JPH05276940A - 豚ミステリー病に関連するウイルス性因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 豚不育症及び呼吸器症候群ウイルスの増殖・
単離及び弱毒化の方法並びに弱毒化したウイルスを含む
生ワクチンの提供を目的とする。 【構成】 血清の存在下に増殖培地中でサルの細胞のシ
ート上に豚不育症及び呼吸器症候群ウイルスを接種し、
約３４℃乃至約３７℃にて細胞病理的作用が観察される
までインキュベートすることよりなる、該ウイルスを増
殖・単離する方法、該ウイルスを血清の存在下にｐＨ約
７．６にて約３５乃至約３７℃で、維持培地上のサルの
細胞株に約２５回継代接種し、次いで血清の存在下にｐ
Ｈ約７．６にて約３１℃で、維持培地上のサルの細胞株
に約１２回継代接種することよりなる、該ウイルスを弱
毒化する方法、並びに、該毒化弱毒化したウイルスを含
んでなる生ワクチン。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】〔背景〕最近、群れの繁殖に重大な損失を
引き起こす、明らかに新しい豚の疾患が、合衆国におい
て及びカナダのある地域において出現している（Keffab
er,K.K., "Reproductive Failure of Unknown Etiolog
y", American Association of Swine Practitioners Ne
wsletter, 1:109(1989). ）。類似の疾患が、ドイツの
ある地域、オランダ、並びに英国及びスペインにおいて
も報告されている（Wensvoort, G. et al., "Blue Ear
Disease of Pigs", Vet. Rec., 128:574(1991).)。

【０００２】この疾患の最も顕著な臨床的症状は、健康
そうに見えその後まともに育たず又は呼吸障害、中枢神
経系症状を発現しそして死亡するいくらかの子豚と共
に、死んだ又は病弱な子豚を生むことである。罹患した
群れのあるものでは、全子豚の７５％までが失われ得
る。この疾患の経済的帰結は、従って、破壊的である。
それは、「豚ミステリー病」("mystery swine diseas
e") 、豚不育症及び呼吸器症候群（ＳＩＲＳ）、「青耳
病」("blue ear disease")、及び豚繁殖及び呼吸器症候
群と呼ばれてきた。

【０００３】ＳＩＲＳは、繁殖不全、呼吸器疾患、並び
に、食欲不良、発熱、呼吸困難及び軽い神経学的兆候を
含む種々の臨床的兆候によって特徴づけられる、明らか
に感染性疾患である。この疾患は、あらゆるタイプの養
豚施設を冒しており、今日の養豚業に悪影響を与える最
もコストのかかる疾患に含まれよう（Polson, D.P. et
al., "Financial Implications of Mystery Swine Dise
ase", Proceedings, Livestock Conservation Institut
e, Denver, CO (October 6, 1990).) 。

【０００４】雌豚の感染は気付かれないか、又は、１乃
至２、３日続く損なわれた全身状態によって明らかとな
ろう。例えば、雌豚は、食欲をなくし、正常より高い又
は低い体温を示すであろう。出産相において、疾患の兆
候は、抑鬱、嗜眠、発熱、時折の嘔吐、流産、死産及び
／又はミイラ化した胎仔の出産を含む。最も頻繁な臨床
的兆候は、死産の豚数の劇的増加である。死産の数は、
感染した群れにおける全ての出産の２０％乃至３０％に
達し得る。死産として出産された胎仔の多くは軟化して
おり、死後２４乃至４８時間を経過しているように見え
るであろう。

【０００５】上述のように、ＳＩＲＳの主要な構成要素
は、未熟仔出産、後期流産、生まれつき弱い豚、増加す
る死産、ミイラ化した胎仔、低下した出産率及び発情期
の復帰の遅れとして明らかとなる繁殖不全である。その
ような臨床症状は、典型的には、群れにおいて４乃至１
６週、又はより長く、観察されるであろう。日焼け様の
褐色の皮膚変色及び死後自己融解によって明らかである
ように、感染した一腹の胎仔中の死産胎仔は、しばしば
ミイラ化の初期段階にある。胎仔の頭骨のドーム形の奇
形が時折みられる。

