CZ286766B6

CZ286766B6 - Attenuated virus strain, process of its preparation, vaccine, process of its preparation, cellular clone and use of the attenuated strain

Info

Publication number: CZ286766B6
Application number: CZ19973377A
Authority: CZ
Inventors: Burch Reina Alemany; Maso Enric Espuea; Pujadas Pere Riera; Roca Narcis Saubi
Original assignee: Hipra Lab Sa
Priority date: 1996-01-25
Filing date: 1996-12-04
Publication date: 2000-06-14
Also published as: HUP9801124A3; CA2216436A1; CN1185806A; EP0835929A1; BR9604888A; PL322455A1; WO1997027288A1; JPH10507372A; ES2102971B1; PL185841B1; MX9707302A; HUP9801124A2; US6001370A; UA68326C2; KR19980703268A; ES2102971A1; CZ337797A3; JP3068204B2

Description

Atenuovaný kmen viru, způsob jeho přípravy, vakcína, způsob její přípravy, buněčný klon a použití atenuovaného virového kmene

Oblast techniky

Tento vynález se týká nového atenuovaného kmenu viru způsobujícího chorobu prasat známou jako reprodukční a respirační syndrom prasat (PRRS). Atenuační a replikační postupy virulentního kmene za použití nového klonu buněk získaného z opičích ledvin umožňují přípravu vakcín a diagnostických kitů, které dovolují časnou diagnosu PRRS a účinnou preventivní léčbu tohoto onemocnění.

Dosavadní stav techniky

V roce 1987 byla prvně detekována v Severní Americe choroba prasat, která byla vtom okamžiku definována jako „Zásadní choroba prasat“ nebo MSD, a později byla známá jako „syndrom prasečí neplodnosti a poruch respirace“, neboli SIRS. Velmi podobný syndrom byl poprvé detekován ve střední Evropě v roce 1990 a později se šířil do jiných evropských zemí, včetně Španělska. Na začátku bylo onemocnění v Evropě pojmenováno jako „Epidemické potraty a respirační syndrom u vepřů“ neboli PEARS a nakonec jako „Reprodukční a respirační syndrom prasat“ neboli PRRS. Toto pojmenování bylo ve světě akceptováno pro toto onemocnění.

Je již známo, že etiologickým agens PRRS je malý enkapsulovaný RNA virus, poprvé izolovaný v Holandsku a pojmenovaný jako Lelystad virus. Bylo naznačeno, že virus patří ke skupině Arteviridae. Tento virus byl popsán v patentové přihlášce PCT WO-92/21357 a v Evropské patentové přihlášce EP-B-0587780 (Stichting Centraal Diegeneeskundig Instituut), kde druhá je odvozená od první. Pro účel této přihlášky byl izolát výše uvedeného viru deponován v Institut Pasteur of Paris, pod čísle 1-1102.

Severoamerický typ viru byl izolován téměř simultánně s evropským typem viru, jak je popsáno v patentové přihlášce PCT WO 93/03760 (Collins et al.) a v evropské patentové přihlášce EP-A0529584 (Boehringer Ing.). Pro účely této přihlášky byl izolát výše uvedeného viru deponován v Američan Type Culture Collection (ATCC), č. VR-2332.

Evropský a severoamerický typ viru jsou jasně odlišné, nejen s ohledem na serologickou reaktivitu, ale také s ohledem na stupeň homologie sekvence nukleotidů signifikantních RNA fragmentů. Na prvních dvou stranách evropské patentové přihlášky EP-A-0676467 (Akzo) je podrobný popis těchto rozdílů, s rozsáhlou citací literatury. Ve výše uvedené patentové přihlášce je usouzeno, že evropský typ a americký typ virů jasně divergovali před dlouhou dobou. V důsledku toho může být očekáváno, že eventuální účinná vakcína proti jednomu z těchto typů bude málo ne nebude vůbec účinná proti druhému typu.

Byly izolovány různé kmeny jak z evropského, tak z amerického typu viru. Každý kmen má svou vlastní specifickou charakteristiku, a několik kmenů bylo objektem patentové přihlášky. Například, patentová přihláška PCT WO-93/07898 (Akzo) popisuje evropský kmen, a vakcínu od něho odvozenou, deponovaný v CNCM (Institut Pasteru), č. 1-1140. Patentová přihláška PCT WO93/14196 a evropská patentová přihláška EP-A-541418 (Rhone-Merieux), obě odvozené od přihlášky stejné priority, popisují nový kmen izolovaný ve Francii, deponovaný v CNCM (Institut Pasteur), č. 1-1153. Evropská patentová přihláška EP-A-0595436 (Solvay) popisuje nový kmen amerického typu, více viruentní než dříve popsané, a jeho vakcínu. Tento kmen byl deponován v ATCC, ale přírůstkové číslo není v této přihlášce podrobně uvedeno. Konečně, španělská patentová přihláška ES-A-2074950 (Canamid Iberica) popisuje takzvaný „španělský

-1 CZ 286766 B6 kmen“, který je odlišný od jiných evropských a amerických kmenů. Tento „španělský kmen“ byl deponován v European Animal Cell Culture Collection (EACCC), č. V93070108.

