TWI652346B - Ｐｒｒｓｖ之商業化規模製備方法 - Google Patents

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Abstract

本發明描述用於製備PRRS病毒之有效商業化規模製備方法。

Description

PRRSV之商業化規模製備方法
本發明係關於活減毒豬生殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)之商業化規模製備，該病毒可用於製備基於該病毒之疫苗，及疫苗用於治療豬之用途。
豬生殖與呼吸症候群(PRRS)被許多人視為目前影響全世界養豬業之最重要的疾病。1987年，該症候群首先在美國描述為「神秘豬疾病」且迅速傳遍全球。其引起生殖力嚴重降低，致使因繼發性感染引起之死亡率增加，且導致飼料轉化率及平均日增重降低。不幸的是，已證明難以控制引起PRRS之病毒。
PRRS病毒(PRRSV)為一種歸類於動脈炎病毒科(family Arteriviridae)之包膜單股RNA病毒(Cavanaugh,1997)。其引起廣泛的豬疾病，該豬疾病首先於1987年在美國描述為「神秘豬疾病」(Hill,1990)。該疾病在所有年齡組之豬中均表現為呼吸疾病，引起一些較年輕豬死亡以及繁殖適齡母豬產生嚴重的生殖問題。
PRRSV可經由感染豬與易感染豬之間的直接接觸傳播且常常如此。在極短距離內亦可能藉由空氣或經由精液傳播。一旦感染，病毒可在成年豬血液中保留約兩週至四週，且在感染豬中保留1至2個月或更長時間。感染公豬可將病毒排在精液中，長達100天以上。此長期病毒血症顯著提高傳播可能性。此外，PRRS病毒可在妊娠期最後第 三期期間穿過胎盤，感染子宮內之仔豬且引起死胎或產下弱仔豬。
所有類型及規模之畜群，包括健康狀態良好或一般或來自室內或室外單元之畜群，均可感染PRRS病毒。感染畜群可能遭遇嚴重的生殖力降低，以及斷乳後肺炎程度提高且生長緩慢。生殖期通常持續兩至三個月；然而，斷乳後問題通常變成地方病。生殖疾病之特徵為在妊娠後期影響大母豬與小母豬的流產爆發。在妊娠約109天及112天過早產下小豬。死胎及產下之弱仔豬數目增加且引起斷乳前死亡率顯著增加。
傳統上已在養殖場，特別是連續流動養殖場中見到呼吸期。然而，亦可在肥育畜中見到作為豬呼吸疾病綜合症(porcine respiratory disease complex；PRDC)之一部分的由PRRS病毒引起之呼吸問題。生長速率會降低，不能出售之豬的百分比增加，且斷乳後死亡率升高。診斷結果指示存在與PRRS病毒相關聯之高程度肺炎以及一般視為次級感染原之多種其他微生物。細菌分離株可尤其包括豬鏈球菌(Streptococcus suis)、豬嗜血桿菌(Haemophilus suis)、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、豬放線桿菌(Actinobacillus suis)、豬肺炎黴漿菌(Mycoplasma hyopneumoniae)及多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)。通常涉及之病毒劑包括豬流感病毒及豬呼吸道冠狀病毒。患病豬很少對高程度之藥物治療起反應，且全進/全出系統已無法控制該疾病。
PRRSV病毒以兩種稱為「美國」型與「歐洲」型之基因型存在，該等基因型共享約50%序列同源性(Dea S等人(2000)。Arch Virol 145：659-88)。此兩種基因型亦可以其免疫性質而加以區分。有關各種分離株之大部分定序資訊係基於結構蛋白質，亦即僅佔病毒基因組約4%之包膜蛋白GP5，而關於非結構蛋白質(nsp)所知甚少。PRRSV之分離及疫苗之製造已在多個公開案中描述(WO 92/21375、WO 93/06211、WO 93/03760、WO 93/07898、WO 96/36356、EP 0 676 467、EP 0 732 340、EP 0 835 930)。
疫苗接種為減輕PRRS負荷之關鍵方法，因為自PRRS感染恢復之豬將發展免疫反應，此免疫反應在正常情況下將保護豬免遭相同病毒株再次感染。然而，PRRS病毒因為常發生在陽性單股RNA病毒中之突變的高速率而具有變化之能力；因此，可能出現新的病毒株。在該等狀況下，病毒株之間的交叉保護可能不存在，且在先前已感染之農場中可能觀察到新的爆發。因此，對其他疫苗存在持續需要。
製備減毒活病毒疫苗之最常用方法為在除天然宿主以外之基質(通常為具有可感染病毒之細胞株的細胞培養物)中連續繼代病毒，直至其減弱(亦即毒性或致病能力降低)至足以用作疫苗。對於第一代，將細胞培養物用所選接種物感染。獲得明顯的病毒複製證據(例如感染細胞中病毒誘發之細胞病變效應[CPE])後，使用第一代之細胞培養物之等分試樣或感染細胞或兩者來感染第二細胞培養物。重複 此過程，直至病毒基因組中之一或多個關鍵突變引起充分減毒，使得病毒可安全地用作疫苗。減毒程度通常憑經驗藉由將天然宿主暴露於逐漸更大繼代水準之病毒來確定。
以上程序基本上可靠且已成功地用於研發許多疫苗供人類及獸醫學使用。然而，當開始工業規模製備時，仍然需要提供一種有效且成本有效之PRRSV製備方法。
本發明係關於一種製備用於製造該等疫苗之活PRRS病毒的新方法。本文所述之方法可用於大規模製備任何PRRS病毒，包括(但不限於)根據布達佩斯條約(the Budapest Treaty)之規定寄存在歐洲細胞培養物收藏中心(European Collection of Cell Cultures，ECACC)寄存編號ECACC 11012501及ECACC 11012502(各自於2011年1月25日寄存)下PRRSV株94881，或上述病毒株之一之任何後代或子代。
更特定言之，本發明係關於一種商業化規模製備豬生殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)之方法，其包含：
a)在生物反應器中同時用允許PRRSV感染之哺乳動物細胞株接種大規模培養基及用PRRSV感染哺乳動物細胞。
b)感染後使病毒繁殖5至7天；
c)藉由自生物反應器移除培養基且自其分離繁殖之病毒進行第一次收穫步驟；
d)補充生物反應器中之培養基，且使病毒繁殖1至4天；
e)藉由自生物反應器移除培養基且自其分離繁殖之病毒進行第二次收穫步驟；
f)補充生物反應器中之培養基，且使病毒繁殖1至4天；及
g)藉由自生物反應器移除培養基且自其分離繁殖之病毒進行第三次收穫步驟。
在某些實施例中，該方法可進一步包含在第三次收穫步驟之後的至少一次再進料及收穫步驟，其包含補充生物反應器中之培養基且使病毒繁殖1至4天，且藉由自生物反應器移除培養基且自其分離繁殖之病毒進行第四次收穫步驟。