【０００６】呼吸器疾患の臨床的兆候は、３週齢未満の
子豚においては最も顕著であるが、感染した群れの全て
の週齢の豚に起こることが報告されている。罹患した子
豚の成長は遅く、粗い体毛、呼吸困難（「サンピング」
（"thumping"）) 及び高い死亡率（離乳前死亡率が約８
０％にのぼる）を有する。

【０００７】ＳＩＲＳに罹患した豚の全体的な及び顕微
鏡的病変についての予備的研究における知見は、顕微鏡
的肺病変がこの疾患の重要な臨床的特徴であることを示
唆している。顕著な呼吸器兆候にも拘わらず、細菌の二
次感染による合併症のない肺は、全体的に正常か、又
は、肺表面の軽い散在性の日焼け様の褐色の変色を有す
るかのいずれかである。ＳＩＲＳに罹患した子豚の肺組
織の顕微鏡的検査は、しかしながら、間質性肺炎の特徴
的なパターンを明らかにしている（Collins, J.E. et a
l. "Respiratory Disease in a Swine Herd Experienci
ng a Reporductive Failure Syndrome", Proceedings,
Minnesota Swine Conference for Veterinarians, p. 2
54, St. Paul, MN (September 10-18, 1990).)。

【０００８】ＳＩＲＳ又は「豚ミステリー病」の発生
は、合衆国に拡がっており、少なくとも１１の州におい
て報告されている。刊行された文献に報告されていると
ころによれば、研究されている主要な原因因子は、脳心
筋炎ウイルス（ＥＭＣ）、豚インフルエンザウイルス
（ＳＩＶ）、マイコトキシン及びクラミジアを含む。

【０００９】〔本発明〕ＳＩＲＳ感染群の子豚から得た
組織ホモジネートは、ノトバイオートの子豚と妊娠雌豚
に経鼻的に接種したとき、一貫してＳＩＲＳの呼吸器及
び繁殖形態を再現した。濾過した又は濾過しない（０．
４５、０．２２又は０．１μｍ）接種物で接種されたノ
トバイオート子豚は、食欲不良におちいり、ＳＩＲＳ罹
患群に見られる病変に類似の顕微鏡的肺病変を発現し
た。同じ接種物はまた、ＳＩＲＳ感染群にみられるのと
同一の繁殖上の効果を引き起こした。その組織ホモジネ
ートからウイルス性因子が回収された。このウイルス性
因子は、子豚及び妊娠した雌豚にＳＩＲＳ類似の疾患を
引き起こすものである。このウイルス性因子の寄託は、
１９９１年７月１８日に、受託番号ＡＴＣＣ−ＶＲ２３
３２のもとに、American Type Culture Collection, Ro
ckville, Maryland になされた。このウイルス性因子
は、気難しい、非血液凝集性のエンベロープを有するＲ
ＮＡウイルスである。

【００１０】Ａ．単離 ＳＩＲＳ感染群の感染子豚から得た肺組織、及び、脳−
脾臓−肝臓−腎臓を合わせた組織を、別々にホモジナイ
ズした。各ホモジネートを、約１００μｇ／ｍＬのゲン
タマイシンを含む改良イーグル培地（ＭＥＭ）と混合し
た。両サンプルを約４０００×ｇで約２５分間遠心し
た。上澄を次いで取り除き、０．４５μｍのフィルター
を通して濾過した。組織及び肺ホモジネートを次いで合
わせ、この合わせた材料を、種々の組織培養瓶を感染さ
せるのに使用した。

【００１１】７５ｃｍ² のプラスチック瓶を用いて２つ
の試験を行った。試験番号１においては、合わせた材料
は２つの瓶の、以下に掲げた各細胞株の完全な細胞シー
トに接種した。更に、各細胞株の瓶の１つに、約２．５
ｍｇのトリプシンを加えた。他の条件は全て、各瓶の細
胞株につき同一であった。血清は培地には含まれなかっ
た。接種量は約１ｍＬとした。全ての瓶を、約７日間約
３４℃に保った。約７日の終りに、結果を記録した。凍
結しそして解凍した後、同じ細胞株中における第２の継
代接種のためにサンプルをとった。残った材料は凍結
し、約−６０℃にて貯蔵した。

