KR102320269B1 - 돼지생식기호흡기증후군 바이러스의 감염력 향상 또는 억제를 위한 돼지 대식세포 분화 및 극성화 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 돼지 말초혈액 단핵세포에서 M1 대식세포 또는 M2 대식세포로의 분화 유도 방법과 상기 방법에 의해 분화된 M1 대식세포를 이용한 PRRSV 증식 증진용 물질의 스크리닝 방법 및 M2 대식세포를 이용한 PRRSV 증식 억제용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 종래에는 PRRSV 분리와 배양을 위해 돼지를 죽여 폐에서 직접 폐포대식세포를 수거해야 했다는 점에서 불편함이 있었다. 그러나, 본 발명의 방법을 이용하면 돼지 혈액으로부터 수득한 돼지 말초혈액 단핵세포에서 M1 대식세포 및 M2 대식세포를 분화시키고 이를 PRRSV에 대한 배양, 증식 및 분리에 이용할 수 있다는 점에서 매우 유용하다.

Description

돼지생식기호흡기증후군 바이러스의 감염력 향상 또는 억제를 위한 돼지 대식세포 분화 및 극성화 방법 {The method of in vitro differentiation and polarization of macrophages for improving or inhibiting infectivity against PRRSV}
본 발명은 돼지생식기호흡기증후군 바이러스의 감염력 향상 또는 억제를 위한 돼지 말초혈액 단핵세포에서 M1 대식세포 또는 M2 대식세포로의 분화 및 극성화 유도 방법과, 이를 이용한 돼지생식기호흡기증후군 바이러스의 감염력 향상 또는 억제 방법에 관한 것이다.
돼지생식기호흡기증후군(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)은 단일질병으로 양돈산업에 미치는 경제적 손실이 가장 큰 질병으로 PRRS에 의한 직접적인 경제손실은 매년 미국 5억 6천달러, 캐나다 1억 캐나다달러, 우리나라의 경우도 약 1천억원에 추정된다는 보고가 있으며, 돼지호흡기복합병(porcine respiratory disease complex, PRDC)과 같은 돼지소모성질환과의 연관성을 고려한다면 PRRS가 양돈산업에 미치는 피해는 더욱 클 것으로 보고 있다. PRRS는 북미지역과 유럽지역에서 거의 동시에 발생하였으며, 이들 지역에서의 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV)는 독립적으로 진화되어 두 지역의 바이러스들의 유전자는 약 60%정도만 일치한다. 최근 우리나라를 포함하여 전 세계적으로 두 종류의 바이러스가 지역에 관계없이 동시에 출현하고 있는 경향을 보이며, 이러한 패턴은 PRRSV의 진단과 예방 등 방역관리에 심각한 영향을 미치고 있다.
PRRSV에 감염되는 동물은 돼지 이외에는 거의 없으며, 돼지에 감염되면 돼지폐포대식세포(porcine alveolar macrophage, PAM)에서 증식하는 것으로 알려져 있다. 대식세포에서 처음 증식한 바이러스는 임파기관이나 폐 등으로 빠르게 이동한다. PRRSV 감염의 가장 큰 특징 중 하나는 돼지에서 만성의 지속감염을 일으키고, 임상증상이 없는 보균돼지의 감수성 세포에서 수개월 동안 증식하면서 다른 돼지에게 바이러스를 전파시킨다는 것이다. 돈군 내에서 지속적인 순환감염을 유발할 수 있고, 유산, 사산 및 허약자돈을 발생시키기도 한다.
대식세포는 특이 인자들에 의해서 표현형이 극성화(polarization)되며, 극성화된 대식세포는 M1 대식세포(classically activated macrophage), M2 대식세포(alternatively activated macrophage)가 된다.
PRRS의 경우 생독 및 사독백신이 개발되어 사용되고 있음에도 불구하고 지속적인 바이러스의 변이로 인해 질병방제에 어려움을 겪고 있고, PRRSV 자체가 숙주의 면역체계를 회피하는 특징을 나타내기 때문에 PRRS 청정화(안정화)를 위한 PRRSV 자체 특성화 연구 및 새로운 백신 후보주의 탐색이 필요한 실정이다.
