BR112012007215A2 - imobilização de piscose-epimerase e um método para a produção de d-psicose utilizando a mesma - Google Patents

imobilização de piscose-epimerase e um método para a produção de d-psicose utilizando a mesma Download PDF

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Abstract

IMOBILIZAÇÃO DE PSICOSE-EPIMERASE E UM MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE D-PSICOSE UTILIZANDO A MESMA. A presente invenção se refere a um método para ,produzir sucessivamente D-psicose a partir da D-frutose ou da D-glicose utilizando uma psicose-epimerase derivada da Agrobacterium tumefaciens, que é expressa em forma de segurança alimentar.

Description

: 1/21 “IMOBILIZAÇÃO DE PSICOSE-EPIMERASE E UM MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE D-PSICOSE UTILIZANDO À MESMA” Campo técnico A presente invenção se refere a um método para produzir sucessivamente D-psicose a partirda D-frutose ou da D-glucose utilizando uma psicose-epimerase derivada da Agrobacterium tumefaciens , que é expressa em forma de segurança alimentar. Estado da Técnica A D-psicose tem sido amplamente utilizada como um adoçante funcional que tem um sabor doce semelhante ao do açúcar, mas é um monossacarídeo de baixíssimo teor calórico. Em especial, a D-psicose é conhecida como um "açúcar raro" porque é raramente encontrada na natureza, e mesmo quando encontrada, ocorre apenas em pequenas quantidades.
A D-psicose é um epímero da D-frutose e a intensidade da sua dogura e seus tipos são bastante semelhantes aos da D-frutose. No entanto, ao contrário da D-frutose, quando absorvida pelo corpo a D-psicose raramente é metabolizada e tem aproximadamente zero calorias. Além disso, graças à sua ação no alívio da obesidade abdominal suprimindo as atividades enzimáticas relativas à síntese de lipídios, a D-psicose pode ser utilizada como um ingrediente eficaz na formulação de alimentos dietéticos. Além disso, enquanto os álcoois de açúcar, que são amplamente utilizados como substitutos do açúcar, apresentam a desvantagem de causar efeitos colaterais tais como diarreia quando ingeridos em excesso, a —D-psicose quase não tem efeitos colaterais (Matsue, t., y. Baba, m. Hashiguchi, k. Takeshita, k. lzumori e h. Suzuki. 2001.D-psicose dietética, um epimero C-3 da D-frutose, suprime a atividade de enzimas lipogênicas hepáticas em ratos, Ásia PAC j Clin. Nutr. 10:233- 237,.:Matsuo, 1. e k, Izumori. 2004. D-psicose, um açúcar raro que não fornece nenhuma caloria além de proporcionar efeitos benéficos para a nutrição clínica. Ásia PAC j Clin.
Nutr13:8/27).
| A
. 2/21 Por estas razões, a D-psicose está obtendo destaque no campo da indústria de alimentos como um adoçante dietético e, portanto, existe a crescente necessidade de desenvolver um método de produção eficiente da D-psicose. Os métodos convencionais de produção da D-psicose com a utilização de uma —psicose-epimerase têm sido focados em desenvolver um processo de epimerização da D- psicose a partir da D-frutose, utilizando uma enzima recombinante maciçamente expressa num recombinante e. coli ou uma célula hospedeira que compreende o mesmo. No entanto, a produção biotecnológica da D-psícose usando tal recombinante e. coli é inadequada para a produção da D-psicose como um produto alimentício em termos de segurança alimentar. Para produzir a D-psicose de forma adequada para a sua utilização como alimento, é necessário desenvolver um método de produção em escala industrial usando uma psicose-epimerase expressa numa célula hospedeira, que é uma linhagem considerada GRAS (geralmente reconhecida como segura), bem como uma espécie capaz de ser produzida em escala industrial ou utilizando um hospedeiro compreendendo a mesma.
A condição GRAS é atribuída a substâncias que são geralmente reconhecidas como seguras quando especialistas qualificados por sua formação científica e experiência avaliam sua segurança através de procedimentos científicos nas condições de utilização pretendida. GRAS é um sistema implementado nos EUA mas sua importância e necessidade são reconhecidas internacionalmente bem como nos EUA. Por isso as pessoas estão prestando —atençãono desenvolvimento do conceito GRAS.
