CN116240240A - MPLA和IFN-γ组合使用提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法 - Google Patents

MPLA和IFN-γ组合使用提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种MPLA和IFN‑γ组合使用提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，属于细胞工程领域。该方法包括如下步骤：S1、巨噬细胞激活和极化：将外周血单核细胞PBMC分化为巨噬细胞；向巨噬细胞中添加25‑100ng/ml IFN‑γ和25‑200ng/ml MPLA或MPLA类似物,激活极化巨噬细胞6‑48h；S2、腺病毒转染巨噬细胞：向激活极化后的巨噬细胞中按照100‑500 MOI加入腺病毒，转染24‑172h，转染目的基因。该方法中腺病毒使用量更少，同时可以大大提高转染效率，而且可以提高细胞的得率和状态，使得嵌合抗原受体巨噬细胞（CAR‑Mac）产品更加安全有效，产品质量更高，产量更高。

Description

MPLA和IFN-γ组合使用提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法
技术领域
本发明属于细胞工程领域，具体地说，涉及一种MPLA和IFN-γ组合使用提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法。
背景技术
嵌合抗原受体巨噬细胞（CAR-Mac）疗法已经成为细胞免疫治疗领域的一个重要的方向。该疗法是将从外周血来源的CD14阳性单核细胞诱导成巨噬细胞，并通过病毒的形式将外源基因导入巨噬细胞，生产CAR-Mac。
目前，通过病毒转染方式生产嵌合抗原受体巨噬细胞（CAR-Mac）主要有两种方式：慢病毒和腺病毒，这两种方式虽然都有一定的转染效率，但是由于巨噬细胞的特性，转染效率在20%以下。有部分研究人员通过改造腺病毒（Ad5F35腺病毒）感染巨噬细胞，虽然提高了腺病毒转染巨噬细胞的效率，在较高的MOI情况下，转染效率可以达到50%左右，但是该种方法需要使用大量腺病毒，使得嵌合抗原受体巨噬细胞（CAR-Mac）成本较高，同时CAR-Mac细胞的得率较低，状态差。虽然有其他研究人员也试图通过改造慢病毒，使用LV-Vpx慢病毒转染巨噬细胞，但是转染效率依然不高；并且，慢病毒转染有随机整合的风险，存在造成巨噬细胞基因突变的风险。
申请人申请了中国专利CN202211148544.3，发明名称为：一种提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，该专利公开了：LPS和IFN-γ联合使用可以提高Ad5F35腺病毒感染巨噬细胞的效率，使得在合理的MOI情况下，转染效率得到提高。但是申请人在后续研究发现一个技术问题：因Ad5F35腺病毒成本较高，如何能进一步降低Ad5F35腺病毒使用量，同时仍然保持较高转染效率，如果能解决该技术问题则将进一步推广腺病毒转染巨噬细胞在市场上的应用。
单磷酸脂质A（monophosphoryl lipid A，MPLA）一般用于在疫苗制剂中，作为免疫佐剂可以促使其诱导高质量且持久的免疫应答。目前，MPLA并没有应用于腺病毒转染巨噬细胞的相关报道。
本发明开发了一种将单磷酸脂A（MPLA）或其类似物应用于巨噬细胞激活极化及腺病毒感染巨噬细胞方法中，可以降低腺病毒使用量，提高转染效率。
发明内容
本发明目的是提供一种MPLA和IFN-γ组合使用可以提高Ad5F35腺病毒感染巨噬细胞的效率的方法，该方法中Ad5F35腺病毒使用量更少，同时可以大大提高转染效率，而且可以提高细胞的得率和状态，使得嵌合抗原受体巨噬细胞（CAR-Mac）产品更加安全有效，产品质量更高，产量更高。
第一方面，本发明公开了一种MPLA和IFN-γ组合使用提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，包括如下步骤：