較佳地，在製備方法中，目標感染倍率(MOI)為0.01至0.30，且哺乳動物細胞以每300L生物反應器約7×108至1.0×109之密度種植。更特定言之，細胞種植密度為每300L生物反應器約1.0×109。在特定實施例中，感染係使用每300L生物反應器約7×108個病毒粒子。
該方法可包含監測培養基之右旋糖濃度，其中第一次收穫步驟在培養基之右旋糖濃度降至小於0.1g/L之第一天進行。
在商業化製備方法中，第二次收穫較佳在培養基再進料後1或2天進行，且第三次收穫在培養基第二次再進料後1至4天進行。
在特定實施例中，培養基在添加哺乳動物細胞株及PRRS的前一天或同一天添加至生物反應器中。較佳地， 培養基在添加哺乳動物細胞株及PRRS的前一天添加至生物反應器中。生物反應器之溫度設定在34℃與38℃之間。
在特定實施例中，培養基包含5%v/v經照射胎牛血清。
該方法可用於商業化規模製備任何PRRSV，包括(但不限於)選自由以下組成之群之PRRSV：根據布達佩斯條約之規定寄存在歐洲細胞培養物收藏中心(ECACC)寄存編號ECACC 11012501及ECACC 11012502(各自於2011年1月25日寄存)下之PRRSV株94881、萊利斯塔病毒株(Lelystad virus strain)(萊利斯塔劑(CDI-NL-2.91))或其他株，諸如寄存在寄存編號ECACC 04102703、ECACC 04102702、ECACC 04102704、CNCM寄存編號I-1140、CNCM寄存編號I-1387、CNCM寄存編號I-1388、ATCC VR 2332、VR 2385、VR 2386、VR 2429、VR 2474及VR 2402；CNCM I-1102、ECACC V93070108；ATCC寄存編號VR-2368；ATCC VR-2495下之株，或上述病毒株之一之任何後代或子代。
亦涵蓋一種用於製備PRRSV之商業化規模製備方法，其包含：a.將允許PRRSV感染之哺乳動物細胞與PRRSV同時接種至含有適於細胞生長之培養基的生物反應器中；及b.進行三次收穫PRRSV之連續收穫步驟，其中各在第 一次及第二次收穫後，補充培養基，且其中：i.第一次收穫在培養基之右旋糖濃度降至小於0.1 g/L之第一天進行；ii.第二次收穫在第一次收穫後添加培養基之後1或2天進行；及iii.第三次收穫在第二次收穫後添加培養基之後1與4天之間進行。亦涵蓋一種替代性方法，其使用等同於上述生物反應器製程之並行滾瓶製程。更特定言之，本發明係關於一種商業化規模製備豬生殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)之方法，其包含：a)在滾瓶中同時用允許PRRSV感染之哺乳動物細胞株接種大規模培養基及用PRRSV感染該等哺乳動物細胞；b)感染後使病毒繁殖5至7天；c)藉由自該等滾瓶移除培養基且自其分離繁殖之病毒進行第一次收穫步驟；d)補充該滾瓶中之培養基，且使病毒繁殖約2天；e)藉由自該等滾瓶移除培養基且自其分離繁殖之病毒進行第二次收穫步驟；f)補充該滾瓶中之培養基，且使病毒繁殖約2天；及g)藉由自該生物反應器移除培養基且自其分離繁殖之病毒進行第三次收穫步驟。
本發明之另一態樣係關於一種PRRSV MLV，其包含根據本文所述之方法製備之PRRSV用可接受之佐劑或載劑調配以供傳遞至豬。
本發明提供大規模製備用於製備疫苗及其他組合物之活豬生殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)的方法。在典型製備方 法中，病毒生長在允許PRRSV感染之細胞株上。然而，在該等一般方法中，細胞株在感染PRRSV之前生長至匯合或接近匯合。在本發明中，本發明者意外地證明細胞株不需要在用PRRSV感染之前種植及生長，而是可將PRRSV及細胞株同時添加至細胞培養製程中。因此，當以商業化規模大量製備病毒時，本發明提供節約時間、成本及材料之顯著優點。術語商業化規模係指超過10 L之細胞培養物體積。舉例而言，商業化規模係指活PRRSV 10 L至3000 L範圍內之製備規模。在更特定實施例中，體積為30 L至約300 L。
本發明之方法可用於製備任何PRRSV株，包括(但不限於)寄存為ATCC VR 2332、VR 2385、VR 2386、VR 2429、VR 2474及VR 2402；CNCM I-1102、CNCM I-1140、CNCM I-1387、CNCM I-1388或ECACC V93070108之PRRSV株。在尤其較佳實施例中，本發明之方法用於製備根據布達佩斯條約之規定寄存在歐洲細胞培養物收藏中心(ECACC)寄存編號ECACC 11012501(親本株)及ECACC 11012502(高代數減毒MSV)(各自於2011年1月25日寄存)下之PRRSV株94881或上述病毒株之一之任何後代或子代。生長之病毒可為呈減毒格式之任何上述病毒。或者，病毒可經遺傳修飾，以包含一或多種編碼一或多種豬疾病之其他抗原決定子之異源性核酸。
熟習此項技術者應瞭解存在多種允許PRRSV感染之細胞株。例示性細胞為豬肺泡巨噬細胞，諸如來源於MARC- 145細胞之彼等細胞。可感染PRRSV之其他細胞包括MA-104細胞；幼倉鼠腎(BHK)細胞；中國倉鼠卵巢(CHO)細胞；及除MA-104細胞或MARC-145細胞以外的非洲綠猴腎細胞，諸如VERO細胞；其經轉染。此外，細胞可為來自豬類動物，已適於長期生長在培養物中之初級細胞。尤其適合之宿主細胞為猿細胞株MA-104、VERO細胞或豬肺泡巨噬細胞。PRRSV優先在肺泡肺巨噬細胞中生長(Wensvoort等人，1991)。諸如CL2621及自猴腎細胞株MA-104選殖之其他細胞株的幾個細胞株(Benfield等人，1992；Collins等人，1992；Kim等人，1993)亦容易感染病毒，且可用於本文所述之大規模製備方法中。
在以下實例1中所示之本發明之例示性方法中，提供一種製備PRRSV 94881 MLV之並行製程。雖然此程序係針對PRRSV 94881 MLV而顯示，但熟習此項技術者應瞭解此程序可容易用於需要大規模製備之任何PRRSV。
由本發明製備方法製備之病毒可用於目前使用PRRSV之任何應用。在一特定實施例中，根據本文所述之方法製備之病毒用以製備PRRSV MLV。