Závěrem, zdá se jasné, že etiologické agens PRRS ukazuje mnoho variet a pro účinný boj proti této chorobě, jsou potřeba vakcíny různých typů závisející na kmenu viru, který infikuje prasata.

U sviní je onemocnění charakterizováno ztrátou apetitu, anorexií, poruchami reprodukce (potraty, předčasnými porody, porody mrtvých nebo slabých selat a smrtí plodu, s nebo bez mumifikace). Některá infikovaná prasata mohou zemřít. Méně obvyklými příznaky je transientní mokré zbarvení uší, břicha nebo vulvy; podle tohoto byla choroba prvně známa jako „modiý potrat“ v Holandsku a „modré uši“ ve Velké Britanii. U novorozených selat může být pozorována dušnost nebo třes, zatímco u starších selat je častější posteriomí paresa a ataxie. Při vrcholu vypuknutí onemocnění je mortalita během prvních dní omezena, ale může dosáhnout až 80 % u desetidenních selat. Infikovaná krmená selata pijí méně a vykazují více respiračních problémů.

Inkubační doba onemocnění je velmi variabilní, v rozmezí od 5 do 37 dní (I.B. Robertson Europ. Comm. Comm. Seminář on PRRS, 11:4 - 5, Brussels, 1991). Někdy se onemocnění šíří velmi pomalu, ale pokud je postižena farma, pak může onemocnění přetrvávat několik měsíců (B. Thacker, Int. Symp. on SIRS, St. Paul/Minnesota, 1992).

Protilátky proti viru byly detekovány imunoperoxidasovou technikou (imunoperoxidasový monovrstevný test, zde IPMA) v den 6 po-infekci, jak je popsáno Wensvoortem, G., et al. (The Vet. Quart. 13: 121-130, 1991). Titry protilátek mohou dosáhnout 1/20 000 o pět dní později, a obyčejně persistují více než 12 měsíců. Nicméně, některá prasata se stanou seronegativními o 4 - 5 měsíců později, jak to popsal V. Ohlinger et al., Meredith, M. De. Pig Dis. Info. Center Cambridge, 12/1992. Tito autoři byli schopni izolovat virus po infekci z různých orgánů, s titrem viru dosahujícím 10⁴ TCID₅₀ (infekční dávka pro tkáňovou kulturu 50 %) 6 dní po infekci v homogenátech plic, séra, plazma a krevních buněk. Toto ukazuje, že virus a protilátky spolu mohou persistovat několik týdnů, kromě toho, je dobře známo, že zvířata, která přežívají vypuknutí onemocnění mohou být zdrojem infekce pro citlivá zvířata. Viremie může být detekována od dnu 1 po infekci a může trvat do 56 dní, ačkoliv je obvykle kratší.

Při hematogenním šíření viru může virus dosáhnout placenty pregnantních sviní. Bylo ukázáno, že virus může procházet placentou a způsobovat smrt plodu. Maximální citlivost plodu se vyskytuje během třetí třetiny gestace. Kromě toho, virus je schopen replikace v plodu bez toho, že by způsobil jeho smrt. Nicméně, virus nebyl nikdy izolován z mumifíkovaných nebo autolysovaných plodů.

U selat se nástup onemocnění projevuje tehdy, když je hladina kolostrálních mateřských protilátek snížena. U živě narozených selat od sviní infikovaných v poslední třetině březosti byly pozorovány některé případy selat s protilátkami proti viru před tím, než byla pozorována sekrece kolostra. Obvykle tato zvířata vykazují viremii při narození (C. Terpstra et al, Vet. Q. 13: 131 136, 1991).

I přes destrukci velkého počtu makrofágů nebyla imunosupresorická aktivita PRRS - způsobujícího viru jasně prokázána. Nicméně, asociované sekundární infekce jsou časté, a způsobují vážné ekonomické ztráty na prasečích farmách.

V současnosti byl PRRS virus nalezen ve většině zemí s významnou populací prasat.

V současnosti je PRRS jednou z nejvýznamnějších onemocnění postihujících prasata díky sekundárním ztrátám, jak přímým, tak nepřímým, způsobeným sekundárními agens po infekci PRRS virem.

-2CZ 286766 B6

Použití inaktivovaných vakcín redukovaných v prasečích kulturách alvoelámích makrofágů (PAM) dává akceptovatelné výsledky na laboratorní úrovní, ale účinnost v polních podmínkách závisí, částečně, na podmínkách prostředí a na chovu vakcinovaných zvířat.

Jedním z problémů, které brání získání imunologických produktů proti PRRS viru je omezená dostupnost stabilních substrátů pro replikaci viru.