Entretanto, para a produção industrial de D-psicose é necessário desenvolver um método de produção da D-psicose através de um substrato mais barato. Atualmente, devido à alta especificidade do substrato de uma psicose-epimerase, apenas a dispendiosa D-frutose é utilizada na produção da D-psicose. Divulgação
. 3/21 Problema técnico A presente invenção tem sido estudada ativamente na produção de D-psicose em escala industrial como alimento, chegando-se à conclusão que a produção sucessiva de D- psícose a partir da D-frutose ou da D-glucose pode ser obtida utilizando imobilização a fim de proporcionar um ambiente estável para ativação enzimática destinada à produção de D- psicose em escala industrial e utilizando uma isomerase-D-glucose juntamente com uma psicose-epimerase, Um dos objetivos da presente invenção consiste em fornecer uma psicose-epimerase com segurança alimentar para a preparação da Dr-psicose utilizável como produto alimentar.
Outro objetivo da presente invenção consiste em proporcionar um método de produção sucessiva da D-psicose a partir da D-glucose ou da D-frutose, usando uma psicose-epimerase e uma isomerase D-glucose com segurança alimentar imobilizada.
Solução técnica A presente invenção proporciona um método de preparação da D-psicose através da D-frutose, utilizando uma psicose-epimerase derivada da Agrobacterium tumefaciens que é expressa numa linhagem GRAS.
O método da presente invenção compreende as seguintes etapas: expressar uma —psicose-epimerase derivada da Agrobacterium tumefaciens numa linhagem GRAS; e preparar a D-psicose a partir da D-frutose utilizando a psicose-epimerase expressa.
O método da presente invenção pode ainda compreender as seguintes etapas: separar uma psicose-epimerase da cultura de uma linhagem de GRAS capaz de expressar uma psicose-epimerase derivada da Agrobacterium tumefaciens; e preparar a D-psicose a partir da —D-frutose utilizando a psicose-epimerase separada.
e 4/21 A linhagem GRAS expressando uma psicose-epimerase derivada da Agrobacterium tumefaciens pode ser uma linhagem transformada com um vetor de expressão recombinante incluindo um gene que codifica a enzima acima mencionada.
A psicose-epimerase utilizada na preparação da D-psicose de acordo com a presente invenção, pode se apresentar sob a forma contida numa cultura de linhagem GRAS expressando a psicose-epimerase derivada da Agrobacterium tumefáciens ou pode ser isolada da cultura, A linhagem GRAS pode ser uma linhagem transformada com um vetor de expressão recombinante incluindo um gene que codifica uma psicose-epimerase.
A linhagem GRAS pode ser Corynebacierium sp., preferivelmente Corynebacterium glutamicum KCCM 11046, É preferível que a psicose-epimerase derivada da Agrobacterium tumefaciens utilizada no método da presente invenção tenha a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: |. O método de preparação da D-psicose de acordo com a presente invenção pode ainda incluir a etapa de imobilização da psicose-epimerase num transportador.
O transportador adequado para a presente invenção pode incluir alginato, preferivelmente alginato de sódio, mas não está limitada a ele.
O método de preparação da D-psicose de acordo com a presente invenção pode ainda compreender etapas que consistem em preencher uma coluna com o transportador em que a | psicose-epimerase está imobilizada, e fornecer a coluna de preenchimento (packed-bed — column) com uma solução de D-frutose.
A presente invenção tanbém fornece um método de preparação da D-psicose a partir da D-glucose, compreendendo a etapa que consiste em imobilizar uma psicose-epimerase e uma isomerase D-glucose em direção aos transportadores.
O transportador adequado para a presente invenção pode incluir o alginato, preferencialmente o alginato de sódio, mas não estálimitadaaele. o —
. 51 No método acima descrito, a psicose-epimerase pode estar contida numa cultura de linhagem GRAS capaz de expressar a psicose-epimerase derivada da Agrobacterium tumefaciens ou pode estar isolada da cultura.
A linhagem GRAS pode ser uma linhagem transformada com um vetor de expressão recombinante incluindo um gene que codifica a —psicose-epimerase.
