BRPI0308736B1 - células de pulmão de rato cotton para cultura de vírus - Google Patents
células de pulmão de rato cotton para cultura de vírusInfo
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Abstract
"células de pulmão de rato cotton para cultura de vírus". a presente invenção refere-se a uma linhagem de célula de rato cotton, usos de células de rato cotton para crescimento, propagação ou cultura de organismos, patógenos ou vírus, tal como prrsv, e usos dos organismos, patógenos ou vírus resultantes.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CÉLULAS DE PULMÃO DE RATO COTTON PARA CULTURA DE VÍRUS".
Pedidos Relacionados/lncorporacão a Título de Referência Este pedido reivindica prioridade do Pedido de Patente U.S. Provisório Ne de Série 60/366.014 depositado em 20 de março de 2002, aqui incorporado a título de referência. O pedido acima, e todos os documentos citados nele ou durante seu processo de instauração ("documentos citados no pedido") e todos os documentos citados ou referidos nos documentos citados no pedido, e todos os documentos citados ou referidos aqui ("aqui documentos citados") e todos os documentos citados ou referidos em tais documentos citados, junto com quaisquer instruções do fabricante, descrições, especificações de produto, e folhas de produto para quaisquer produtos mencionados aqui ou em qualquer documento incorporado aqui a título de referência, são aqui incorporados a título de referência, e podem ser empregados na prática da invenção.
Campo da Invenção A presente invenção refere-se a um novo tipo celular e seus usos, incluindo um novo método para produção de organismos ou patóge-nos, tal como vírus, tal como o vírus que causa a doença suína tal como sín-drome reprodutiva e respiratória do porco (PRRS).
De um modo mais geral, a invenção refere-se à propagação de organismos ou patógenos tal como vírus, por exemplo, vírus virulentos ou atenuados, usando células de pulmão de rato cotton ou as células ou tipo celular de acordo com a invenção (por exemplo, células depositadas ou tipo de célula ou células ou tipo de célula tendo suas características de identificação) para a produção de organismos ou patógenos tal como vírus, por exemplo, vírus virulento ou atenuado, tal como organismos ou patógenos, por exemplo, vírus, que não têm normalmente os roedores ou ratos ou o rato cotton ou a célula de pulmão de rato cotton como hospedeiro natural, ou vírus de RNA, por exemplo, vírus de RNA de filamento simples de filamento positivo, tal como vírus da Ordem Nidovirales, por exemplo, artevírus ou vírus na família Arteríviridae, por exemplo, vírus de promoção de lactato desi- drogenase (LDV), vírus da arterite eqüina (EAV), vírus da febre hemorrágica simiana (SHFV), e vírus PRRS (cujo vetor é tipicamente artrópodos); vírus na família Coronaviridae, por exemplo, coronavírus, tal como vírus da bronquite infecciosa, coronavírus canino, coronavírus felino, coronavírus humano 229E, vírus da diarréia epidêmica de porco, vírus da gastroenterite transmissível, vírus respiratório de porco, coronavírus bovino, coronavírus humano OC43, vírus da hepatite de murino, vírus da encefalomielite de hemaglutina-ção de porco, coronavírus de rato, vírus sialodacrioadenite, vírus da bronquite infecciosa de ave, coronavírus de peru, coronavírus de coelho (também vírus cujos vetor é tipicamente artrópodos), e Torovírus tal como torovírus eqüino, torovírus de porco, torovírus humano, torovírus bovino.
Os vírus que vantajosamente propagaram usando células de pulmão de rato cotton ou as células ou tipo de célula de acordo com a invenção incluem Parainfluenza Canina (CPI), por exemplo, CPI tipo 2 (CPI-2), adenovírus, tal como adenovírus canino (CAV), por exemplo, adenovírus canino do tipo 2 (CAV-2), adenovírus de porco (PAV), por exemplo, adenovírus de porco do tipo 3 e tipo 5 (PAV-3), herpesvírus bovino, por exemplo, herpesvírus bovino do tipo 1 (responsável pela rinotraqueíte bovina infecciosa (IBR)), herpesvírus eqüino (EHV), por exemplo, tipo 1 (EHV-1) ou tipo 4 (EHV-4), rotavírus bovino (BRV), vírus parainfluenza bovino do tipo 3 (PI-3), coronavírus bovino entérico e respiratório (BCV), vírus da síndrome reprodutiva e respiratória de porco (PRRSV).
Mais vantajosamente o vírus é o vírus PRRS. E em modalidades mais vantajosas, as células de pulmão de rato cotton ou tipo celular são as depositadas com o ATCC como PTA-3930 ou uma célula de pulmão de rato cotton ou linhagem celular tendo todas as características de identificação de ATCC PTA-3930 ou uma célula de pulmão de rato cotton ou tipo celular produzida através de cultura de células de pulmão de rato cotton até pelo menos 10, por exemplo, até pelo menos 21 ou 76 ou 100 passagens tal como 10 ou mais ou 21 ou mais ou 76 ou mais passagens, pelo menos 10 ou 21 ou 76 passagens e vantajosamente até (e incluindo) 100 passagens, e estabelecendo um tipo celular de modo que as células de pulmão de rato cotton são essencialmente células epiteliais e as características morfológicas são mantidas ao longo das passagens. A invenção refere-se então a tais células ou tipo celular, bem como todos seus usos. Vírus propagados usando células de pulmão de rato cotton ou tipo de célula de acordo com a invenção são úteis para a preparação de composições e vacinas imunogênicas contra doenças causadas pelos vírus, tal com PRRSV. Da mesma maneira, organismos ou outros patógenos propagados usando as células de pulmão de rato cotton ou células ou tipo celular de acordo com a invenção são úteis para a preparação de composições imunogênicas e de vacina contra tais outros patógenos ou organismos. A presente invenção refere-se também ao uso de vírus cultivados por passagem nas células de acordo com a invenção, por exemplo, para prover composições e vacinas atenuadas, inativadas e de subunidade imunogênicas; e, desse modo, a invenção refere-se a tais composições e vacinas atenuadas, inativadas ou de subunidade imunogênica.
Antecedentes A síndrome reprodutiva e respiratória do porco (PRRS) foi primeiro descrita na Carolina de Norte (USA) em 1987. Esta doença de suíno foi definida naquele momento como "Doença Misteriosa do Suíno" ou MSD, e foi mais tarde conhecida como "Síndrome de Infertilidade e Respiratória do Suíno", ou SIRS. Sua próxima aparição foi na Europa Central em 1990. No início, na Europa, a doença foi chamada "Síndrome de Aborto e Respiratória Epidêmica do Porco" ou PEARS, e, finalmente, "Síndrome Reprodutiva e Respiratória do Porco" ou PRRS que se tornou a denominação aceita em todo o mundo. O vírus da PRRS é um vírus de RNA de filamento simples, en-velopado, isolado pela primeira vez nos Países Baixos, e chamado vírus Le-lystad. Ele foi classificado como um membro da família Arteviridae. Vírus da família Arteviridae são da Ordem Nidovirales. Outros vírus na Ordem Nidovi-rales são vírus na família Coronaviridae tal como coronavírus e torovírus. PRRS foi descrita no WO 92/21375. Um isolado conforme depo- sitado com o Collection Nationale de Culture de Micro-organismes (CNCM) do Institut Pasteur, Paris, França, sob o número de acesso 1-1102. Um tipo Norte-americano foi também isolado (W093/03760) e o vírus foi depositado com o American Type Culture Collection (ATCC) sob o número de acesso VR-2332.
Nas porcas, a doença PRRS é caracterizada por distúrbios reprodutivos e sintomas respiratórios. As células alvo para os vírus de PRRS são as células macrófago.
Um dos problemas que têm impedido a obtenção de produtos imunológicos contra vírus da PRRS é a disponibilidade limitada de substratos estáveis para replicação de vírus. O vírus de PRRS poderia ser apenas amplificado em culturas de macrófago alveolar de porco (PAM) (Wensvoort G. e outros, em The Vet. Quart. 13:121-130, 1991). A necessidade de se usar porcos sem doença de uma certa idade para a obtenção desses macrófagos implicou em vários inconvenientes. Além disso, a susceptibilidade a infecções virais não era garantida no PAM recuperado, porque os substratos celulares derivados de animais diferentes são sempre variáveis. Isso apresentou um inconveniente grande na produção de bateladas de antígeno de qualidade constante e homogênea, e cada batelada precisava ser avaliada a fim de se determinar sua susceptibilidade.
Tem havido pesquisa quanto a outros substratos celulares. Desse modo, na Patente U.S. NQ 5.476.778 15 tipos celulares obtidos de várias espécies (por exemplo, bovino, canino, felino, humano, de porco, simiano) e de vários tecidos (por exemplo, rim, pulmão, testículo) foram testados para a cultura de vírus de PRRS. Apenas um tipo (células MA-104) de 15 tipos celulares permite o crescimento do vírus de PRRS.
Tipos de célula do rim de macaco (por exemplo, VERO, MA-104, MARC-145), vide respectivamente Patente U.S. N° 5.476.778 e WO 98/00165) são usados para a cultura e atenuação de vírus de PRRS. Mas títulos de vírus de PRRS nessas células são baixos e desse modo o custo de produção é alto.
