CN112625987A - 一种同时生产2`-岩藻糖基乳糖和d-阿洛酮糖的方法 - Google Patents

一种同时生产2`-岩藻糖基乳糖和d-阿洛酮糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组菌株，所述重组菌株是将质粒pCOLADuet‑1‑CB、质粒pCDFDuet‑1‑GW、质粒pETDuet‑1‑BY共转化到大肠杆菌获得。本发明还公开了该菌株的应用以及同时生产2'‑岩藻糖基乳糖和D‑阿洛酮糖的方法。本发明以果糖为初始原料，经过酶催化、细胞工厂转化，同时生产出稀少单糖D‑阿洛酮糖和人乳寡糖2'‑岩藻糖基乳糖（2’‑FL），再通过下游分离分别得到D‑阿洛酮糖和2’‑FL结晶产品的方法，实现了两种高附加值产品的同时生产，具有很强的技术原创性及经济价值。该技术的应用将为食品添加剂生产技术的升级提供借鉴。

Description

一种同时生产2`-岩藻糖基乳糖和D-阿洛酮糖的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种同时生产2′-岩藻糖基乳糖和D-阿洛酮糖的方法。
背景技术
人乳寡糖(human milk oligosaccharides，简称HMO)是母乳中非常独特的一类寡糖物质，大多由3～6个糖基组成，迄今已发现了200多种。HMO是母乳中含量第3的固形物(仅次于乳糖和脂肪)，它在初乳中的含量为20～25g/L，在成熟母乳中的含量为10～15g/L。HMO的类型主要包括岩藻糖基化的中性HMO(占比35～50％)、唾液酸化的酸性HMO(占比12～14％)、以及非岩藻糖基化的中性HMO(占比42～55％)，所有的HMO中超过70％由岩藻糖进行修饰。具有代表性的HMO成分包括2’-岩藻糖基乳糖，2’-FL(CAS号：41263-94-9)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、6’-唾液酸乳糖(6’-SL)、乳糖-N-新四糖(LNnT)等。其中，2’-FL结构式如下：
Figure BDA0002847932400000011
是含量最高的一种人乳寡糖，可以占到母乳总物质量的 30％。牛奶、山羊奶、绵羊奶中几乎不含HMO，或含量仅为母乳的百分之一甚至千分之一、而且种类更少。研究表明，在肠道中2′-FL可被有益微生物利用，从而调节肠道微生物菌群；还可抑制弯曲杆菌与人肠粘膜的结合，从而减少腹泻；也可以通过调节人肠道上皮细胞CD14 的表达，从而减轻炎症。体外研究发现，2′-FL可使空肠弯曲杆菌对人体的侵袭能力降低80％，从而抑制肠道粘膜促炎因子和信号的释放，并减少婴儿由空肠弯曲杆菌引发腹泻的发作次数。所以在婴儿奶粉中加入食品级微生物生产的2′-FL可以增强新生婴儿的免疫力，可有效地增强新生婴儿体质。2′-FL还可以通过提高非致病菌共生体的竞争优势来间接抑制致病菌的生长，并能直接充当抗黏附抗菌剂减少微生物感染，使摄入2’-FL的婴儿不容易患由肺炎链球菌、绿脓杆菌引起的中耳炎。此外，2′-FL在大脑发育、神经元传递和突触的形成中也起作用，能够刺激大脑发育，所以在饮食中添加2′-FL可以促进大脑发育并且能够改善学习和记忆能力。由于2′-FL的突出生理功能，使得2′-FL成为食品添加剂市场上的急需产品。稀少糖(Rare sugar)是指自然界中存在但含量极少，需要通过人工合成技术才能大量获得的单糖或者寡糖。稀少糖一般具有低热量、改善肠道菌群比例、不导致龋齿等优点，常被用作益生元或代糖类产品。较知名的稀少糖包括D-阿洛酮糖、D-塔格糖、低聚果糖、低聚半乳糖等，已在日韩、欧美等发达国家广泛生产和销售，具有很高的经济附加值；且为肥胖、糖尿病、肠道菌群失调等健康问题的预防提供了解决方案。稀少糖的合成高度依赖生物技术，这是由于有机化学合成对于稀少糖的制备存在路线复杂、步骤多、副产物多、得率低等难以解决的问题。
发明内容
发明目的：本发明的目的是通过生物工程技术，以D-果糖为原料同时生产两种昂贵的食品添加剂产品2′-岩藻糖基乳糖(2’-FL)和D-阿洛酮糖。因此，本发明所要解决的技术问题是提供了一种利用生物工程技术同时生产2′-岩藻糖基乳糖(2’-FL)和D-阿洛酮糖的方法。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种重组菌株，所述重组菌株是将质粒pCOLADuet-1-CB、质粒pCDFDuet-1-GW、质粒pETDuet-1-BY共转化到大肠杆菌获得。