대한민국 공개특허공보 제10-2014-0006038호
본 발명자들은 돼지 체외에서 PRRSV를 증식 및 분석할 수 있는 방법을 개발하고자 연구 노력하였다. 그 결과, 돼지 혈액으로부터 분리한 말초혈액 단핵세포를 극성화시켜 M1 대식세포 또는 M2 대식세포로 분화시키는 방법을 개발하였고, 상기 분화된 대식세포를 이용하면 PRRSV의 감염력을 향상 또는 억제시킬 수 있을 뿐 아니라 나아가 PRRSV의 증식을 증진 또는 억제시키는 물질을 스크리닝할 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 돼지 말초혈액 단핵세포에서 M1 대식세포로의 분화 유도 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 돼지 말초혈액 단핵세포에서 M2 대식세포로의 분화 유도 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 PRRSV 증식 증진용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 PRRSV 증식 억제용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 PRRSV의 감염력 향상 방법 또는 감염력 억제 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 돼지 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)에서 M1 대식세포(classically activated macrophages)로의 분화 유도 방법에 관한 것이다:
(a) 분리된 돼지 말초혈액 단핵세포로부터 CD14+의 표현형을 갖는 단핵구를 분리하는 단계;
(b) 상기 CD14+의 표현형을 갖는 단핵구를 GM-CSF(granulocyte macrophage colony stimulating factor)를 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및
(c) 상기 배양한 단핵구를 IFN-γ(interferon-gamma) 및 LPS(lipopolysaccharides)를 포함하는 배지에서 배양하여 극성화(polarization)하는 단계.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 돼지 말초혈액 단핵세포에서 M2 대식세포로의 분화 유도 방법에 관한 것이다:
(a) 분리된 돼지 말초혈액 단핵세포로부터 CD14+의 표현형을 갖는 단핵구를 분리하는 단계;
(b) M-CSF(macrophage colony stimulating factor)를 포함하는 배지에서 상기 CD14+의 표현형을 갖는 단핵구를 배양하는 단계; 및
(c) 상기 배양한 단핵구를 IL-4(interleukin-4)를 포함하는 배지에서 배양하여 극성화(polarization)하는 단계.
PRRS는 1980년대 말 북미에서 최초로 발생 보고된 이후 현재 국내 뿐만 아니라 전 세계 양돈 산업 국가에 만연되어 있는 돼지 전염성 질병이다. 돼지생식기호흡기증후군의 원인체인 PRRS는 항원적 그리고 유전학적 특성들에 따라 유럽형 type 1(European genotype)과 북미형 type 2(North American genotype)로 구분되며 이들은 각각 유전자 수준에서 약 60% 정도의 상동성만을 유지하고 있으며, 주로 숙주 내 PAM에 감염을 유발하며 정상적인 면역 기능을 변화시켜 감염에 대한 숙주 방어 반응을 저하시킨다.
현재까지 PRRSV 분리와 배양을 위해서는 돼지 폐에서 직접 PAM (pulmonary alveolar macrophage)을 수거하여 이용하는 초대세포배양(primary cell culture) 방법이 주로 이용되고 있어 PRRSV에 대한 연구를 위해서는 돼지를 죽여 폐에서 PAM을 분리하여 이용해야 한다는 불편함이 있다. 또한, PAM에서는 PRRSV 감염율과 직접적인 관련이 있는 마커인 CD163의 발현율이 돼지 개체별로 다르게 나타나며, CD163 발현율이 높을수록 PRRSV 감염율도 증가한다. 따라서, PRRSV의 분리와 증식 실험을 위해 PAM을 사용할 경우, PAM의 CD163 발현율이 실험결과에 영향을 끼칠 수 있다.
본 발명의 방법을 통해 돼지 말초혈액 단핵세포로부터 분화시킨 M1 대식세포 및 M2 대식세포는 PRRSV에 대한 배양, 증식 및 분리가 가능하다. 따라서, 본 발명의 방법을 이용하면 돼지를 죽이지 않고 채혈을 통해 PRRSV 연구 및 분석에 사용할 수 있는 M1 대식세포 및 M2 대식세포를 수득할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 분화된 M1 대식세포 및 M2 대식세포는 돼지 개체에 따라 특성 차이를 나타내는 PAM과 달리 동일한 세포 특성을 나타내기 때문에 PRRSV 관련 실험에 있어서 일관된 결과를 얻을 수 있다는 장점이 있다.
본 발명은 돼지 말초혈액 단핵세포로부터 M1 대식세포 또는 M2 대식세포로 분화를 유도하는 방법을 제공한다.
대식세포는 인체내 염증반응의 초기과정에 매우 중요한 역할을 가지는데, 그 분화되는 방법에 따라 특이적으로 M1 대식세포(Classically activated macrophages)와 M2 대식세포(Alternatively activated macrophages)의 두 가지 형태로 성숙하게 된다.
M1 대식세포는 전형적인 기능을 가지는 종류의 대식세포라 할 수 있다. 기존에 일반적으로 알려진 대식세포들이 보이는 기능적 특징을 보이는데, 즉, 외부 유기체나 박테리아, 바이러스 등을 인식하여 제거하고, 또한 암세포를 효율적으로 죽이고 방어하는 기능을 가진 전형적인 형태의 대식세포이다.