【００１２】試験番号２においては、合わせた材料は、
試験番号１において使用したのと同じ細胞株を含有する
瓶に接種した。しかしながら、接種時に細胞シートは２
０乃至４０％のコンフルエントに過ぎなかった。培地は
約１０％の胎仔牛血清を含んでいた。やはり接種量は約
１ｍＬとし、培養物は約３４℃にて約７日間インキュベ
ートした。試験番号１及び試験番号２の両試験の結果を
以下にまとめる。

【００１３】

【表１】

【００１４】試験番号１では、評価した細胞株のいずれ
においても、細胞病理的作用は観察されなかった。試験
番号２では、しかしながら、ＭＡ−１０４細胞の小さい
塊が膨らんで、瓶の縁の周りの単一細胞層に「弱い穴」
を形成し始めた。液体を瓶から分離し、ＭＡ−１０４細
胞の新しい瓶（やはり２０乃至４０％細胞シート）に継
代接種し、次いでその後３回目の継代接種を行った。細
胞病理的作用（ＣＰＥ）は、各継代接種と共に強くなっ
た。上記の手順を完全な細胞シートを用いてＭＡ−１０
４細胞株で繰り返した。ＣＰＥも観察された。更なる試
験はまた、ウイルス性因子が約３７℃においても増殖す
るであろうことをも実証した。血清の存在は、ウイルス
性因子の最初の単離にとって役立つであろう。ＭＡ−１
０４細胞株におけるウイルス性因子の以降の継代培養
は、血清の存在なしにＣＰＥを発現するであろう。しか
しながら、より顕著なＣＰＥは、ＭＡ−１０４細胞株に
ついて増殖培地中で血清を使用した場合に観察される。

【００１５】ウイルス性因子が、約５６℃で約５０分間
の加熱に対して部分的に抵抗性であるということもまた
判定された。そのような熱処理の結果として、ウイルス
のタイターは約３対数（１０³ ）だけ減少した。ウイル
ス性因子は、ＭＡ−１０４細胞株にて８回継代接種し、
５番目の継代接種以降は、３日で良好なＣＰＥを発現し
た。得られたタイターは約5.5 対数（１０^5.5 ）であ
る。ウイルス性因子は、追加のサルの細胞株においても
増殖するであろう。従って、ＳＩＲＳウイルスＡＴＣＣ
−ＶＲ２３３２又はその突然変異体を、増殖条件、増殖
培地等の修正によって他の細胞株上に増殖させること
は、当業者の技術の範囲内であろう。

【００１６】Ｂ．IN VIVO 試験 ３番目の継代接種の収穫物を、２頭の３日齢のノトバイ
オート子豚に接種するのに使用した。両方の子豚は、一
方は１ｍＬ、他方は２ｍＬで経鼻的に暴露された。子豚
を７日間観察し、次いで安楽死させた。

【００１７】組織病理のため及びウイルス性因子の回収
のために、組織サンプルを収集した。組織病理学報告
は、感染させた子豚の肺病変がＳＩＲＳを有することの
知られている子豚から得た肺病変と同一であることを確
認した。組織サンプルは前記と同様に処理し、次いでＭ
Ａ−１０４細胞株の２０乃至４０％及び１００％単層上
にて胎仔牛血清を加えて培養した。ウイルス性因子が再
び回収された。

【００１８】３番目の継代接種の収穫物はまた、疾患の
繁殖上の効果が再現され確認されることを確かめるため
に、雌豚に接種するのにも使用した。２頭の経産雌豚
に、妊娠の約９３日目に経鼻的に接種した。雌豚は、５
０％の死産（死産／生存：８／１３及び６／１４）を伴
う子を妊娠のそれぞれ１１２日目及び１１４日目に産ん
だ。死産の子豚のうち７頭は部分的にミイラ化してお
り、生きて産まれた子豚は弱く、活発に乳を飲めなかっ
た。死産の子豚の組織からは、ウイルス性因子が回収さ
れた。

【００１９】ウイルス性因子は、ＳＩＲＳを有すること
の知られている３つの群れから回収された。これらの同
じ群れにおいて、ＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２因子に対する
抗体タイターが同定された。臨床的兆候、すなわちヨー
ロッパ豚において耳、尾及び乳房の皮膚チアノーゼにお
いていくらかの違いはあるが、北アメリカ及びヨーロッ
パの疾患は同じウイルスによって起こっているというの
が一般的な見解である。