Embora vacinas de PRRS inativado ou atenuado estejam agora comercialmente disponíveis, seria de grande valor ter substratos de célula alternativos par produzir vírus de PRRS, por exemplo, para a produção de vacinas ou composições imunogênicas. E, de um modo mais geral, seria de grande valor ter substratos celulares alternativos para produzir patógenos, tal como vírus, por exemplo, vírus de RNA, por exemplo, vírus de RNA de filamento simples de filamento positivo, tal como o vírus da Ordem Nidovira-les, tal como artenovírus ou vírus na família Arteriviridae e vírus na família Coronaviridae, por exemplo, para a produção de vacinas ou composições imunogênicas.
Além disso, seria vantajoso prover um novo tipo de célula de pulmão de rato cotton.
Sumário da Invenção A presente invenção é baseada na constatação de que embora roedores não sejam hospedeiros naturais para vírus de PRRS, células de pulmão do rato cotton são permissivas para o crescimento ou preparação do vírus de PRRS. Ainda, um novo tipo de célula derivado de tecido de pulmão de rato cotton foi produzido e depositado. A presente invenção é também baseada na constatação de que células de pulmão de rato cotton são também permissivas para crescimento e propagação de outros vírus, vírus que não são um patógeno natural de roedores. Esses vírus incluem vírus de parainfluenza canino do tipo 2 (CPI-2), adenovírus canino do tipo 2 (CAV-2), herpesvírus eqüino do tipo 1 (EHV-1), herpesvírus eqüino do tipo 4 (EHV-4), rotavírus bovino (BRV) e coronaví-rus bovino (BCV). A presente invenção, de um modo mais geral, envolve o uso de células de pulmão de rato de cotton ou células ou o tipo de célula de acordo com a invenção para propagar organismos ou patógenos tal como vírus, por exemplo, vírus virulento ou atenuado, tal como vírus que não têm normalmente roedores ou ratos ou o rato cotton ou as células de pulmão do rato cotton como o hospedeiro natural ou o vírus da Ordem Nidovirales, por exemplo, artevírus ou vírus na família Arteviridae, por exemplo, vírus de promoção de lactato desidrogenase (LDV), vírus da arterite equina (EAV), vírus da febre hemorrágica simiana (SHFV), e vírus da PRRS (cujo vetor é tipicamente artrópodos); vírus na família Coronaviridae, por exemplo, coro-navírus, tal como vírus da bronquite infecciosa, coronavírus canino, corona-vírus felino, coronavírus humano 229E, vírus da diarréia epidêmica de porco, vírus da gastroenterite transmissível, vírus respiratório de porco, coronavírus bovino, coronavírus humano OC43, vírus da hepatite de murino, vírus da encefalomielite de hemaglutinação de porco, coronavírus de rato, vírus da sialodacrioadenite, vírus da bronquite infecciosa de ave, coronavírus de peru, coronavírus de coelho (também vírus cujo vetor é tipicamente artrópodos), e Torovírus tal como torovírus eqüino, torovírus de porco, torovírus humano, torovírus bovino.
Os vírus que vantajosamente propagaram usando células de pulmão de rato cotton ou as células ou tipo de célula de acordo com a invenção incluem o da Parainfluenza Canino (CPI), por exemplo, CPI tipo 2 (CPI-2), adenovírus, tal como adenovírus canino (CAV), por exemplo, adenovírus canino do tipo 2 (CAV-2), adenovírus de porco (PAV), por exemplo, adenovírus de porco do tipo 3 (PAV-3), herpesvírus bovino, por exemplo, herpesví-rus bovino do tipo 1 (responsável pela rinotraqueíte bovina infecciosa (IBR)), herpesvírus eqüino (EHV), por exemplo, tipo 1 (EHV-1) ou tipo 4 (EHV-4), rotavírus bovino (BRV), vírus parainfluenza bovino do tipo 3 (PI-3), coronavírus bovino (BCV) e vírus da síndrome reprodutiva e respiratória de porco (PRRSV). Mais vantajosamente, o vírus é o vírus da PRRS. Desse modo, a invenção refere-se à propagação ou cultura ou crescimento de tais vírus.
Alguns vírus podem crescer nas células do pulmão a partir de Ratos cotton tal como o herpesvírus bovino do tipo 1 (BHV-1) (vide Papp Z. e outros, J. Gen. Viroi, 1997, 78, 2933-2943, por exemplo, p. 2935), vírus da parainfluenza do tipo 3 (bPI-3) (vide Breker-KIassen M.M. e outros, J. Virol., 1995, 69(7), 4308-4315) e adenovírus de porco do tipo 3 (PAV-3) (vide Pedido de Patente PCT WO-A3-99/53047). Esses documentos falham em descrever ou sugerir o uso de tais células e vírus produzidos a partir delas para a preparação de composições ou vacinas inativas, atenuadas ou de subuni- dade imunogênicas e sua administração a animais e métodos de imunização ou vacinação. A invenção também envolve as células de pulmão de rato cotton ou tipo de célula que foram depositadas com o ATCC como PTA-3930 ou uma célula de pulmão de rato cotton ou tipo de célula tendo as características de identificação de ATCC PTA-3930 ou uma célula de pulmão de rato cotton ou tipo de célula produzido através de cultura de células de pulmão de rato cotton até pelo menos 10 ou 21 ou 76 passagens tal como 10 ou mais ou 21 ou mais ou 76 ou mais passagens, por exemplo, pelo menos 10 ou 21 ou 76 passagens e vantajosamente até e incluindo 100 passagens, e estabelecendo um tipo de célula de modo que as células de pulmão de rato cotton são essencialmente células epiteliais e as características morfológicas são mantidas ao longo das passagens. A presente invenção vantajosamente envolve o uso de células de pulmão de Rato cotton (Células de CRL), por exemplo, tipos de células feitos a partir dessas células, para a propagação de vírus de PRRS virulento ou atenuado. A presente invenção vantajosamente também envolve o uso de células de CRL, por exemplo, células ou tipos de célula feitos dessas células tal como células ou tipos de células da invenção (por exemplo, o tipo de célula depositado ou as células tendo suas características), para a propagação de organismos ou patógenos tal como vírus, por exemplo, vírus virulento ou atenuado, tal como CPI-2, CAV-2, EHV-1, EHV-4, BRV, BCV.
Desse modo, a invenção compreende um método para cultura ou propagação de um vírus tal como PRRSV, CPI-2, CAV-2, PAV-5, EHV-1, EHV-4, BRV, BCV, LDV, EAV, SHFV, vírus da bronquite infecciosa, corona-vírus canino, coronavírus felino, coronavírus humano 229E, vírus da diarréia epidêmica de porco, vírus da gastroenterite transmissível, vírus respiratório de porco, coronavírus bovino, coronavírus humano OC43, vírus da hepatite de murino, vírus da encefalomielite de hemaglutinação de porco, coronavírus de rato, vírus sialodacrioadenite, vírus da bronquite infecciosa de ave, coronavírus de peru, coronavírus de coelho, torovírus eqüino, torovírus de porco, torovírus humano, torovírus bovino, compreendendo contato das células de pulmão de rato cotton sob condições adequadas para cultura ou propagação. O método pode ainda incluir colheita do vírus resultante. Para a preparação de uma composição imunogênica ou imunológica ou de vacina, o vírus pode ser opcionalmente inativado e/ou ter proteína(s) ou antígeno(s) ou epitopo(s) isolados dele (para composições inativadas ou de subunidade) e o vírus ou subunidade pode ser misturado com um veículo ou diluente e/ou adjuvante adequado, por exemplo, um veículo ou diluente e/ou adjuvante veterinariamente aceitável ou farmaceuticamente aceitável.
Os termos "composição imunogênica" e "composição imunológica" e "composição imunogênica ou imunológica" compreendem qualquer composição que elicite uma resposta imune contra o patógeno alvo; por exemplo, após administração ou injeção no animal (tal como porco), elicita uma resposta imune contra o patógeno alvo (por exemplo, PRRS). Os termos "composição para vacina" e "vacina" e "composição de vacina" compreendem qualquer composição que induza uma resposta imune contra o patógeno alvo ou que proteja eficazmente contra o patógeno; por exemplo, após administração ou injeção no animal (por exemplo, porco), elicite uma resposta imunoprotetora contra o patógeno alvo ou proveja proteção eficácia contra o patógeno (por exemplo, PRRS). Uma subunidade de um patógeno, por exemplo, vírus, um antígeno ou imunógeno ou epitopo isolado do patógeno, por exemplo, vírus; e, uma composição de subunidade compreende ou consiste essencialmente em um ou mais antígenos, imunógenos ou epi-topos isolados do patógeno, por exemplo, vírus. A presente invenção também provê culturas de um organismo ou patógeno, por exemplo, vírus, tal como um vírus que não tem normalmente roedores ou ratos ou o rato cotton ou a célula de pulmão de rato cotton como hospedeiro natural, por exemplo, PRRSV, LDV, EAV, SHFV, vírus da bronquite infecciosa, coronavírus canino, coronavírus felino, coronavírus humano 229E, vírus da diarréia epidêmica de porco, vírus da gastroenterite transmissível, vírus da gastroenterite transmissível do porco, vírus respiratório de porco, coronavírus bovino, coronavírus humano OC43, vírus da hepa- tite de murino, vírus da encefalomielite de hemaglutinação de porco, corona-vírus de rato, vírus sialodacrioadenite, vírus da bronquite infecciosa de ave, coronavírus de peru, coronavírus de coelho, torovírus eqüino, torovírus de porco, torovírus humano, torovírus bovino, CPI-2, CAV-2, PAV-5, EHV-1, EHV-4, BRV ou BCV, vantajosamente, vírus da PRRS, CPI-2, CAV-2, EHV-1, EHV-4, BRV ou BCV, obtidos da cultura ou propagação nas células de pulmão de rato cotton ou nas células ou tipo de célula da invenção, por exemplo, culturas ou preparações inativadas, atenuadas e de subunidade.