M2 대식세포는 광범위의 생리학적 병리학적 효과를 가지는 대체활성화된 대식세포이다. M2 대식세포는 M1 대식세포와는 다른 기능을 가지는데, 세포항상성(cell homeostasis) 및 염증반응(inflammation)에 중요하고, 조직손상 복구(tissue repair)나 대사작용(metabolic processes)에 특이적인 효과를 가진다.
본 발명에서 M1 대식세포 또는 M2 대식세포로의 분화 유도에 사용되는 돼지 말초혈액 단핵세포는 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 돼지 혈액으로부터 분리할 수 있다.
상기 분리된 돼지 말초혈액 단핵세포로부터 M1 대식세포 또는 M2 대식세포를 분화시키기 위해 먼저 CD14에 대한 항체를 이용하여 분리된 돼지 말초혈액 단핵세포에서 CD14+의 표현형을 갖는 단핵구를 분리한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 돼지 말초혈액 단핵세포에서 M1 대식세포로 분화시키기 위해 돼지 말초혈액 단핵세포로부터 분리한 CD14+의 표현형을 갖는 단핵구를 GM-CSF를 포함하는 배지에서 배양한 다음, IFN-γ 및 LPS를 포함하는 배지에서 배양하여 극성화시킴으로써 M1 대식세포로 분화시킬 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 돼지 말초혈액 단핵세포에서 M1 대식세포로의 분화에 사용되는 GM-CSF는 돼지 유래 재조합 GM-CSF(recombinant porcine granulocyte macrophage colony stimulating factor, rpGM-CSF) 일 수 있고, IFN-γ는 돼지 유래 재조합 IFN-γ(recombinant porcine interferon-gamma, rpIFN-γ) 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, M1 대식세포로의 분화에 사용되는 GM-CSF의 농도는 10 내지 200 ng/ml, 10 내지 180 ng/ml, 10 내지 160 ng/ml, 10 내지 140 ng/ml, 10 내지 120 ng/ml, 10 내지 110 ng/ml, 30 내지 200 ng/ml, 30 내지 180 ng/ml, 30 내지 160 ng/ml, 30 내지 140 ng/ml, 30 내지 120 ng/ml, 30 내지 110 ng/ml, 50 내지 200 ng/ml, 50 내지 180 ng/ml, 50 내지 160 ng/ml, 50 내지 140 ng/ml, 50 내지 120 ng/ml, 50 내지 110 ng/ml, 70 내지 200 ng/ml, 70 내지 180 ng/ml, 70 내지 160 ng/ml, 70 내지 140 ng/ml, 70 내지 120 ng/ml, 70 내지 110 ng/ml, 90 내지 200 ng/ml, 90 내지 180 ng/ml, 90 내지 160 ng/ml, 90 내지 140 ng/ml, 90 내지 120 ng/ml 또는 90 내지 110 ng/ml일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, M1 대식세포로의 분화에 사용되는 IFN- γ의 농도는 10 내지 100 ng/ml, 10 내지 80 ng/ml, 10 내지 60 ng/ml, 20 내지 100 ng/ml, 20 내지 80 ng/ml, 20 내지 60 ng/ml, 30 내지 100 ng/ml, 30 내지 80 ng/ml, 30 내지 60 ng/ml, 40 내지 100 ng/ml, 40 내지 80 ng/ml 또는 40 내지 60 ng/ml 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, M1 대식세포로의 분화에 사용되는 LPS의 농도는 10 내지 200 ng/ml, 10 내지 180 ng/ml, 10 내지 160 ng/ml, 10 내지 140 ng/ml, 10 내지 120 ng/ml, 10 내지 110 ng/ml, 30 내지 200 ng/ml, 30 내지 180 ng/ml, 30 내지 160 ng/ml, 30 내지 140 ng/ml, 30 내지 120 ng/ml, 30 내지 110 ng/ml, 50 내지 200 ng/ml, 50 내지 180 ng/ml, 50 내지 160 ng/ml, 50 내지 140 ng/ml, 50 내지 120 ng/ml, 50 내지 110 ng/ml, 70 내지 200 ng/ml, 70 내지 180 ng/ml, 70 내지 160 ng/ml, 70 내지 140 ng/ml, 70 내지 120 ng/ml, 70 내지 110 ng/ml, 90 내지 200 ng/ml, 90 내지 180 ng/ml, 90 내지 160 ng/ml, 90 내지 140 ng/ml, 90 내지 120 ng/ml 또는 90 내지 110 ng/ml 일 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 돼지 말초혈액 단핵세포에서 M1 대식세포로 분화시키기 위해 돼지 말초혈액 단핵세포로부터 분리한 CD14+의 표현형을 갖는 단핵구를 rpGM-CSF를 100 ng/ml 포함하는 배지에서 6일간 배양한 다음, rpIFN-γ 50 ng/ml 및 LPS 100 ng/ml 를 포함하는 배지에서 24시간 동안 배양하여 극성화시킴으로써 M1 대식세포로 