根據本發明方法生長之病毒株可為毒性PRRS病毒、減毒PRRS病毒或實際上已經修飾以賦予其他所需性質之PRRS病毒。此可藉由經典繁殖及選擇技術，如在適合宿主細胞中持續繁殖以擴展減弱表型來達成。或者，病毒株可藉由適合基因工程改造技術，使此等病毒株之基因組之核酸序列定向突變來進行遺傳修飾。PRRSV之基因組已得 到完全或部分定序(Conzelmann等人，1993；Meulenberg等人，1993a；Murthaugh等人，1995)，且除RNA依賴型RNA聚合酶(ORF 1a及1b)外亦編碼六種結構蛋白質，其中四種稱為GP2(ORF2)、GP3(ORF3)、GP4(ORF4)及GP5(ORF5)之包膜醣蛋白、一種非糖基化膜蛋白M(ORF6)及核衣殼蛋白N(ORF7)(Meulenberg等人，1995,1996；van Nieuwstadt等人，1996)。歐洲型及美國型PRRSV株之免疫表徵及核苷酸定序已鑑別出PRRSV株之位於結構病毒蛋白質內之次要抗原差異(Nelson等人，1993；Wensvoort等人，1992；Murtaugh等人，1995)。
實際上，本發明中生長之例示性病毒為PRRSV 94881病毒。雖然減毒株使用本文所述之方法生長，但病毒可容易為製成嵌合病毒之PRRSV 94881病毒，其中ECACC寄存編號11012502下之PRRSV 94881病毒或實際上寄存在ECACC寄存編號11012501下之親本株的骨架經修飾以用來自不同PRRS病毒株之相應ORF置換ORF 1a、ORF 1b、ORF 2、ORF 3、ORF 4、ORF 5、ORF 6或ORF 7中一或多者之內源性序列。舉例而言，不同PRRS病毒株可為不同的歐洲型株，諸如萊利斯塔病毒株(萊利斯塔劑(CDI-NL-2.91))，或其他株，諸如寄存在寄存編號ECACC 04102703、ECACC 04102702、ECACC 04102704、CNCM寄存編號I-1140、CNCM寄存編號I-1387、CNCM寄存編號I-1388、ATCC VR 2332、VR 2385、VR 2386、VR 2429、VR 2474及VR 2402；CNCM I-1102、CNCM I-1140、CNCM I- 1387、CNCM I-1388或ECACC V93070108下之株，或實際上可為美國型株，諸如北美PRRS病毒pT7P129A；ATCC寄存編號VR-2332、ATCC寄存編號VR-2368；ATCC VR-2495；ATCC VR 2385、ATCC VR 2386、ATCC VR 2429、ATCC VR 2474及ATCC VR 2402。
用於製備經修飾之序列的重組技術為熟習此項技術者所熟知，且通常採用構築病毒基因組之全長互補DNA複本(感染性純系)，接著可藉由DNA重組及操縱方法(如定點突變誘發等)進行修飾。以此方式，可修飾例如病毒蛋白質之抗原位點或酶性質。歐洲及北美基因型之PRRS病毒株之感染性純系已在文獻中報導且可使用本發明之方法生長。
較佳地，本發明之疫苗為經修飾之活疫苗，其包含一或多種此等活株於適合載劑中，但亦可使用不活化病毒來製備死疫苗(KV)。MLV通常調配成允許每一劑投與101至107個病毒粒子，較佳每一劑103至105個粒子，更佳為每一劑104至105個粒子(4.0-5.0 log10 TCID50)。KV可基於每一劑103至1010個病毒粒子之預不活化力價調配。疫苗可包含醫藥學上可接受之載劑，例如生理鹽溶液。疫苗可包含或可不包含佐劑。適合佐劑之一實例為α-生育酚乙酸酯，其可以商標名Diluvac Forte®獲得。或者，可使用例如基於明礬(alum)之佐劑。
豬可經由口鼻途徑感染PRRSV。肺中之病毒由肺的肺泡巨噬細胞吸收且在此等細胞中在9小時內完成PRRSV複 製。PRRSV在12小時內自肺行進至肺淋巴結，且在3天內行進至周圍淋巴結、骨髓及脾。在此等部位，僅少數細胞對病毒抗原呈染色陽性。病毒在血液中存在至少21天且通常時間長得多。7天後，在血液中發現PRRSV抗體。PRRS感染豬中病毒與抗體之組合存在表明儘管存在抗體，但病毒感染可持續長時間，不過感染程度低。在至少7週期間，肺中之肺泡細胞群體不同於正常SPF肺。
疫苗可以活病毒之冷凍乾燥製劑形式提供，其用溶劑復原，產生注射用溶液。因此，在本發明之收穫步驟後，病毒可組合且冷凍乾燥。溶劑可例如為水、生理鹽水或緩衝液或輔助溶劑。溶劑可含有佐劑，例如α-生育酚乙酸酯。復原疫苗接著可注射至豬中，例如以肌肉內或皮內注射液形式注射至頸中。對於肌肉內注射，可應用2 ml體積，對於皮內注射，其通常為0.2 ml。因此，在另一態樣中，本發明為一種疫苗產品，其在各別容器中包含病毒之冷凍乾燥組合物及復原用溶劑，且視情況進一步含有包含使用說明書之活頁或標籤。
由本發明方法製備之病毒製備的疫苗不僅可包含一或多種上述株，而且亦可包括對PRRS或其他豬病毒性或細菌性疾病(如豬環狀病毒或經典豬瘟病毒)具有活性之其他組分。因此，本發明進一步係關於所述疫苗，其特徵在於其含有至少一種對非PRRS之豬疾病具有活性之其他抗原。此外，疫苗可包含某些醫藥學上或獸醫學上可接受之佐劑。一種此類佐劑為α-生育酚。因此，新型疫苗組合物、 尤其包含PRRSV 94881之PRRS病毒疫苗可藉由添加佐劑進一步改良。該等改良包含製備與加強疫苗功效之佐劑組合之疫苗，使得在投與佐劑與疫苗之組合時，可見臨床反應/結果優於單獨投與疫苗。舉例而言，本發明之疫苗組合物可包含PRRSV 94881病毒疫苗及選自由以下組成之群之佐劑：MCP-1、睡眠嗜血桿菌(Haemophilus sonmus)部分、卡波莫(Carbapol)TM及其組合。在一些實施例中，包含PRRSV 94881病毒疫苗之病毒疫苗可為重組次單位疫苗或者可為活減毒病毒疫苗。所存在之一例示性活疫苗為Ingelvac® PRRS MLV，且PRRSV 94881可以類似於Ingelvac® PRRS MLV之方式調配。
除上述外，疫苗組合物亦可含有其他成分，只要該等其他成分不干擾MCP-1、睡眠嗜血桿菌部分、卡波莫TM或其他卡波姆(carbomer)或基本病毒疫苗即可。該等其他成分包括例如黏合劑、著色劑、乾燥劑、消毒劑、濕潤劑、穩定劑、賦形劑、黏著劑、塑化劑、增黏劑、增稠劑、貼附材料、軟膏基質、角蛋白脫除劑、鹼性物質、吸附促進劑、脂肪酸、脂肪酸酯、高級醇、界面活性劑、水及緩衝劑。較佳其他成分包括緩衝劑、軟膏基質、脂肪酸、消毒劑、鹼性物質或界面活性劑。
本發明中所用之佐劑之含量或量可變化且可藉由考慮例如所用PRRS病毒疫苗之性質及劑型來確定。佐劑可佔例如1至100重量%。本發明之基於PRRSV 94881之組合物藉由單獨或在各種其他成分下將佐劑組分與病毒疫苗組分混 合在一起來製備。組合物可使病毒疫苗與佐劑作為一種調配物提供，或者佐劑與疫苗提供於可同時或依序投與之不同調配物中。
佐劑組分可在投與生物體時與病毒疫苗分開投與。或者，本發明之佐劑連同病毒疫苗一起可呈單一疫苗組合物形式投與。病毒疫苗可為任何病毒疫苗。更特定實施例涵蓋使用包含PRRSV 94881之PRRS病毒疫苗。此外，該種疫苗可與諸如Ingelvac® PRRS MLV及/或Porcilis® PRRS之其他疫苗組合。此僅僅為一種例示性PRRS病毒疫苗且其他該等疫苗可補充有本文所述之佐劑。
