KR0138068B1 - 미확인(Mystery) 돼지 질병 관련 바이러스제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 약 35내지 37℃에서 시미안 세포주를 통해 계대 배양함을 특징으로 하여 약독화된 SIRS 바이러스를 함유하는 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 SIRS에 대해 돼지를 면역화시키기 위한 약제학적 조성물을 제조하는데 있어서 이러한 백신 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

미확인 돼지 질병 관련 바이러스제

최근에, 양돈수의 심각한 손실을 야기시키는 외관상으로 새로운 돼지 질병이 미국과 캐나다의 일부 지역에서 나타나고 있다[참조 : Keffaber, K. K., Reproductive Failure of Unknown Etiology, American Association of Swine Practitioners Newsletter, 1 : 109(1989)]. 독일의 일부지역과 네덜란드, 그리고 영국과 스페인에서도 이와 유사한 질병이 역시 보고되고 있다[참조 : Wensvoort, G. et al., Blue Ear Disease of Pigs, Vet. Rec., 128 : 574(1991)].

이 질병의 가장 두드러진 임상적 증상은 죽거나 병든 새끼 돼지를 분만하는 것이며, 설사 건강해 보이는 일부의 새끼 돼지들도 계속해서 식욕부진을 나타내고, 호흡곤란, CNS증상 및 사망으로 발전하게 된다. 이 질병에 감염된 일부의 돼지들에서, 새끼 돼지의 치사율은 전체 새끼 돼지의 75%까지 이를 수도 있다. 따라서, 이 질병에 의한 경제적 손실은 막대한 것이다. 이 질병은 미확인 돼지 질병(mystery swine disease), 돼지 불임 및 호흡기 증후군(Swine Infertility and Respiratory Sydnrome : SIRS), 청이병(Blue Ear Disease) 및 돼지 생식 및 호흡기 증후군으로 불리우고 있다.

SIRS는 생식장애, 호흡기질병, 및 식욕부진, 발열, 호흡장애 및 경증의 신경적 증상을 포함한 다양한 임상적 증상을 특징으로 하는 감염성 질병임이 명백하다. 이 질병은 모든 형태의 양돈 시설에 영향을 미치고 있기 때문에 오늘날 양돈 산업에 영향을 미치는 질병중에서 가장 심각한 것일 수 있다[참조 : Polson, D. P. et al. Financial Implications of Mystery Swine Disease, Proceedings, Livestock Conservation Institute, Denver, CO(October 6, 1990)].

암돼지의 감염 여부는 발견되지 않거나, 하루 또는 며칠동안 지속되는 일반적인 질병증상으로부터 확인될 수 있다. 예를 들면, 암돼지는 사료를 섭취하지 않고 체온이 정상온도 이하이거나 이상으로 될 수 있다. 분만기에서의 질병의 증상으로는 우울증, 혼수상태, 발열, 간헐적인 구토, 유산, 사산 및 건성 괴저화된 태자의 분만을 들 수 있다. 가장 흔한 임상적 증상은 사산 돼지 수의 급격한 증가이다. 감염된 돼지의 경우에 사산 수는 총 출산수의 20내지 30%까지 이를 수 있다. 사산된 태자의 대부분은 야위어 있고 24내지 48시간전에 죽은 것으로 보인다.

상기에서 언급한 바와 같이, SIRS의 주요 증상은 조산, 후기 유산(late term abortions), 약한 새끼 돼지 출산, 사산 증가, 건성괴저 태자, 분만율의 감소 및 발정 주기의 지연으로 나타나는 생식 장애이다. 이러한 임상적 증상은 보통 4내지 16주 또는 그 이상된 돼지에게서 관찰된다. 감염 돼지에서의 사산된 태자는 종종 피부의 황갈색 변색 및 사후 자기분해에 의해 입증되는 바와 같이, 건성괴저의 초기 단계에 있다. 때로는 태자 두 개골의 돔(Dome)모양의 기형도 발견된다.