其中，所述质粒pCOLADuet-1-CB是将manC基因克隆到pCOLADuet-1质粒上获得重组质粒pCOLADuet-1-C，然后将manB基因克隆到pCOLADuet-1-C质粒上获得重组质粒pCOLADuet-1-CB。
其中，所述质粒pCDFDuet-1-GW是将gmd基因克隆到pCDFDuet-1质粒上获得重组质粒pCDFDuet-1-G；然后将wcag基因克隆到pCDFDuet-1-G质粒上获得重组质粒 pCDFDuet-1-GW。
其中，所述质粒pETDuet-1-BY是将wcfB基因克隆到pETDuet-1质粒上获得重组质粒 pETDuet-1-B；然后将lacY基因克隆到pETDuet-1-B质粒的NdeI-XhoI位点，获得重组质粒 pETDuet-1-BY。
本发明内容还包括所述的重组菌株在制备2′-岩藻糖基乳糖和/或D-阿洛酮糖中的应用。
本发明内容还包括一种同时生产2′-岩藻糖基乳糖和D-阿洛酮糖的方法，包括以下步骤：
1)首先制备交联有D-塔格糖-3-差向异构酶的固定化酶，将D-果糖溶液循环通过固定化酶实现异构化，获得包含有D-果糖和D-阿洛酮糖的混合糖液；
2)然后将D-果糖和D-阿洛酮糖的混合糖液作为发酵碳源进行发酵培养，流加补料喂养权利要求1～4任一项所述的菌株，同时流加乳糖，经过发酵获得包含有D-阿洛酮糖和2’-岩藻糖基乳糖的混合糖液；
3)最后将包含有D-阿洛酮糖和2’-岩藻糖基乳糖的混合糖液依次经过除菌、脱色、除盐、树脂分离步骤，分别进行结晶，最终分别获得D-阿洛酮糖和2’-FL的结晶型产品。
其中，所述步骤1)中固定化酶具体获得方法为：将根癌农杆菌来源的D-塔格糖-3-差向异构酶酶液与DEAE-阴离子交换树脂结合，常温下轻微搅拌后，加入终浓度为戊二醛溶液，常温交联获得固定化酶。
其中，所述步骤2)中的发酵培养基为5～20g/L蛋白胨，5～20g/L酵母粉，1～10g/LNH4H2PO4，1～10g/L K2HPO4，1～5g/L KOH，0.1～0.5g/L柠檬酸，1～5g/L MgSO4·7H2O，0.01～0.05g/L CaCl2·6H2O，10～30g/L混合糖液，卡那霉素25mg/L，链霉素50mg/L，氨苄青霉素100mg/L。
其中，所述步骤3)中采用的树脂为强酸性树脂LX-160、弱碱性树脂LX-360和阳离子交换树脂Amberlite IR-120型。
其中，所述步骤3)结晶的具体步骤为：分别将高纯度2’-FL糖液和高纯度D-阿洛酮糖糖液置于抽真空旋转蒸发装置，控制系统温度为45～55℃，并加入少量沸石，浓缩至brix值大于65％，加入等体积的无水乙醇，持续搅拌，期间加入2’-FL固体粉末或D-阿洛酮糖固体粉末作为晶种，晶体生成量达到最大值用滤纸过滤截留，45～55℃烘干后即分别得到2’-FL或 D-阿洛酮糖白色晶体粉末。
有益效果：生物技术尤其是酶催化或细胞工厂合成技术生产稀少糖是当前的最优工艺。人乳寡糖和稀少糖均为极具经济价值的食品添加剂，且都可以通过生物工程技术来制造；本发明以D-果糖为初始原料，经过酶催化、细胞工厂转化，同时生产出稀少单糖D-阿洛酮糖和人乳寡糖2′-岩藻糖基乳糖(2’-FL)，再通过下游分离分别得到D-阿洛酮糖和2’-FL结晶产品的方法，实现了利用相对廉价的原料D-果糖来同时生产两种高附加值产品的工艺流程，在构建2’-FL生产菌株中选择的基因组合能够获得很高的2’-FL产量，具有很强的技术原创性及经济价值。该技术的应用将为食品添加剂生产技术的升级提供借鉴。
附图说明
图1、利用D-果糖同时生产2’-FL和D-阿洛酮糖的工艺流程图；
图2、固定化酶装置示意图；
图3、2’-FL含量标准曲线；
图4、2’-FL的质谱图；
图5、D-阿洛酮糖质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为本发明的限制。
实施例1利用固定化D-塔格糖-3-差向异构酶催化D-果糖生产D-阿洛酮糖
将根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)来源的D-塔格糖-3-差向异构酶(AtDPE)酶液(含100mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.5，酶液蛋白质浓度1g/L，酶活力50000U/L，酶的氨基酸序列见序列表，购自南京洽尔生物科技有限公司，货号：DPE-1)与DEAE-阴离子交换树脂(美国GE公司，货号：17070901)结合，常温下轻微搅拌2h后，加入终浓度为0.3％(v/v)的戊二醛溶液，常温交联6h。用去离子水将树脂洗净，装填到有机玻璃材质的柱式反应器中去(构造示意图见图2)，反应器通过外部循环水控制系统温度为37℃。将500g/L 的D-果糖糖液以较低流速泵入此反应器，循环反应48h，用泵抽出反应器中所有液体即得到含有D-阿洛酮糖的反应液。通过高效液相色谱法分析反应液中糖组份比例，方法如下：