분화시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 돼지 말초혈액 단핵세포에서 M2 대식세포로 분화시키기 위해 돼지 말초혈액 단핵세포로부터 분리한 CD14+의 표현형을 갖는 단핵구를 M-CSF를 포함하는 배지에서 배양한 다음, IL-4를 포함하는 배지에서 배양하여 극성화시킴으로써 M2 대식세포로 분화시킬 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 돼지 말초혈액 단핵세포에서 M2 대식세포로의 분화에 사용되는 M-CSF는 인간 유래 재조합 M-CSF(recombinant human macrophage colony stimulating factor, rhM-CSF) 일 수 있고, IL-4는 돼지 유래 재조합 IL-4(recombinant porcine interleukin-4, rpIL-4) 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, M2 대식세포로의 분화에 사용되는 M-CSF의 농도는 10 내지 200 ng/ml, 10 내지 180 ng/ml, 10 내지 160 ng/ml, 10 내지 140 ng/ml, 10 내지 120 ng/ml, 10 내지 110 ng/ml, 30 내지 200 ng/ml, 30 내지 180 ng/ml, 30 내지 160 ng/ml, 30 내지 140 ng/ml, 30 내지 120 ng/ml, 30 내지 110 ng/ml, 50 내지 200 ng/ml, 50 내지 180 ng/ml, 50 내지 160 ng/ml, 50 내지 140 ng/ml, 50 내지 120 ng/ml, 50 내지 110 ng/ml, 70 내지 200 ng/ml, 70 내지 180 ng/ml, 70 내지 160 ng/ml, 70 내지 140 ng/ml, 70 내지 120 ng/ml, 70 내지 110 ng/ml, 90 내지 200 ng/ml, 90 내지 180 ng/ml, 90 내지 160 ng/ml, 90 내지 140 ng/ml, 90 내지 120 ng/ml 또는 90 내지 110 ng/ml일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, M2 대식세포로의 분화에 사용되는 IL-4의 농도는 10 내지 100 ng/ml, 10 내지 80 ng/ml, 10 내지 60 ng/ml, 20 내지 100 ng/ml, 20 내지 80 ng/ml, 20 내지 60 ng/ml, 30 내지 100 ng/ml, 30 내지 80 ng/ml, 30 내지 60 ng/ml, 40 내지 100 ng/ml, 40 내지 80 ng/ml 또는 40 내지 60 ng/ml 일 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 돼지 말초혈액 단핵세포에서 M2 대식세포로 분화시키기 위해 돼지 말초혈액 단핵세포로부터 분리한 CD14+의 표현형을 갖는 단핵구를 rhM-CSF를 100 ng/ml 포함하는 배지에서 6일간 배양한 다음, rpIL-4를 50 ng/ml 포함하는 배지에서 24시간 동안 배양하여 극성화시킴으로써 M2 대식세포로 분화시킬 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 PRRSV 증식 증진용 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다:
(a) 상기 방법에 의해 분화된 돼지 말초혈액 단핵세포 유래 M1 대식세포에 분석하고자 하는 시험물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 시험물질을 처리한 M1 대식세포에 PRRSV를 감염시키는 단계; 및
(c) 상기 M1 대식세포에서 PRRSV의 감염 정도를 측정하는 단계로서, 상기 시험물질이 상기 PRRSV의 감염율을 증가시키는 경우에 상기 시험물질은 PRRSV 증식 증진용 물질로 판정된다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 PRRSV 증식 억제용 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다:
(a) 상기 방법에 의해 분화된 돼지 말초혈액 단핵세포 유래 M2 대식세포에 분석하고자 하는 시험물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 시험물질을 처리한 M2 대식세포에 PRRSV를 감염시키는 단계; 및
(c) 상기 M2 대식세포에서 PRRSV의 감염 정도를 측정하는 단계로서, 상기 시험물질이 상기 PRRSV의 감염율을 감소시키는 경우에 상기 시험물질은 PRRSV 증식 억제용 물질로 판정된다.
본 발명의 스크리닝 방법에 의해 분석되는 시험물질은 화학물질, siRNA(small interference RNA), shRNA(small hairpin RNA 또는 short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 항체, 앱타머 및 천연추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 스크리닝 방법에 의해 분석되는 시험물질이 화학물질인 경우, 단일 화합물 또는 화합물들의 혼합물(예컨대, 세포 또는 조직 배양물)일 수 있다. 시험 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 상업적으로 구입 가능하다.