Dosud mohl být PRRS virus aplifikován pouze v kulturách prasečích alveolámích makrofágů (PAM) (Wensvoort G., et al., vThe Vet. Quart. 13 : 121-130, 1991). Potřeba použití zdravých prasat jistého věku pro získání těchto makrofágů implikovala vážné překážky. Kromě toho, citlivost na virovou infekci nebyla garantována v získaných PAM, protože buněčné substráty odvozené od různých zvířat jsou již různé. Toto určovalo hlavní překážku při produkci antigenních vsádek konstantní a homogenní kvality a každá vsádka musela být hodnocena pro určení její citlivosti.

Ze všech těchto důvodů, redukovaná dostupnost stabilního kontinuálního buněčného hostitele vážně bránila studiu strategií pro získání mutantů na základě replikace PRRS viru v buněčných substrátech a selekci atenuovaných variet.

Jedním z hlavních problémů, který má být vyřešen, je potřeba neutralizace virulentního viru vyhýbající se jeho replikaci v PAM, protože replikace viru způsobuje jejich destrukci.

Z toho plyne, že adaptace viru na stabilní substrát odvozený od transformované buněčné linie poskytne vhodný nástroj jak pro získání atenuovaných mutantů, tak pro přípravu inaktivních vakcín, což eliminuje závislost a variabilitu PAM.

Patentová přihláška PCT WO-94/18311 (Miles) navrhuje propagaci jistých kmenů PRRS viru vjedinečném klonu, označeném jako klon 9009B, odvozeném od ledvinné buněčné linie afrických zelených opic, označené jako linie MA-104 (M) patentovou přihláškou, odvozené od komerční buněčné linie známé jako MA-104. V patentové přihlášce není uvedeno přírůstkové číslo uvedeného jedinečného klonu a proto je hodnocení přihlášky a reprodukování obtížné.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří atenuovaný kmen viru, způsobujícího chorobu prasat známou jako reprodukční a respirační syndrom prasat, PRRS, který zcela koresponduje depozitu s přírůstkovým číslem 1-1642 v CNCM Institut Pasteur, uloženému 23. 11. 1995.

Součást podstaty vynálezu tvoří také vakcína pro ochranu prasat proti onemocnění známému jako reprodukční a respirační syndrom prasat, PRRS, která obsahuje svrchu popsaný virový kmen a/nebo alespoň jeden virový antigen, který je možno získat od tohoto kmenu.

Podstatu vynálezu tvoří rovněž buněčný klon C8 odvozený od stabilní buněčné linie opičích ledvin MA-104, v němž je 10⁵ až 10⁷ TCID₅o/ml a který je uložen v CNCM Institut Pasteur pod depozitním číslem 1-1643.

Součást řešení tvoří rovněž použití svrchu popsaného atenuovaného kmenu viru pro výrobu vakcíny proti onemocnění prasat, známému jako PRRS.

Atenuovaný kmen PRRS viru, který je předmětem předkládaného vynálezu, byl odvozen atenuováním virulentního kmene izolovaného od infikovaných prasat ze španělské farmy. Pro splnění podmínek popisu byl tento atenuovaný kmen deponován v Collection Nationale de

-3 CZ 286766 B6

Cultures de Microorganismes (CNCM) z Institute Pasteur, s přírůstkovým číslem 1-1642. Datum uložení je 23. 11. 1995.

Atenuování virulentního kmene a replikace atenuovaného kmene byly provedeny sériovým pasážováním v buněčném klonu, který je také předmětem předkládaného vynálezu, a který byl autory označen jako Klon-8. Tento klon je odvozen od komerční opičí ledvinné buněčné linie známé jako MA-104. Také pro splnění podmínek popisu bylo provedeno uložení klonu-8, ve stejný den jako je uvedeno výše, v CNCM z institut Pasteur, s přírůstkovým číslem 1-1643.

Nejprve, komerční buněčná linie MA-104 byla klonována pro selekci a při izolaci klonu 8. Toto klonování bylo provedeno suspendováním buněk ve vhodném kultivačním mediu (např. Earlovu minimálním esenciálním médiu (Earle's MEM) s fetálním hovězím sérem (FBS)), umístěním suspenze při různých koncentracích, selekcí a trypsinizováním klonů a jejich expandováním v kultivačních nádobách. Klony získané tímto způsobem byly postupně klonovány za použití popsaných technik, dokud nebyly získány dobře diferencované klony.

Po odstranění klonů, které vykazovaly nepravidelné chování nebo které bylo obtížné amplifíkovat, byly selektované klony testovány s ohledem na citlivost k infekci k počátečnímu virulentnímu kmenu PRRS viru. Klon 8 byl selektován díky své vysoké citlivosti pro replikaci virového kmene (vysoké TCID₅o) a reprodukovatelnosti a konzistenci získaného výnosu viru.

Virulentní kmen byl atenuován sekvenční replikací v kulturách klon-8, preferenčně při 34 °C. Obsah infekčních virových částic byl určen pro hodnocení relikační životaschopnosti a cytopatický účinek (CPE) byl vyšetřován s cílem určit stupeň adaptace. Podle získaných výsledků je virus schopen replikace v klonu-8 bez ztráty životaschopnosti, alespoň po dobu 20 pasáží, a atenuací vzniká prakticky neškodný virus, který si zachovává svou antigenní aktivitu.