液相设备：Agilent 1260 Infinity II；示差检测器检测，型号：G7162A-1260RId；
液相柱型号：Sepax HP-Amino，4.6*250mm、5微米粒径(或同等规格氨基柱)；
流速：0.8ml/min，流动相：80％纯乙腈：20％水(v/v)，系统温度：35℃，进样量10～20微升。分析测得反应液中D-果糖浓度为335g/L，即占比67％；D-阿洛酮糖浓度为165g/L，即占比33％。
实施例2 2’-FL大肠杆菌生产菌株的构建
1)提取大肠杆菌E.coli K12菌株的基因组，通过PCR方法(聚合酶链式反应)扩增获得如下数个基因：manC(Genbank登录号：NP_416553.1)，manB(Genbank登录号： NP_416552.1)，gmd(Genbank登录号：NP_416557.1)，wcag(Genbank登录号：NP_416556.1)，lacY(Genbank登录号：NP_414877.1)，委托通用生物系统(安徽)有限公司，通过DNA全合成获得wcfB基因(Genbank登录号：CAH06753.1)。
2)将manC基因克隆到pCOLADuet-1质粒(北京华越洋生物，货号：VECT4960)的NcoI-BamHI位点粒，获得重组质pCOLADuet-1-C；将manB基因克隆到pCOLADuet-1-C质粒的NdeI-XhoI位点，获得重组质粒pCOLADuet-1-CB(克隆用引物序列见表1)。
具体方法为：
S1、使用NcoI和BamHI酶双酶切pCOLADuet-1质粒，酶切体系为：pCOLADuet-1质粒50μL，NcoI酶(NEB公司，货号：#R0193L)3μL，BamHI酶(NEB公司，货号：#R0136L) 3μL，10*缓冲液10μL，双蒸水34μL；37℃酶切8小时，使用DNA纯化试剂盒(Takara 公司，货号：9761)回收酶切后的质粒DNA。
S2、通过PCR法扩增manC基因，扩增体系为：2*高保真Taq DNA聚合酶mix 50μL，正向引物2μL，反向引物2μL，大肠杆菌E.coli K12菌株基因组2μL，双蒸水44μL；PCR 仪扩增程序：94℃变性30秒，55℃退火30秒，68℃延伸1分30秒，反复进行30个循环。使用DNA纯化试剂盒(Takara公司，货号：9761)回收扩增的manC基因DNA片段。
S3、使用南京诺唯赞公司的连接试剂盒(货号：C112-01)连接酶切后的pCOLADuet-1 质粒和扩增的manC基因DNA片段，具体方法见试剂盒说明书。
S4、将酶连接后的少量重组质粒转化大肠杆菌DH5α，通过培养该重组大肠杆菌，提取获得大量重组质粒pCOLADuet-1-manC用于下一步实验。
具体方法为：取1μL酶连接后的重组质粒，加入到100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞悬液(南京诺唯赞公司，货号：C502-02)，用移液器轻柔混匀，冰上静置20min。42℃水浴中热激90秒，然后迅速置冰上3～5min，整个过程不要振荡菌液。加入1mL LB液体培养基 (不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养(180rpm)1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。取100μL菌液，至含有25mg/L卡那霉素的LB琼脂平板上，涂布均匀。待菌液被培养基吸收后，37℃倒置培养12～16小时，出现单菌落后挑取单菌落到含有25mg/L卡那霉素的LB液体培养基中37℃培养。使用质粒提取试剂盒(南京诺唯赞公司，货号：DC202-01)即可提取获得大量重组质粒pCOLADuet-1-manC。
S5、使用NdeI酶和XhoI酶双酶切pCOLADuet-1-manC质粒，酶切体系为：pCOLADuet-1-manC质粒50μL，NdeI酶(NEB公司，货号：#R0111L)3μL，XhoI酶(NEB 公司，货号：#R0146L)3μL，10*缓冲液10μL，双蒸水34μL；37℃酶切8小时，使用 DNA纯化试剂盒(Takara公司，货号：9761)回收酶切后的质粒DNA。
S6、同步骤2～4获得重组质粒pCOLADuet-1-CB。