S1、巨噬细胞激活和极化：将外周血单核细胞PBMC分化为巨噬细胞；向巨噬细胞中添加25-100ng/ml IFN-γ和25-200ng/ml MPLA或MPLA类似物,激活极化巨噬细胞6-48h；
S2、腺病毒转染巨噬细胞：向激活极化后的巨噬细胞中按照100-500 MOI加入腺病毒，转染24-172h，转染目的基因；转染目的基因后，可以换液，继续培养细胞一段时间。
步骤S3、转染后基因表达检测：将将步骤S2中获得的腺病毒转染后的巨噬细胞，消化处理，200-500g离心2-10min，收集细胞，用流式检测目的基因的表达CAR:嵌合抗原受体。
进一步的技术方案，所述步骤S1中，外周血单核细胞PBMC分化为巨噬细胞的具体方法为：将PBMC复苏后通过CD14磁珠进行阳性分选出单核细胞，放入培养皿，添加25-100ng/ml GM-CSF促进单核细胞分化为巨噬细胞，达到规定的细胞接种密度后，将其放入CO2培养箱，培养24-72h。
进一步的技术方案，所述细胞接种密度为0.5×106～4×106个/mL；所述CO2培养箱的温度为35～38℃,CO2浓度为3～7％。
进一步的技术方案，所述的IFN-γ的浓度为40-60ng/ml ，优选50ng/ml ；MPLA或MPLA类似物的浓度为50-150ng/ml，优选75ng/ml。
进一步的技术方案，所述步骤S1中，激活活化后的巨噬细胞为M1型巨噬细胞；
所述的MPLA类似物包括吡喃葡萄糖基脂C529（CAS No. 216014-46-9）、OM-174（CAS No.171092-39-0）、E6020（CAS No.287180-63-6）、ONO-4007（CAS No.152646-95-2）、GLA（CAS No.1246298-63-4）等。
进一步的技术方案，所述的腺病毒为Ad5F35腺病毒。
第二方面，本发明公开了一种激活和极化巨噬细胞的组合物，包括25-100ng/mlIFN-γ和25-200ng/ml MPLA或MPLA类似物。
进一步的技术方案，所述的 IFN-γ的浓度为40-60ng/ml ，优选50ng/ml ；MPLA或MPLA类似物的浓度为50-150ng/ml，优选75ng/ml。
进一步的技术方案，所述的MPLA类似物包括吡喃葡萄糖基脂C529（CAS No.216014-46-9）、OM-174（CAS No.171092-39-0）、E6020（CAS No.287180-63-6）、ONO-4007（CAS No.152646-95-2）、GLA（CAS No.1246298-63-4）等。
有益效果
与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：
（1）本发明的方法，通过MPLA和IFN-γ的组合使用，促进腺病毒转染巨噬细胞，在腺病毒使用量少的同时，仍然具有较高的转染效率，而且转染效率比LPS和IFN-γ组合提高了20-50%，大大提高了巨噬细胞基因导入的成功率，且CAR-Mac得率更高，细胞状态更好；而且同时添加MPLA和IFN-γ，也促进巨噬细胞向M1型极化，有利于其在后续肿瘤治疗等应用。
(2) 本发明的方法，通过大量筛选，最终确定MPLA浓度为25-200ng/ml、IFN-γ浓度为25-100ng/ml，该浓度范围值极大地激活和极化巨噬细胞，同时可以提高了病毒的转染效率。
(3) 本发明中MPLA和IFN-γ的组合使用可以充分激活巨噬细胞，使得巨噬细胞被超活化，巨噬细胞的体积大大增加，具有较强的吞噬能力，进而导致巨噬细胞更容易被腺病毒转染，大大提高转染效率和外源基因的导入效率，与现有技术相比，细胞状态更好，得率更高（如图5）。
（4）本发明的制备方法简单，只需一次转染，腺病毒使用量更少，提高转染效率的同时，极大地节约了成本，且制备的产品安全性高。
附图说明
图1为具体实施中不同实验组的腺病毒转染巨噬细胞(目的基因CAR检测)的转染效率对比图；