本文所述之免疫原性組合物尤其有利於誘導產生對PRRS病毒之抗體反應。詳言之，本文中顯示當組合投與佐劑與PRRS病毒疫苗時，相比於單獨投與疫苗，使用此等特定佐劑、尤其MCP-1可增強對PRRS病毒之免疫反應。顯示該投與可減輕臨床症狀之嚴重程度，諸如與PRRSV感染有關之肺病變、厭食症、皮膚變色、嗜睡、呼吸徵象、乾癟仔豬、咳嗽、腹瀉及其組合。實際上，相比於在缺乏該佐劑下由單獨投與疫苗所產生之該等症狀之嚴重程度減輕，在疫苗與佐劑之組合下觀察到與PRRS病毒感染有關之臨床症狀之嚴重程度減輕更多。
因此，相比於因單獨投與PRRS病毒疫苗產生之結果，組合物尤其增強患病動物中之臨床結果。在特定實施例中，增強之臨床結果為與未接收免疫原性組合物與該佐劑組合之動物相比，肺病變百分比降低。在其他實施例中， 增強之臨床結果為與未接收免疫原性組合物與該佐劑組合之動物相比，動物中之病毒血症降低。
因此，在一個態樣中，本發明係關於一種經改良之疫苗，更尤其經改良之PRRS病毒疫苗，其中改良包含將選自由MCP-1、睡眠嗜血桿菌部分、卡波莫及其組合組成之群之佐劑與病毒疫苗混合。本發明之疫苗組合物可進一步包含醫藥學上可接受之載劑。此外，疫苗可包含其他活性成分，包括HS、ORF 5、INFα、聚ICLC、IL-12，以進一步增強PRRS疫苗之功能。該等佐劑可單獨添加或與MCP-1組合添加。
本發明之疫苗組合物可藉由調配技術中已知之任何方法調配成例如液體製劑、懸浮液、軟膏、散劑、洗劑、油包水乳液、水包油乳液、乳液、乳膏、泥罨劑、貼片及凝膠，且較佳用作藥劑。因此，根據本發明之另一態樣，提供一種包含以上疫苗組合物之醫藥組合物。本發明之疫苗組成物在經皮投與時可顯著誘導抗體產生。因此，在本發明之另一較佳實施例中，疫苗組合物可呈經皮製劑形式提供。
此外，如上所述，本發明中之病毒及佐劑可呈單一疫苗組合物形式一起投與生物體，或呈與疫苗之抗原性PRRS病毒組分分開且不同之佐劑製劑形式投與，其中佐劑以使生物體中回應於PRRS病毒疫苗所產生之抗體之量可相比於PRRS病毒疫苗單獨投與顯著增加的方式起作用。因此，根據本發明之另一態樣，提供一種增加針對PRRS病 毒產生之抗體之量的方法，該方法包含向生物體同時或依次投與免疫有效量之PRRS病毒疫苗及有效作為免疫佐劑之量的選自由MCP-1、睡眠嗜血桿菌部分、卡波莫及其組合組成之群的佐劑，該佐劑單獨或與選自由HS、ORF 5、INFα、聚ICLC、IL-12及其組合組成之群的另一組分組合。
當將佐劑及PRRS病毒疫苗投與生物體時，動物之臨床結果增強。佐劑之有效量及PRRS病毒疫苗之免疫有效量可由一般技術者考慮例如抗原物質之類型及性質、生物體物種、年齡、體重、疾病嚴重程度、疾病類型、投藥時間及投藥方法且此外使用針對生物體中抗原物質產生之抗體之量作為指數來適當確定。
PRRS病毒疫苗、佐劑或其組合可藉由視例如患者情況及疾病性質而選擇之任何適合方法投與生物體。該等方法之實例包括腹膜內投與、經皮投與(例如皮下注射、肌肉內注射、皮內注射及貼片)、經鼻投與、經口投與、經黏膜投與(例如直腸投與、陰道投與及角膜投與)。其中肌肉內投與較佳。
PRRSV MLV之一例示性治療劑量為約兩毫升(2 mL)。熟習此項技術者將認識到，劑量可基於個別個體之品種、體型及其他身體因素以及PRRSV MLV之特定調配物及投藥途徑而變化。較佳地，PRRSV MLV以單一劑量投與；然而，其他劑量可為適用的。此外，熟習此項技術者經由本發明將認識到，劑量及給藥次數受個別豬之年齡及身體情 況以及此行業所共同之其他考慮因素及投與PRRSV MLV之特定條件影響。
在某些其他實施例中，疫苗可為包含兩種或兩種以上PRRS病毒之多價疫苗，其中至少一種PRRS病毒為寄存在ECACC寄存編號11012502下之減毒94881病毒。其他PRRS病毒可為一或多種選自由以下組成之群之病毒：寄存在寄存編號萊利斯塔病毒株下之PRRSV株(萊利斯塔劑(CDI-NL-2.91))，或其他株，諸如寄存在寄存編號ECACC 04102703、ECACC 04102702、ECACC 04102704、CNCM寄存編號I-1140、CNCM寄存編號I-1387、CNCM寄存編號I-1388、ATCC VR 2332、VR 2385、VR 2386、VR 2429、VR 2474及VR 2402；CNCM I-1102、CNCM I-1140、CNCM I-1387、CNCM I-1388或ECACC V93070108下之株，或實際上可為美國型株，諸如北美PRRS病毒pT7P129A；ATCC寄存編號VR-2332、ATCC寄存編號VR-2368；ATCC VR-2495；ATCC VR 2385、ATCC VR 2386、ATCC VR 2429、ATCC VR 2474及ATCC VR 2402。
基於PRRS病毒之疫苗可用以接種仔豬與大母豬兩者。在本發明之一個態樣中，特定給藥方案基於豬之年齡及選用於投與之抗原選擇。基於本發明發現PRRSV感染(自野生型暴露與疫苗接種兩者)在年齡更大之動物中清除快得多，此將使任何年齡之豬接收最有效之劑量。因此，在某些方面，較佳地，接種年齡更大之動物，而非接種較年輕之豬(包括三週齡及更年輕之豬)有助於誘導主動免疫且仍 非常有益。動物年齡可為控制PRRS之一個重要因素，且可為影響疫苗接種及發展有效免疫反應之因素。因此，年齡、疾病管理、畜牧業、先天性免疫及主動免疫為重要的且需要在控制策略中加以考慮。
PRRSV 94881疫苗可以任何習知方式投與且在一些較佳方法中投藥係經鼻投與。較佳地，所投與之PRRSV疫苗在單次給藥後如同Ingelvac®一樣，提供治療PRRSV感染或降低其嚴重程度或發病率的益處，然而，若選擇其他抗原或組合或多價疫苗，則應瞭解其可以在初始投藥後可包括一或多個增強劑量的其習知方式投與。熟習此項技術者將能夠基於所選PRRSV疫苗及抗原將投與之動物之年齡範圍確定適當的劑量。
實例1： PRRSV 94881 MLV製備之例示性按比例擴大
PRRSV 94881之300 L生物反應器製程按比例增大使用在64-84代之間的MA104細胞。此等細胞在850 cm2滾瓶(Corning)中擴增。在300 L氣提生物反應器中在病毒感染的同時培養細胞。在整個培養過程中，監測培養基之右旋糖/乳酸鹽濃度(g/L)。在收穫時，棄去流體且保留病毒樣品。
培養基組成如下表中所示：
製備無酚紅培養基之MEM、新黴素及1.4 g/L碳酸氫鈉且過濾。在培養基置放於生物反應器中之同時，FBS添加至培養基中。所添加新黴素之量如下計算：體積(L)×30 mg/L÷效能(以mg/g計)。
PRRSV 94881生長之並行製程包含將AK MA104細胞種植於生物反應器中且同時用PRRSV 94881病毒種子感染細胞。圖1概述該並行製程。在圖2中，提供圖1中概述之並行製程之時刻表。