(3)将gmd基因克隆到pCDFDuet-1质粒的NcoI-BamHI位点，获得重组质粒pCDFDuet-1-G；将wcag基因克隆到pCDFDuet-1-G质粒的NdeI-XhoI位点，获得重组质粒pCDFDuet-1-GW(克隆用引物序列见表1)，具体方法同前。
(4)将wcfB基因克隆到pETDuet-1质粒的NcoI-BamHI位点，获得重组质粒pETDuet-1-B；将lacY基因克隆到pETDuet-1-B质粒的NdeI-XhoI位点，获得重组质粒pETDuet-1-BY(克隆用引物序列见表1)，具体方法同前。
(5)通过质粒转化方法将pCOLADuet-1-CB、pCDFDuet-1-GW、pETDuet-1-BY三个质粒共转化到JM109(DE3)菌株(北京华越洋生物，货号：NRR00980)，获得 JM109(DE3)-CBGWBY菌株。
具体方法如下：
A1、制备含有25mg/L卡那霉素、50mg/L链霉素，100mg/L氨苄青霉素的LB琼脂平板(配方为10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，20g/L琼脂)。
A2、取一个1.5ml离心管，加入100μL大肠杆菌JM109(DE3)感受态细胞悬液(北京华越洋生物，货号：NRR00980)，置于冰上；加入1μL pCOLADuet-1-CB质粒(100ng/μL 浓度)、1μL pCDFDuet-1-GW质粒(100ng/μL浓度)、1μL pETDuet-1-BY质粒(100ng/μL 浓度)，用移液器轻柔混匀，冰上静置20min。
A3、42℃水浴中热激90秒，然后迅速置冰上3～5min，整个过程不要振荡菌液。
A4、加入1mL LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养(180rpm)1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。
A5、取100μL菌液，至含有25mg/L卡那霉素、50mg/L链霉素，100mg/L氨苄青霉素的LB琼脂平板上，涂布均匀。
A6、待菌液被培养基吸收后，37℃倒置培养12～16小时，出现单菌落后挑取单菌落到含有25mg/L卡那霉素、50mg/L链霉素，100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃培养至浑浊，吸取500μL菌液至灭过菌EP管，再加入500μL 40％(w/w)浓度甘油，混匀后-80℃保藏待用。
JM109(DE3)-CBGWBY菌株能够在含有D-葡萄糖和乳糖的LB培养基中合成2’-FL。具体方法为：将JM109(DE3)-CBGWBY菌株以1％(v/v)接种量接种到含有D-葡萄糖的LB培养基(配方为10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，20g/L D-葡萄糖，卡那霉素25 mg/L，链霉素50mg/L，氨苄青霉素100mg/L)，37℃，220rpm培养至OD＝1.0，冷却至25℃，加入终浓度3g/L乳糖，继续37℃，220rpm培养发酵60小时；对比标品标准曲线，最终测得发酵液中2’-FL含量为1.2g/L。
2’-FL含量标准曲线的制作方法如下：取2’-FL标准品粉末(上海阿拉丁生化科技公司，货号：F130960)溶解制成不同浓度的糖液(1、2、5、10、15、20g/L)，经过0.22μm滤头过滤。在高效液相色谱设备中分别进样并积分计算产物峰的峰面积S，以各峰面积S和2’-FL浓度(g/L)分别为纵/横坐标作散点图，拟合产生直线即为标品的标准曲线，要求拟合方程的R2值大于0.99属于合格。标准曲线图参见图3。
表1引物序列表
引物名称 引物序列
manC-正向引物 taagaaggagatataccatggctatgagctcacctcttattccgg
manC-反向引物 gccgagctcgaattcggatccttaatcttcaaatcgaaggatat
manB-正向引物 taagaaggagatatacatatgatgctaacttgctttaaagcttatga
manB-反向引物 ggtttctttaccagactcgagttacttgttcagtaactcaaggat
gmd-正向引物 taagaaggagatataccatggatgtcaaaagtcgctctcatcacc
gmd-反向引物 gccgagctcgaattcggatccttatgactccagcgcgatcg