Tais culturas são diferentes das culturas anteriores uma vez que elas podem ser livres de contaminantes das culturas propagadas em células diferente e podem ter títulos de cultura diferentes de culturas propagadas em células diferentes. Por exemplo, considere novamente vírus da PRRS amplificado em células de porco; suas culturas são suscetíveis a conter contaminantes das células de porco, e PRRSV culturado em células de CRL são prováveis de não conter contaminantes encontrados em células de porco. Esta análise pode ser estendida para culturas de PRRSV e outros vírus cul-turados em outras células que foram usadas para propagar PRRSV e outros vírus em comparação com culturadas de vírus culturados em células de CRL como na presente invenção, de modo que é claro que as culturas da presente invenção são diferentes das culturas anteriores. A presente invenção também compreende composições e vacinas imunogênicas contra doença de PRRS ou PRRSV que podem ser obtidas a partir de cultura de vírus de PRRS de acordo com a invenção, vantajosamente composições e vacinas imunogênicas atenuadas vivas, composições e vacinas imunogênicas inativadas e composições e vacinas imunogênicas de subunidade. A presente invenção também compreende composições e vacinas imunogênicas contra outros patógenos ou organismos culturados ou propagados em células de CRL ou o tipo de célula ou células da invenção, por exemplo, composições ou vacinas atenuadas, inativadas ou de subunidade. Essas composições ou vacinas imunogênicas podem ser contra qualquer organismo ou patógeno ou vírus cultivado, culturado, propagado ou similar nas células de CRL ou o tipo celular ou as células da invenção, por exemplo, tais composições imunogênicas ou de vacina contra qualquer um dos vírus ou organismos ou patógenos aqui mencionados, tal como CPI-2, CAV-2, BHV-1, EHV-1, EHV-4, BRV, bPI-3 ou BCV. A invenção compreende estojos contendo células e vírus ou organismos ou patógeno para sua cultura, vantajosamente em recipientes separados; e, mais vantajosamente ainda, os recipientes separados estão na mesma embalagem; e, opcionalmente, o kit inclui instruções para cultura, crescimento, nutrição das células e/ou vírus, com as instruções opcionalmente incluindo instruções para colheita e/ou inativação do vírus e/ou isolamento de um antígeno ou imunógeno ou epitopo de subunidade. A invenção compreende ainda combinação de composições; por exemplo, composições compreendendo uma ou mais composições de vacina ou imunogênicas da invenção, ou uma composição de vacina ou imuno-gênica da invenção em combinação com uma outra composição de vacina ou imunogênica ou componente ativo (por exemplo, vírus inativado ou atenuado ou patógeno ou organismo ou antígeno de subunidade ou imunógeno ou proteína ou epitopo dele).
Desse modo, por exemplo, a invenção compreende composições e vacinas imunogênicas contra doença do porco compreendendo uma mistura de culturas do vírus de PRRS e PAV-3 de acordo com a invenção, tal como composições e vacinas imunogênicas atenuadas vivas, composições e vacinas imunogênicas inativadas ou composições e vacinas imunogênicas de subunidade. O PAV-3 pode ser também um PAV-3 recombinante que contém uma ou mais seqüência(s) de ácido nucleico codificando, e que expressam, um ou mais imunógeno(s), antígeno(s) ou epitopo(s) estrangeiros ou heterólogos ou exógenos (estrangeiro, heterólogo ou exógeno como para o adenovírus). É feito menção ao WO 99/53047, WO 99/08706, WO 01/83737 e WO 00/47756 como exemplos de vetores de adenovírus de porco recombinantes que podem ser usados na prática da invenção.
Um outro exemplo é que a invenção compreende composições e vacinas imunogênicas contra doença canina que compreendem uma mistura de culturas de vírus CPI-2 e CAV-2 de acordo com a invenção, tal como composições e vacinas imunogênicas atenuadas vivas, vacinas e composições imunogênicas inativadas ou composições e vacinas imunogênicas de subunidade. O CAV-2 pode ser também um CAV-2 recombinante que contém uma ou mais seqüência(s) de ácido nucléico codificando, e que expressa, um ou mais imunógeno(s), antígeno(s) ou epitopo(s) estrangeiros ou heterólogos ou imunógenos (estrangeiro, heterólogo ou exógeno para o adenovírus). Menção é feita à Patente U.S. No. 6.090.393 para exemplos de adenovírus caninos recombinantes que podem ser usados na prática da invenção.
Um exemplo adicional é que a invenção compreende composições e vacinas imunogênicas contra doença bovina que compreendem uma mistura de pelo menos dois ou pelo menos três ou todas as quatro culturas de vírus de acordo com a invenção compreendendo BHV-1, BRV, bPI-3 e/ou BCV, por exemplo, BHV-1+BRV, BHV-1+BRV+bPI-3, BHV-1+BRV+bPI-3+BCV, BRV+bPI-3, BRV+bPI-3+BCV, bPI-3+BCV, BHV+bP-3, BHV+bPI-3+BCV, BHV-1+BCV, BRV+BCV, tal como composições e vacinas imunogênicas atenuadas vivas, composições e vacinas imunogênicas inativadas ou composições e vacinas imunogênicas de subunidade. Composições e vacinas imunogênicas contra doença respiratória bovina que compreendem uma mistura de pelo menos duas culturas de vírus de acordo com a invenção compreendendo BHV-1 e bPI-3, e composições e vacinas imunogênicas contra doença entérica bovina que compreendem uma mistura de pelo menos duas culturas de vírus de acordo com a invenção compreendendo BCV e BRV são consideradas vantajosas. E, um exemplo adicional de combinação de composições de acordo com a invenção são as composições e vacinas imunogênicas contra doença eqüina que compreendem uma mistura de culturas de vírus EHV-1 e EHV-4 de acordo com a invenção, tal como composições e vacinas imunogênicas atenuadas vivas, composições e vacinas imunogênicas inativadas e composições e vacinas imunogênicas de subunidade. A invenção compreende preparação de tais composições de combinação; por exemplo, misturando os componentes ativos, vantajosamente junto e com um veículo ou diluente e/ou adjuvante. A invenção também compreende um kit para preparação da combinação imunogênica ou composições de vacina da invenção; por exemplo, tal estojo compreende (a) um organismo, patógeno ou vírus ou antígeno ou seu epitopo (vantajosamente um vírus conforme aqui mencionado) e (b) um organismo, patógeno ou vírus ou imunógeno, antígeno ou seu epitopo (vantajosamente um vírus ou imunógeno, antígeno ou seu epitopo, mas outros patógenos conforme aqui mencionado são também considerados), que é diferente de (a), em recipientes separados, opcionalmente na mesma embalagem, e opcionalmente com instruções para mistura e/ou administração. A invenção compreende ainda métodos para indução de uma resposta imune ao administrar a um hospedeiro, tal como um hospedeiro suscetível a uma doença causada por um patógeno ou organismo ou vírus propagado em uma célula de pulmão de rato cotton ou tipo de célula, por exemplo, uma célula de pulmão de rato cotton ou tipo de célula da invenção, por exemplo, um vírus conforme aqui mencionado, uma composição imunogênica ou de vacina da invenção compreendendo tal patógeno ou organismo ou vírus inativado ou atenuado ou um antígeno ou imunógeno ou seu epitopo em uma quantidade suficiente para induzira resposta imune.
Desse modo, a presente invenção provê métodos para imunização ou vacinação ou indução de uma resposta imune contra doença ou vírus da PRRS usando uma composição e/ou vacina imunogênica da invenção, por exemplo, administrando a composição imunogênica ou vacina a um hospedeiro, por exemplo, porco, em uma quantidade suficiente para elicitar uma resposta imune adequada. E a invenção provê ainda métodos para imunização ou vacinação ou indução de uma resposta imune contra doença ou vírus CPI-2, CAV-2, BHV-1, EHV-1, EHV-4, BRV, bPI-3 ou BCV usando uma composição e/ou vacinas imunogênicas da invenção, administrando a composição de vacina ou imunogênica a um hospedeiro, por exemplo, uma hospedeiro natural do vírus, em uma quantidade suficiente para elicitar uma resposta imune adequada. A presente invenção, por exemplo, quando coquetel ou composições em combinação são empregados, envolve métodos de imunização ou vacinação ou de elicitação de uma resposta imune em um animal hospedeiro contra dois ou mais antígenos, epitopos ou patógenos ou patógenos ou organismos ou vírus diferentes, tal como em um porco contra doença de PRRS e PAV-3 compreendendo administrar uma quantidade eficaz para elicitação da resposta de composição(ões) e/ou vacina(s) imunogênica(s) da invenção. (A indicação de "(s)" é usada como o método pode ser também praticada através de administração seqüencial das composições ou vacinas da invenção). Da mesma maneira, como um exemplo adicional, a invenção envolve métodos de imunização ou vacinação ou elicitação de um resposta imune em um canino contra doença ou vírus CPI-2 e CAV-2 usando ou administrando uma quantidade eficaz de composição(ões) e/ou vacina(s) imunogênica(s) da invenção. Similarmente, a invenção provê métodos de imunização ou vacinação ou de elicitação de uma resposta imune em um bovino contra pelo menos duas ou pelo menos três ou pelo menos quatro doenças ou vírus bovinos usando ou administrando uma quantidade eficaz da(s) composição(ões) e/ou vacina(s) imunogênica(s) da invenção. A invenção envolve ainda métodos de imunização ou vacinação ou de elicitação de uma resposta imune em um bovino contra doença ou vírus BHV-1 e bPI-3 usando ou administrando composição(ões) e/ou vacina(s) imunogênica(s) da invenção. A invenção também envolve métodos de imunização ou vacinação ou de elicitação de uma resposta imune em um bovino contra doença ou vírus BCV ou BRV usando ou administrando composição(ões) e/ou vacina(s) imunogênica(s) da invenção. E a invenção envolve métodos de imunização ou vacinação ou de elicitação de uma resposta imune em um eqüino contra doença ou vírus EHV-1 e EHV-4 usando ou administrando composição(ões) e/ou vacina(s) imunogênica(s) da invenção. É notado que neste relatório e particularmente nas reivindicações termos tais como "compreende", "compreendido", "compreendendo" e similar podem ter o significado atribuído a ele na lei de Patente Norte- americana; por exemplo, eles podem significar "incluir", "incluído", "incluindo" e similar; e os termos tais como "consistindo essencialmente em" e "consiste essencialmente em" têm os significados atribuídos a eles na lei de Patente Norte-americana, por exemplo, eles permitem elementos não explicitamente mencionados, mas excluem elementos que são encontrados na técnica anterior e que afetam a característica básica ou nova da invenção.