在並行製程中，270 L體積之培養基經無菌過濾至生物反應器中。培養基在細胞及血清添加的同一天或前一天添加至容器中。若培養基在細胞及血清添加前一天添加至生物反應器中，則推薦啟動溫度控制，使得培養基維持在35℃下，pH值處於控制模式下，使pH值維持在7.25±0.1，且DO處於監測模式下且攪動設定在35 rpm下。在添加細胞及經照射胎牛血清(IFBS)之日，溫度控制設定在36℃下。在添加培養基之後及細胞接種之前，IFBS添加至生物反應器中。IFBS之目標濃度為5% v/v，每個生物反應器270 L體積中有14.0 L體積之IFBS。
進行三輪300 L生物反應器操作。生物反應器參數為：溫度設定點為36℃，以控制模式pH值設定點為7.25，DO監測，及攪拌器在35 rpm下。表3、4及5顯示針對來自OIT之DO%、來自YSI之右旋糖及乳酸鹽及pH值及來自NOVA之L-麩醯胺酸所記錄之日期。PD力價僅供參考。QC力價為正式力價。
表3顯示在感染7天期間批次001PD-X之結果。每日獲取樣品且操作在PI第7天終止。pH值設定在7.25下且在操作期間恆定，除了PI第4天以外，此時其降至7.0以下。在PI第4天，葡萄糖自前一天之0.74降至0.4，麩醯胺酸開始消耗且力價開始上升約1 log。當葡萄糖完全消耗(0.1 g/L)時，在PI第5天觀察到峰值力價。亦在PI第5天，DO降至30%且開始控制以避免DO一夜降至零。PI第6天力價下降，接著在PI第7天增至7.4。樣品在PI第7天混濁。
表4顯示批次002PD-X之結果(R0PI為培養物再進料之點)。基於批次001PD-X之力價結果，收穫日設定在PI第5天。批次002PD-X PI第1天至PI第5天與批次001PD-X一致。收穫生物反應器，接著在PI第5天再進料。確定收穫-II之生長曲線。每日獲取樣品，持續5天。右旋糖至第R2PI天完全消耗。力價處於峰值，持續5天(0.5 log變化在分析誤差範圍內)。麩醯胺酸至第R5PI天完全消耗。DO探針在再進料後失效。無法量測DO含量(很可能接近0)。在第R4PI天，細胞仍然附接，因為瓶中樣品清澈。在第R5PI天，在樣品瓶上觀察到有些混濁，指示細胞可能已開始自彈簧脫落。
表5顯示批次003PD-X之結果。基於批次002PD-X之力價結果，收穫-II日設定在PI第1天或PI第2天。決定在PI第2天收穫流體以靈活用於製備。建立收穫-III持續7天之生長曲線。每日獲取樣品。右旋糖至第2R2PI天完全消耗。力價處於峰值，持續4天，接著降至7.0，持續2天(0.5 log變化在分析誤差範圍內)，接著在PI第7天降至6.2。麩醯胺酸至第2R5PI天完全消耗。DO在第2R2PI天脫除控制，以監測細胞死亡。
300 L規模之病毒繁育的收穫-I階段：收穫-I(批次001PD-X)之生長曲線顯示儘管右旋糖至PI第5天完全消耗(0.1 g/l)，但病毒粒子持續生長至PI第7天。當右旋糖為約1 g/L之初始濃度一半時(PI第4天)，麩醯胺酸開始消耗，且接著在右旋糖耗盡後，麩醯胺酸似乎為能量之主要來源。開始2-3天麩醯胺酸讀數之不一致可歸因於NOVA儀器之波動，因為培養基僅含有2 mmol/L。DO含量在右旋糖/麩醯胺酸新陳代謝及病毒繁育期間一致下降。
病毒繁育動力學表明PI 5-7天收穫病毒。PI第4天與PI第7天之間的QC力價變化在分析變化範圍內(±0.71 log/ml)。收穫-I準則為右旋糖完全消耗(0.1 g/l)時之時間，與30 L資料(研究號6127-1310-09K-198)一致。因此，由PI第4天開始之右旋糖離線量測將需要追蹤右旋糖含量。表3顯示在300 L生物反應器中在右旋糖耗盡後PRRSV 94881病毒穩定3天(PI 5-7天)。然而，若進行第二次收穫，則基於表4及5之結果，推薦在右旋糖濃度<0.1 g/L(使用YSI量測)之第一天進行收穫-I，以確保細胞附接至生物反應器中之彈簧(載具)。
300 L規模之病毒繁育的收穫-II階段：對於批次002PD-X及003PD-X，在PI第5天進行收穫-I後，添加新鮮培養基及5%血清以產生第二收穫病毒流體(表4及5)。根據與針對建立第一收穫材料所述相同之程序，將含IFBS(5% v/v)之MEM培養基(270-280 L)添加至生物反應器中。在批次002PD-X上，收穫-II之生長曲線進行5天，且在再進料後1 天達到峰值力價(參見表4)。力價穩定4天。再進料後1天之病毒力價可與第一次收穫之力價(表2)相當。右旋糖含量在PI第2天完全消耗。再進料後4天之範圍可用於第二次收穫準則。然而，在PI第4天進行第二次收穫可能對第三次收穫有影響，因為在PI第4天獲取之流體樣品上觀察到有些混濁，指示細胞死亡或自彈簧脫離。因此，對於批次003PD-X，在PI第2天進行收穫-II。基於批次003PD-X之資料，若將進行第二次再進料及第三次收穫，則推薦收穫II目標日為1-2PI。
300 L規模之病毒繁育的收穫-III階段：對於在PI第2天進行之收穫II後的批次003PD-X(表5)，再添加培養基及血清至容器中以產生第三收穫病毒流體(表5)。根據與針對建立第一收穫材料所述相同之程序，將含IFBS(5% v/v)之MEM培養基(270-280 L)添加至生物反應器中。收穫-III之生長曲線進行7天，且在再進料後1天達到峰值力價(參見表5)。力價穩定4天。再進料後1天之病毒力價可與第二次收穫之力價(表4及5)相當。右旋糖在PI第1天完全消耗。再進料後4天之範圍可用於第三收穫準則。
以下三個圖代表在300 L生物反應器中進行之三次操作的右旋糖、麩醯胺酸及DO型態與力價。該等圖之目的在於展示三次試驗之一致性。
圖3展示以300 L規模進行之所有三次操作之右旋糖消耗及病毒力價的概述。三次操作之收穫-I型態非常一致，至PI第5天右旋糖完全消耗(0.1 g/l)，且其與所進行之三次 操作時的峰值力價一致。第一次再進料後，對於批次002PD及003PD，在PI第1天右旋糖小於0.3 g/l，且力價已處於峰值。在PI第2天，右旋糖完全消耗且病毒力價保持在峰值。對於批次003PD中之收穫III，當第二次再進料在第R2PI天進行時，右旋糖至第2R1PI天降至小於0.1 g/L且力價處於峰值。
圖4展示以300 L規模進行之所有三次操作之麩醯胺酸消耗及病毒力價的概述。如針對收穫-I型態所見，三次操作非常一致。麩醯胺酸至PI第5天降至其初始濃度2 mmol/L之一半，且其與所進行之三次操作時的峰值力價一致。第一次再進料後，對於批次002PD及003PD，麩醯胺酸至PI第2天降至其初始濃度之一半，且力價自PI第1天已處於峰值。對於批次003PD中之收穫III，第二次再進料在第R2PI天進行。至PI第5天，麩醯胺酸緩慢消耗至0，且病毒力價一致，接著細胞開始死亡且力價至PI第7天下降。