wcag-正向引物 taagaaggagatatacatatgatgagtagacaacgcatttttatcg
wcag-反向引物 ggtttctttaccagactcgagttacccccgaaagcggtc
wcfB-正向引物 taagaaggagatataccatggatgttatatgtaattttacgtggacgatt
wcfB-反向引物 gccgagctcgaattcggatccttacatattcttctttcttttccatattaatc
lacY-正向引物 taagaaggagatatacatatgatgtactatttaaaaaacacaaacttttgg
lacY-反向引物 ggtttctttaccagactcgagttaagcgacttcattcacctgacg
实施例3利用实施方式1所得酶反应液喂养大肠杆菌菌株生产2’-FL
将实施例1所得含有D-阿洛酮糖的反应液装入补料瓶，并加入MgSO4·7H2O至终浓度10g/L，115℃高温湿热灭菌25分钟备用。在10L发酵罐中装入5L培养基(配方为5g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，7g/L NH4H2PO4，7g/L K2HPO4，2g/L KOH，0.3g/L柠檬酸，2g/L MgSo4·7H2o，0.02g/L CaCl2·6H2o，20g/L D-果糖，卡那霉素25mg/L，链霉素50mg/L，氨苄青霉素100mg/L)，121℃高温湿热灭菌20分钟(其中D-果糖115℃单独高温湿热灭菌25 分钟，抗生素通过0.22μm滤膜过滤后加入)。将实施例2所得JM109(DE3)-CBGWBY菌株以10％(v/v)接种量接入发酵罐，37℃培养，期间控制搅拌转速rpm＝400，通气1vvm，pH 通过流加氨水控制为7.0；至OD600＝20时降温至25℃，调节搅拌转速rpm＝600，通气2vvm，流加入终浓度20g/L的乳糖(115℃高温湿热灭菌25分钟)，期间若发现pH开始高于7.0 则表示D-果糖耗尽，应继续流加D-果糖。维持整个发酵周期为80小时，期间用薄层层析TLC 法鉴定发酵液中各糖组份含量变化，具体方法为：
展开剂：2％苯胺-丙酮溶液∶2％二苯胺-丙酮溶液∶85％磷酸＝5∶5∶1(v/v)；显色剂：正丁醇∶乙酸乙酯∶异丙醇∶醋酸∶水＝7∶20∶12∶7∶6(v/v)；检测时用毛细管将糖液样品点于硅胶板，吹风机吹干后置于层析缸，通过展开剂展开至距离硅胶板上沿约2厘米处，取出吹风机吹干后用喷雾瓶均匀喷撒显色剂，置于烘箱中100度烘烤15-20分钟应可见各样品斑点；从板上方到下方依次是D-阿洛酮糖、D-果糖、乳糖、2’-岩藻糖基乳糖，每次点样可同时点上这几种物质的标准品进行对比。若点样斑点过大、拖尾变形等，则应减少点样量再次试验。
待发酵液中乳糖消耗完毕后结束发酵，将发酵液置于离心机5000rpm离心去除菌体，即得到含有2’-FL的发酵液。而流加入发酵罐的D-阿洛酮糖无法被菌株消耗，也残留在所得发酵液中。最终测得2’-FL浓度为35.5g/L，D-阿洛酮糖浓度为67.0g/L。
实施例4从发酵液中分别提取2’-FL和D-阿洛酮糖
向实施例3所得发酵液加入终浓度0.5％(w/w)的活性炭，调节pH为5，65℃下搅拌45 分钟，抽滤去除活性炭，若发酵液呈无色透明外观即完成发酵液的脱色，否则应增加活性炭用量。将强酸性树脂LX-160和弱碱性树脂LX-360(西安蓝晓科技公司，货号分别为：LX-160 和LX-360)分别装入有机玻璃柱中，将脱色后的发酵液用蠕动泵依次泵入通过LX-160树脂柱和LX-360树脂柱，用电导率仪测试此时发酵液的电导率，若电导率大于200μS则应增加树脂柱中的树脂量，直到所测电导率低于200μS为止，即实现了发酵液的除盐。将Amberlite IR-120型阳离子交换树脂(美国罗门哈斯公司，货号：9002-23-7)装填入有机玻璃柱(高径比应大于30∶1，外侧带循环水夹套)，并通过循环水控制柱温70℃；将除盐后的发酵液缓慢泵入该树脂柱，用试管依次接出发酵液，期间通过DNS法鉴定含糖量，当含糖量极低时停止液体收集。对含糖的各管液体用纸层析TLC法鉴定成分，将只含2’-FL和只含D-阿洛酮糖的试管分别合并，即分别获得了高纯度的2’-FL和高纯度的D-阿洛酮糖糖液。2’-FL质谱图参见图4，D-阿洛酮糖质谱图参见图5。
实施例5 2’-FL和D-阿洛酮糖的结晶