Além disso, a linhagem GRAS pode ser Corynebacterium SP., preferencialmente Corynebacterium glutamicum KCCM 11046. É preferível que a psicose-epimerase derivada da Agrobacterium tumefaciens utilizada no método da presente invenção tenha a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1. Além disso, a presente invenção proporciona ainda um método de preparação da D- psicose a partir da D-glucose, compreendendo as seguintes etapas: imobilizar uma psicose- epimerase e uma isomerase D-glucose nos transportadores; preencher uma coluna com transportadores para que a psicose-epimerase e a isomerase de D-glucose sejam imobilizadas; e abastecer uma coluna com uma solução de D-glucose.
Os transportadores nos quais a psicose-epimerase e isomerase de D-glucose estão imobilizadas podem ser preenchidos na mesma coluna ou respectivamente em duas colunas separadas.
No entanto, é preferível que o transportador seja preenchido numa coluna separada e neste caso as duas colunas separadas ficam conectadas entre si.
A presente invenção fornece uma linhagem Corynebacferium glutamicum KCCM 11046 útil para a preparação da D-psicose a partir da D-frutose ou da D-glucose.
A expressão "segurança alimentar" no âmbito do presente relatório descritivo significa que um determinado produto é suficientemente seguro para ser usado como alimento.
Portanto, o termo "expresso em forma de segurança alimentar" no presente ' relatório descritivo significa que um gene alvo foi expresso numa linhagem reconhecidamente segura e sem efeitos nocivos ainda que tenha sido utilizada como | — alimento, por exemplo, uma linhagem GRAS. | o :
” 6/21 Numa configuração da presente invenção, um método de transformação da linhagem GRAS com um vetor recombinante pode incluir uma eletro-perfuração, mas não é limitado a ela e pode ser levado a efeito utilizando qualquer método de transformação bem conhecido na arte pelos peritos dedicados ao campo da presente invenção.
Numa configuração da presente invenção, o vetor recombinante incluindo o gene que codifica a psicose-epimerase derivada da Agrobacterium tumefaciens pode incluir o gene de codificação de psicose-epimerase operacionalmente ligado a um promotor ativo na bactéria Corynebacterium sp. O promotor pode ter uma das seqiiências SEQ ID NOs: 2 a 8 que tenham sido confirmadas para expressar um gene alvo mais eficientemente do que um promotor tac na bactéria Corynebacterium sp. (Patente Coreana, publicação NO 2006- 0068505).
O termo "psicose-epimerase" utilizado no presente relatório descritivo significa uma D-psicose-3-epimerase tendo uma atividade de conversão da D-frutose para a D-psicose.
Numa configuração da presente invenção, a psicose-epimerase derivada da Agrobacterium tumefaciens pode ter a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 ou pode ser constituída por fragmentos funcionais da mesma. Fragmento funcional significa um fragmento que inclui mutações por substituição, inserção, exclusão ou processos similares de alguns aminoácidos na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, quando apresenta uma atividade de conversão da D-frutose para D-psicose.
Numa configuração da presente invenção, a linhagem GRAS pode ser uma linhagem Corynebacterium Sp.
A linhagem Corynebacterium sp. é um microorganismo industrial que produz compostos químicos que têm várias aplicações na alimentação animal, medicina e áreas de alimentos, etc., incluindo a L-lisina, a L-treonina e vários ácidos nucleicos. Tal linhagem Corynebacterium sp, é uma linhagem GRAS (geralmente reconhecida como segura) e tem | -
. . 7/21 propriedades que lhe conferem facilidade de manipulação genética e cultivo em grande escala. Além disso, a linhagem Corynebacterium Sp. apresenta alta estabilidade em várias condições de processos, tem uma estrutura de parede celular relativamente rígida quando comparada com outras bactérias, tendo assim a propriedade biológica de existir numa massa celular em estado estável mesmo sob alta pressão osmótica pela concentração elevada de açúcar, etc. Numa configuração da presente invenção, a linhagem Corynebacterium sp. pode ser a Corynebacterium glutamicum. Numa configuração da presente invenção, a linhagem GRAS expressando a psicose- —epimerase derivada da Agrobacterium tumefaciens pode ser uma linhagem recombinante de Corynebacterium glutamicum KCCM 11046, A psicose-epimerase pode ser facilmente modificada por mutagênese convencionalmente conhecida pelos peritos na arte, tais como a evolução dirigida e a mutagênese dirigida, etc, Portanto, podemos concluir que enzimas recombinantes com uma certa amplitude de homologia de sequência, tais como homologia de sequência de 70% ou superior, de preferência 80% ou superior, e mais preferivelmente 90% ou superior para a sequência de aminoácidos da psicose-epimerase representada por SEQ ID NO: | e sendo expressa como uma forma ativa na linhagem GRAS; e uma célula hospedeira compreendendo a mesma, estão dentro do escopo da presente invenção.