V důsledku toho je získán atenuovaný kmen PRRS viru, který je předmětem předkládaného vynálezu, stabilním a průmyslově reprodukovatelným způsobem, což usnadňuje jeho použití pro získání PRS vakcín a PRRS diagnostických kitů.

Srovnávací testy mezi skupinami prasat infikovanými buď virulentním kmenem, nebo atenuovaným kmenem jasně ukázaly, že atenuovaný kmen je neškodný pro zvířata, která jsou jím infikována. Na druhou stranu, atenuovaný kmen, který je předmětem předkládaného vynálezu, vykazuje vysokou replikační účinnost u seronegativních prasat a je schopen vyvolat serokonverzi u zvířat inokulovaných dávkou 200 TCID50 intramuskulámě. Protilátky vyvolané tímto způsobem persistují alespoň 80 dní.

Dále, atenuovaný kmen, který je předmětem předkládaného vynálezu, je výborným základem pro přípravu vakcín pro preventivní léčbu prasat proti PRRS. Takové vakcíny mohou být připraveny za použití dobře známých metod odborníky v oboru a v různých běžných formách, jako jsou vodné disperze, olejové emulse, liposomové kompozice, lyofilizované formy atd. Vakcinové kompozice mohou být doplněny různými adjuvans, jako jsou imunostimulans, emulsifikátory, stabilizátory, atd. Vakcíny mohou být podány intramuskulámě nebo subkutálně, intranasálně, intratracheálně, kutálně, perkutálně nebi intrekutálně.

Účinné dávky vakcíny se budou velmi lišit, v preferované formě rozmezí od 10² do 10⁶ TCID50 atenuovaného kmenu, který je předmětem předkládaného vynálezu.

Získané vakcíny, také předmět předkládaného vynálezu, mohou být také formulovány jako polyvalentní vakcíny, spolu s jiným živým nebo inaktivovaným virem prasat, nebo spolu s živou nebo inaktivovanou bakterií.

-4CZ 286766 B6

Jak je odborníkům v oboru zřejmé, mohou být také připraveny vakcíny obsahující virové antigeny odvozené od virového kmene, který je předmětem předkládaného vynálezu, například vakcíny obsahující uvedený kmen ve zcela inaktivované formě za použití jakékoliv běžné metody, například tepelné nebo chemické metody, vakcíny obsahující obaly nebo RNA fragmenty uvedeného kmenu a podobně.

Atenuovaný kmen, který je předmětem předkládaného vynálezu, může být také použit pro přípravu vhodných diagnostických kitů - za použití běžných technik - obsahujících antigenní elementy schopné detekovat protilátky u séropozitivních zvířat. Například, IPMA postupy pro detekci PRRS protilátek mohou obsahovat následující kroky:

a) Adaptaci atenuovaného kmenu, který je předmětem předkládaného vynálezu, na stabilní buněčnou kulturu, preferovaně klon-8, na kultivační mikroplotně, tak, že každá jamka je infikována asi okolo 20 - 40 infekčními částicemi.

b) Fixaci infikovaných buněk na pevnou fázi za použití známých fixačních látek.

c) Detekci sérových protilátek prasat jejich inkubací na mikroplotně, a potom barvením uvedených protilátek na mikroplotně IMPA technikami.

Přehled obrázků na výkresech

Dvě strany se čtyřmi obrázky jsou připojeny k předkládanému popisu a jsou jeho součástí. Obrázky jsou ilustrativní a nijak neomezují předkládaný popis.

Obrázek 1 ukazuje dvourozměrný obrázek reprezentující vývoj rektální teploty u březích prasnic inokulovaných intranasálním způsobem atenuovaným kmenem, který je předmětem předkládaného vynálezu.

Obrázek 2 je dvourozměrný obrázek reprezentující vývoj hmotnosti selat, která se narodila prasnicím inokulovaným atenuovaným kmenem, který je předmětem předkládaného vynálezu.

Obrázek 3 je dvourozměrný obrázek reprezentující kinetiku kolostrálních protilátek jak byla určena IPMA, v potomstvu prasnic vakcinových atenuovaným kmenem, který je předmětem předkládaného vynálezu. Nízké titry u potomstva prasnic 1 a 10 při narození jsou způsobeny skutečností, že některá selata ještě nesála kolostrum v době odběru krve.

Obrázek 4 ukazuje trojrozměrný obrázek reprezentující vývoj protilátkové odpovědi u selat inokulovaných intramuskulámí cestou 200, 2000, a 20 000 TCID₅₀ atenuovaného kmenu, který je předmětem předkládaného vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Je ukázáno několik příkladů postupů s cílem podrobněji ilustrovat popis předkládaného vynálezu. Takové příklady neomezují rozsah vynálezu.

Příklad 1: Získání buněčných klonů ze stabilní buněčné linie opicích ledvin MA-104.