【００２０】Ｃ．ウイルスの特徴 ＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２は、一貫してノトバイオート動
物に臨床兆候及び肺病変を引き起し、ＩｍＦ陰性の結果
は、そのウイルスが現行のTogaviridae の属のウイルス
に抗原的に類似するグループ抗原を有しないことを示し
ている。従って、ＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２ウイルスは、
Togaviridae の未確認の属の１つであろう。ＡＴＣＣ−
ＶＲ２３３２ウイルスはまた、豚の既知の病原でもな
い。なぜなら、豚の数種の一般的なウイルス性病原に対
する特異的抗血清が、ウイルスを中和することも、感染
細胞中の抗原を検出することもできなかったからであ
る。

【００２１】ＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２は、気難しい、非
血液凝集性のエンベロープを有するＲＮＡウイルスであ
る。ＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２ウイルス連続的細胞株、特
にＭＡ−１０４及び他のサルの細胞株において増殖す
る。ＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２ウイルスは、市販の細胞株
ＭＡ−１０４上で高いタイターにまで（１０⁷ ＴＣＩＤ
₅₀／１ｍＬ）増殖する。

【００２２】ＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２ウイルスは、クロ
ロホルムによる処理後は感染性を喪失することによって
示されるように、脂質のエンベロープを含む。脂質のエ
ンベロープはまた、空虚な粒子を取り囲む半透明の電子
リングとして視覚化することもできる。ＳＩＲＳウイル
スの形態学は、直接電子顕微鏡法（ＤＥＭ）によっては
識別できず、細胞残滓を含有する標本中で同定すること
は極度に困難であろう。ＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２ビリオ
ンは、ＣｓＣｌ勾配中で精製し、続いて、抗ＡＴＣＣ−
ＶＲ２３３２高免疫血清と金抱合体でビリオンを免疫−
金標識した後に同定することができよう。ＣｓＣｌ勾配
中のＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２ビリオンのブイヨン密度は
１．１８乃至１．１９ｇ／ｍＬである。ショ糖勾配は一
貫してウイルスタイターの損失をもたらすものであるた
め、精製のための適当な勾配としては捨てられた。

【００２３】勾配精製したＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２粒子
の形態学及び６２ｎｍの平均直径は、馬の動脈炎及び乳
酸デヒドロゲナーゼウイルスビリオンに非常に近似して
いる。馬の動脈炎のウイルスは、報告されたサイズ範囲
５０乃至７３ｎｍを有し、ＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２ウイ
ルスの４８乃至８４ｎｍのサイズと近似している。ＡＴ
ＣＣ−ＶＲ２３３２の数個の粒子中に３０乃至３５ｎｍ
のコアが観察されたが、それらのコアは、馬動脈炎ウイ
ルスにつき記述されたヌクレオカプシドのコアに近似し
ている。このように、形態学的には、ＡＴＣＣ−ＶＲ２
３３２は、動脈炎ウイルス群に最も密接に近似してい
る。

【００２４】ＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２のＲＮＡゲノムの
存在は、ＤＮＡウイルスと、ＲＮＡウイルスのうち一群
（Retroviridae) の増殖を阻害するが、他のＲＮＡウイ
ルスの増殖は阻害しないことが知られている５−ブロモ
−２−デオキシウリジン及びマイトマイシンＣの存在下
に複製を続けるこのウイルスの能力によって確認され
た。しかしながら、ＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２ウイルスの
ＲＮＡウイルスとしての暫定的な位置づけは、ＩｍＦに
よって検出される抗原の存在によって示されるように、
このウイルスが細胞の細胞質中で複製するという観察と
一致する。更に、ＤＮＡ依存性のＲＮＡ複製に干渉する
アクチノマイシンＤは、ＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２ウイル
スの複製には何ら影響を与えない。これらの結果は、Ａ
ＴＣＣ−ＶＲ２３３２ウイルスが複製のために核の機能
を要求必要としないことを示している。