A cultura da linhagem GRAS expressando a psicose-epimerase derivada da Agrobacterium tumefaciens pode ser obtida pela cultura da bactéria transformada em meios de cultura média e baixa que podem ser facilmente selecionadas pelos peritos na arte, dependendo das propriedades da linhagem. O método de cultura pode incluir qualquer método de cultura conhecido pelos peritos na arte, tais como cultura batch, cultura contínua e cultura fed-batch, mas não está limitado a elas.
A e 2 e o
. 8/21 O método de preparação da D-psicose de acordo com uma configuração da presente invenção pode compreender uma etapa que consiste em separar a psicose-epimerase da cultura da linhagem GRAS que expressa a psicose-epimerase derivada da Agrobacterium tumefáciens.
Numa configuração da presente invenção, células separadas da cultura da linhagem que expressa a psicose-epimerase derivada da Agrobacterium tumefaciens por centrifugação, filtração, etc.; ou o sobrenadante obtido pela homogeneização e centrifugação das células separadas; ou a psicose-epimerase que é separada e purificada do sobrenadante por fraccionamento, cromatografia, ete podem ser utilizadas como uma enzima para converter a D-frutose em D-psicose. Numa configuração da presente invenção, a psicose-epimerase pode estar sob a forma de massa celular na cultura ou como psicose-epimerase separada da massa celular. Numa configuração da presente invenção, a etapa de preparação da D-psicose pode ainda incluir a etapa de imobilização da psicose-epimerase ou da massa de células expressando a mesma num transportador. Como no caso de imobilização da enzima ou da massa celular num transportador pode ocorrer um ambiente para a mantenção da atividade por um longo período de tempo, a imobilização tem sido utilizada no método de produção industrial utilizando uma enzima ou um microorganismo. O transportador aplicável na imobilização pode incluir alginatos como o alginatode sódio, mas não está limitado a ele.
Numa configuração da presente invenção, a imobilização poderá ser efetuada utilizando alginato de sódio como transportador. O alginato de sódio que é um polissacarídeo coloidal natural presente abundantemente na parede celular de algas consiste de ácido B-D- manurônico e ácido a-L-gulurônico e é formado por ligações B-1,4 aleatórias no conteúdo, e —porissoé bom que a massa celular ou as enzimas possam ser estavelmente imobilizadas nele, | o
. 9121 Numa configuração da presente invenção, a imobilização pode ser feita utilizando-se 1,5% a 4,0% de alginato de sódio como transportador.
Numa configuração da presente invenção, a imobilização pode ser feita utilizando-se 2% de alginato de sódio como transportador.
Numa configuração da presente invenção, se o alginato de sódio for usado como transportador para a imobilização, a imobilização pode ser feita adicionando-se | a 2 vezes o volume de uma solução aquosa de alginato de sódio para uma amostra contendo a enzima ou a massa celular, reduzindo a mistura resultante para uma solução de íons cálcio de 0,1 M para criar à enzima ou o complexo de massa celular de alginato em grânulos utilizando-se uma —bombade seringa e uma bomba de vácuo.
Numa configuração da presente invenção, a etapa de imobilização da psicose- epimerase no transportador pode ainda incluir as etapas que consitem em preencher uma coluna com a enzima imobilizada e abastecer a coluna preenchida com uma solução de D- frutose, A coluna a ser preenchida com o transportador no qual a enzima ou a massa celular está imobilizada e o método de preenchimento da coluna com o mesmo podem ser facilmente selecionados pelos peritos na arte, dependendo da enzima ou a massa celular, ou do transportador usado na imobilização.