시험물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, "1-비드 1-화합물" 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909 (1993); Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 11422 (1994); Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37: 2678 (1994); Cho et al., Science261: 1303 (1993); Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059 (1994); Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37: 1233 (1994) 등에 개시되어 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide)"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 명세서에서 언급되는 용어 "상보적(complementary)"은 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 타겟에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하는 것으로 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있으며, '실질적으로 상보적(substantially complementary)' 및 '완전히 상보적(perfectly complementary)'인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 보다 구체적으로는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 길이는 6 내지 100 염기이고, 보다 구체적으로는 8 내지 60 염기이고, 가장 구체적으로는 10 내지 40 염기이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "siRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(참조: WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다. siRNA는 식물, 벌레, 초파리 및 기생충에서 처음으로 발견되었으나, 최근에 siRNA를 개발/이용하여 포유류 세포 연구에 응용되었다(Degot S, et al. 2002; Degot S, et al. 2004; Ballut L, et al. 2005).
본 발명의 siRNA 분자는, 타겟 센스 가닥과 안티센스 가닥이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 또한, 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 구체적으로는 15 내지 80 염기, 더욱 구체적으로는 20 내지 70 염기, 그리고 가장 구체적으로는 20-30 염기이다.
siRNA 말단 구조는 타겟의 발현을 RNAi(RNA interference) 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다. 본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.
본 발명에서 언급되는 용어 "shRNA(small hairpin RNA 또는 short hairpin RNA)"는 견고한 헤어핀 턴을 만드는 RNA의 서열을 나타내며, 이는 RNA 간섭을 통해 유전자 발현을 사일런스 시키는 데 이용될 수 있다. shRNA는 세포 도입용 벡터를 이용하며 shRNA를 발현할 수 있는 U6 프로모터를 주로 이용한다. 이러한 벡터는 항상 딸세포로 전달되어 유전자 사일런싱이 유전될 수 있도록 한다. shRNA 헤어핀 구조는 세포 내 기작(machinery)인 siRNA로 분해되어 RNA-유도 사일런싱 복합체(RNA-induced silencing complex)에 결합된다. 상술한 복합체는 이에 결합된 siRNA에 상응하는(matched) mRNA에 결합하여 분해시킨다. shRNA는 RNA 폴리머라제 III에 의해 전사되며, 포유동물 세포에서 shRNA 생산은 세포가 shRNA를 바이러스 공격으로 인식하여 방어 수단을 찾는 것처럼 인터페론 반응을 야기시킬 수도 있다.
본 명세서의 사용되는 용어 "마이크로RNA(microRNA, miRNA)"는 21-25개의 뉴클레오타이드의 단일가닥 RNA 분자로서 mRNA(messengerRNA)의 3'-UTR에 결합하여 진핵생물의 유전자 발현을 제어하는 물질을 나타낸다(Bartel DP, et al., Cell, 23;116(2): 281-297(2004)). miRNA의 생성은 Drosha(RNaseIII type 효소)에 의해 스템-루프 구조의 전구체 miRNA(pre-miRNA)로 만들어지고, 세포질로 이동하여 다이서(Dicer)에 의해 절단되어 성숙한 miRNA로 만들어진다[Kim VN, et al., Nat Rev Mol Cell Biol., 6(5): 376-385(2005)]. 상술한 바와 같이 제조된 miRNA는 표적단백질의 발현을 조절함으로써 발생, 세포증식 및 사멸, 지방대사, 종양형성 등에 관여한다[Wienholds E, et al., Science, 309(5732): 310-311(2005); Nelson P, et al., Trends Biochem Sci., 28: 534-540(2003); Lee RC, et al., Cell, 75: 843-854(1993); 및 Esquela-Kerscher A, et al., Nat Rev Cancer, 6: 259-269(2006)].
본 명세서에서, 용어 "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미하며, 통상적으로 아미노산 잔기 4-40개를 포함한다.
본 발명의 시험물질로서의 펩타이드는 당업계에서 통상적으로 사용하는 고체상(solid-phase) 합성 방법에 의해 제조된다(Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc. , 85:2149-2154 (1963), Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I., Anal. Biochem., 34:595-598 (1970)). 즉, α-아미노 및 측쇄 작용기가 보호화된 아미노산을 레진에 결합시킨 후, α-아미노 보호기를 제거하고 남은 α-아미노 및 측쇄 작용기가 보호화된 아미노산을 원하는 순서로 단계적으로 커플링하여 중간체를 얻는다. 상기 본 발명의 PAUF 억제제 펩타이드를 제조하기 위한 아미노산 서열은 종래의 방법을 참조하였다(Chen L, Hahn H, Wu G, Chen CH, Liron T, Schechtman D, Cavallaro G, Banci L, Guo Y, Bolli R, Dorn GW, Mochly-Rosen D., Proc. Natl. Acad. Sci., 98, 11114-9 (2001); Phillipson A, Peterman EE, Taormina P Jr, Harvey M, Brue RJ, Atkinson N, Omiyi D, Chukwu U, Young LH., Am. J. Physiol. HeartCirc. Physiol.,289, 898-907 (2005); 및 Wang J, Bright R, Mochly-Rosen D, Giffard RG., Neuropharmacology.,47, 136-145 (2004)).