图2为具体实施例中不同浓度的MPLA对腺病毒(MOI=250)转染巨噬细胞的转染效率对比图；
图3为具体实施例中巨噬细胞流式图；
图4为具体实施例中巨噬细胞流式检测CD80和CD163 MFI值；
图5为具体实施例中巨噬细胞在不同培养条件下的细胞状态图；
图6为具体实施例中巨噬细胞在不同培养条件下的细胞得率图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，所用原料为市售商品。
实施例1
MPLA和IFN-γ组合使用提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，包括如下步骤：
S1、巨噬细胞培养：
细胞复苏：取一支PBMC细胞，迅速将其放入37℃的水浴中速溶，加入到10ml X-VIVO15培养基中混合均匀，于300g的条件下离心3min，去掉上清液，通过CD14磁珠进行阳性分选出单核细胞，加入10mL完全培养基重悬细胞，将重悬好的细胞接入细胞培养瓶中，放入CO2细胞培养箱中，于37℃条件下静置培养；
细胞分化培养：在细胞培养基中加入50ng/ml GM-CSF，达到规定的细胞接种密度后，将其放入CO2培养箱，进行分化培养72h。
S2、巨噬细胞激活和极化：
巨噬细胞激活和极化培养基配制：在培养基中加入75ng/mlMPLA和50ng/mlIFN-γ，激活和极化巨噬细胞24h。
S3、巨噬细胞腺病毒转染：将巨噬细胞激活和极化巨噬细胞24h后，换液培养基，加入Ad5F35腺病毒(MOI=200)，混匀共孵育，在37℃，5％浓度的CO2培养箱中培养。
S4、巨噬细胞收获：病毒转染24h后换液，并继续培养48h。用TrypLE Select细胞消化液消化细胞,300g离心5min收获细胞，目的细胞用DPBS重悬，用于检测。
S5、转染后基因表达检测：收获后检测目的基因表达，目的基因表达达到42%；巨噬细胞为M1型巨噬细胞表型。
实施例2
MPLA和IFN-γ组合使用提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，包括如下步骤：
S1、巨噬细胞培养：
细胞复苏：取一支PBMC细胞，迅速将其放入37℃的水浴中速溶，加入到10ml X-VIVO15培养基中混合均匀，于300g的条件下离心3min，去掉上清液，通过CD14磁珠进行阳性分选出单核细胞，加入10mL完全培养基重悬细胞，将重悬好的细胞接入细胞培养瓶中，放入CO2细胞培养箱中，于37℃条件下静置培养；
细胞分化培养：在细胞培养基中加入50ng/ml GM-CSF，达到规定的细胞接种密度后，将其放入CO2培养箱，进行分化培养72h。
S2、巨噬细胞激活和极化：
配制5组巨噬细胞激活和极化培养基：在5组培养基中分别加入50ng/ml IFN-γ和0 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、75ng/ml、150ng/ml MPLA，激活和极化巨噬细胞24h。
S3、巨噬细胞腺病毒转染：将巨噬细胞激活和极化巨噬细胞24h后，换液培养基，加入Ad5F35腺病毒(MOI=250)，混匀共孵育，在37℃，5％浓度的CO2培养箱中培养。
S4、巨噬细胞收获：病毒转染24h后换液，并继续培养48h。用TrypLE Select细胞消化液消化细胞,300g离心5min收获细胞，目的细胞用DPBS重悬，用于检测。
S5、转染后基因表达检测：收获后检测目的基因表达，目的基因表达结果如表2和图2；巨噬细胞为M1型巨噬细胞表型。
实施例3
MPLA和IFN-γ组合使用提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，包括如下步骤：
S1、巨噬细胞培养：
细胞复苏：取一支PBMC细胞，迅速将其放入37℃的水浴中速溶，加入到10ml X-VIVO15培养基中混合均匀，于300g的条件下离心3min，去掉上清液，通过CD14磁珠进行阳性分选出单核细胞，加入10mL完全培养基重悬细胞，将重悬好的细胞接入细胞培养瓶中，放入CO2细胞培养箱中，于37℃条件下静置培养；