호흡기 질병의 임상적 증상은 3주령 이하의 새끼 돼지에서 가장 분명하게 나타나지만, 감염된 돼지군에 있어서는 모든 나이의 돼지에게서 나타나는 것으로 보고 되어 있다. 질병에 감염된 새끼 돼지는 성장이 느리고, 모피가 거칠며, 호흡곤란(thumping) 및 사망률의 증가(이유전 사망률의 약 80%까지)를 나타낸다.

SIRS 감염 돼지의 육안적 및 현미경의 병변에 대한 예비 연구에서 발견된 사실은 현미경적 폐 병변이 이 질병의 중요한 임상적 특징임을 시사한다.

뚜렷한 호흡기 증상에도 불구하고, 2차적인 박테리아 감염에 의한 협병증이 나타나지 않은 폐는 육안적으로 정상이거나 또는 폐 표면에 미약하게 분포된 황 회색 변색을 나타낸다. 그러나, SIRS-질병에 걸린 새끼 돼지의 폐 조직을 현미경으로 검사하면 간질(間質)성 폐렴의 특징적 패턴이 확인된다[참조 : Collins, J. E. et al. Respiratory Disease in a Swine Herd Experiencing a Reproductive Failure Syndrome, Proceedings, Minesota Swine Conference for Veterinarians, P. 254, st, Paul MN(1990. 9. 10-18)].

SIRS, 즉 미확인 돼지 질병의 발생은 미국에 만연되고 있으며, 적어도 11개 주에서 보고되었다. 문헌에 보고된 것으로써, 연구중에 있는 주요 병인물질에는 뇌심근염 바이러스(encephalomyocarditis virus : EMC), 돼지 인플루엔자 바이러스(Swine influenza virus : SIV), 마이코 톡신 및 클라미디아가 포함된다.

SIRS 감염 돼지들 중에 새끼 돼지로부터 수득한 조직 균질물(tissue homogenate)을 무균 새끼 돼지와 임신한 암돼지에 비강내로 접종하였을 때, 호흡기 및 생식형 SIRS가 일관되게 재현된다. 이와 같이 비여과되거나 여과된(0.45, 0.22, 또는 1μm)접종물로 접종된 무균 새끼 돼지는 식욕부진을 나타내게 되며, SIRS-감염 돼지에서 나타나는 병변과 유사한 현미경적 폐 병변을 나타냈다.

상기 접종물은 또한 SIRS-감염 돼지에서 관찰되는 것과 동일한 생식효과를 야기시킨다. 조직 균질물로부터 바이러스제를 회수하였다. 이 바이러스제는 새끼 돼지 및 임신한 암돼지에서 SIRS와 유사한 질병을 야기시킬 것이다. 이 바이러스제는 1991년 7월 18일에 미국 매릴랜드 로크빌 소재의 American Type Culture Collection에 수탁번호 ATCC-VR 2332로 기탁되었다. 이 바이러스제는 까다로우며 비-혈구응집성인 엔벨로프(envelope) RNA바이러스이다.

[A. 분리]

SIRS 감염 돼지군에서의 감염 새끼 돼지로부터 수득한 폐 조직 및 뇌-비장-간-신장 혼합 조직을 별도로 균질화시킨다. 각 균질물을 ml당 약 100㎍의 겐타마이신을 합유하는 변형 이글배지(Modified Eagle's medium : MEM)과 혼합한다. 두 샘플을 약 4000xg에서 약 25분동안 원심분리시킨다. 상등액을 분리하여 0.45마이크론 필터를 통해 여과한다. 이 조직 및 폐 균질물을 합하여, 이 혼합물을 여러 조직배양 용기를 감염시키는데 사용한다.

75㎠ 플라스틱 용기를 사용하여 두가지 시험을 수행한다. 1번 시험에서는 하기 표에 기재된 세표 주(ceⅡ line) 각각의 전 세포 쉬트(full cell sheet)를 함유하는 두 용기에 혼합물을 접종하였다. 또한, 각 세포주의 하나의 용기에 약 2.5mg의 트립신을 첨가한다. 그 밖의 나머지 모든 조건은 세포주의 각 용기에 대하여 동일하게 한다. 혈청은 배지에 첨가하지 않는다. 접종량은 약 1ml로 하였다. 모든 용기는 약 34℃에서 약 7일간 유지시켰다. 결과는 약 7일후에 기록하였다. 냉동 및 해동 후에, 샘플을 취하여 동일 세포주 내에서의 2차 계대 배양에 이용하였다. 잔여물질은 약 -60℃에서 냉동하여 보관하였다.