본 명세서에서, 용어 "천연 추출물"은 천연물의 다양한 기관 또는 부분 (예: 잎, 꽃, 뿌리, 줄기, 가지, 껍질 및 과실 등)으로부터 추출하여 얻은 것을 의미하며, 천연 추출물은 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 1,3-부틸렌글리콜, (h) 헥산 (i) 디에틸에테르를 추출 용매로 하여 얻을 수 있다.
본 발명에서 시험물질로서 항체가 이용될 수도 있다. 본 발명에서 시험물질로서 이용되는 항체는 이중특이성 항체(bispecific antibody)를 포함한다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.
항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European JournalofImmunology, 6:511-519 (1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597 (1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., UsingAntibodies: A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., MonoclonalAntibodies: A ManualofTechniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.
본 발명의 상기 방법에 의해 분화된 돼지 말초혈액 단핵세포 유래 M1 대식세포는 PRRSV 감염 시 대조군 대식세포와 비교하여 낮은 감염율을 나타낸다. 따라서, 상기 스크리닝 방법에서 상기 시험물질이 M1 대식세포에 대하여 PRRSV 감염율을 증가시킬 경우, 상기 시험물질은 PRRSV의 증식을 증진시키는 물질로 판정될 수 있다.
본 발명의 상기 방법에 의해 분화된 돼지 말초혈액 단핵세포 유래 M2 대식세포는 PRRSV 감염 시 대조군 대식세포와 비교하여 높은 감염율을 나타낸다. 따라서, 상기 스크리닝 방법에서 상기 시험물질이 M2 대식세포에 대하여 PRRSV 감염율을 감소시킬 경우, 상기 시험물질은 PRRSV의 증식을 억제시키는 물질로 판정될 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 방법에 의해 분화된 돼지 말초혈액 단핵세포 유래 M1 대식세포에 돼지생식기호흡기증후군 바이러스를 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스의 감염력 억제 방법에 관한 것이다.
상기 방법에 의해 분화된 돼지 말초혈액 단핵세포 유래 M1 대식세포는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 대하여 대조군에 비해 낮은 감염율을 나타내므로 상기 방법에 따라 돼지 질병 바이러스를 체외에서 증식시키는 경우, 백신개발, 면역원성 실험 등 다양한 질병 실험에서 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 방법에 의해 분화된 돼지 말초혈액 단핵세포 유래 M2 대식세포에 돼지생식기호흡기증후군 바이러스를 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스의 감염력 향상 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 방법에 의해 분화된 돼지 말초혈액 단핵세포 유래 M2 대식세포는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 대하여 대조군에 비해 높은 감염율을 나타내므로 상기 방법에 따라 돼지생식기호흡기증후군 바이러스를 체외에서 증식시키는 경우, 백신개발, 면역원성 실험 등 다양한 질병 관련 실험에서 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명은 돼지 말초혈액 단핵세포에서 M1 대식세포 또는 M2 대식세포로의 분화 유도 방법과 상기 방법에 의해 분화된 M1 대식세포를 이용한 PRRSV 증식 증진용 물질의 스크리닝 방법 및 M2 대식세포를 이용한 PRRSV 증식 억제용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 종래에는 PRRSV 분리와 배양을 위해 돼지를 죽여 폐에서 직접 폐포대식세포를 수거해야 했다는 점에서 불편함이 있었다. 그러나, 본 발명의 방법을 이용하면 돼지 혈액으로부터 수득한 돼지 말초혈액 단핵세포에서 M1 대식세포 및 M2 대식세포를 분화시키고 이를 PRRSV에 대한 배양, 증식 및 분리에 이용할 수 있다는 점에서 매우 유용하다.
도 1a는 광학현미경으로 단핵구를 촬영한 사진이다.
도 1b는 광학현미경으로 대식세포를 촬영한 사진이다.
도 1c는 광학현미경으로 M1 대식세포를 촬영한 사진이다.
도 1d는 광학현미경으로 M2 대식세포를 촬영한 사진이다.
도 2a는 M1 대식세포의 세포 표현 마커(SLA-DR) 발현을 FACS로 분석한 결과이다.
도 2b는 M2 대식세포의 세포 표현 마커(CD163) 발현을 FACS로 분석한 결과이다.
도 3a는 M1 대식세포의 발현 마커(IL-1β)에 대한 mRNA 발현 정도를 정량적 실시간 PCR로 분석한 결과이다.