Šest pasáží selektovaného PRRS virulentního kmene bylo provedeno za použití stabilní buněčné linie opičích ledvin MA-104 dodané od European Animal Cell Culture Colection (EACCC), přírůstkové číslo 85102918, ve statické kultivační buněčné monovrstvě kultivované v plastových

-5 CZ 286766 B6 kultivačních nádobách v Earle's MEM médiu doplněném 10% fetálním hovězím sérem (FBS), při 37 °C a bez doplňování CO₂. Sklizeň viru byla provedena 6-7 dní po inokulaci v každé pasáži.

Pro studium zisku virové sklizně byla buněčná linie inokulována virulentním kmenem při různých silách infekce (zde MOI). Výtěžky sklizně viru byly nízké (mezi 10³ a 10⁴ TCID₅₀/ml) a nedostatečné pro použití v produkci vakcíny, i po čtyřech adaptačních pasážích.

V těchto pokusech bylo pozorováno, že pouze část infikovaných buněk byla citlivá na virulentní virus, zatímco zbytek buněk zůstával refraktemí na infekci. Z tohoto důvodu byla buněčná linie klonována s cílem selektovat tu populaci buněk, která je zcela citlivá na virulentní kmen.

Klonování selekce byla provedena následovně:

Suspenze buněčné linie byla ředěna v Earle MEM s 20% FBS a různá ředění byla umístěna do 96 jamkové mikroplotny (NUNC^R). Plotny byly inkubovány po 8 dní při 37 °C v 5% CO₂. V den 3 byly jamky obsahující pouze jednu buňku identifikovány mikroskopicky a byly trypsinizovány v den 8. Tímto způsobem bylo získáno 44 klonů. Potom byly získány klony expandovány v kultivačních nádobách, dokud nebyla získána suspenze 5 x 10⁷ buněk/ml. Tyto buňky byly potom klonovány podruhé a potřebí za použití stejného postupu.

Po třetím klonování bylo 44 získaných klonů expandováno, dokud nebylo získáno 25 ml buněčné suspenze každého klonu obsahujícího 6 x 10⁶ buněk/ml. Médium použité v tomto procesu obsahovalo 20% FBS.

Tyto klony byly dále selektovány podle jejich růstových charakteristik a podle jejich životaschopnosti.

Příklad 2: Selekce buněčného klonu klon-8

Klony získané v předchozím příkladu byly hodnoceny podle jejich růstové účinnosti, a ty, které vykazovaly amplifikační problémy, nepravidelnou morfologii neboje bylo obtížné udržovat při 37 °C, byly odstraněny. 35 klonů bylo odstraněno po této předchozí selekci a zbylých 9 klonů bylo selektováno.

Selektované buněčné klony byly infikovány PRRS virem virulentního kmene při osmi pasážích viru (P-8) a PAM kulturách (jak popsal Bloemberg, M. et al., Vet Microb. 42 : 361 - 371, 1994). Adaptační proces pro buněčné klony byl proveden před tím: virus byl replikován při 37 °C během 3 pasáží udržováním 80 - 90% konfluentní monovrstvy v kontaktu s virovou suspenzí během 6 dnů a potom zmražen při -80 °C a rozmražen o 24 hodin později.

Earle MEM doplněné 10% FBA a gentamycinem (0,4 mg/ml) bylo použito jako infekční médium. Nebyly použity ani sloučeniny proti houbám, ani sloučeniny proti kvasinkám. Každá sklizeň viru získaná tímto způsobem byla titrována v korespondujícím buněčném klonu. Po analýze výsledků bylo uzavřeno, že 9 klonů bylo citlivých na virovou infekci, s titrem rovným nebo větším než 10^{4 2} TCID₅o/ml. Výsledky jsou ukázány v tabulce 1.

-6CZ 286766 B6

Tabulka 1: Sensitivita získaných buněčných klonů k selektovanému virulentnímu kmenu

Klon nebo buněčná linie	Titr jako TCID₅o/ml
neklonovaná buněčná linie	10³
klon 1	10⁵⁷⁵
klon 2	10⁴⁵
klon 3	10⁵²
klon 4	10⁵³
klon 8	10⁶
klon 29	10⁵⁷⁵
klon 30	10⁵³⁸
klon 41	10⁵³⁸
klon 44	10⁴²

Jak je vidět v tabulce 1, neklonovaná buněčná linie vykazuje velmi nízkou sensitivitu pro virus a proto se její použití jako antigenu pro získání účinné vakcíny nezdá možné. Tabulka 1 také ukazuje, že některé klony, zejména klon 8, jsou více sensitivní k viru než neklonovaná buněčná linie. Klon-8 je zejména zaznamenání hodný. Titry vyšší než 10⁶ TCID₅o/ml mohou být získány při sklizni viru z klonu-8.

V souladu s výsledky popsanými výše byl selektován klon-8. Bylo provedeno několik testů pro stadium spolehlivosti tohoto klonu. V různých testech byly titry virové sklizně vysoce reprodukovatelné, s hodnotami mezi 10⁵ a 10⁷ TCID₅o/ml.