将实施例4所得高纯度2’-FL糖液(或高纯度D-阿洛酮糖糖液)置于抽真空旋转蒸发装置，控制系统温度为55℃并加入少量沸石，浓缩至brix值(白利糖度)大于65％，加入等体积的无水乙醇，50转/分钟持续搅拌，期间加入0.1％(w/w)的2’-FL固体粉末或D-阿洛酮糖固体粉末作为晶种，约48小时后出现晶体，72小时晶体生成量达到最大值，用滤纸过滤截留，55℃烘干后即得到2’-FL或D-阿洛酮糖白色晶体粉末。将2’-FL或D-阿洛酮糖晶体粉末用去离子水溶解后上样高效液相色谱仪分析，根据出峰峰面积判断，2’-FL和D-阿洛酮糖样品的纯度大于95％，分别为97.1％和98.3％。同时计算得到2’-FL和D-阿洛酮糖的结晶率分别为82.5％和85.1％。
序列表
<110> 南通励成生物工程有限公司
<120> 一种同时生产2'-岩藻糖基乳糖和D-阿洛酮糖的方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> manC-正向引物(Artificial Sequence)
<400> 1
taagaaggag atataccatg gctatgagct cacctcttat tccgg 45
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> manC-反向引物(Artificial Sequence)
<400> 2
gccgagctcg aattcggatc cttaatcttc aaatcgaagg atat 44
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> manB-正向引物(Artificial Sequence)
<400> 3
taagaaggag atatacatat gatgctaact tgctttaaag cttatga 47
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> manB-反向引物(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtttcttta ccagactcga gttacttgtt cagtaactca aggat 45
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> gmd-正向引物(Artificial Sequence)
<400> 5
taagaaggag atataccatg gatgtcaaaa gtcgctctca tcacc 45
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> gmd-反向引物(Artificial Sequence)
<400> 6
gccgagctcg aattcggatc cttatgactc cagcgcgatc g 41
<210> 7
<211> 46
<212> DNA
<213> wcag-正向引物(Artificial Sequence)
<400> 7
taagaaggag atatacatat gatgagtaga caacgcattt ttatcg 46
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> wcag-反向引物(Artificial Sequence)
<400> 8
ggtttcttta ccagactcga gttacccccg aaagcggtc 39
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> wcfB-正向引物(Artificial Sequence)
<400> 9
taagaaggag atataccatg gatgttatat gtaattttac gtggacgatt 50
<210> 10
<211> 53
<212> DNA
<213> wcfB-反向引物(Artificial Sequence)
<400> 10
gccgagctcg aattcggatc cttacatatt cttctttctt ttccatatta atc 53
<210> 11
<211> 51
<212> DNA
<213> lacY-正向引物(Artificial Sequence)
<400> 11
taagaaggag atatacatat gatgtactat ttaaaaaaca caaacttttg g 51
<210> 12
<211> 45
<212> DNA
<213> lacY-反向引物(Artificial Sequence)