도 3b는 M2 대식세포의 발현 마커(IL-10)에 대한 mRNA 발현 정도를 정량적 실시간 PCR로 분석한 결과이다.
도 4는 M1 대식세포 및 M2 대식세포에서 PRRSV에 대한 감염율을 확인한 결과이다.
도 5는 4마리의 돼지로부터 분리한 PAM의 CD163 발현율을 비교한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 거쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%"는 별도의 언급이 없는 한 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예 1. 돼지 대식세포의 M1 MDM ( Monocyte derived macrophages) type 분화 및 극성화 방법
Leucosep tube(Greiner Bio)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 돼지 혈액에서 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)를 분리하였다. PBMC를 CD14으로 positive sorting하고, MACS cell separation system(Miltenti Biotec)을 통하여 CD14-FITC 항체와 anti-FITC 항체로 염색한 PBMC를 positive sorting 하였다.
1%의 항생제-항진균제 용액과 10% 돼지 혈청이 첨가된 RPMI 1640 배지를 사용하여 3×105/well의 농도로 CD14+ 단핵구를 24웰에 시딩하였다. rpGM-CSF(recombinant porcine granulocyte macrophage colony stimulating factor, 100 ng/ml)를 첨가하여 6일간 배양하였다. 6일 배양 중 2일에 한번 씩 배지(rpGM-CSF 100 ng/ml 포함)를 교체하였다. 6일 동안 배양한 다음, 극성화를 위해 rpIFN-γ(recombinant porcine interferon-gamma, 50 ng/ml)과 LPS(lipopolysaccharides, 100 ng/ml)를 첨가하여 24시간 배양하였다.
실시예 2. 돼지 대식세포의 M2 MDM type 분화 및 극성화 방법
Leucosep tube(Greiner Bio)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 돼지 혈액에서 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)를 분리하였다. PBMC를 CD14으로 positive sorting하고, MACS cell separation system(Miltenti Biotec)을 통하여 CD14-FITC 항체와 anti-FITC 항체로 염색한 PBMC를 positive sorting 하였다.
1%의 항생제-항진균제 용액과 10% 돼지 혈청이 첨가된 RPMI 1640 배지를 사용하여 3×105/well의 농도로 CD14+ 단핵구를 24웰에 시딩하였다. rhM-CSF(recombinant human macrophage colony stimulating factor, 100 ng/ml)를 첨가하여 6일간 배양하였다. 6일 배양 중 2일에 한번 씩 배지(rhM-CSF 100 ng/ml 포함)를 교체하였다.
6일 동안 배양한 다음, 극성화를 위해 rpIL-4(recombinant porcine interleukin-4, 50 ng/ml)를 첨가하여 24시간 배양하였다.
실시예 3. M1 MDM , M2 MDM type 분화 및 극성화 확인
3-1. 표현형 분석
M1 MDM, M2 MDM의 분화는 표현형, 세포 표면 마커, mRNA 발현 정도로 확인 가능하다.
M1 MDM, M2 MDM으로 최종 분화되었는지 확인하기 위하여 광학현미경으로 표현형을 관찰하였다. 라운드 모양의 부유상태의 단핵구(도 1a), 배양접시 부착형의 대식세포(도 1b), 달걀 프라이 모양의 M1 MDM(도 1c), 길쭉한 바늘모양의 M2 MDM(도 1d)이 확인되었다.
3-2. 세포 표면 마커 분석
실시예 1 및 2에서 수득한 각각의 세포를 SLA-DR과 CD163 항체를 이용하여 4℃에서 30분 동안 염색하고 FACS로 분석하였다. 결과 분석은 각각의 항체에 양성반응을 보이는 세포의 양(%) 또는 평균형광강도(MFI)값으로 분석하였다.
M1 MDM의 세포 표현 마커인 SLA-DR은 M1 MDM에서 mock group 보다 2배, M2 MDM 보다 3배 높게 발현되었으며(도 2a), M2 MDM의 세포 표현 마커인 CD163의 경우 M2 MDM에서 mock group과 M1 MDM에 비해 1.5배 많이 발현되었다(도 2b).
3-3. mRNA 발현 정도 확인(Quantitative Real-time PCR )
실시예 1 및 2에서 수득한 각각의 세포에 대하여 총 RNA를 추출하였다. 각각의 세포에 대하여 M1 MDM 발현 마커인 IL-1β 및 IL-6와 M2 MDM 발현 마커인 IL-10 및 arginase 1를 이용하여 quantitative Real-time PCR을 실시하였다.
GAPDH 대조군과 비교한 결과, 전체 세포의 mRNA 발현양은 전체적으로 유사하였다.
mock group과 비교하여 M1 MDM의 발현 마커인 IL-1β는 M1 MDM에서 17배, IL-6은 M1 MDM에서 2배 높게 발현되었고(도 3a), M2 MDM 표현 마커인 IL-10은 M2 MDM에서 5배, arginase 1 은 3.2배 높게 발현되었다(도 3b).