Essas e outras modalidades são descritas e são óbvias a partir da e compreendidas pela Descrição Detalhada que segue.
Descrição Detalhada Os inventores desenvolveram um método para produção ou propagação viral que usa células de pulmão de Rato cotton, bem como a uma nova linhagem celular; e a propagação ou produção ou cultura ou crescimento de organismos ou patógenos ou vírus em tais células.
Os pulmões são coletados de ratos cotton e submetidos a uma digestão enzimática (por exemplo, com tripsina e/ou colagenase). Sobrena-dante contendo células dissociadas é coletado e culturado, por exemplo, como uma monocamada ou em suspensão. Vantajosamente, as células são culturadas como uma monocamada, por exemplo, em Meio Essencial Mínimo (MEM) suplementado com soro bovino fetal (FBS) e/ou hidrosilato de lactalbumina (LAH). Vantajosamente, o meio de cultura pode conter antibióticos, por exemplo, gentamicina, streptomicina e/ou penicilina. Vírus de PRRS foi culturado em tal cultura celular de pulmão. Vírus PAV-3, CPI-2, CAV-2- BHV-1, EHV-1, EHV-4, BVR, bPI-3 ou BCV são também culturados em tal cultura de célula de pulmão. A cultura celular pode vantajosamente resultar de várias passagens dessas células. Vantajosamente, as passagens dessas células permitem que uma pessoa produza linhagens de células que são úteis, por exemplo, para propagação de vírus de PPRS. Por exemplo, as células podem ser submetidas a pelo menos 10 passagens, por exemplo, 10 a 100 passagens. Vantajosamente, essas linhagens celulares são duráveis na ausência de soro bovino fetal (FBS), embora o estabelecimento da monocamada requeira um pouco de FBS ou um outro fator de crescimento de célula apropriado.
Uma outra vantagem da cultura das células de CRL de acordo com a invenção é que uma cultura das células pode persistir por pelo menos um mês como uma monocamada ou suspensão saudável sem requerer reposição de meio gasto ou suplementação nutricional adicional. Esta resistência conferiu a vantagem de coletas de vírus múltiplas da mesma cultura de células sem necessitar momento de início (estabelecimento de cultura) e consumo de estoque de célula. É também possível ter coletas virais múltiplas da mesma cultura celular. Em uma modalidade, o processo de cultura compreende duas ou mais coletas do vírus, como ou sem reinoculação viral e/ou adição de meio de cultura fresco. Vantajosamente, após cada coleta, meio de cultura fresco é adicionado à cultura celular.
Seguindo este procedimento, células de pulmão de Rato cotton foram culturadas até 76 passagens e estabelecidas como uma linhagem celular. Essas células de pulmão de Rato cotton são essencialmente células epiteliais e as características morfológicas são mantidas ao longo das passagens. A passagem 21 foi depositada em 18 de dezembro de 2001, sob os termos do Tratado de Budapeste com o American Type Culture Collection, 10801, University, Blvd., Manassas, VA 20110-2209 e foi concedido o número de acesso ATCC PTA-3930.
Em uma modalidade, a presente invenção envolve o uso de células de pulmão epiteliais de Rato cotton, linhagens de célula epitelial derivados delas, tais como a linhagem de célula TPA-3930 ou uma linhagem de célula tendo as suas características de identificação, para a produção de vírus de PRRS virulento ou atenuado. Em modalidades adicionais, a presente invenção envolve o uso de células de pulmão epiteliais de Rato cotton, linhagens de célula epiteliais derivadas delas, tais como a linhagem de célula PTA-3930 ou uma linhagem de célula tendo as suas características de identificação, para a produção de vírus CPI-2, CAV-2, EHV-1, EHV-4, BRV ou BVC virulento ou atenuado. Em modalidades adicionais, a presente invenção envolve o uso da linhagem celular PTA-3930 ou uma linhagem de célula tendo as suas características de identificação para a produção de ví- rus BHV-1 ou bPI-3 virulento ou atenuado. A linhagem de célula ou linhagem de célula tendo as suas características de identificação pode ser também usada com respeito a outros vírus aqui mencionados.
Um outro aspecto da invenção é então um método de produção de vírus de PRRS, compreendendo cultura de vírus de PRRS em uma cultura de célula de pulmão de Rato cotton, compreendendo células epiteliais, vantajosamente em uma linhagem de célula de pulmão de Rato cotton. Por exemplo, produção viral é feita em uma linhagem de célula PTA-3930 ou uma linhagem de célula tendo as suas características de identificação. Este método de produção de vírus pode ser também usado para vírus CPI-2, CAV-2, BHV-1, EHV-1, EHV-4, BRV, bPI-3 e BVC, bem como para outros vírus aqui mencionados. O vírus pode ser um vírus virulento ou um vírus atenuado. A produção de vírus compreende as etapas de inoculação e propagação do vírus em tais células. Antes da inoculação, as células de acordo com a invenção podem ser cultivadas em um meio de cultura adequado, por exemplo, meio MEM suplementado com FBS ou um outro fator de crescimento de célula apropriado. A cultura da célula é vantajosamente feita em uma temperatura entre 35 e 39° C, vantajosamente por volta de 37° C. Vantajosamente, a cultura de célula é uma monocamada. Alternativamente, a cultura de célula é uma suspensão. Em geral, o vírus é inoculado quando as células que crescem em monocamada são confluentes. O vírus extracelular pode ser recuperado diretamente com o sobrenadante. Vírus intracelular pode ser recuperado após rompimento apropriado das células, por exemplo, através de congelamento/descongelamento ou sonificação. No caso de culturas celulares em suspensão, o vírus pode ser recuperado, por exemplo, após filtragem do filtrado. O vírus pode ser recuperado 2 a 15 dias, tal como 3 a 7 dias, mais vantajosamente 5 a 7 dias pós-inoculação. A produção do vírus é feita de acordo com o conhecimento geral do versado na técnica referente à produção viral. A cultura bruta do vírus é obtida neste estágio. O meio de cultura usado nesta invenção pode ser suplementado com antibióticos.
Se necessário, o vírus, por exemplo, o vírus de PRRS, é adaptado para o crescimento nas células de acordo com a invenção. Adaptação pode ser feita através de co-culturas nas células de acordo com a invenção e células de rim de macaco tal como MA-104. A adaptação é feita como é bem conhecido através de passagens seriais em co-culturas com quantidade sempre crescente de células de acordo com a invenção. Esta adaptação pode ser também feita para vírus CPI-2, CAV-2, BHV-1, EHV-1, EHV-4, BRV, bPI-3 ou BCV, bem como outros vírus aqui mencionados. A cultura bruta pode ser concentrada e/ou purificada. A concentração pode ser realizada através de qualquer método convencional conhecido por uma pessoa versada na técnica, por exemplo, através de precipitação seletiva ou ultrafiltragem. A purificação pode ser realizada através de qualquer método convencional conhecido por uma pessoa versada na técnica, por exemplo, através de métodos de ultracentrifugação ou cromatografia, por exemplo, filtragem em gel. As culturas concentradas, culturas purificadas ou culturadas concentradas e purificadas de vírus são obtidas neste estágio.
Em um outro aspecto da invenção, as culturas de vírus de acordo com a invenção (bruta, concentrada, purificada ou concentrada e purificada) podem ser inativadas usando qualquer método convencional, por exemplo, método térmico e/ou químico. Um método vantajoso é inativação química, por exemplo, usando beta-propiolactona, formalina, etilenoimina ou um seu derivado tal como etilenoimina binária (BEI) e combinações desses compostos de inativação. Culturas de vírus de PRRS inativado são obtidas neste estágio.
Em um outro aspecto da invenção, frações imunogênicas tais como glicoproteínas ou proteínas podem ser extraídas a partir dos vírus presentes nas culturas de vírus de acordo com a invenção (bruta, concentrada, purificada ou concentrada e purificada, opcionalmente inativada). A extração de frações imunogênicas do vírus é feita de acordo com o conhecimento geral de uma pessoa versada na técnica. Preparações de vírus de subunidade são obtidas neste estágio.
Outros aspectos da invenção são então as culturas brutas de vírus, culturas concentradas, culturas purificadas, culturas concentradas e purificadas, culturas inativadas, preparações de subunidades descritas aqui.
