吸综合症病毒(PRRSV) 5.22  5.34/MARC-145细胞
病毒滴度表示成每毫升细胞培养物感染剂量50的log10(log10CCID50/ml)。
尽管在每种情况中，通过基于CRL的测定法产生的滴度低于标准细胞系的滴度，然而必须强调的是这些病毒未经过使用CRL细胞的细胞适应过程，而参照病毒在标准细胞系上进行过适应过程。这只是用于检测任何病毒复制的测试。换言之，通过一定的努力，很有可能能够将在CRL细胞上生长的活病毒浓度提高到等同或好于在适应的细胞系上生长的病毒浓度。适应CRL的PRRS(实施例4)证明了这一点，在使用CRL细胞和MARC-145细胞(MA-104细胞的敏感亚克隆)时，病毒相同连续稀释度的滴度分别是5.22和5.34(log10CCID50/ml)。滴度的这种差异是可以忽略的。
下面的编号段落进一步描述了本发明：
1.产生PRRS病毒的方法，其中制备棉鼠肺细胞培养物，并在该细胞培养物上繁殖PRRS病毒。
2.依照第1段的方法，其中细胞培养物包括上皮细胞。
3.生产PRRS病毒的方法，包括由棉鼠肺细胞系制备细胞培养物，并在该培养物上繁殖PRRS病毒。
4.依照第3段的方法，其中培养物包括上皮细胞。
5.生产PRRS病毒的方法，包括制备棉鼠肺上皮细胞培养物，并在该细胞培养物上繁殖PRRS病毒。
6.生产PRRS病毒的方法，包括由棉鼠肺上皮细胞系制备细胞培养物，并在该细胞系上繁殖PRRS病毒。
7.依照第3或6段的方法，其中细胞系是以编号PTA-3930保藏于ATCC的细胞系，或者是具有以编号PTA-3930保藏于ATCC的细胞系的所有鉴定特征的棉鼠肺细胞系。
8.依照第7段的方法，其中细胞系是以编号PTA-3930保藏于ATCC的细胞系。
9.依照第1-8段之任一的方法，其中PRRS病毒是有毒力的PRRS病毒。
10.依照第1-8段之任一的方法，其中PRRS病毒是减毒的PRRS病毒。
11.依照第1-8段之任一的方法，其中在细胞上繁殖PRRS病毒，并回收PRRS病毒的粗培养物。
12.依照第1-8段之任一的方法，其中在细胞上繁殖PRRS病毒，回收PRRS病毒得到PRRS病毒的粗培养物，并由该粗培养物纯化得到PRRS病毒的纯化培养物。
13.依照第1-8段之任一的方法，其中在细胞上繁殖PRRS病毒，回收PRRS病毒得到PRRS病毒的粗培养物，并由该粗培养物浓缩得到PRRS病毒的浓缩培养物。
14.依照第1-8段之任一的方法，其中在细胞上繁殖PRRS病毒，回收PRRS病毒得到PRRS病毒的粗培养物，并由该粗培养物浓缩和纯化得到PRRS病毒的浓缩且纯化的培养物。
15.依照第11段的方法，包括灭活粗培养物。
16.依照第12段的方法，包括灭活纯化培养物。
17.依照第13段的方法，包括灭活浓缩培养物。
19.依照第14段的方法，包括灭活浓缩且纯化的培养物。
20.依照第15、16、17或18段的方法，包括用化学试剂灭活培养物。
21.依照第19段的方法，其中化学试剂选自：β-丙酸内酯、福尔马林、乙烯亚胺和二元乙烯亚胺。
22.依照第11、12、13、14、15、16、17、18、19或20的方法，其中处理培养物以回收PRRS亚单位。
23.依照第9段的方法，包括在细胞上繁殖PRRS病毒，并回收减毒的PRRS病毒。
24.在棉鼠肺细胞上繁殖PRRS病毒后得到的PRRS病毒或PRRS病毒的培养物。
25.在棉鼠肺细胞系上繁殖PRRS病毒后得到的PRRS病毒或PRRS病毒培养物。
26.依照第23或24段的PRRS病毒或PRRS病毒培养物，其中细胞是上皮细胞。
27.依照第23或24段的PRRS病毒或PRRS病毒培养物，其中细胞包括上皮细胞。