细胞分化培养：在细胞培养基中加入100ng/ml GM-CSF，达到规定的细胞接种密度后，将其放入CO2培养箱，进行分化培养72h。
S2、巨噬细胞激活和极化：
巨噬细胞激活和极化培养基配制：在培养基中加入200ng/ml MPLA和100ng/mlIFN-γ，激活和极化巨噬细胞24h。
S3、巨噬细胞腺病毒转染：将巨噬细胞激活和极化巨噬细胞24h后，换液培养基，加入Ad5F35腺病毒(MOI=150)，混匀共孵育，在37℃，5％浓度的CO2培养箱中培养。
S4、巨噬细胞收获：病毒转染24h后换液，并继续培养48h。用TrypLE Select细胞消化液消化细胞,300g离心5min收获细胞，目的细胞用DPBS重悬，用于检测。
S5、转染后基因表达检测：收获后检测目的基因表达，目的基因表达达到31%；巨噬细胞为M1型巨噬细胞表型。
实施例4
MPLA和IFN-γ组合使用提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，包括如下步骤：
S1、巨噬细胞培养：
细胞复苏：取一支PBMC细胞，迅速将其放入37℃的水浴中速溶，加入到10ml X-VIVO15培养基中混合均匀，于300g的条件下离心3min，去掉上清液，通过CD14磁珠进行阳性分选出单核细胞，加入10mL完全培养基重悬细胞，将重悬好的细胞接入细胞培养瓶中，放入CO2细胞培养箱中，于37℃条件下静置培养；
细胞分化培养：在细胞培养基中加入25ng/ml GM-CSF，达到规定的细胞接种密度后，将其放入CO2培养箱，进行分化培养72h。
S2、巨噬细胞激活和极化：
巨噬细胞激活和极化培养基配制：在培养基中加入25ng/mlGLA和25ng/mlIFN-γ，激活和极化巨噬细胞24h。
S3、巨噬细胞腺病毒转染：将巨噬细胞激活和极化巨噬细胞24h后，换液培养基，加入Ad5F35腺病毒(MOI=500)，混匀共孵育，在37℃，5％浓度的CO2培养箱中培养。
S4、巨噬细胞收获：病毒转染24h后换液，并继续培养48h。用TrypLE Select细胞消化液消化细胞,300g离心5min收获细胞，目的细胞用DPBS重悬，用于检测。
S5、转染后基因表达检测：收获后检测目的基因表达，目的基因表达达到95%；巨噬细胞为M1型巨噬细胞表型。
下面针对上述实施例和对比例进一步研究，具体如下
1、目的基因CAR转染效率对比
转染效率和细胞活率检测方法：以实施例1的提高腺病毒转染巨噬细胞的方法，用MOI=200感染目的细胞，然后利用流式细胞仪检测腺病毒的转染效率，用细胞计数仪检测细胞活率。
其他实验组：
对比例1：与实施例1的区别在于，步骤S3细胞培养时，未添加腺病毒转染，其余步骤与实施例1相同。
对比例2：与实施例1的区别在于，步骤S2细胞培养时，未添加MPLA和IFN-γ，其余步骤与实施例1相同。
对比例3：与实施例1的区别在于，步骤S2细胞培养时，只添加75ng/mL MPLA，其余步骤与实施例1相同。
对比例4：与实施例1的区别在于，步骤S2细胞培养时，只添加50ng/mL IFN-γ，其余步骤与实施例1相同。
对比例5：与实施例1的区别在于，步骤S2细胞培养时，添加的是50ng/mL LPS和50ng/mL IFN-γ；其余步骤与实施例1相同。
转染效率和细胞活率的结果如下表1和图1所示：
表1：不同实验组的转染效率和细胞活率
实验组 CAR表达 细胞活率
对比例1 1% 91%
对比例2 10% 90%
对比例3 11% 92%
对比例4 9% 92%
对比例5 30% 90%
实施例1 42% 93%
实验结果：根据表1和图1，从对比例2-对比例4的数据可以看出，未添加IFN-γ和MPLA与IFN-γ单一使用、MPLA单一使用相比，转染效率相差不大。但是结合实施例1的数据，可以看出IFN-γ和MPLA 的组合使用是将转染效率提高到42%，说明IFN-γ和MPLA 组合使用可以促进腺病毒转染巨噬细胞的，同时使得细胞保持较高的细胞活率，与未添加腺病毒相比，相差不大。