2번 시험에서는, 혼합물질을 1번 시험에서 사용된 것과 동일한 세포주를 함유하는 용기내에 접종하였다. 그러나, 접종시에 세포 쉬트는 불과 20내지 40%만이 융합성(confluent)이었다. 배지는 약 10% 소 태자 혈청을 함유한다.

접종량은 역시 약 1ml이었고, 배양물을 약 34℃에서 약 7일간 배양하였다. 1번 시험 및 2번 시험 둘다의 결과를 하기 표에 요약하였다.

+ = 세포변성 효과

- = 세포변성 효과 무

·1번 시험에서는 시험된 어떤 세포주에서도 세포변성 효과가 관찰되지 않았다. 그러나, 2번 시험에서는 MA-104 세포의 소응집물들이 팽윤하기 시작하여 용기 가장자리 주변의 단일층에 약한 홀(weak hole)을 형성하였다. 유체를 용기로부터 분리하여 MA-104 세포의 새로운 용기(역시 20 내지 40% 세포 쉬트)에 계대한 후, 이어서 세번째 계대시켰다. 세포 변성 효과(cytopathic effect, CPE)는 각 계대를 거칠때마다 더 강력해졌다. 상기 과정을 전 세포 쉬트를 사용하는 MA-104 세포주에 대해 반복하였다. CPE를 또한 관찰하였다. 또한 추가의 시험에 의해 바이러스제는 약 37℃에서도 성장할 것이라는 것도 확인되었다. 혈청의 존재는 바이러스제의 초기 분리를 용이하게 할 수 있다. MA-104 세포주내에서 바이러스제의 후속 계대는 혈청부재하에서도 CPE를 발생시킬 수 있을 것이다. 그러나, 보다 명백한 CPE는 MA-104 세포주용 성장 배지내에 혈청을 사용함으로써 관찰된다.

또한 바이러스제는 약 56℃에서 약 50분간의 가열에 대해 부분적으로 내성을 가진다는 것이 밝혀졌다. 이러한 열처리의 결과로서, 바이러스 역가(titer)는 약 3 로그까지 감소되었다. 이 바이러스제는 MA-104 세포주내에서 8회 계대하였으며, 여기에서 계대 5회 이상에서 3일내에 상당한 CPE를 발생시켰다. 수득된 역가는 약 5½로그(10^5.5)이다. 이 바이러스제는 또한 추가 시미안 세포주내에서도 증식할 것이다.

따라서, 성장조건, 성장배지 등을 변화시킴으로써 다른 세포주상에서 SIRS 바이러스 ATCC-VR 2332, 또는 그 돌연변이체를 성장시키는 것도 본 발명의 범위내에 들어가는 것이다.

[B. 생체내 시험]

3번째 계대의 수확물을 사용하여 생후 3일된 두 마리의 무균 새끼 돼지에 접종하였다. 두 마리의 새끼 돼지중 한 마리에는 1ml, 다른 한 마리에는 2ml를 비강내로 접종하였다. 새끼 돼지를 7일간 관찰한 후 안락시켰다.

조직병리 및 바이러스제의 회수를 위하여 조직샘플을 수거하였다. 조직병리학적 보고로부터, 감염된 새끼 돼지에서의 폐 병변은 SIRS 감염된 것으로 알려진 새끼 돼지의 폐 병변과 동일한 것으로 확인되었다.

조직샘플을 전과 같이 처리한 후 소 태자 혈청의 존재하에 20 내지 40% 및 100% MA-104 세포주 단일 층상에서 배양하였다. 바이러스제를 다시 회수하였다.