Em uma modalidade vantajosa da invenção, o vírus virulento pode ser atenuado por um número suficiente de passagens nas células de acordo com a invenção. Uma pessoa versada na técnica é capaz de determinar através de experimentação de rotina o número de passagens suficientes para atenuação do vírus. A preparação de vírus atenuado é obtida. É também um objetivo da presente invenção prover composições e vacinas imunogênicas para prevenir infecção com o vírus. Essas composições ou vacinas imunogênicas compreendem pelo menos uma cultura ou preparação conforme aqui descrito. O termo "composição imunogênica" compreende aqui qualquer composição capaz, assim que foi administrada a um animal, por exemplo, porco, de elicitar uma resposta imune contra o vírus ou antígeno ou imunó-geno ou epitopo. O termo "vacina" compreende aqui qualquer composição capaz de, uma vez administrada ao animal, por exemplo, porco, de induzir uma resposta imunoprotetora contra o vírus, ou para eficazmente proteger o animal contra o dito vírus.
Composições ou vacinas imunogênicas de acordo com a invenção podem incluir a cultura de vírus ou preparação ou antígeno ou imunóge-no ou epitopo do vírus, e pelo menos um imunógeno, antígeno ou epitopo de um outro patógeno ou um outro patógeno (por exemplo, patógeno inativado ou atenuado). Tal imunógeno, antígeno ou epitopo pode ser, por exemplo, de origem bacteriana, ou parasítica ou viral ou uma forma inativada ou atenuada do patógeno. A invenção também compreende kits para preparação dessas composições em combinação, bem como métodos para fabricação dessas composições em combinação e o uso dos componentes dessas composições em combinação para preparar as composições em combinação. Desse modo, a invenção envolve um estojo para preparação das composições imunogênicas ou de vacina em combinação da invenção; por exemplo, tal estojo compreende (a) um organismo, patógeno, ou vírus ou antígeno ou epitopo dele (vantajosamente um vírus conforme aqui mencionado) e (b) um organismo, patógeno ou vírus ou imunógeno, antígeno ou epitopo dele (vantajosamente um vírus ou imunógeno, antígeno ou epitopo dele, mas outros patógenos conforme aqui mencionado são também compreendidos) que é diferente (a), em recipientes separados, opcionalmente na mesma embalagem, e opcionalmente com instruções para mistura e/ou administração.
Composições imunogênicas e/ou vacinas de acordo com a invenção podem incluir cultura ou preparação de vírus de PRRS (por exemplo, PRRSV inativado ou atenuado ou um imunógeno ou antígeno ou epitopo dele), e pelo menos um imunógeno, antígeno ou epitopo de um outro patógeno de porco (incluindo sem limitação o patógeno na forma inativada ou atenuada). Este patógeno pode ser selecionado do grupo incluindo mas não limitado a vírus pseudoraivosos, vírus da influenza de porco, parvovírus de porco, vírus da gastroenterite transmissível (coronavírus), circovírus de porco tal como circovírus de porco do tipo 2, rotavírus, adenovírus de porco do tipo 3, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Bordetella bronchisepti-ca, Clostridium spp., Salmonella spp., Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma, hyopneumoniae e Actinobaci-llus pleuropneumoniae. Composições e vacinas imunogênicas vantajosas de acordo com a invenção podem incluir cultura ou preparação do vírus de PRRS e vírus PAV-3 cultivados e propagados em células ou linhagens de célula de acordo com a invenção, por exemplo, na linhagem de célula PTA-3930 ou uma linhagem de célula tendo todas as suas características de identificação. Imunógenos de patógenos de porco podem incluir vírus da pseudoraiva gB, vírus da pseudoraiva gC, vírus da pseudoraiva gD, influenza do porco HA, influenza do porco NA, influenza do porco NP, ORF4 do vírus da síndrome reprodutiva e respiratória do porco, ORF7 do vírus da sín-drome reprodutiva e respiratória do porco, ORF5 de PRRSV, ORF3 de PRRSV, ORF6 de PRRSV, estruturas de leitura aberta de PRRSV 5 (ORF5) e 6 (ORF6), estruturas de leitura aberta de PRRSV 5 (ORF5) e 3 (ORF3) e 6 (0RF6), Vírus do Cólera do Porco E1, gene do Vírus do Cólera do Porco E2, VP2 do parvovírus, ORF1 do circovírus de porco do tipo 2, ou ORF2 do cir-covírus de porco do tipo 2. Referência é feita às Patentes U.S. Nos. 6.517.843, 6.497.883, 6.391.314, 6.379.676, 6.217.883, 6.207.165 e publicações de Patente U.S. 2003003112 e WO 99/53047, WO 99/08706, WO 01/83737, WO 00/47756 para imunógenos de patógenos de porco, moléculas de ácido nucléico codificando para eles e construtos expressando os mesmos. Desse modo, a invenção também envolve métodos para fabricação dessas composições, bem como estojos para elas.
Composições e vacinas imunogênicas de acordo com a invenção podem incluir cultura ou preparação de vírus CPI-2 e/ou CAV-2 (por exemplo, CPI-2 e/ou CAV-2 inativado ou atenuado ou um imunógeno ou an-tígeno ou epitopo dele) e pelo menos um imunógeno, antígeno ou epitopo de um outro patógeno canino (incluindo sem limitação o patógeno na forma ina-tivada ou atenuada). Este patógeno pode ser selecionado do grupo incluindo mas não limitado a vírus da raiva canino, parvovírus canino, coronavírus canino, herpesvírus canino, agente da doença Lyme, Borrelia burgdorferi e vírus da raiva. Vantajosamente, composições e vacinas imunogênicas de acordo com a invenção incluem uma cultura ou preparação de vírus CPI-2 e/ou cultura ou preparação de vírus CAV-2 de acordo com a invenção. Imunógenos de CPI-2 podem ser CPI-2 F e/ou HN. Vide também Patentes U.S. Nos. 5.616.326, 6.090.393, 6.159.477, 6.228.846 com relação a imunógenos de patógenos caninos e moléculas de ácido nucléico codificando os mesmos e construtos que expressam os mesmos. Desse modo, a invenção também envolve métodos para fabricação dessas composições, bem como estojos para elas.
Composições e vacinas imunogênicas de acordo com a invenção podem incluir cultura ou preparação de vírus BHV-1, BRV, bPI-3 e/ou BCV (por exemplo, BHV-1, BRV-; bPI-3 e/ou BCV inativado ou atenuado ou um imunógeno ou antígeno ou epitopo dele), e pelo menos um imunógeno, antígeno ou epitopo de um outro patógeno bovino (incluindo sem limitação o patógeno na forma inativada ou atenuada). Este patógeno pode ser selecio- nado a partir do grupo incluindo mas não limitado a vírus sincicial respiratório bovino e vírus da diarréia viral bovina. Vantajosamente, composições e vacinas imunogênicas de acordo com a invenção incluem pelo menos duas culturas ou preparações de vírus de acordo com a invenção compreendendo BHV-1, BRV, bPI-3 ou BCV. Imunógenos de BRSV podem ser BRSV F ou G ou N, tal como BRSV F e/ou G ou N e/ou G. Imunógenos de BHV-1 podem ser gB e/ou gC e/ou gD. Imunógenos de BVDV podem ser a proteína EO (gp48) e/ou a proteína E2 (gp53). O BVDV pode ser do tipo 1 e/ou tipo 2. Os imunógenos de bPI-3 podem ser bPI-3 F e/ou HN. Vide também as Patentes U.S. Nos. 6.451.770, 6.376.473, 6.224.878, com relação a imunógenos de patógenos bovinos e moléculas de ácido nucléico codificando para eles e construtos que expressam o mesmo. Desse modo, a invenção também envolve métodos para fabricação dessas composições, bem como estojos para elas.
Composições e vacinas imunogênicas de acordo com a invenção podem incluir uma cultura ou preparação de vírus EHV-1 e/ou EHV-4 (por exemplo, EHV-1 e/ou EHV-4 inativado ou atenuado ou um seu imunó-geno ou antígeno ou epitopo), e pelo menos um imunógeno, antígeno ou epitopo de um outro patógeno eqüino (incluindo sem limitado o patógeno na forma inativada ou atenuada). Este patógeno pode ser selecionado a partir do grupo incluindo mas não limitado a vírus influenza eqüino, vírus da ence-falomielite oriental (EEV), vírus da encefalomielite ocidental (WEV), vírus da encefalomielite Venezuelana (VEV), agente da doença Lyme, Borrelia burdgorferi, Clostridium tetani, vírus da arterite eqüina (EAV) e vírus da raiva. Composições e vacinas vantajosamente imunogênicas de acordo com a invenção podem incluir uma cultura ou preparação de vírus EHV-1 e cultura ou preparação de vírus EHV-4 de acordo com a invenção. Glicoproteínas de EHV podem ser gB, gD, gB+gD, gC e gE. Referência é feita às Patentes U.S. Nos. 6.207.166 e 6.368.603 para imunógenos de patógenos eqüinos e moléculas de ácido nucléico codificando para eles e construtos que expressem os mesmos. Desse modo, a invenção também envolve métodos para fabricação dessas composições, bem como estojos para elas.