28.依照第25段的PRRS病毒或PRRS病毒培养物，其中细胞系是以编号PTA-3930保藏于ATCC的细胞系，或者是具有以编号PTA-3930保藏于ATCC的细胞系的所有鉴定特征的棉鼠肺细胞系。
29.依照第25段的PRRS病毒或PRRS病毒培养物，其中细胞系是以编号PTA-3930保藏于ATCC的细胞系。
30.通过执行第1-20或22段之任一的方法而得到的PRRS病毒或PRRS病毒培养物。
31.依照第23-28段之任一的PRRS病毒或PRRS病毒培养物，其是灭活的。
32.依照第23-28段之任一的PRRS病毒或PRRS病毒培养物，其是减毒的。
33.通过执行第21段的方法而得到的亚单位PRRS病毒制备物。
34.包含依照第23-31段之任一的PRRS病毒或PRRS病毒培养物以及兽医学可接受赋形剂、稀释剂或载体的免疫原性组合物。
35.包含依照第32段的亚单位PRRS病毒制备物以及兽医学可接受赋形剂、稀释剂或载体的免疫原性组合物。
36.第33段的免疫原性组合物，还包含稳定剂。
37.第33或34或35段的免疫原性组合物，还包含佐剂。
38.包含通过依照第1段的方法得到的PRRS病毒培养物的免疫原性组合物。
39.包含通过依照第3段的方法得到的PRRS病毒培养物的免疫原性组合物。
40.包含通过依照第1-22段之任一的方法得到的PRRS病毒培养物的免疫原性组合物。
41.包含通过依照第1段的方法得到的PRRS病毒培养物的疫苗。
42.包含通过依照第3段的方法得到的PRRS病毒培养物的疫苗。
43.包含通过依照第1-22段之任一的方法得到的PRRS病毒培养物的疫苗。
44.包含依照第23-31段之任一的PRRS病毒或PRRS病毒培养物以及兽医学可接受赋形剂、稀释剂或载体的疫苗。
45.包含依照第32段的亚单位PRRS病毒制备物以及兽医可接受赋形剂、稀释剂或载体的疫苗。
46.第43段的疫苗，还包含稳定剂。
47.第43或44或45段的疫苗，还包含佐剂。
48.给猪免疫的方法，包括对猪施用依照第33-39段之任一的免疫原性组合物。
49.给猪接种的方法，包括对猪施用依照第40-46段之任一的疫苗。
50.以编号PTA-3930保藏于ATCC的棉鼠肺细胞系或具有以编号PTA-3930保藏于ATCC的细胞系的所有鉴定特征的棉鼠肺细胞系。
51.以编号PTA-3930保藏于ATCC的棉鼠肺细胞系。
由此详细描述本发明的优选实施方案后，应当理解，由上述段落定义的本发明不限于上述说明书中所列出的具体细节，因为有可能对它们进行许多明显的变化且不违背本发明的精神或范围。

Claims (28)

1.棉鼠细胞系ATCC PTA-3930或具有其所有鉴定特征的细胞系。
2.权利要求1的细胞系，它是ATCC PTA-3930。
3.用于生产病原体、生物体或病毒的方法，包括在权利要求1或2的细胞系的细胞上繁殖病原体、生物体或病毒。
4.权利要求3的方法，其中所述病原体、生物体或病毒是病毒，其中病毒是乳酸脱氢酶病毒(LDV)、马动脉炎病毒(EAV)、猿出血热病毒(SHFV)、猪生殖和呼吸综合症病毒(PRRSV)、传染性支气管炎病毒、犬冠状病毒、猫冠状病毒、人冠状病毒229E、猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪呼吸道病毒、牛冠状病毒(BCV)、人冠状病毒OC43、鼠肝炎病毒、猪血凝性脑脊髓炎病毒、大鼠冠状病毒、涎泪腺炎病毒、禽传染性支气管炎病毒、火鸡冠状病毒、兔冠状病毒、马torovirus、猪torovirus、人torovirus、牛torovirus、犬副流感病毒(CPI)、腺病毒、牛疱疹病毒(BHV)、马疱疹病毒(EHV)、牛轮状病毒(BRV)、或3型牛副流感病毒(bPI-3)。