3번째 계대의 수확물을 사용하여 또한 암돼지를 접종하여 이 질병의 생식에 대한 효과가 재현될 수 있고, 확인될 수 있는지를 검증하였다. 두 마리의 다산(多産) 암돼지에 임신 약 93일째에 비강내로 접종하였다. 암돼지는 각각 임신 112일과 114일째 새끼 돼지를 분만하였는데, 사산율은 50%(8/13 및 6/14 사산/생존)였다. 사산된 새끼 돼지중의 7마리는 부분적으로 건성괴저 상태였고, 생존한 새끼 돼지들은 약하여 강건하게 사육하는데 실패하였다. 사산된 새끼 돼지의 조직으로부터 바이러스제를 회수하였다.

SIRS를 나타내는 것으로 알려진 세 마리의 돼지로부터 바이러스제를 회수하였다. 이들 동일한 돼지에서 ATCC-VR 2332 바이러스제에 대한 항체 역가를 확인하였다. 북미와 유럽에서의 질명은 임상적 증상에서 약간의 차이 즉, 유럽 돼지에서는 귀, 꼬리 및 유방의 피부 청색증(cutaneous cyanosis)이 나타나지만 동일 바이러스에 의해 야기된다는 것이 지배적 견해이다.

[C. 바이러스 특성]

ATCC-VR 2332는 항상 무균 돼지에서 임상증상과 폐 병변을 야기시키며 음성(negative) ImF결과를 나타내는데, 이것은 바이러스가 현재의 토가비리다에(Togaviridae) 속에 속하는 바이러스와 항원적으로 유사한 그룹 항원을 갖지 않음을 시사하는 것이다. 따라서, ATCC-VR 2332 바이러스는 토가비리다에의 미확인 속으로 나타낼 수가 있다. 돼지의 몇가지 일반적인 바이러스 병원균에 대한 특이적 항 혈청이 ATCC-VR 2332 바이러스를 중화시키거나 감염 세포내에서 항원을 검출하지 못하기 때문에 ATCC-VR 2332 바이러스는 또한 공지되어 있는 병원균이 아니다.

ATCC-VR 2332는 배양이 까다로운 비-혈구 응집성 엔밸로프 RNA 바이러스이다. ATCC-VR 2332 바이러스는 연속 세포주(continuous cell line), 특히 MA-104 및 그 밖의 다른 시미안 세포주에서 성장한다. ATCC-VR 2332 바이러스는 시판세포주, MA-104에서 고역가(10⁷TCID₅₀/1ml)로 성장한다.

ATCC-VR 2332 바이러스는 클로로포름 처리 후에 감염성이 손실되는 것으로부터 알 수 있는 바와 같이 지질 엔벨로프를 함유한다. 지질 엔벨로프는 또한 엠프터 입자를 둘러싸는 전자 반투명 링으로 보일 수도 있다. SIRS 바이러스 형태는 직접 전자 현미경(Direct electron microscopy, DEM) 상에서는 특별한 점이 없어, 세포편을 함유하는 시료에서 확인한다는 것은 매우 어려울 수 있다.

ATCC-VR 2332 비리온은 CsCI 구배로 정제한 후에 비리온을 항-ATCC-VR 2332 고면역 혈청 및 골드(gold) 결합체로 면역-골드 라벨화(Immuno-gold labeling) 시킴으로써 확인이 가능하다. CsCI 구배내에서의 ATCC-VR 2332 비리온의 부유밀도(buoyant density)는 1.18내지 1.19g/ml이다. 슈크로스 구배는 항상 바이러스 역가의 손실을 야기시키므로 정제에 적합한 구배방법은 아니다.

구배-정제된 ATCC-VR 2332 입자의 형태와 62nm의 평균 직경은 말 동맥염(equine Arteritis) 및 락트산 데하이드로게나제 바이러스의 비리온과 매우 유사하다. 말 동맥염 바이러스는 ATCC-VR 2332 바이러스의 크기 48 내지 84nm와 유사한 50 내지 73nm의 크기를 갖는다. 몇몇 ATCC-VR 2332 바이러스의 입자에서 30 내지 35nm의 핵(core)이 관찰되었는데, 이 핵은 말 동맥염 바이러스에 대해 기술된 뉴클레오캅시드(nucleocapsid)핵과 유사하다. 따라서, ATCC-VR 2332는 형태학적으로 말 동맥염 바이러스 그룹과 가장 유사하다.