Uma composição ou vacina imunogênica de acordo com a invenção que também compreende tal componente imunogênico adicional (imunógeno, antígeno ou epitopo adicional) tem a vantagem de que ela in-duz uma resposta imune ou proteção contra várias infecções ou males ou agentes causadores deles ao mesmo tempo. Este componente imunogênico adicional pode ser microorganismo atenuado ou inativado, um construto ou subunidades recombinantes (por exemplo, proteínas, glicoproteínas, poli-peptídeos ou epitopos). Os procedimentos de determinação de epitopo, tais como geração de bibliotecas de peptídeo de sobreposição (Hemmer B. e outros, Immunology Today, 1998,19(4), 163-168), Pepscan (Geysen H.M. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 1984, 81 (13), 3998-4002; Geysen H.M. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1985, 82(1), 178-182; Van der Zee R. e outros, Eur. J. Immunol., 1989, 19(1), 43-47; Geysen H.M., Southeast Asian, J. Trop. Med. Public. Health, 1990, 21(4), 523-533; Multipin Peptide Synthe-sis Kits de Chiron) e algoritmos (De Groot A. e outros, Nature Biotechnology, 1999, 17, 533-561), podem ser usados na prática da invenção, para determinar epitopos de imunógenos, antígenos, polipeptídeos, glicoproteínas e similar, sem experimentação indevida. A partir desta informação, uma pessoa pode construir moléculas de ácido nucléico codificando tal epitopo; e a partir deste conhecimento e conhecimento na técnica, uma pessoa pode construir vetores ou construtos, por exemplo, vírus ou vetores ou plasmídeos recombinantes que expressem imunógenos, epitopos ou antígenos; todos sem experimentação indevida.
As composições imunogênicas ou composições de vacina compreendem ainda um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável, e opcionalmente um estabilizador e/ou um adju-vante. Formulações adequadas ficarão aparentes a qualquer pessoa versada na técnica. As formulações podem ser desenvolvidas para qualquer via de administração adequada. O veículo farmaceuticamente aceitável pode ser água ou solução salina.
As composições imunogênicas inativadas ou vacinas inativadas compreendem vantajosamente pelo menos um adjuvante.
Os vírus atenuados vivos podem ser secos com congelamento, vantajosamente com um estabilizador. Secagem com congelamento pode ser feita de acordo com procedimentos de secagem com congelamento padrão bem conhecidos. Os estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis podem ser SPGA (albumina de glutamato de fosfato de sacarose) (Bovarnik e outros, J. Bacteríology, 1950, 59:509), carboidratos (por exemplo, sorbitol, manitol, lactose, sacarose, glicose, dextrano, trealose), glutamato de sódio (Tsvetkov T. e outros, Cryobiology, 1983, 20(3):318-23; Israeli E. e outros, Cryobiology 1993, 30(5):519-23), proteínas tais como peptona, albumina ou caseína, proteínas contendo agentes tais como leite desnatado (Mills C.K. e outros, Cryobiology, 1988, 25(2): 148-52; Wolff E. e outros, Cryobiology, 1990, 27(5):569-75) e tampões (por exemplo, tampão de fosfato, tampão de fosfato de metal alcalino).
Um adjuvante pode ser usado para tornar as preparações secas com congelamento solúveis.
Exemplos de adjuvantes são emulsões óleo-em-água, água-em-óleo-em-água baseadas em óleo mineral e/ou óleo vegetal e tensoativos não-iônicos tais como copolímeros em bloco, Tween®, Span®. Outros adjuvantes adequados são, por exemplo, vitamina E, saponinas, Carbopol®, hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio ou óxido de alumínio ("Vaccine De-sign, The subunit and adjuvant approach", Pharmaceutical Biotechnology, vol. 6, Editado por Michael F. Powell e Mark J. Newman, 1995, Plenum Press New York). Os documentos citados aqui podem ser também consultados como para adjuvantes, bem como para diluentes, veículos e veículos de excipientes.
Um outro aspecto da presente invenção é um método de imunização ou um método de vacinação usando composições imunogênicas ou as composições de vacina de acordo com a invenção, respectivamente. O método inclui pelo menos uma administração a um animal de uma quantidade eficiente da composição ou vacina imunogênica de acordo com a invenção. O animal pode ser macho, fêmea, fêmea grávida e recém- nascido. Esta administração pode ser notavelmente feita através de injeção intramuscular (IM), intradermal (ID) ou subcutânea (SC) ou através de administração intranasal ou oral. A composição imunogênica ou a vacina de acordo com a invenção pode ser administrada através de uma seringa ou um aparelho sem agulha (tal como, por exemplo, Pigjet ou Biojector (Bioject, Oregon, USA)).
Para composições atenuadas, as doses dos vírus ou organismo ou patógeno produzido na nova cultura de célula podem estar entre cerca de 103 e cerca de 107 CCID50 (Doses de Infecção de Cultura de Célula Médias), vantajosamente entre cerca de 104 e cerca de 106 CCID50 e mais vantajosamente cerca de 105 CCID50. Os volumes são de 0,2 a 2,0 ml, vantajosamente cerca de 2,0 ml. Uma ou mais administrações podem ser feitas; por exemplo, com duas injeções com intervalo de 2-4 semanas, e vantajosamente com um reforço cerca de 3 semanas após a primeira injeção.
Com composições inativadas do vírus ou organismo ou patógeno produzido na cultura de célula nova, o animal pode ser administrado aproximadamente 104-109 de CCID5o equivalente (título antes da inativação), vantajosamente aproximadamente 105-108 de CCID50 equivalente em uma unidade de dose única. O volume de uma unidade de dose única pode estar entre 0,2 ml e 5,0 ml e vantajosamente entre 0,5 ml e 2,0 ml e mais vantajosamente cerca de 2,0 ml. Uma ou mais administrações podem ser feitas, por exemplo, com duas injeções com intervalos de 2-4 semanas, e vantajosamente com um reforço 3 semanas após a primeira injeção.
Com composições de subunidade, por exemplo, do vírus ou patógeno ou organismo produzido na nova cultura celular, o animal pode ser administrado aproximadamente a 5 pg a 500 pg, vantajosamente 20 pg a 50 pg. Os volumes são de a partir de 0,1 a 2,0 ml, vantajosamente cerca de 2,0 ml. Uma ou mais administrações podem ser feitas; por exemplo, com duas injeções com 2-4 semanas de espaçamento, e vantajosamente com um reforço cerca de 3 semanas após a primeira injeção.
As composições de acordo com a invenção podem ser administradas a outros mamíferos, por exemplo, camundongos ou animal de labo- ratório, por exemplo, para gerar anticorpos policlonais, ou para preparar hi-bridomas para anticorpos monoclonais. A invenção será ainda adicionalmente descrita pelos exemplos não-limitantes que seguem.
Exemplos Exemplo 1: Obtenção de células de pulmão de rato cotton (CRL) Quando da excisão a partir do animal eutanizado, os pulmões foram postos em meio de cultura de célula contendo meio essencial mínimo F-15 (MEM F-15, Hyclone catNo.SH30024.02) e gentamicina a 30 pg/ml. Este meio foi suplementado com antibiótico comercial (penicilina e estrepto-micina) e antimicótico (anfotericina B) a 2% v/v de concentração. Os pulmões foram digeridos a 37° C em um tubo de centrífuga cônico de 50 ml contendo 25 ml de uma solução de colagenase (Sigma, catNo.L-0130) e tripsina (Sigma, catNo.T-8003) em uma concentração de 1 mg/ml e 1X de resistência (corresponde a uma concentração de 2,5 mg/ml), respectivamente, em MEM F-15 contendo gentamicina a 30 μg/ml. Seguindo uma digestão de 30 minutos, Soro Bovino Fetal (FBS) (Bio Whittaker) foi adicionado a uma concentração final de 10% v/v. Seguindo dispersão de células usando uma pipeta e clarificação, o sobrenadante contendo células dissociadas foi coletado e posto em frascos de 25 cm2 com meio MEM-F15 contendo gentamicina a 30 pg/ml e suplementado com FBS em uma concentração final de 10% de v/v.
Exemplo 2: Cultura de Células de CRL
Uma solução de tripsina foi usada para retirar com enxágüe FBS residual de uma monocamada confluente de células de CRL obtidas no Exemplo 1. As células que formaram camadas com 0,1% (1X) de uma mistura de tripsina de porco com ácido etileno diamina tetraacético (EDTA) (JRH Bioscience, catNo.62244-79P) (3 ml para um frasco de 75 cm2, 5 ml para um de 150 cm2) foram postas em uma incubadora a 37° C e monitoradas de perto até desligamento celular estar completo. As células foram dispersas usando uma pipeta e 3 ml de suspensão celular foram coletados. Neste ponto, 1:4 das células coletadas foram culturados com meio de cultura de célula fresco contendo MEM F-15, gentamicina em uma concentração de 30 pg/ml e FBS em uma concentração v/v de 10%.
As células de CRL foram cultivadas a 37° C em incubadoras com 5% de CO2 de pressão parcial. Uma divisão 1:4 de uma monocamada con-fluente estava confluente em cerca de 4 dias, e uma divisão 1:8 produziu uma monocamada confluente dentro de cerca de 7 dias. Isso constitui uma passagem.
As células foram então propagadas a partir da passagem 2 para a passagem 76.
Após adição de crioprotetor de sulfóxido de dimetila (DMSO), bancos pequenos foram congelados em todas as passagens até 76. Os bancos foram armazenados em nitrogênio líquido.