Příklad 3: Získání atenuovaného kmene viru

Atenuovaný kmen viru, který je předmětem předkládaného vynálezu, byl získán replikací selektovaného virulentního kmenu při 34 °C v klon-8 buněčných kulturách.

Virem infikované monovrstvy buněk klonu 8 byly udržovány při 34 °C dokud nebylo vyvinuto CPE. CPE bylo detekováno 24 a 48 hodin později než v kulturách udržovaných při 37 °C. Nicméně, nebyly nalezeny žádné signifikantní rozdíly ve vlastnostech CPE vyvinutých při obou teplotách.

Vzniklé virové sklizně byly titrovány za použití buněčných mono vrstev klonu-8. Dále byla identita viru ověřena IMPA.

Virus byl inokulován do 75 cm² buněčné monovrstvy klonu-8 okolo konfluence a byla umožněna adsorpce při 34 °C po 2 hodiny. Potom bylo infekční médium přidáno k monovrstvě. Infekčním médiem bylo Earle modifikované minimální esenciální médium doplněné 10% FBS a předem ohřáté na 34 °C.

cm² nádoby byly umístěny při 34 °C v inkubátoru a denně kontrolovány, dokud nebylo pozorováno CPE. Když 80 - 95 % buněčné monovrstvy vykazovalo CPE, obvykle mezi 5 a 7 dnem po infekci, byla provedena virová sklizeň. Virová sklizeň byla potom centrifugována při 2000 rpm a supematant byl titrován pro určení titru viru (TCID₅o/ml).

Za použití výše popsané metody bylo provedeno 20 pasáží. Obsah viru byl hodnocen při pasáži P.l, P.5, P.10 a P.20. Výsledky ukazují, že virus může být replikován v buněčné monovrstvě klonu-8 při 34 °C, bez jakékoliv ztráty životaschopnosti, alespoň do pasáže P.20 (tabulka 2).

-7CZ 286766 B6

Tabulka 2: Vývoj viru propagovaného v klonu-8 při 34 °C od pasáže P.l do pasáže P.20.

Pasáž v klonu-8	Obsah viru v TCID₅o/ml
P.l	10⁵⁵
P.5	10⁵⁷
P.10	10⁵⁵
P.15	10⁵⁶
P.20	10⁶²

Další výsledky potvrdily, že klon-8 buněčná monovrstva může být infikována při MOI 0,001.

Pokusy provedené podle následujícího příkladu ukázaly, že od P.20 odvozený kmen viru byl neškodný pro prasata.

Příklad 4: Biologická charakteristizace atenuovaného virového kmene a účinky vakcinace tímto kmenem

Počátečním virovým kmenem použitým pro získání atenuovaného kmene viru, který je předmětem předkládaného vynálezu, je virulentní kmen. Hlavní účinky na březí svině jsou předčasné porody a slabá, mrtvá a/nebo mumifikovovaná novorozená selata. Infikované svině také ukazují depresi a 3 - 5 denní periodu mírné anorexie v den 4 - 5 po infekci.

Čtyři těhotné svině (označené 01, 02, 03 a 06) byly infikovány intranasálně 10⁶⁶ TCID₅₀ počátečního virulentního kmene. Dvě neinfikované svině (označené 73 a 74) byly použity jako kontroly. Výsledky jsou ukázány v tabulce 3.

Tabulka 3: Účinky na potomstvo březích sviní inokulovaných virulentním virem

Svině č.	Inokulace virulentním virem	Počet narozených selat	Počet mrtvých selat do odstavení
živá	mrtvá	mumifikovaná
01	+	10	2	0	2
02	+	15	0	0	4
03	+	6	5	0	2
06	+	6	6	0	1
73	—	13	0	0	0
74	-	10	0	0	0

Pouze infikované svině porodily v očekávaném datu. Infikované svině měly 2, 0 5 a 6 mrtvě narozených selat a 2, 4, 2 a 1 slabých selat, v příslušném pořadí. Slabá selata zemřela několik dní po narození. Při odstavení bylo průměrně 11 selat od každé kontroly naživu. Pouze průměrně 6,5 selat od každé infikované svině bylo naživu při odstavení. Při odstavení byla průměrná hmotnost selat 4,621 g (selata od infikovaných sviní) a 5,365 g (selata od kontrolních sviní). Virulentní PRRS virus byl izolován z homogenizovaných plic slabých selat. Po vystavení infekci jak infikované svině, tak jejich potomstvo sérokonvertovalo.