ATCC-VR 2332의 RNA 게놈의 존재는 DNA 및 RNA 바이러스중의 한 그룹[레트로비리다에(Retroviridae)]의 증식은 억제하지만, 그 밖의 RNA 바이러스의 증식은 억제하지 않는 것으로 알려진 5-브로모-2-데옥시유리딘 및 미토마이신 C의 존재하에서도 이 바이러스가 계속 복제하는 능력을 가지고 있다는 사실로부터 확인되었다. 그러나, ATCC-VR 2332 바이러스를 RNA 바이러스로 잠정적으로 분류한 것은, ImF에 의해 검출된 바이러스 항원의 존재에 의해 확인되는 것으로 이 바이러스가 세포의 세포질내에 증식한다는 관찰과 일치한다. 또한, DNA의 의존성 RNA 전사를 방해하는 악티노마이신 D 역시 ATCC-VR 2332 바이러스 증식에 아무 영향을 미치지 않는다. 이들 결과로부터 ATCC-VR 2332 바이러스는 복제에 있어서 핵의 기능이 불필요함을 알 수 있다.

ATCC-VR 2332 바이러스는 37℃와 56℃에서 열에 불안정하지만 4℃와 -70℃에서는 장기간동안 비교적 안정하다. 37℃에서의 이 바이러스의 열 불안정성은 바이러스가 온난한 환경하에서 비료적 불안정함을 시사하는 것이다. 이것은 또한 37℃ 미만의 온도에서 배양하면 보다 높은 수율로 ATCC-VR 2332 바이러스를 수득할 수 있다는 바이러스 배양에 대한 실제적 응용성을 제시하는 것이다.

바이러스 분리를 위한 진단 피검물의 단기간의 보관을 위하여는 냉장만으로도 충분하며, 그렇지 않을 때는 시료를 냉동 보관하여야 한다.

요약하면, 크기, 형태, RNA 게놈의 존재, 및 기타의 생물학적 특성으로부터 일단 ATCC-VR 2332 바이러스를 토가비리다에 속으로 분류한다. 그러나, ATCC-VR 2332는 분명히 기존의 이러한 토가비리다에 속에 포함될 수는 없다.

비록 형태학적으로, ATCC-VR 2332 바이러스가 말 동맥염 바이러스와 매우 유사하기는 하지만, RNA 및 단백질 구조에 대한 추가의 정보를 이용할 수 있을 때까지, 이 바이러스를 하나의 정해진 속에 포함시켜서는 안된다.

[D. 변형 생 백신 제조]

백신 제제는 변형되거나 약독화된 생 ATCC-VR 2332를 포함시켜 제조하며, 이 제제는 감염에 대해 돼지를 성공적으로 면역화시켰다. SIRS 바이러스 ATCC-VR 2332를 MA-104 연속세포주에서 번식시켰다. 이 세포주를 10% 송아지 태아 혈청이 첨가된 MEA를 함유하는 플라스크태에서 성장시켰다. 배지의 pH를 7.2로 조정하고 약 37℃에서 배양하였다. 바이러스는 1ml의 냉동 접종물을 액체 배지에서 첨가함으로써 세포에 접종시켰다. 이 바이러스가 24시간동안 세포상에서 흡수되도록 하였다. 이때 성장 배지를 4% 송아지 태아 혈청이 첨가된 pH 7.6의 MEM으로 구성된 보존 배지(maintenance media)로 대체하였다. 주변 온도는 35 내지 37℃였다. MA-104 세포 쉬트의 50%가 바이러스에 의해 파괴될 때까지 이 바이러스를 성장시켰다. 샘플을 냉동시킨 후, 또다른 MA-104 세포의 플라스크에 계대하기 위해 준비하였다. 이 과정을 세포주내에서 바이러스를 25회 계대하는 동안 계속하였다. 그 후 바이러스는 35 내지 37℃ 대신에 약 31℃에서 상기와 동일한 기술을 사용하여 추가로 12회 증식시켰다. 12회 계대물을 소량씩으로 나누어 냉동하여 마스터시드(Master Seed)바이러스로 사용하였다.