<400> 12
ggtttcttta ccagactcga gttaagcgac ttcattcacc tgacg 45

Claims (10)

1.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株是将质粒pCOLADuet-1-CB、质粒pCDFDuet-1-GW、质粒pETDuet-1-BY共转化到大肠杆菌获得。
2.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，所述质粒pCOLADuet-1-CB是将manC基因克隆到pCOLADuet-1质粒上获得重组质粒pCOLADuet-1-C，然后将manB基因克隆到pCOLADuet-1-C质粒上获得重组质粒pCOLADuet-1-CB。
3.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，所述质粒pCDFDuet-1-GW是将gmd基因克隆到pCDFDuet-1质粒上获得重组质粒pCDFDuet-1-G；然后将wcag基因克隆到pCDFDuet-1-G质粒上获得重组质粒pCDFDuet-1-GW。
4.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，所述质粒pETDuet-1-BY是将wcfB基因克隆到pETDuet-1质粒上获得重组质粒pETDuet-1-B；然后将lacY基因克隆到pETDuet-1-B质粒的NdeI-XhoI位点，获得重组质粒pETDuet-1-BY。
5.权利要求1~4任一项所述的重组菌株在制备2'-岩藻糖基乳糖和/或D-阿洛酮糖中的应用。
6.一种同时生产2'-岩藻糖基乳糖和D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）首先制备交联有D-塔格糖-3-差向异构酶的固定化酶，将D-果糖溶液循环通过固定化酶实现异构化，获得包含有D-果糖和D-阿洛酮糖的混合糖液；
2）然后将D-果糖和D-阿洛酮糖的混合糖液作为发酵碳源进行发酵培养，流加补料喂养权利要求1~4任一项所述的菌株，同时流加乳糖，经过发酵获得包含有D-阿洛酮糖和2’-岩藻糖基乳糖的混合糖液；
3）最后将包含有D-阿洛酮糖和2’-岩藻糖基乳糖的混合糖液依次经过除菌、脱色、除盐、树脂分离步骤，分别进行结晶，最终分别获得D-阿洛酮糖和2’-FL的结晶型产品。
7.根据权利要求6所述的同时生产2'-岩藻糖基乳糖和D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述步骤1）中固定化酶具体获得方法为：将根癌农杆菌来源的D-塔格糖-3-差向异构酶酶液与DEAE-阴离子交换树脂结合，常温下轻微搅拌后，加入终浓度为戊二醛溶液，常温交联获得固定化酶。
8.根据权利要求6所述的同时生产2'-岩藻糖基乳糖和D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述步骤2）中的发酵培养基为5~20 g/L 蛋白胨，5~20 g/L 酵母粉，1~10 g/LNH4H2PO4，1~10 g/L K2HPO4，1~5 g/L KOH，0.1~0.5 g/L 柠檬酸，1~5 g/L MgSO4·7H2O，0.01~0.05 g/L CaCl2·6H2O，10~30 g/L 混合糖液，卡那霉素25 mg/L，链霉素50 mg/L，氨苄青霉素100 mg/L。
9.根据权利要求6所述的同时生产2'-岩藻糖基乳糖和D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述步骤3）中采用的树脂为强酸性树脂LX-160、弱碱性树脂LX-360和阳离子交换树脂Amberlite IR-120型。
10.根据权利要求6所述的同时生产2'-岩藻糖基乳糖和D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述步骤3）中的结晶具体步骤为：分别将高纯度2’-FL糖液和高纯度D-阿洛酮糖糖液置于抽真空旋转蒸发装置，控制系统温度为45~55℃，并加入少量沸石，浓缩至brix值大于65%，加入等体积的无水乙醇，持续搅拌，期间加入2’-FL固体粉末或D-阿洛酮糖固体粉末作为晶种，晶体生成量达到最大值用滤纸过滤截留，45~55℃烘干后即分别得到2’-FL或D-阿洛酮糖白色晶体粉末。
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