【００２５】ＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２ウイルスは３７℃
及び５６℃において熱に不安定であるが、４℃及び−７
０℃では長期間比較的安定である。このウイルスの３７
℃における熱不安定性は、このウイルスが温かい環境中
では比較的不安定であることを示唆するものであろう。
３７℃より低い温度における増殖がＡＴＣＣ−ＶＲ２３
３２ウイルスの一層高い収率を生み出すであろうという
ことは、このウイルスの増殖のために実際的に適用でき
るものでもある。冷蔵は、ウイルスの単離のために診断
用標本を短期間保存するのに十分であろうが、そうでな
いときはサンプルは冷凍保存すべきである。

【００２６】要するに、サイズ、形態学、ＲＮＡゲノム
の存在、及び他の生物学的性質が、ＡＴＣＣ−ＶＲ２３
３２ウイルスを暫定的にTogaviridae の群に分類してい
る。しかしながら、ＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２は、この群
の既知の属に明らかに帰属させることはできない。形態
的にはＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２ウイルスは、動脈炎ウイ
ルスに密接に近似しているが、本ウイルスは、ＲＮＡ及
び蛋白構造に関する追加の情報が入手できるまでは明確
な属に帰属すべきでない。

【００２７】Ｄ．修正された生ワクチン調製物 修正されたすなわち弱毒化ＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２生ワ
クチンを用いてワクチン調製物が処方され、その調製物
は豚を感染から成功裏に免疫した。ＳＩＲＳウイルスＡ
ＴＣＣ−ＶＲ２３３２は、ＭＡ−１０４連続細胞株中で
増殖させた。細胞株は、１０％胎仔牛血清を添加したＭ
ＥＭを含むフラスコ中で増殖させた。培地のｐＨは７．
２に調整し、約３７℃にてインキュベートした。液体培
地に約１ｍＬの冷凍接種物を添加することにより、細胞
にウイルスを接種した。ウイルスは、細胞上に２４時間
吸着させた。このとき、増殖培地は、４％胎仔牛血清を
添加したｐＨ７．６のＭＥＭよりなる維持培地に取り換
えた。環境は３５乃至３７℃とした。ウイルスは、ウイ
ルスによってＭＡ−１０４細胞シートの５０％が破壊さ
れるまで、増殖させた。サンプルを次いで凍結し、他の
ＭＡ−１０４細胞のフラスコへの継代接種のために調製
した。このプロセスは、細胞株へのウイルスの２５回の
継代接種を通して連続された。ウイルスは次いで、３５
乃至３７℃ではなく約３１℃にて、上記と同じ技術を用
いて、更に１２回増殖させた。この１２番目の継代接種
物を少量ずつ凍結し、マスター種ウイルスと名付けた。

【００２８】

【実施例】

〔弱毒ＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２の調製〕 Ｉ． 培地： ａ．JRH Biosciences からのイーグル最少必須培地（Ｍ
ＥＭ）, #200-2041 ｂ．JRH Biosciences からの胎仔牛血清 ｃ．細胞を播くための増殖培地： ＭＥＭ＋１０％胎仔
牛血清 ｄ．維持培地： ４％胎仔牛血清添加ＭＥＭ ｅ．トリプシン−ベルセン（Versene ）IX ｆ．５％又は飽和炭酸水素ナトリウム