同时，根据实施例1和对比例5的数据可知，本发明中IFN-γ和MPLA 的组合使用，相较于最优选浓度值的LPS和IFN-γ的组合使用相比，IFN-γ和MPLA 的组合使用是将转染效率从30%提高到42%，转染效率提高了40%，同时细胞活率也有一定程度的提高。
对对比例5和实施例1中的巨噬细胞通过流式细胞仪进行分析，结果如图3所示。
从图3可以看出，与LPS和IFN-γ组合使用相比，MPLA和IFN-γ的组合使用，不仅使得CAR阳性率得到了显著的提高，而且细胞状态更好。
2、细胞表型分析
实验样品：携带目的基因CAR的腺病毒Ad5F35
实验方法：用流式方法检测实施例1的细胞表型，检测巨噬细胞极化指标CD80、CD163；
其他实验组：
control组：转染方法与实施例1相同，与实施例1的区别在于，步骤S2细胞培养时，在培养基中未添加IFN-γ和LPS，步骤3中未添加腺病毒；
IFN-γ+LPS组：转染方法与实施例1相同，与实施例2的区别在于，步骤3中未添加腺病毒。
实验结果：检测结果见图4。
从图4可以看出， MPLA与IFN-γ的组合使用提高了巨噬细胞M1表型(CD80)，降低了M2表型（CD163）,说明MPLA与IFN-γ的组合使用可以促进巨噬细胞向M1型极化，增强抗肿瘤效果。
3、不同浓度的MPLA对腺病毒(MOI=250)转染巨噬细胞的转染效率
实验方法：以实施例2的提高腺病毒转染巨噬细胞的方法，用50ng/ml IFN-γ分别和0 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、75ng/ml、150ng/ml MPLA组合处理巨噬细胞，再用携带目的基因的腺病毒（MOI=250）转染巨噬细胞，检测CAR表达。实验结果如下表2和图2所示：
表2：不同浓度的MPLA对腺病毒(MOI=250)转染巨噬细胞的转染效率表
MPLA浓度 CAR表达
0 ng/mL 25%
25 ng/mL 67%
50 ng/mL 73%
75 ng/mL 84%
150 ng/mL 73%
实验结果：从表2和图2的数据可以看出，当MPLA浓度为75 ng/mL时，CAR表达率为84%，转染效率最高，即50ng/ml IFN-γ和75 ng/mL MPLA组合使用效果最好。
3、巨噬细胞在不同条件下培养的细胞状态和得率对比
实验方法如下：
S1、巨噬细胞培养：
细胞复苏：取一支PBMC细胞，迅速将其放入37℃的水浴中速溶，加入到10ml X-VIVO15培养基中混合均匀，于300g的条件下离心3min，去掉上清液，通过CD14磁珠进行阳性分选出单核细胞，加入10mL完全培养基重悬细胞，将重悬好的细胞接入细胞培养瓶中，放入CO2细胞培养箱中，于37℃条件下静置培养；
细胞分化培养：在细胞培养基中加入25ng/ml GM-CSF，达到规定的细胞接种密度后，将其放入CO2培养箱，进行分化培养72h。
S2、巨噬细胞激活和极化：
巨噬细胞激活和极化培养基配制：在培养基中加入75ng/mL MPLA 和50ng/mLIFN-γ，激活和极化巨噬细胞24h，用显微镜观察细胞状态，并计算细胞得率，该方法为MPLA+ IFN-γ组的处理。
其他实验组：
Ctrl组：实验具体步骤如MPLA+ IFN-γ组，不同点在于，不执行步骤S2巨噬细胞激活和极化；
MPLA组：实验具体步骤如MPLA+ IFN-γ组，不同点在于，步骤S2采用75ng/mLMPLA；
IFN-γ组：实验具体步骤如MPLA+ IFN-γ组，不同点在于，步骤S2采用 50ng/mLIFN-γ；
LPS+FN-γ组：实验具体步骤如MPLA+ IFN-γ组，不同点在于，步骤S2采用50ng/mLLPS和50ng/mL IFN-γ；
巨噬细胞在不同条件下培养的细胞状态的实验结果如图5所示，从图5可以看出，MPLA和IFN-γ的组合使用使得巨噬细胞明显极化，与LPS+FN-γ组，即最优选浓度值的LPS和IFN-γ的组合使用相比，MPLA+ IFN-γ组的细胞状态更好；而且MPLA+ IFN-γ组合使用，相较于IFN-γ单一使用、MPLA单一使用的细胞状态更好。