Byla provedena biologická charakterizace atenuovaného kmenu viru, který je předmětem předkládaného vynálezu, podle specifických testů, za použití prasat obou pohlaví. Test neškodnosti byl proveden u 3 PRRS séronegativních březích sviní z malé farmy, kde PRRS infekce nebyla nikdy detekována. Svině byly inokulovány v poslední třetině těhotenství, kdy je sensitivita na virus maximální. Dávka 10⁶ TCED₅o/svini atenuovaného viru byla podána intranasálním

-8CZ 286766 B6 způsobem mezi dnem 78 a 93 březosti. Po inokulaci viru zůstaly fyziologické konstanty třech sviní nezměněny a rektální teplota byla v mezích normálu (viz obr. 1). Tři svině také vykazovaly očekávaná data. Získané výsledky jsou shrnuty v tabulce 4.

Tabulka 4: Účinky na potomstvo březích sviní inokulovaných atenovaným virem

Svině č. Inokulace ate- Počet narozených selat Počet úmrtí způsobených nuovaným virem živá mrtvá mumifikovaná PRRS do odstavení

1	+	13	0	3
2	+	4	1	0
10	+	16	0	1

Tři svině porodily 13, 4 a 1 selat, v příslušném pořadí. Vitalita novorozených selat byla považována za normální. Nicméně, několik mumifikovaných selat bylo nalezeno v potomstvu dvou sviní. Toto může být považováno za normální vzhledem k velkým vrhům těchto sviní. Vývoj hmotnosti selat byl ve všech případech považován za normální (viz obr. 2) a byl do konce pozorování v normálních mezích (45 dní). Symptomy slabosti a onemocnění, které mohou souviset s infekcí PRRS virem, nebyly pozorovány u jakéhokoliv selete. Dále, PRRS virus nebyl detekován ani v krvi, ani ve vzorcích séra od novorozených selat.

Stejně tak nebyl PRRS virus detekován ve vzorcích krve a séra od březích sviní 21-36 dní po inokulaci viru. Všechny tyto skutečnosti potvrzují neškodnost atenuovaného kmene PRRS u březích sviní, které jsou nejcitlivější kategorií pro infekci přirozeným typem viru. Všechny vzorky séra od novorozených selat od inokulovaných březích sviní byly negativní, když byly vyšetřovány na přítomnost PRRS viru a PAM kulturách za použití běžných technik. Tři svině inokulované atenuovaným virem měly humorální protilátky stitry IPMA 1/480 v den 45 po porodu, s tím, že byly stabilní s malými odchylkami od tohoto dne. Svině byly séropozitivní již 21 den po inokulaci. Jak je vidět na obrázku 3, selata od inokulovaných sviní byly séropozitivní po sání kolostra a zůstávaly séropozitivní alespoň po 75 dní věku.

Další test neškodnosti byl proveden ve skupině 12 březích sviní v poslední třetině těhotenství. Osm sviní bylo vakcinováno intramuskulámě 39 dávkami vakcíny (10⁵ TCID₅₀) a zbylé čtyři svině byly použity jako kontroly pro hodnocení účinků atenuovaného kmene na parametry reprodukce. Žádné změny nebyly pozorovány ve fyziologických parametrech vakcinovaných sviní, které ukazovaly očekávaná data. Výsledky jsou kázány v tabulce 5. Jak je vidět z této tabulky, jak osm inokulovaných sviní, tak čtyři kontrolní svině vykazovaly normální počet selat. Selata také měla normální životaschopnost.

-9CZ 286766 B6

Tabulka 5: Účinek inokulace atenuovaného viru a parametry reprodukce u březích sviní v poslední třetině březosti

č. svině	vakcinovaná	Odchylka od očekávaného data porodu (ve dnech)	Počet živých selat (A)	Počet selat vážících méně než skupina s průměrnou hmotností (B)	Počet selat pfi narození slabých (C)	Počet mrtvě narozených selat (D)	Počet mumifikovaných selat (E)	Celkový počet selat (F)
86	ano	K+)	11	1	0	1	0	12
94	ano	0	9	0	0	0	1	10
96	ano	K+)	13	2	1	0	0	13
102	ano	2(+)	13	1	0	1	2	16
116	ano	0	10	0	0	1	0	11
121	ano	K+)	11	0	0	1	0	12
143	ano	i (-)	14	2	1	2	1	17
151	ano	2(+)	8	0	0	0	0	8
76	ne	2(+)	7	0	0	0	2	9
79	ne	0	13	2	1	1	0	14
81	ne	I (-)	9	0	1	0	0	9
83	ne	LA)	10	1	0	1	1	12

A zahrnuje BaC:F = A + D + E

Atenuovaný virus, kteiý je předmětem předkládaného vynálezu, se účinně replikuje v PRRS séronegativních selat. Toto je demonstrováno skutečností, tak malá dávka, jako je 200 TCID₅₀podaná intramuskulámě může replikovat a indukovat sérokonverzi u prasat. Jak je vidět z obrázku 4, indukované protilátky persistují po dobu alespoň 52 dní u inokulovaných zvířat.