실시예 4. M1 MDM , M2 MDM의 PRRSV를 이용한 바이러스 감염 시험
PRRSV type 2 형 3주 Korea lineage Kor B 타입 NA10(ATCC accession No KX757786), Korea lineage Kor 5 타입 NA8(ATCC accession No KX757784), PRRS2 북미형 표준주 VR2322(ATCC accession AY150564)를 1 MOI(multiplicity of infection)로 M1과 M2 세포에 각각 접종하고 60분 후, 상층액을 제거하였다. RPMI1640+1% 항생제-항진균제 용액을 이용하여 2회 세척하고 RPMI1640+1% 항생제-항진균제 용액+10% 열불화성화 돼지 혈청을 넣고 20시간 배양하였다. PRRSV를 접종한 세포를 PRRSV 항체 SDOW-17A(RTI, USA)로 염색하고, FACS로 리딩 하였다. 결과 분석은 각각의 항체에 양성반응을 보이는 세포의 양(%)으로 분석하였다.
PRRSV NA type의 Korean lineages kor B와 lineages 5의 PRRS 바이러스를 접종한 실험에서 모든 균주에서 M2 MDM은 M1 MDM 보다 2배, mock group 보다는 1.3배 높은 감염율을 보였다. M1 MDM은 M2 MDM 보다 2배, mock group 보다는 1.5배 낮은 감염율을 보였다.
실시예 5. 돼지폐포대식세포의 CD163 발현율
4마리의 돼지로부터 폐포대식세포(porcine alveolar macrophage, PAM)를 분리하고 이들의 CD163 발현율을 비교하였다.
PAM의 표면 마커인 CD163의 발현율을 FACS로 확인한 결과, 4마리의 돼지에서 추출한 각각의 PAM의 CD163 발현율이 적게는 4배에서 많게는 20배까지 차이가 나는 것으로 확인되었다(도 5, 표 1).
개체번호 색 구분 MFI 값
1 하늘색 4986
2 보라색 1105
3 연두색 523
4 빨강색 225
CD163 발현율은 PRRSV 감염율과 직접적인 관련이 있는 마커로 CD163 발현율이 높을수록 PRRSV 감염율도 증가한다. 따라서, PRRSV의 분리와 증폭 실험을 위해 PAM을 사용할 경우, PAM의 CD163 발현율이 실험결과에 영향을 끼칠 수 있다.

Claims (6)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 다음의 단계를 포함하는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV) 증식 증진용 물질의 스크리닝 방법:
    (a) 분화된 돼지 말초혈액 단핵세포 유래 M1 대식세포에 분석하고자 하는 시료를 처리하는 단계로, 상기 분화된 돼지 말초혈액 단핵세포 유래 M1 대식세포는 다음의 방법으로 분화되는 것인, 단계:
    (i) 분리된 돼지 말초혈액 단핵세포로부터 CD14+의 표현형을 갖는 단핵구를 분리하는 단계;
    (ii) 상기 CD14+의 표현형을 갖는 단핵구를 돼지 유래 GM-CSF(granulocyte macrophage colony stimulating factor)를 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및
    (iii) 상기 배양한 단핵구를 IFN-γ(interferon-gamma) 및 LPS(lipopolysaccharides)를 포함하는 배지에서 배양하여 극성화(polarization)하는 단계;
    (b) 상기 시료를 처리한 M1 대식세포에 돼지생식기호흡기증후군 바이러스를 감염시키는 단계; 및
    (c) 상기 M1 대식세포에서 돼지생식기호흡기증후군 바이러스의 감염 정도를 측정하는 단계로서, 상기 시료가 상기 돼지생식기호흡기증후군 바이러스의 감염율을 증가시키는 경우에 상기 시료는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 증식 증진용 물질로 판정된다.

  4. 삭제
  5. 다음의 방법에 의해 분화된 돼지 말초혈액 단핵세포 유래 M1 대식세포에 돼지생식기호흡기증후군 바이러스를 접종하여 배양하는 단계를 포함하는, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스의 감염력 억제 방법:
    (i) 분리된 돼지 말초혈액 단핵세포로부터 CD14+의 표현형을 갖는 단핵구를 분리하는 단계;
    (ii) 상기 CD14+의 표현형을 갖는 단핵구를 돼지 유래 GM-CSF(granulocyte macrophage colony stimulating factor)를 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및
    (iii) 상기 배양한 단핵구를 IFN-γ(interferon-gamma) 및 LPS(lipopolysaccharides)를 포함하는 배지에서 배양하여 극성화(polarization)하는 단계.

  6. 삭제
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