Células de CRL da passagem 21 foram depositadas com o American Type Culture Collection, sob o número de acesso ATCC PTA3930. Exemplo 3: propagação de vírus de PRRS em células de CRL
Foi feito uso de um vírus de PRRS sabido propagar em células de rim de macaco. A propagação de vírus de PRRS foi feita em uma monocamada de células de CRL em um frasco de 75 cm2 (frasco T75) com 50 ml de meio de cultura contendo MEM F-15, gentamicina em uma concentração de 30 μg/ml e FBS em uma concentração v/v de 10%. Antes da inoculação viral, as células foram incubadas a 37° C por 24 horas, até elas estarem confluentes. Após inoculação com 1 ml de vírus de PRRS, as células inoculadas foram incubadas a 37° C por 5-7 dias. O crescimento viral foi checado através de teste de anticorpo imunofluorescente indireto (IFA) e titulação do material sobrenadante. Após congelamento/descongelamento, 0 sobrenadante foi coletado. Isso constitui uma cultura bruta de vírus de PRRS.
Teste de anticorpo imunofluorescente indireto (IFA) Para IFA, as células foram tripsinizadas, dispersas, coletadas e ressuspensas em meio MEM F-15 fresco contendo gentamicina (a 30 pg/ml) e suplementado com FBS para uma concentração de 10% v/v. As células foram semeadas em placas tratadas com cultura de tecido de 96 cavidades a 100 μΙ/cavidade e foram deixadas crescer para confluência da noite para o dia. Diluições seriais quádruplas dos vírus de PRRS foram preparadas. Então, ou 100 μΙ ou 200 μΙ do vírus diluído foram carregados em cada cavidade em uma fila da placa de 96 cavidades. A placa foi posta em uma incubadora a 37° C, 5% de C02, por 7 dias. As cavidades contendo células de CRL infectadas foram determinadas através de teste de anticorpo imunofluores-cente indireto (IFA) com um anticorpo monoclonal de vírus anti-PPRS (SDOW17, obtido da USDA; Magar R. e outros, Can. J. Vet. Res., 1995, 59(3):232-4).
Caracterização de vírus de PPRS cultivado em cultura de CRL: Vírus de PRRS foi titulado em uma placa de 96 cavidades contendo células de CRL. O título foi calculado usando o método Spearman-Karber de 50% de determinação de ponto final, e foi descrito em uma base por ml. Os resultados são expressos em Logio (FAID50)/ml. O resultado da titulação era 4,3 em Logio (FAID50)/ml.
Exemplo 4: adaptação de vírus de PRRS para crescimento em CRL e propagação Vírus de PRRS NADC8 foi adaptado para crescimento em células de CRL. NADC8 foi obtido a partir do Centro Nacional de Doença Animal (USDA).
Os vírus foram seqüencialmente propagados em co-culturas de células de CRL e células MA-104 (células de rim de macaco verde Africano, linhagem de célula de origem de MARC-145) contendo quantidade gradualmente menor de células MA-104. Inicialmente, as células de CRL foram semeadas em uma razão 1:9 com as células MA-104 (20.000 células/ml de CRL: 180.000 células/ml de MA-104) a 37° C, MEM F-154 com hidrosilato de lactalbumina (LAH, em uma concentração v/v de 0,1%), gentamicina em uma concentração de 30 pg/ml e FBS em uma concentração v/v de 10%. Quando essas co-culturas eram confluentes, vírus de PRRS foi inoculado (1 ml por frasco de T75) sem qualquer reposição de meio. O crescimento viral foi checado através de teste de anticorpo imunofluorescente indireto (IFA, conforme descrito no Exemplo 3) e titulação do material sobrenadante. As células inoculadas foram incubadas a 37° C por 5-7 dias. A passagem inclui um congelamento/descongelamento, e coleta do sobrenadante e uma sub-seqüente inoculação de 1 ml do frasco T75 de co-cultura sucessivo, isto é, cerca de 10% do sobrenadante coletado. Isso é repetido passando inóculo em co-culturas de razões de CRL-MA-104 de 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 e 9:1, respectivamente.
Finalmente, em um frasco T75, o vírus foi cultivado em uma mo-nocamada composta somente de células de CRL com 50 ml de meio de cultura contendo MEM F-15, gentamicina em uma concentração de 30 pg/ml e FBS em uma concentração v/v de 10% (então sem LAH). As células de CRL inoculadas foram incubadas a 37° C por 5-7 dias. Após congelamento/descongelamento, o sobrenadante foi coletado. Isso constitui uma cultura bruta de vírus de PRRS. OIFA mostrou que NADC 8 infectou células de CRL. Caracterização de vírus PRRS cultivado em cultura de CRL: A cepa NADC8 do vírus de PRRS foi titulada em uma placa de 96 cavidades contendo células de CRL. A cultura foi feita conforme descrito antes. O título foi calculado usando o método Spearman-Karber de 50% de determinação do ponto final, e foi descrito em uma base por ml. Os resultados são expressos em Logio (FAID50)/ml. O resultado da titulação era 4,12 em Logio (FAID5o)/ml.
Outros vírus, tal como outros vírus da Ordem Nidovirales, por exemplo, artevírus ou vírus na família Arteriviridae, por exemplo, vírus de aumento da lactato desidrogenase (LDV), vírus da arterite eqüina (EAV), vírus da febre hemorrágica simiana (SHFV), vírus na família Coronaviridae, por exemplo, coronavírus, tal como vírus da bronquite infecciosa, coronaví-rus canino, coronavírus felino, coronavírus humano 229E, vírus da diarréia epidêmica de porco, vírus da gastroenterite transmissível, vírus respiratório de porco, coronavírus bovino, coronavírus humano OC43, vírus da hepatite de murino, vírus da encefalomielite de hemaglutinação de porco, coronavírus de rato, vírus sialodacrioadenite, vírus da bronquite infecciosa de ave, coronavírus de peru, coronavírus de coelho, Torovírus tal como torovírus eqüino, torovírus de porco, torovírus humano, torovírus bovino, e outros vírus cujo hospedeiro não é naturalmente um roedor ou rato ou o rato cotton, podem ser adaptados para crescerem em células de pulmão de rato cotton, vantajosamente as células de pulmão do rato cotton ou a linhagem de célula da invenção (por exemplo, aqueles depositados), empregando técnicas aqui descritas ou técnicas análogas àquelas aqui descritas com relação à PRRS. Exemplo 5: método de inativação Vírus de PRRS propagado em CRL (exemplo 3 ou 4) são coletados. A suspensão viral é sonificada em uma temperatura de cerca de 5o C. A suspensão viral é filtrada em uma membrana de 50-100 μΙ de porosidade por volta de 5o C.
Beta-propiolactona é adicionada à suspensão viral em uma concentração final de 1/3000 (v/v). Após homogeneização através de agitação, a suspensão é transferida para um outro frasco estéril.
Inativação é realizada sob agitação por 24 horas por volta de 5o C. O pH é regulado para cerca de 7,2 através de adição de NaOH 1M. A suspensão viral inativada é concentrada através de ultrafiltra-gem de aproximadamente 50 vezes. A suspensão viral concentrada é armazenada a-40° C.
Exemplo 6: Preparação da vacina inativada na forma de uma emulsão baseada em óleo mineral A vacina é preparada com o vírus de PRRS inativado obtido no Exemplo 5 (após descongelamento e diluição) e de acordo com a fórmula que segue: - suspensão de vírus de PRRS inativado: 167 ml - fase oleosa: 83 ml A fase oleosa era 7% de volume em peso (p/v) de oleato de ani-dromanitol, 8% p/v de ácido oléico etoxilado (11 óxidos de etileno) e 85% v/v de óleo de parafina líquida leve (de acordo com a farmacopéia Européia). A fase aquosa e a fase oleosa são esterilizadas separadamente através de filtragem. A emulsão é preparada misturando e homogeneizando os ingredientes com o auxílio de um emulsificante de turbina Silverson.
Uma dose de vacina contém cerca de 107,5 CCID50 (título antes da inativação). O volume de uma dose de vacina é 2,0 ml para administração através de via intramuscular.
Exemplo 7: propagação de vírus em células de CRL
Estoques virais rotineiramente usados em ensaios como vírus de referência para os quais reagentes de anticorpo fluorescentes (FA) estavam disponíveis foram titulados usando células de CRL. Devido ao fato desses vírus de referência terem sido rotineiramente titulados usando linhagens de célula padrão, cada um tem um título conhecido com vários graus de variação. Diluições de dez vezes ou quatro vezes desses vírus de referência foram usadas para inocular células de CRL em um formato de 96 cavidades usando o método de titulação padrão para cada vírus. Seguindo 7 dias de incubação, as placas foram fixadas com acetona e tingidas com os reagentes de FA apropriados. Os títulos das culturas fluorescentes-positivas foram comparados aos títulos obtidos a partir de culturas de célula padrão. Os resultados são apresentados abaixo: Títulos de vírus são expressos em log-ιο de 50 de Dose Infecciosa de Cultura Celular por mililitro (log10 CCID5o/ml) Embora, em cada caso, os títulos gerados pelo ensaio baseado em CRL fossem menores do que aquele da linhagem de célula padrão, deve ser enfatizado que esses vírus não sofreram o processo de adaptação de célula usando células de CRL aue o vírus de referência tem com a linhaaem de célula padrão. Isso era apenas um teste para detectar qualquer replica-ção viral. Em outras palavras, com algum esforço, é provável que a concentração de vírus vivo cultivado em células de CRL pudesse ser melhorada para o grau que ela seria equivalente ou melhor do que a concentração do vírus cultivado nas linhagens de célula para os quais ele foi adaptado. Isso é mostrado pela PPRS adaptada para CRL (Exemplo 4) cujos títulos da mesma diluição serial de vírus eram 5,22 e 5,34 (log-ιο CCID5o/ml) quando células de CRL e células MARC-145 (um subclone sensível de células MA-104) foram usadas, respectivamente. Esta diferença na titulação é desprezível. A invenção é ainda descrita pelos parágrafos numerados que seguem: 1. Método de produção de vírus de PRRS, onde uma pessoa prepara uma cultura de célula de pulmão de Rato cotton e um propaga o vírus de PRRS nesta cultura celular. 2. Método de acordo com o parágrafo 1, onde a cultura celular compreende células epiteliais. 3. Método de produção de vírus de PRRS, onde uma pessoa prepara uma cultura de células a partir de uma linhagem de célula de Rato cotton e uma propaga o vírus de PRRS nesta cultura. 4. Método de acordo com o parágrafo 3, onde a cultura compreende células epiteliais. 5. Método de produção do vírus de PRRS, onde uma pessoa prepara uma cultura de célula epitelial de pulmão de Rato cotton e uma propaga o vírus de PRRS nesta cultura de célula. 6. Método de produção do vírus de PRRS, onde uma pessoa prepara uma cultura de células a partir de uma linhagem de célula epitelial de pulmão de Rato cotton e uma propaga o vírus de PRRS nesta linhagem de célula.