如針對收穫-I型態所見，三次操作非常一致，DO至PI第5天降至30%，且其與所進行之三次操作時的峰值力價一致。在第一次再進料後，批次002PD-X之DO探針失效，因此資料不可用，在批次003PD-X時，DO在PI第1天下降，與峰值力價一致。對於批次003PD中之收穫-III，當在第R2PI天進行第二次再進料時，DO迅速減少，直至PI第3天，此時細胞開始死亡，且DO至PI第5天消耗至0且病毒力價一致，接著細胞開始死亡且力價至PI第7天下降。
將來自批次001PD-X之病毒流體漂白且棄去。保留來自批次002PD-X收穫-I之一公升，且添加SGS(25% v/v)以用於研究之目的，其餘流體漂白且棄去。保持來自批次003PD-X收穫II之兩公升處於冷凍下以用於濃縮之目的，其餘流體漂白且棄去。
300 L規模之種植細胞密度(PCD)之範圍：目標種植細胞密度(PCD)為每300 L生物反應器在270-280 L工作體積下7.0×109個總細胞。基於來自30 L最終製程轉移報告(6127-1310-09K-198)之資料，總細胞種植範圍在每30 L生物反應器7.0×108-1.0×109之間。由於時間限制，僅僅評估目標細胞種植密度。
300 L規模之感染倍率(MOI)之範圍：對於PRRSV 94881在此生長系統內之繁育，0.1之目標MOI為理想的。在30 L生物反應器中檢查分別0.01及0.3之低及高MOI水準。
風險分析：所推薦之300 L生物反應器並行製程參數概述於表11中。僅測試目標參數且考慮其對製程而言為關鍵 還是非關鍵。範圍以30 L規模評估。定義如下：˙ 關鍵參數為對最終產物之品質屬性為關鍵之彼等參數；˙ 非關鍵參數為可直接控制在規定範圍內或具有寬操作範圍，因此與設定點之偏差非關鍵的彼等參數。非關鍵參數有助於控制關鍵參數在規定範圍內；˙ 「僅供參考」參數為進行監測以獲得關於製程之額外資訊，但與最終產物之屬性不直接相關的參數。
結論及製程推薦：成功實現並行製程自30 L按比例擴大至300 L生物反應器。收穫-I之收穫日及力價在30 L生物反 應器範圍內。收穫-II亦為成功的，其中力價可與收穫-I相比。第二次收穫之力價穩定4天。實現額外(第三次)收穫，其中力價可與收穫-I及II相當。第三次收穫之力價穩定至少4天。
對PRRSV 94881 MLV之較佳300 L生物反應器並行製程的推薦如下：病毒繁育收穫-I：培養基組合物為無酚紅之MEM、30 mg/L新黴素及1.4 g/L碳酸氫鈉。MA104細胞以7×109個/300 L彈簧生物反應器之密度種植於270-280 L補充有14.0 L 5% v/v胎牛血清的培養基中(範圍：7×109-1×1010/300 L彈簧生物反應器)。生物反應器之溫度控制在36±1℃下。DO設定在「監測模式」下。一旦DO含量降至10-30%，即啟動DO控制在10%之設定點下。pH 7.2設定在控制模式下。用於高pH值(添加CO2)之PID參數為：
氣流流速設定在2.0 SLPM；CO2流速設定在2.0 SLPM；O2流速設定在2.0 SLPM；N2流速設定在2.0 SLPM且總氣體鼓泡速率應在2.0 SLPM下。
目標MOI為0.1(範圍7×108-1×109個病毒粒子/300 L彈簧生物反應器)。
對於收穫-I準則，在PI第4天開始，進行右旋糖量測之離線取樣。DO趨勢可用作指示物。收穫-I應在右旋糖0.1 g/L時(範圍2天+/-)進行，其通常在PI 5-7天之間出現。然而，若進行第二次收穫，則推薦收穫-I在右旋糖濃度0.1 g/L之第一天。
第一次再進料-收穫-II：第一次收穫後，向生物反應器再進料270-280 L補充有14.0 L胎牛血清(5% v/v)之培養基組合物：無酚紅之MEM、新黴素及1.4 g/L碳酸氫鈉。再進料在與建立第一次收穫培養基相同之條件下進行(參見以上第一次收穫參數)。pH值控制仍在7.2之設定點下。用於高pH值(添加CO2)之PID參數為：
溫度控制保持在36±1℃之設定點。DO控制設定在「監測模式」下。
第二次再進料-收穫-III：在第二次收穫後，即刻向生物反應器再進料270-280 L補充有1.40 L經照射胎牛血清(5% v/v)之培養基組合物：無酚紅之MEM、新黴素及1.4 g/L碳酸氫鈉。再進料在與建立第一次收穫培養基相同之條件下進行(參見以上第二次收穫參數)。pH值控制仍在7.2之設定點下。用於高pH值(添加CO2)之PID參數為：
溫度控制保持在36±1℃之設定點。DO設定在「監測模式」下。當前測試結果顯示對於第三次收穫病毒流體，最佳時間在再進料後第1天-第4天之間。
應瞭解以上製程為例示性的且可進一步修改，以提高產率及/或降低操作生物處理器之成本。舉例而言，參數變化可包括(但不限於)：降低第二次及第三次收穫之血清濃度，降低細胞種植密度，添加細胞及種子於同一瓶中且攪拌，因此可縮短收穫I之病毒繁育。此外，可藉由針對可能收穫IV之再一次再進料，進一步改良病毒產率。進料消耗培養基組分，諸如(但不限於)葡萄糖及麩醯胺酸。
實例2
在一特定實例中，使用根據上述方法製備之PRRSV 94881來確定PRRSV 94881在接種豬中之功效。在此研究中，4至13日齡之仔豬經肌肉內接種包含107.6 TCID 50於2 ml中之組合物(研究第0天)。在第13天，仔豬斷奶且監測各種疾病參數，直至第90天。研究參數包括監測病毒血症、組織及分泌物中病毒之存在、臨床觀察、肺病變及增重。
各研究組：在研究第0、14、28、56及90天，對接種、 警哨及對照稱重。對於接種組與警哨，在第0天與第14天之間每隔一天對血液取樣，且至第90天，一週取樣一次，且對於對照，在整個研究時期期間一週取樣一次，直至第90天。
對於接種組與警哨，在第0天與第14天之間每隔一天獲取鼻、口腔及糞便拭子，且至第56天，一週獲取一次，且對於對照，在整個研究時期期間一週獲取一次，直至第56天。
在疫苗接種組中之2隻豬中，第0天至第14天每隔一天評定屍檢及第14天至第90天一週評定一次，且剩餘豬在第90天評定。在警哨組中，5隻豬在第56天評定，剩餘豬在第90天評定。對照組2隻豬在第0天至第14天每隔一天評定，在第14天與第56天之間一週評定一次，且剩餘豬在第90天。
每天進行臨床觀察。
使用PRRSV歐洲型特異性引子，對來自血液、口腔、糞便及鼻拭子以及肺灌洗液之樣品進行定量RT-PCR。
自此等研究，資料顯示除了幾隻豬跛行外，仔豬均顯示正常健康。事後剖析，屍檢時無異常，除了1-2隻動物顯示腹股溝淋巴結輕微增大。重要的是，可見在接種組中未觀察到肺病變。
圖6顯示與用含有寄存在ECACC寄存編號11012502下之減毒PRRS病毒株之組合物接種的組相比，警哨組中具有病毒血症之動物之百分比，表明根據本發明方法製備之 PRRS病毒向豬提供保護性免疫力之功效。
實例3
以下設備及試劑(表8)用於發展歐洲型PRRS 94881之並行滾瓶製程：