[실시예]

약독화 ATCC-VR 2332의 제조

I. 배지 :

a. 이글스 최소 필수 배지[Eagles Minimum Essential Medium(MEM), JRH Bioscience 사, # 200-2041]

b. 송아지 태자 혈청(JRH Bioscience 사)

c. 세포 접종용 성장 배지-MEM + 10% 송아지 태자 혈청

d. 보존 배지-MEM + 4% 송아지 태자 혈청

e. 트립신-베르센(Versene) Ⅸ

f. 중탄산나트륨 5% 또는 포화

Ⅱ. 조직배양 :

사용된 세포주 : MA-104(20회 계대 수준 이내의 아프리카 녹색 원숭이 신장세포(계대 58-78))

Ⅲ. 장치 :

·75㎝ 조직 배양 플라스크

·35 내지 37℃로 고정된 배양기

·31℃로 고정된 배양기

·원심분리기

Ⅳ. 35내지 37℃에서 배양한 SIRS-VR 2332 바이러스의 약독화 방법.

A. 조직 배양 원액의 제조:

1. 75㎠ 원액용기의 5 내지 7일된 MA-104를 다음과 같이 1 : 4로 분배한다.

a. 모든 배지를 붓는다(용기당 50ml)

b. 10ml의 트립신-베르센을 사용하여 37℃에서 5 내지 10분 배양하여 세포 쉬트를 분리한다.

c. 용기로부터 세포를 분리하고 5 내지 10분동안 270xg으로 원심분리한다.

c. 상등액을 경사시키고 세포를 5 내지 10ml의 성장배지(MEM 10% FCS)에 재현탁시킨다.

e. 모든 세포를 200ml의 MEM 10% FCS에 도입시킨 후 4개의 75㎝ 용기에, 용기당 50ml 씩 분주하여 1 : 4로 분배한다. 그후 용기는 필요할 때까지 35내지 37℃에서 유지시킨다(CO₂부재하에서도 수행할 수 있다).

f. 전세포 쉬트가 형성된 3 또는 4일간 용기는 사용이 가능한 것이다.

g. 플라스크내의 50ml 배지의 pH를 7.2로 조정한 후 배지에 1ml의 SIRS 바이러스를 가하고 플라스크를 35 내지 37℃에서 배양한다(CO₂부재하에서도 수행할 수 있다).

h. 24시간 후, 배지를 버리고 플라스크를 50ml의 MEM 4% FCS pH 7.6으로 다시 채운 후, 35내지 37℃에서 재차 배양한다.

i. 이러한 액 교환 24시간 후, CPE가 나타나야 하며, 50 내지 60%홀(hole)이 세포 쉬트에 존재하면, 냉동시킨다.

j. 상기 용기를 해빙시킨 후, 이 액 1ml을 취하여 상기에 언급한 바와 같이 새로운 75㎝ 용기에 옮겨 다음 계대의 SIRS-VR 2332 바이러스를 만든다.

상기 과정을 총 25회 수행하거나, SIRS-VR 2332를 25회 계대하여 35 내지 37℃에서 배양시켰다.

V. 31℃에서 배양한 SIRS-VR 2332 바이러스의 약독화 방법(31℃에서 배양한 1회 계대 SIRS-VR 2332 바이러스의 제조를 위해 35 내지 37℃에서 25회 계대시킨 SIRS-VR 2332 바이러스를 사용한 점이 중요하다).