5.权利要求4的方法，其中病毒是PRRSV、2型CPI、2型犬腺病毒、3型猪腺病毒、BHV-1、EHV-1、EHV-4、bPI-3、BRV或BCV。
6.权利要求5的方法，其中病毒是PRRSV。
7.包含权利要求5的病毒或其免疫原、抗原、表位的免疫原性或疫苗组合物。
8.权利要求7的免疫原性或疫苗组合物，其中病毒是灭活或减毒的。
9.权利要求8的免疫原性或疫苗组合物，其中病毒是灭活的。
10.权利要求9的免疫原性或疫苗组合物，其中病毒是PRRSV。
11.用于诱导针对病毒的免疫学或保护性应答的方法，包括对动物施用有效量的权利要求7的免疫原性或疫苗组合物以诱导应答。
12.权利要求11的方法，其中病毒是PRRSV且动物是猪。
13.权利要求7的免疫原性或疫苗组合物，其额外包含与所述病毒或其抗原、免疫原或表位不同的免疫原、抗原或表位。
14.用于制备权利要求13的免疫原性或疫苗组合物的方法，包括混合所述病毒或其抗原或表位以及所述与所述病毒或其抗原或表位不同的免疫原、抗原或表位。
15.用于制备权利要求13的免疫原性或疫苗组合物的试剂盒，其在分开的容器中包含(a)所述病毒或其抗原或表位和(b)所述与所述病毒或其抗原或表位不同的免疫原、抗原或表位，任选在相同包装中，且任选附有对混合和/或施用的说明。
16.为了免疫原性或疫苗组合物而生产病原体、生物体或病毒或者为了免疫原性或疫苗组合物而提供抗原、免疫原或表位的方法，包括在棉鼠肺细胞上繁殖病原体、生物体或病毒。
17.权利要求16的方法，其中所述病原体、生物体或病毒是病毒，其中病毒是乳酸脱氢酶病毒(LDV)、马动脉炎病毒(EAV)、猿出血热病毒(SHFV)、猪生殖和呼吸综合症病毒(PRRSV)、传染性支气管炎病毒、犬冠状病毒、猫冠状病毒、人冠状病毒229E、猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪呼吸道病毒、牛冠状病毒(BCV)、人冠状病毒OC43、鼠肝炎病毒、猪血凝性脑脊髓炎病毒、大鼠冠状病毒、涎泪腺炎病毒、禽传染性支气管炎病毒、火鸡冠状病毒、兔冠状病毒、马torovirus、猪torovirus、人torovirus、牛torovirus、犬副流感病毒(CPI)、腺病毒、牛疱疹病毒(BHV)、马疱疹病毒(EHV)、牛轮状病毒(BRV)、或3型牛副流感病毒(bPI-3)。
18.权利要求17的方法，其中病毒是PRRSV、2型CPI、2型犬腺病毒、3型猪腺病毒、BHV-1、EHV-1、EHV-4、bPI-3、BRV或BCV。
19.权利要求18的方法，其中病毒是PRRSV。
20.包含权利要求18的病毒或其免疫原、抗原、表位的免疫原性或疫苗组合物。
21.权利要求20的免疫原性或疫苗组合物，其中病毒是灭活或减毒的。
22.权利要求21的免疫原性或疫苗组合物，其中病毒是灭活的。
23.权利要求22的免疫原性或疫苗组合物，其中病毒是PRRSV。
24.用于诱导针对病毒的免疫学或保护性应答的方法，包括对动物施用有效量的权利要求20的免疫原性或疫苗组合物以诱导应答。
25.权利要求24的方法，其中病毒是PRRSV且动物是猪。
26.权利要求20的免疫原性或疫苗组合物，其额外包含与所述病毒或其抗原、免疫原或表位不同的免疫原、抗原或表位。
27.用于制备权利要求26的免疫原性或疫苗组合物的方法，包括混合所述病毒或其抗原或表位以及所述与所述病毒或其抗原或表位不同的免疫原、抗原或表位。
28.用于制备权利要求26的免疫原性或疫苗组合物的试剂盒，其在分开的容器中包含(a)所述病毒或其抗原或表位以及(b)所述与所述病毒或其抗原或表位不同的免疫原、抗原或表位，任选在相同包装中，且任选附有对混合和/或施用的说明。
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