【００２９】II． 組織培養： 使用細胞株： ＭＡ−１０４ (アフリカ緑ザル腎臓細
胞：２０の継代接種レベル内（５８乃至７８継代接種）
に維持）。

【００３０】III. 装置： ７５ｃｍ² 組織培養フラスコ ３５乃至３７℃に設定したインキュベーター ３１℃に設定したインキュベーター 遠心機

【００３１】IV. ３５乃至３７℃で増殖させたＳＩＲ
Ｓ ＶＲ−２３３２ウイルスを弱毒化するのに使用した
方法 Ａ． 組織培養貯蔵物の調製： １． ５乃至７日を経たＭＡ−１０４の７５ｃｍ² 貯蔵
瓶を、次の仕方で１：４に分ける。 ａ．全ての培地を注ぎ出す（５０ｍＬ／瓶） ｂ．トリプシン−ベルセン（Versene)１０ｍＬを用いて
３７℃にて５乃至１０分間インキュベーションすること
により、細胞シートを除去する。 ｃ．瓶から細胞を取り出し、２７０×ｇにて５乃至１０
分間遠心する。 ｄ．上澄を傾捨し、細胞を５乃至１０ｍＬの増殖培地
（１０％胎仔牛血清添加ＭＥＭ）に再懸濁する。 ｅ．全ての細胞を２００ｍＬの１０％胎仔牛血清添加Ｍ
ＥＭ中に入れ、次いで４つの７５ｃｍ瓶に、各瓶５０ｍ
Ｌずつ、１：４に分割して配付する。各瓶を次いで３５
乃至３７℃にて必要時まで維持する（ＣＯ₂ なしでも行
なえる）。 ｆ．完全な細胞シートを形成した３又は４日を経た瓶
が、今や使用準備完了である。 ｇ．フラスコ中の５０ｍＬの培地のｐＨを７．２に調整
し、次いで培地に１ｍＬのＳＩＲＳウイルスを加え、そ
してフラスコを３５乃至３７℃とした（ＣＯ₂ なしでも
行なえる）。 ｈ．２４時間後、培地を傾捨し、フラスコに５０ｍＬの
ｐＨ７．６の４％胎仔牛血清添加ＭＥＭを加え直し、３
５乃至３７℃に戻す。 ｉ．この液体交換の２４時間後、細胞病理的作用が見ら
れるであろう。そして５０乃至６０％の穴が細胞シート
に存在するに至ったとき、凍結する。 ｊ．上記瓶を解凍し、この液体の１ｍＬをとり、上記の
ように新たな７５ｃｍ瓶中に移し、ＳＩＲＳウイルスの
次の継代接種を行う。

【００３２】この上記の手順は、計２５回行われ、すな
わちＳＩＲＳ ＶＲ−２３３２は２５回継代接種し、３
５乃至３７℃にて増殖させた。

【００３３】Ｖ． ３１℃で増殖させてＳＩＲＳ ＶＲ
−２３３２ウイルスを弱毒化するのに使用した方法（３
５乃至３７℃にて２５回継代接種したＶＲ−２３３２
ＳＩＲＳウイルスが、３１℃で増殖させて第１継代接種
ＳＩＲＳ ＶＲ−２３３２ウイルスを作るために用いら
れているということに注意することは重要である。) Ａ． 組織培養貯蔵物の調製： １． ５乃至７日を経たＭＡ−１０４の７５ｃｍ² 貯蔵
瓶を、次の仕方で１：４に分ける。 ａ．全ての培地を注ぎ出す（５０ｍＬ／瓶） ｂ．トリプシン−ベルセン（Versene)１０ｍＬを用いて
３７℃にて５乃至１０分間インキュベーションすること
により、細胞シートを除去する。 ｃ．瓶から細胞を取り出し、２７０×ｇにて５乃至１０
分間遠心する。 ｄ．上澄を傾捨し、細胞を５乃至１０ｍＬの成育培地
（１０％胎仔牛血清添加ＭＥＭ）に再懸濁する。 ｅ．全ての細胞を２００ｍＬの１０％胎仔牛血清添加Ｍ
ＥＭ中に入れ、次いで４つの７５ｃｍ瓶に、各瓶５０ｍ
Ｌずつ、１：４に分割して配付する。各瓶を次いで３５
乃至３７℃にて必要時まで維持する（ＣＯ₂ なしでも行
なえる）。 ｆ．完全な細胞シートを形成した３又は４日を経た瓶
が、今や使用準備完了である。 ｇ．フラスコ中の５０ｍＬの培地のｐＨを７．２に調整
し、次いで培地に１ｍＬのＳＩＲＳウイルスを加え、そ
してフラスコを３１℃とした（ＣＯ₂ なしでも行なえ
る）。 ｈ．２４時間後、培地を傾捨し、フラスコに５０ｍＬの
ｐＨ７．６の４％胎仔牛血清添加ＭＥＭを加え直し、３
１℃に戻す。 ｉ．この液体交換の２４時間後、細胞病理的作用が見ら
れるであろう。そして５０乃至６０％の穴が細胞シート
に存在するに至ったとき、凍結する。 ｊ．上記瓶を解凍し、この液体の１ｍＬをとり、ＳＩＲ
Ｓ ＶＲ−２３３２ウイルスの次の継代接種を行う。