巨噬细胞在不同条件下培养的细胞得率的实验结果如图6所示，从图6可以看出，MPLA+ IFN-γ组的细胞得率与比IFN-γ组、MPLA组、LPS+FN-γ组的细胞得率相比，MPLA+IFN-γ组的细胞得率最高，且相较于LPS+FN-γ组的细胞得率相比，有较大幅度的提升。

Claims (10)

1.MPLA和IFN-γ组合使用提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、巨噬细胞激活和极化：将外周血单核细胞PBMC分化为巨噬细胞；向巨噬细胞中添加25-100ng/ml IFN-γ和25-200ng/ml MPLA或MPLA类似物,激活极化巨噬细胞6-48h；
S2、腺病毒转染巨噬细胞：向激活极化后的巨噬细胞中按照100-500 MOI加入腺病毒，转染24-172h，转染目的基因。
2.根据权利要求1所述的MPLA和IFN-γ组合使用提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，其特征在于：所述步骤S1中，外周血单核细胞PBMC分化为巨噬细胞的具体方法为：将PBMC复苏后通过CD14磁珠进行阳性分选出单核细胞，放入培养皿，添加25-100ng/ml GM-CSF促进单核细胞分化为巨噬细胞，达到规定的细胞接种密度后，将其放入CO2培养箱，培养24-72h。
3.根据权利要求2所述的MPLA和IFN-γ组合使用提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，其特征在于：所述细胞接种密度为0.5×106～4×106个/mL；所述CO2培养箱的温度为35～38℃,CO2浓度为3～7％。
4.根据权利要求1所述的MPLA和IFN-γ组合使用提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，其特征在于：所述的IFN-γ的浓度为40-60ng/ml ，优选50ng/ml ；MPLA或MPLA类似物的浓度为50-150ng/ml，优选75ng/ml。
5.根据权利要求1所述的MPLA和IFN-γ组合使用提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，其特征在于：还包括步骤S3、转染后基因表达检测：将将步骤S2中获得的腺病毒转染后的巨噬细胞，消化处理，200-500g离心2-10min，收集细胞，用流式检测目的基因的表达CAR:嵌合抗原受体。
6.根据权利要求1所述的MPLA和IFN-γ组合使用提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，其特征在于：所述步骤S1中，激活活化后的巨噬细胞为M1型巨噬细胞；
所述的MPLA类似物是吡喃葡萄糖基脂RC529、OM-174、E6020、ONO-4007、GLA、SLA中的一种。
7.根据权利要求1所述的MPLA和IFN-γ组合使用提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，其特征在于：所述的腺病毒为Ad5F35腺病毒。
8.一种激活和极化巨噬细胞的组合物，其特征在于：包括25-100ng/ml IFN-γ和25-200ng/ml MPLA或MPLA类似物。
9.根据权利要求8所述的激活和极化巨噬细胞的组合物，其特征在于：所述的 IFN-γ的浓度为40-60ng/ml ，优选50ng/ml ；MPLA或MPLA类似物的浓度为50-150ng/ml，优选75ng/ml。
10.根据权利要求8所述的激活和极化巨噬细胞的组合物，其特征在于：所述的MPLA类似物是吡喃葡萄糖基脂RC529、OM-174、E6020、ONO-4007、GLA、SLA中的一种。
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