7. Método de acordo com o parágrafo 3 ou 6, onde a linhagem de célula é a linhagem de célula depositada no ATCC sob o número de acesso PTA-3930, ou uma linhagem de célula de pulmão de rato cotton tendo as características de identificação da linhagem de célula depositada no ATCC sob o número de acesso PTA-3930. 8. Método de acordo com o parágrafo 7, onde a linhagem de célula é a linhagem de célula depositada no ATCC sob o número de acesso PTA-3930. 9. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 8, onde o vírus de PRRS é um vírus de PRRS virulento. 10. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 8, onde o vírus de PRRS é um vírus de PRRS atenuado. 11. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 8, onde uma pessoa propaga o vírus de PRRS nas células, e uma recupera uma cultura bruta de vírus de PRRS. 12. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 8, onde uma pessoa propaga o vírus de PRRS nas células, uma recupera o vírus de PRRS dando origem a uma cultura bruta de vírus de PRRS, e uma pessoa submete esta cultura bruta à purificação dando origem a uma cultura purificada de vírus de PRRS. 13. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 8, onde uma pessoa propaga o vírus de PRRS nas células, uma recupera o vírus de PRRS dando origem a uma cultura bruta de vírus de PRRS, e uma pessoa submete esta cultura bruta à concentração dando origem a uma cultura concentrada de vírus de PRRS. 14. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 8, onde uma pessoa propaga o vírus de PRRS nas células, uma recupera o vírus de PRRS dando origem a uma cultura bruta de vírus de PRRS, e uma pessoa submete esta cultura bruta à concentração e purificação dando origem a uma cultura concentrada purificada de vírus de PRRS. 15. Método de acordo com o parágrafo 11, onde uma pessoa inativa a cultura bruta. 16. Método de acordo com o parágrafo 12, onde uma pessoa inativa a cultura purificada. 17. Método de acordo com o parágrafo 13, onde uma pessoa inativa a cultura concentrada. 19. Método de acordo com o parágrafo 14, onde uma pessoa inativa a cultura concentrada e purificada. 20. Método de acordo com o parágrafo 15, 16, 17 ou 18, onde uma pessoa inativa a cultura com um agente químico. 21. Método de acordo com o parágrafo 19, onde o agente químico é escolhido dentre o grupo consistindo em beta-propiolactona, formalina, etile-noimina e etilenoimina binária. 22. Método de acordo com o parágrafo 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19 ou 20, onde a cultura é tratada de modo a recuperar subunidades de PRRS. 23. Método de acordo com o parágrafo 9, onde o vírus de PPRS é propagado nas células e uma pessoa recupera um vírus de PPRS atenuado. 24. Vírus de PRRS ou cultura de vírus de PRRS obtida após propagação de vírus de PRRS em células de pulmão de Rato cotton. 25. Vírus de PRRS ou cultura de vírus de PRRS obtida após propagação de vírus de PRRS em linhagem de célula de pulmão de Rato cotton. 26. Vírus de PRRS ou cultura de vírus de PRRS de acordo com o parágrafo 23 ou 24, onde as células são células epiteliais. 27. Vírus de PRRS ou cultura de vírus de PRRS de acordo com o parágrafo 23 ou 24, onde as células compreendem células epiteliais. 28. Vírus de PRRS ou cultura de vírus de PRRS de acordo com o parágrafo 25, onde a linhagem de célula é a linhagem de célula depositada no ATCC sob o número de acesso PTA-3930, ou uma linhagem de célula de pulmão de rato cotton tendo as características de identificação da linhagem de célula depositada no ATCC sob o número de acesso PTA-3930. 29. Vírus de PRRS ou cultura de vírus de PRRS de acordo com o parágrafo 25, onde a linhagem de célula é a linhagem de célula depositado no ATCC sob o número de acesso PTA-3930. 30. Vírus de PRRS ou cultura de vírus de PRRS obtida realizando o método de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 20 ou 22. 31. Vírus de PRRS ou cultura de vírus de PRRS obtida de acordo com qualquer um dos parágrafos 23 a 28 sendo inativado. 32. Vírus de PRRS ou cultura de vírus de PRRS obtida de acordo com qualquer um dos parágrafos 23 a 28 sendo atenuado. 33. Preparação de um vírus de PRRS de subunidade obtida realizando o método do parágrafo 21. 34. Composição imunogênica compreendendo um vírus de PRRS ou cultura de vírus de PRRS de acordo com qualquer um dos parágrafos 23 a 31, e um excipiente, diluente ou veículo veterinariamente aceitável. 35. Composição imunogênica compreendendo uma preparação de vírus de PRRS de subunidade de acordo com o parágrafo 32, e um excipiente, diluente ou veículo veterinariamente aceitável. 36. Composição imunogênica do parágrafo 33 compreendendo ainda um estabilizador. 37. Composição imunogênica do parágrafo 33 ou 34 ou 35 compreendendo ainda um adjuvante. 38. Composição imunogênica compreendendo uma cultura de vírus de PRRS obtida através do método de acordo com o parágrafo 1. 39. Composição imunogênica compreendendo uma cultura de vírus de PRRS obtida através do método de acordo com o parágrafo 3. 40. Composição imunogênica compreendendo uma cultura de vírus de PRRS obtida através do método de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 22. 41. Vacina compreendendo uma cultura de vírus de PRRS obtida através do método de acordo com o parágrafo 1. 42. Vacina compreendendo uma cultura de vírus de PRRS obtida através do método de acordo com o parágrafo 3. 43. Vacina compreendendo uma cultura de vírus de PRRS obtida através do método de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 22. 44. Vacina compreendendo um vírus de PRRS ou cultura de vírus de PRRS de acordo com qualquer um dos parágrafos 23 a 31, e um excipiente, diluente ou veículo veterinariamente aceitável. 45. Vacina compreendendo uma preparação de vírus de PRRS de subunidade de acordo com o parágrafo 32, e um excipiente, diluente ou veí- culo veterinariamente aceitável. 46. Vacina do parágrafo 43 compreendendo ainda um estabilizador. 47. Vacina do parágrafo 43 ou 44 ou 45 compreendendo ainda um adjuvante. 48. Método de imunização de um porco compreendendo a administração ao porco de uma composição imunogênica de acordo com qualquer um dos parágrafos 33 a 39. 49. Método de vacinação de um porco compreendendo a administração ao porco de uma vacina de acordo com qualquer um dos parágrafos 40 a 46. 50. Linhagem de célula de pulmão de Rato cotton depositada com o ATCC sob o número de acesso PTA-3930 ou uma linhagem de célula de pulmão de rato cotton tendo todas as características de identificação da linhagem de célula depositada no ATCC sob o número de acesso PTA-3930. 51. Linhagem de célula de pulmão de Rato cotton depositada com o ATCC sob o número de acesso PTA-3930.
Tendo então descrito em detalhes as modalidades preferidas da presente invenção, deve ser compreendido que a invenção definida aqui pelos parágrafos acima não deve ser limitada a detalhes particulares descritos acima uma vez que muitas variações aparentes dela são possíveis sem se afastar do espírito ou escopo da presente invenção.
Claims (11)
1. Método para produção de um vírus caracterizado por compreender a propagação do vírus na linhagem de célula de rato cotton, em que o vírus é o vírus da síndrome reprodutiva e respiratória do porco (PRRSV) e em que as células do pulmão de rato cotton são a linhagem de célula de pulmão de rato cotton ATCC PTA-3930.
2. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender a etapa de colheita do vírus resultante.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato do vírus PRRS ser adaptado para crescer na linhagem de célula de rato cotton através da co-cultura de células de rim de macaco.
4. Método, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato do PRRSV ser um vírus atenuado.
5. Composição imunogênica caracterizada por compreender PRRSV e células de pulmão de rato cotton, em que as células de pulmão de rato cotton são a linhagem de célula de rato cotton ATCC PTA-3930, e que a composição compreende um excipiente, diluente, veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável ou opcionalmente um estabilizante e/ou adjuvante.
6. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de ser inativada.
7. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato do PRRSV ser um vírus atenuado.
8. Kit caracterizado por compreender PRRSV e células de pulmão de rato cotton, em que as células de pulmão de rato cotton são a linhagem de célula de rato cotton ATCC PTA-3930 .
9. Kit, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que as referidas células e vírus estão em recipientes separados.
10. Kit, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que os recipientes separados estão na mesma embalagem.
11. Kit, de acordo com uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato do PRRSV ser um vírus atenuado.
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