A. 조직배양 원액의 제조 :

1. 75㎠ 원액 용기의 5 내지 7일된 MA-104를 다음과 같이 1 : 4로 분배한다.

a. 모든 배지를 붓는다(용기당 50ml)

b. 10ml의 트립신-베르센을 사용하여 37℃에서 5 내지 10분 배양하여 세포 쉬트를 분리한다.

c. 용기로부터 세포를 분리하고 5 내지 10분동안 270xg으로 원심분리한다.

d. 상등액을 경사시키고 세포를 5 내지 10ml의 성장배지(MEM 10% FCS)에 재현탁시킨다.

e. 모든 세포를 200ml의 MEM 10%의 FCS에 도입시킨 후 4개의 75㎝ 용기에, 용기당 50ml씩 분주하여 1:4로 분배한다. 그후 용기는 필요할 때까지 35 내지 37℃에서 유지시킨다(CO₂부재하에서도 수행할 수 있다).

f. 전세포 쉬트가 형성된 3 또는 4일간 용기는 사용이 가능한 것이다.

g. 플라스크내의 50ml 배지의 pH를 7.2로 조정한 후 배지에 1ml의 SIRS 바이러스를 가하고 플라스크를 31℃에서 배양한다.(CO₂부재하에서도 수행할 수 있다).

h. 24시간 후, 배지를 버리고 플라스크를 50ml의 MEM 4% FCS pH 7.6으로 다시 채운 후 31℃에서 재차 배양한다.

i. 이러한 액 교환 24시간 후, CPE가 나타나야 하며, 50 내지 60% 홀(hole)이 세포 쉬트에 존재하면, 냉동시킨다.

j. 상기 용기를 해방시킨 후, 이 액 1ml을 취하여 다음 계대의 SIRS-VR 2332 바이러스를 만든다.

상기 과정은 31℃에서 총 12회 실행하였다. 31℃에서 배양된 12회 계대 바이러스를 백신 생산용 마스터시드 바이러스로 지정하였다.

약 10^4.5내지 약 10^5.0TCID₅₀/ml 역가의 한냉-적응 바이러스인 마스터 시드 바이러스를 일반 돼지에 비내 및 근육내로 투과하였다. 대조용으로 약제학적 비히클을 비내 및 근육내로 투여하였다. 약독화 바이러스에 의해 면역된 돼지는 ATCC-VR 2332(역가 10^4.2TCID₅₀/ml)로 공격한 후에도 SIRS 의 어떠한 증상도 발현하지 않았지만, 대조용 돼지 경우는 SIRS 증상을 나타내었다. 한냉-적응 바이러스는 모든 통상적으로 허용되는 약제학적 담체와 배합할 수 있다. 또한, 비록 백신 제제가 비내 및 근육내로 투여되었으나, 기타 다른 투여경로도 이용할 수 있으며 기대될 수 있다.

당해 기술분야의 전분가에게 명백한 바와 같이, 배양조건, SIRS 바이러스 ATCC-VR 2332의 약독화 방법, 백신 제제 등에 대한 여러 변형이 용이하게 이루어지거나 유도될 수 있으며, 따라서, 이러한 모든 변형도 본 발명자들에 의해 생각될 수 있는 것이다.

Claims (8)

1. 약 35 내지 37℃에서 시미안 세포주를 통해 계대 배양함을 특징으로 하여 약동화된 SIRS 바이러스를 함유는 백신 조성물.
2. 제1항에 있어서, 계대 배양된 바이러스가 약 31℃에서 시미안 세포주를 통해 추가로 계대 배양됨을특징으로 하는 조성물.
3. 제1항 또는 2항에 있어서, 계대 배양이 pH 약 7.6에서 혈청 존재하의 보존배지중에서 시미안 세포주를 통하여 이루어짐을 특징으로 하는 조성물.
4. 제1항에 있어서, 약 35 내지 37℃에서의 계대 배양이 25회 수행됨을 특징으로 하는 조성물.
5. 제2항에 있어서, 약 31℃에서의 계대 배양이 12회 수행됨을 특징으로 하는 조성물.
6. 제1항에 있어서, 시미안 세포주가 MA-104임을 특징으로 하는 조성물.
7. 제6항에 있어서, 계대 배양이 CO₂부재하에 수행됨을 특징으로 하는 조성물.
8. 제1항에 따른 백신 조성물을 SIRS에 대해 돼지를 면역화시키기 위한 약제학적 조성물을 제조하는데사용되는 방법.