Atenuovaný virus, který je předmětem předkládaného vynálezu, se nešířil na čtyři neinokulovaná sentinelová selata umístěná spolu se skupinou osmi intramuskulámě inokulovaných selat. Skutečnost, že virus není přenášen na nevakcinovaná zvířata ilustruje vhodnost atenuovaného kmenu pro vakcínu. Kromě toho, u vakcinovaných prasat nebyla pozorována žádná leukopenie ani jiné klinické příznaky, které by ukazovaly na to, že atenuovaný virus je také neškodný, pokud je podán intramuskulámě. Průměrně 86 % inokulovaných selat se stalo séropozitivními již 11 den po inokulaci.

Atenuovaný virus, který je předmětem předkládaného vynálezu, indukuje protektivní imunitní odpověď u vakcinovaných prasat, která brání klinickým účinkům infekce virulentním PRRS kmenem. Tak nebyly žádné klinické příznaky pozorovány u 75 % čtyři týdny starých vakcinovaných selat, pokud byly infikovány virulentním virem. Na druhou stranu, jak je vidět z tabulky 6, 80 % nevakcinováných kontrolních selat mělo signifikantní zvýšení rektální teploty po pokusné infekci. Dále, při nekropsii provedené 19 dnů po pokusné infekci vykazovala vakcinovaná selata signifikantně menší plicní lése než kontrolní nevakcinovaná selata. Podobně, po pokusné infekci byl virulentní virus nalezen pouze u 25 % vakcinovaných zvířat, zatímco u nevakcinovaných kontrolních zvířat mohl být virulentní virus nalezen alespoň 12 dní po infekci u 80 %.

Tabulka 6: Hypertermie u vakcinovaných a kontrolních selat po infekci

	Počet selat s hypertermií / celkový počet selat	Počet dní s hypertermií
Vakcinovaná selata	1/4	1
(intramuskulámě)
Nevakcinovaná selata	4/5	8

-10CZ 286766 B6

Informace o deponování mikroorganismů

Podle Budapešťské smlouvy byly jak virový kmen, tak klon 8, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, deponovány v Intemational Authority of the Collection National de Cultures de Microoganismes (CNCM) Institut Pasteur, Paris, (France)

Identifikace přehlašovatele

VP-046-BIS

CNCM č.

Datum uložení

1-1642

23.11.1995

Clon-8

1-1643

23.11.1995

Tato depozita jsou k dispozici veřejnosti za podmínek specifikovaných v Budapešťské smlouvě. Toto nemůže být interpretováno jako licence pro provádění předmětu předkládaného vynálezu, což by bylo porušení práv přihlašovatele předkládaného vynálezu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Atenuovaný kmen viru způsobujícího chorobu prasat známou jako reprodukční a respirační syndrom prasat (PRRS) CNCM 1-1642.
2. Vakcína pro ochranu prasat proti onemocnění známému jako reprodukční a respirační syndrom prasat (PRRS), která obsahuje virový kmen nárokovaný v nároku 1 a/nebo alespoň jeden virový antigen, který je možné získat od tohoto kmenu.
3. Vakcína podle nároku 2, kde virový antigen je inaktivovaný virus.
4. Vakcína podle nároku 2, která obsahuje mezi 10² a 10⁶ TCID50 atenuovaného kmene viru.
5. Vakcína podle nároku 2 nebo 3, kde dávka vakcíny obsahuje množství virového antigenu, které je ekvivalentní množství produkovanému mezi 10² a 10⁶ TCID₅₀ atenuovaného kmene viru.
6. Vakcína podle jakéhokoliv z nároků 2 až 5, která obsahuje další imunostimulační adjuvans a/nebo emulsifíkátory a/nebo stabilizátory.
7. Buněčný klon C8 CNCM 1-1643 odvozený od stabilní buněčné linie opičích ledvin MA104, v němž je virus podle nároku 1 schopen replikace až do vysokého titru 10⁵ až 10⁷TCIDjo/ml.
8. Způsob přípravy atenuovaného kmenu PRRS viru podle nároku 1, v y z n a č u j í c í se tím, že se virulentní kmen modifikuje postupným pasážováním v buněčném klonu podle nároku 7.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že se při postupném pasážování udržuje teplota 34 °C.
10. Způsob přípravy vakcíny proti PRRS podle nároku 2, vyznačující se tím, že se virový kmen podle nároku 1 propaguje v buněčném klonu podle nároku 7.

-11CZ 286766 B6
11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že se virový kmen propaguje při teplotě 34 °C.
12. Způsob podle některého z nároků 10 nebo 11, vyznačující se tím, že se získaný atenuovaný kmen zpracuje na vodnou disperzi, olejovou emulzi, prostředek typu liposomů nebo na lyofilizovaný prostředek, popřípadě spolu s pomocným prostředkem a/nebo emulgátorem a/nebo stabilizátorem.
13. Způsob podle některého z nároků 10ažl2, vyznačující se tím, že se získaný kmen zpracovává působením tepla nebo chemickým způsobem až do úplné inaktivace.
14. Použití atenuovaného virového kmenu podle nároku 1, pro výrobu vakcíny proti onemocnění prasat, známému jako PRRS.
15. Použití atenuovaného virového kmene podle nároku 1 pro výrobu kitů pro detekci onemocnění PRRS u prasat.