具有酚紅培養基及1.4 g/L碳酸氫鈉之MEM係自SAFC獲得。表9描述培養基組成加血清濃度。此培養基用以繁殖病毒，包括所有滾瓶再進料。
收穫三次之並行製程： 並行製程將具有血清、AK-MA104細胞及歐洲型PRRS 94881病毒種子之培養基添加於容器中。接著混合容器之內含物且分配至滾瓶中(TOI等於PP 0天)。圖7說明並行製程方法且圖8說明製程定義及時刻表。
滾瓶及培養基製備：
此處呈現之實驗為一批5個滾瓶。實際分批規模可變化。
在無菌條件下，2000 mL MEM培養基及100 mL經照射胎牛血清添加至容器中。接著添加5×107個AK-MA104細胞及0.1 MOI之歐洲型PRRS病毒種子。混合此等物質，且在無菌條件下，每850 cm2 Corning滾瓶分配約400 mL。接著滾瓶在0.5 rpm之速度的滾筒架中在37℃下培育。在兩次培養基再進料下進行至多三次收穫。
收穫準則及可接受之效能：
用於收穫滾瓶之準則係基於來自實例1及2之驗證300 L生物反應器製程的關鍵參數之設定點/目標，如下表10中所示。
收穫-I在PI第5-7天及右旋糖含量0.1g/L時進行。收穫II在再進料後PI第2天進行且收穫III在第二次再進料後PI第2天進行。
所有三次滾瓶收穫之效能應105.5 TCID50/mL。
滾瓶操作
表11顯示經設計以基於來自實例1及2中描述之製程的以下參數定義並行滾瓶製程之初始實驗，且工作種子病毒報導展示於表12a。
MA-104細胞以3.5×106至1×107(參見表11第2欄)之範圍內的細胞種植密度種植於15個滾瓶中。滾瓶按字母順序標記。三個滾瓶為一組之滾瓶組具有相同細胞種植密度及在0.005至0.1範圍內之相同MOI(表11第3欄)。
評估三個細胞種植密度及兩個MOI(表12)。三個滾瓶為一組之滾瓶組具有相同細胞種植密度及相同MOI(表4第1欄)。滾瓶根據上述滾瓶及培養基製備建立，且在0.5 RPM速度之滾筒架中在培育箱中於37℃行走下培育。
滾瓶A、D、G、J及M收穫I在PI第5天進行，接著再進料且培育2天。接著進行H-II，滾瓶再進料且培育，並在2天後進行第三次及最終收穫。
滾瓶B、E、H、K及N H-I在PI第6天進行，接著再進料且培育2天。接著進行H-II；滾瓶再進料一次且再培育。2天後進行第三次及最終收穫。
最終，滾瓶C、F、I、L及O H-I在PI第7天進行，接著再進料且培育2天。接著進行H-II，滾瓶再進料且再培育，並在2天後進行第三次及最終收穫。
滾瓶習知製程(滾瓶P、Q、R及S)用作此實驗之對照。發展收穫兩次之此製程。在此等實驗中將第三次收穫物添加 至製程中以及收穫-I範圍為至PI第5天。
MA104細胞以2×107種植於850 cm2滾瓶且培育3天(滾瓶P、Q、R及S)。3天後，滾瓶S以胰蛋白酶處理且藉由Vi-cell計數細胞。細胞數用於滾瓶P、Q及R之病毒MOI計算。計算量之病毒添加至滾瓶中，滾瓶在滾筒架中於37℃下培育。3天後，對滾瓶P進行收穫-I，接著再進料且在37℃下培育。3天後，獲得第二次收穫，且第二次再進料，且再培育3天以進行第三次及最終收穫。
在H-I後滾瓶Q及R遵循相同程序，滾瓶Q在PI第4天且滾瓶R在PI第4天。
習知滾瓶製程比實例1及2中描述之並行製程長，且需要更多工作，因為細胞在感染病毒之前需要生長3天。此外，與並行製程相比，其需要雙倍細胞種植密度，但MOI較低。此製程產生三次收穫高度一致之力價。
決定並行製程之H-I收穫時間(TOH)僅僅基於目標日，無論右旋糖消耗情況如何。獲取樣品以在收穫日量測右旋糖及獲得力價。
基於效能可接受之力價的準則(表10)，滾瓶A、B、C、D、E及F顯示收穫I、II及III之力價不一致。
細胞種植密度為7×106且目標MOI為0.1之滾瓶G、H及I在第一次收穫時右旋糖含量在0.1 g/L之目標內。滾瓶G及H之力價結果可接受。對於收穫-II，所有滾瓶G、H及I均具有高6及低7 log之力價。對於收穫-III，分別具有6.6及6.5之力價的滾瓶G及H可接受。對於大部分收穫，組G、H 及I可接受。
下一組實驗J、K及L為在力價方面最有希望者。對於所有滾瓶，右旋糖在H-I消耗，且力價在基於表10之可接受之準則內。在第二次及第三次收穫時，除了兩個滾瓶外，力價亦符合表3上之準則。滾瓶J、K及L之H-III再延長幾天，顯示力價仍可接受(表11)。
最後滾瓶M、N及O具有高細胞種植密度及低MOI，滾瓶N及O之力價結果顯示一致。
基於表10，展示於表11上之滾瓶J、K及L TCID50/mL結果符合收穫I、II及III之所有準則。滾瓶J、K及L中細胞種植密度/毫升之比率等同於300 L生物反應器細胞種植密度/毫升(表6)。基於此等資料，選擇滾瓶J、K及L之參數用於確認試驗(表13)。
表13顯示表10上評估之所選並行製程的確認操作。
總共15隻滾瓶各建立在400 mL具有血清及歐洲型PRRS 94881 MSV+4種子之培養基中1×107之細胞種植密度下且MOI為0.1。分開滾瓶且5個一組，分為3組。對於J1至J5滾瓶，在PI第5天進行收穫-I，對於K1至K5，在PI第6天進行收穫-I，且對於L1至L5滾瓶，在PI第7天進行收穫-I。量測每個滾瓶之右旋糖。接著彙集收穫物且獲取樣品以獲得力價。隨後再進料且進行收穫II及最終收穫III。
在收穫-I時，平均所有15隻滾瓶之右旋糖在生物反應器製程所設定之0.1 g/L的收穫準則(表3)以內，此證實該製程在滾瓶中一致。
表14顯示對於本發明之並行滾瓶製程，滾瓶J、K及L池在H-I、H-II及H-III時之條件及病毒力價(TCID50/mL)的概述。
為模擬滾瓶製程，彙集組J之各別滾瓶之樣品(表13)且彙集之樣品用於獲得力價。相同程序應用於滾瓶K及L之H-I、H-II及H-III。
對於J、K及L，H-1彙集樣品之右旋糖為0.0 g/L。H-I、H-II及H-III之力價在6.5至7.7之範圍內，其與300 L生物反應器製程(表15)相當。
表15顯示在cGMP條件下進行之三個驗證操作之參數及力價(TCID50/mL)。所有三個批次均具有相同種植細胞密度、相同MOI。所有三個批次之收穫I時的右旋糖均為0.0 g/L。所有收穫均具有接受準則以內之結果。
滾瓶之種植細胞密度(PCD)之範圍：
目標種植細胞密度(PCD)為每個滾瓶在400 mL工作體積下1.0×107個總細胞。對於低範圍，評估7×106(表4)，亦具有可接受之力價。在習知製程上評估高範圍(表11)。
滾瓶之感染倍率(MOI)之範圍：
對於歐洲型PRRS 94881在此生長系統內之繁育，0.1之 目標MOI為理想的。在30 L生物反應器中檢查分別0.01及0.3之低及高MOI水準。在滾瓶中，由於時間限制，僅僅評估目標0.1 MOI及0.005 MOI(表10)。
分析