【００３４】この上記の手順は、３１℃にて計１２回行
われる。３１℃における１２番目の継代接種ウイルス
を、ワクチン製造用マスター種ウイルスと名付ける。。

【００３５】１ｍＬ当たりのタイター約１０^4.5 乃至１
０^5.5 ＴＣＩＤ₅₀の低温適合ウイルス、すなわちマスタ
ー種ウイルスを、コンベンショナルの豚に経鼻的及び筋
肉内に投与した。対照としては、薬剤学的担体をコンベ
ンショナルの豚に経鼻的及び筋肉内に投与した。弱毒化
ウイルスでワクチン接種した豚は、ＡＴＣＣ−ＶＲ２３
３２（タイター：１０^4.2 ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬ）でチャレ
ンジした後も、ＳＩＲＳの症状を何ら発現しなかった
が、対照豚はＳＩＲＳの症状を発現した。低温適合ウイ
ルスは、いかなる適合性の慣用の薬剤学的担体にも加え
ることができる。更に、ワクチン調製物は経鼻的及び筋
肉内に投与したが、他の投与経路も可能であり意図され
ている。

【００３６】当業者には明らかなように、増殖条件、Ｓ
ＩＲＳウイルスＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２の弱毒化の方
法、ワクチン処方の調製その他についての種々の修正
は、直ちに行うことができる。そして、そのような修正
の全ては、本発明者によって意図されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 7/04 7236−4Ｂ (72)発明者 デイビッド、イー、ゴルシカ アメリカ合衆国 ミズリー州 64506、セ ントジョセフ、エレファントトレイル 2408 (72)発明者 ルイス、エル、ハリス アメリカ合衆国 ミズリー州 64506、セ ントジョセフ、タングルウッドドライブ 402

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】豚不育症及び呼吸器症候群ウイルスすなわ
   ちＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２及びその全ての動物病原性突
   然変異体の、豚に不育症及び呼吸器疾患を起こすことの
   できる生物学的に純粋な培養物
2. 【請求項２】ウイルスが豚に対し非動物病原性となるよ
   う修正されたものである、修正された、生きた豚不育症
   及び呼吸器症候群ウイルスすなわちＡＴＣＣ−ＶＲ２３
   ３２と薬剤学的に許容し得る担体とからなるワクチン組
   成物。
3. 【請求項３】死んだ又は不活化した豚不育症及び呼吸器
   症候群ウイルスすなわちＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２と薬剤
   学的に許容し得る担体とからなるワクチン組成物。
4. 【請求項４】請求項２に記載のワクチン組成物を豚に投
   与することよりなる、豚不育症及び呼吸器症候群に対し
   豚を免疫する方法。
5. 【請求項５】請求項３に記載のワクチン組成物を豚に投
   与することよりなる、豚不育症及び呼吸器症候群に対し
   豚を免疫する方法。
6. 【請求項６】血清の存在下に適当な増殖培地中でサルの
   細胞の完全な又は部分的なシート上に当該ウイルスを接
   種し、そして該接種した細胞シートを約３４℃乃至約３
   ７℃にて細胞病理的作用が観察されるまでインキュベー
   トすることよりなる、豚不育症及び呼吸器症候群ウイル
   スすなわちＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２を増殖させそして単
   離する方法。
7. 【請求項７】該サルの細胞がＭＡ−１０４である、請求
   項６に記載の方法。
8. 【請求項８】当該ウイルスを約３５乃至約３７℃にてサ
   ルの細胞株に継代接種し、次いで得られたウイルスを約
   ３１℃にてサルの細胞株に継代接種することよりなる、
   豚不育症及び呼吸器症候群ウイルスすなわちＡＴＣＣ−
   ＶＲ２３３２を弱毒化する方法。
9. 【請求項９】当該ウイルスをｐＨ約７．６にて血清の存
   在下、二酸化炭素を使用することなく約３５乃至約３７
   ℃にて維持培地上のサルの細胞株に約２５回継代接種
   し、次いで得られたウイルスをｐＨ約７．６にて血清の
   存在下、約３１℃にて維持培地上のサルの細胞株に約１
   ２回継代接種することよりなる、豚不育症及び呼吸器症
   候群ウイルスすなわちＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２を弱毒化
   する方法。
10. 【請求項１０】該サルの細胞株がＭＡ−１０４である、
    請求項８又は９に記載の方法。
11. 【請求項１１】該継代接種が二酸化炭素なしに行われる
    ものである、請求項１０に記載の方法。