推薦之滾瓶並行製程參數概述於表16中。僅測試目標參數且考慮其對製程而言為關鍵還是非關鍵。定義如下：關鍵參數為對最終產物之品質屬性為關鍵之彼等參數，且非關鍵參數為可直接控制在規定範圍內或具有寬操作範圍，因此與設定點之偏差非關鍵的彼等參數。非關鍵參數有助於控制關鍵參數在規定範圍內。
結論
成功達成並行滾瓶製程發展，且根據以TCID50/mL量測之效能，其等同於上述生物反應器製程。在並行滾瓶製程中成功再現H-I、H-II及H-III之關鍵參數的目標。
用於病毒繁育收穫-I之歐洲型PRRS 94881 MLV之滾瓶並行製程的較佳實施例如下：具有1.4 g/L碳酸氫鈉之培養基組合物MEM；細胞以在400 mL補充有20 mL 5% v/v胎牛血清之培養基下每850 cm2 Corning滾瓶1×107個種植(範圍：每個滾瓶7×106-2×107)；溫度控制在36±1℃；滾瓶架速度為0.5 RPM；且目標MOI為0.1。
對於收穫-I準則，在PI第5天開始離線右旋糖量測之取樣。收穫-I應在右旋糖0.1 g/L時進行，其通常在PI第5-7天之間出現。然而，若進行第二次收穫，則針對收穫II，第一次再進料。
II.第一次再進料-收穫-II
再進料400 mL補充有20 mL胎牛血清(5% v/v)的培養基組合物MEM及1.4 g/L碳酸氫鈉。在與第一次收穫培養基建立相同之條件下進行再進料(參見以上第一次收穫參數)。溫度控制保持在36±1℃之設定點。滾瓶架速度為0.5 RPM。病毒流體之第二次收穫在再進料後第2天進行。
III.第二次再進料-收穫-III
再進料400 mL補充有20 mL經照射胎牛血清(5% v/v)之培養基組合物MEM、新黴素及1.4 g/L碳酸氫鈉。在與第一次收穫培養基建立相同之條件下進行再進料(參見以上第二次收穫參數)。溫度控制保持在36±1℃之設定點。滾瓶 架速度為0.5 RPM。病毒流體之第三次收穫在再進料後第2天進行。
圖1：大規模製備PRRSV 94881之並行製程。
圖2：300 L生物反應器之並行製程之定義及時刻表。
圖3：300 L生物反應器中三個並行操作之病毒力價及右旋糖型態。
圖4：300 L生物反應器中三個並行操作之病毒力價及麩醯胺酸型態。
圖5：300 L生物反應器中三個並行操作之病毒力價及DO型態。
圖6：展示描繪以PRRSV 94881接種之動物中病毒血症%之RT-PCT時間PCR結果。
圖7：滾瓶製備PRRSV 94881之並行製程。
圖8：滾瓶製程之並行製程之定義及時刻表。

Claims (16)

  1. 一種商業化規模製備豬生殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)之方法，其包含：a)在生物反應器中同時用允許PRRSV感染之哺乳動物細胞株接種大規模培養基及用PRRSV感染該等哺乳動物細胞；b)感染後使病毒繁殖5至7天；c)藉由自該生物反應器移除該培養基且自其分離繁殖之病毒進行第一次收穫步驟；d)補充該生物反應器中之該培養基，且使病毒繁殖1至4天；e)藉由自該生物反應器移除該培養基且自其分離繁殖之病毒進行第二次收穫步驟；f)補充該生物反應器中之該培養基，且使病毒繁殖1至4天；及g)藉由自該生物反應器移除該培養基且自其分離繁殖之病毒進行第三次收穫步驟。
  2. 如請求項1之方法，其進一步包含在該第三次收穫步驟之後的至少一次再進料及收穫步驟，其包含補充該生物反應器中之該培養基且使病毒繁殖1至4天，且藉由自該生物反應器移除該培養基且自其分離繁殖之病毒進行第四次收穫步驟。
  3. 如請求項1之方法，其中目標感染倍率(MOI)為0.01至0.30。
  4. 如請求項1之方法，其中該等哺乳動物細胞以每300L生物反應器約7×108個至1.0×109個之密度種植。
  5. 如請求項4之方法，其中該細胞種植密度為每300L生物反應器約1.0×109個。
  6. 如請求項5之方法，其中該感染係使用每300L生物反應器約7×108個病毒粒子。
  7. 如請求項1之方法，其包含監測該培養基之右旋糖濃度，其中該第一次收穫步驟在該培養基之該右旋糖濃度降至小於0.1g/L之第一天進行。
  8. 如請求項1之方法，其中該第二次收穫在用培養基再進料後1或2天進行。
  9. 如請求項1之方法，其中該第三次收穫在用培養基第二次再進料後1至4天進行。
  10. 如請求項1之方法，其中該培養基在添加該哺乳動物細胞株及該PRRS的前一天或同一天添加至該生物反應器中。
  11. 如請求項1之方法，其中該培養基在添加該哺乳動物細胞株及該PRRS的前一天添加至該生物反應器中。
  12. 如請求項1之方法，其中該生物反應器之溫度設定在34℃與38℃之間。
  13. 如請求項1之方法，其中該培養基包含5%v/v經照射胎牛血清。
  14. 如請求項1之方法，其中該PRRSV係選自由以下組成之群：PRRSV株94881、萊利斯塔病毒株(Lelystad virus strain)(萊利斯塔劑(CDI-NL-2.91))，或其他株，其係選自寄存編號ECACC 04102703、ECACC 04102702、ECACC 04102704、CNCM寄存編號I-1140、CNCM寄存編號I-1387、CNCM寄存編號I-1388、ATCC VR 2332、VR 2385、VR 2386、VR 2429、VR 2474及VR 2402、CNCM I-1102、ECACC V93070108、ATCC寄存編號VR-2368及ATCC VR-2495。
  15. 一種用於製備PRRSV之商業化規模製備方法，其包含：a.將允許該PRRSV感染之哺乳動物細胞與該PRRSV兩者同時接種至含有適於該等細胞生長之培養基的生物反應器中；及b.進行三次收穫PRRSV之連續收穫步驟，其中各在第一次及第二次收穫後，補充該培養基，且其中：i.該第一次收穫在該培養基之右旋糖濃度降至小於0.1g/L之第一天進行；ii.該第二次收穫在該第一次收穫後添加該培養基之後1或2天進行；及iii.該第三次收穫在該第二次收穫後添加該培養基之後1與4天之間進行。
  16. 一種商業化規模製備豬生殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)之方法，其包含：a)在滾瓶中同時用允許PRRSV感染之哺乳動物細胞株接種大規模培養基及用PRRSV感染該等哺乳動物細胞；b)感染後使病毒繁殖5至7天；c)藉由自該滾瓶移除該培養基且自其分離繁殖之病毒進行第一次收穫步驟；d)補充該滾瓶中之該培養基，且使病毒繁殖約2天；e)藉由自該滾瓶移除該培養基且自其分離繁殖之病毒進行第二次收穫步驟；f)補充該滾瓶中之該培養基，且使病毒繁殖約2天；及g)藉由自該生物反應器移除該培養基且自其分離繁殖之病毒進行第三次收穫步驟。
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