Numa configuração da presente invenção, é possível preparar uma coluna de — preenchimento enchendo a coluna com a enzima imobilizada. A reação enzimática, ou seja, a conversão da D-frutose em D-psicose pode ser feita fomecendo-se a coluna de preenchimento com uma solução de D-frutose que é o seu substrato.
Numa configuração da presente invenção, quando a coluna de preenchimento que é preenchida com a massa celular incluindo a psicose-epimerase é abastecida com a solução de —D-frutose numa concentração constante, a reação de epimerização ocorre através da massa
E celular imobilizada resultando na conversão da D-frutose para a D-psicose. À D-psicose convertida é objeto de separação e purificação usando colunas de separação e, em seguida, está disponível como D-psicose pura. A expressão "reator de imobilização" utilizada no presente relatório descritivo S significa um reator cuja reação para a produção da D-psicose ocorre pela massa celular ou pela enzima imobilizada no transportador, ou a coluna preenchida com a massa celular ou com a enzima imobilizada no transportador. Ou seja, a imobilização significa que uma substância fornecendo atividades biológicas, neste caso, uma psicose-epimerase ou um epimerase D-glucose ou uma massa de células incluindo a mesma, está imobilizada no transportador.
A expressão "estabilidade operacional" utilizada no presente relatório descritivo significa que um reator biológico para a produção sucessiva de um produto alvo, tal como a D-psicose, pode ser operado mantendo um nível adequado de produtividade quando comparado à atividade inicial e, de maneira geral, é representado por um período operacional.
Numa configuração da presente invenção, a coluna preenchida com o transportador no qual as células expressando a psicose-epimerase estão imobilizadas é abastecida com 300 g/L de D-frutose a uma taxa de influxo de 0,1 ml/min a 50ºC, o que torna possível garantir 25 dias ou mais de estabilidade operacional.
A presente invenção proporciona ainda um método de preparação da D-psicose a partir da D-glucose, compreendendo a etapa de imobilização de uma psicose-epimerase e uma isomerase D-glucose nos transportadores.
Conforme descrito acima, como a D-frutose utilizada como substrato para a psicose- epimerase é cara, é necessário produzir a D-psicose a partir de um substrato mais barato —comoa D-glucose para a produção da D-psicose em escala industrial. À isomerase D-glucose
' . 1021 é uma enzima capaz de converter a D-glucose em D-frutose, e assim, pode fornecer um substrato para uma psicose-epimerase, convertendo a D-glucose em D-frutose. Portanto, verifica-se que é possível produzir D-psicose a partir da D-glucose, utilizando estas duas enzimas, Numa configuração da presente invenção, a psicose-epimerase pode ser a cultura da linhagem GRAS expressando a psicose-epimerase derivada da Agrobacterium tumefaciens, ou a massa celular ou a psicose-epimerase separada da cultura.
Numa configuração da presente invenção, a isomerase D-glucose pode ser a cultura da linhagem GRAS expressando a isomerase-D-glucose, ou a massa celular ou a isomerase —D-glucose separada da cultura.
Numa configuração da presente invenção, a psicose-epimerase pode ter a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, Numa configuração da presente invenção, a isomerase D-glucose pode ser comercialmente disponível. Por exemplo, a isomerase D-glucose ou a isomerase D-glucose imobilizada disponibilizada comercialmente pela Novozymes A/S (Bagsvaerd, Dinamarca) pode ser utilizada.
A isomerase D-glucose é uma enzima representativa para a conversão da D-glucose em D-ftutose e atualmente vem sendo largamente utilizada para a produção de frutooligossacarídeos. Dentre as enzimas utilizadas atualmente para a produção industrial, a —isomerase D-glucose é uma das enzimas cujas actividades e mecanismos têm sido claramente identificados.
Numa configuração da presente invenção, a linhagem GRAS pode ser uma linhagem transformada com um vetor recombinante incluindo um gene que codifica a psicose- epimerase e um gene que codifica a isomerase D-glucose ou uma linhagem co-transformada — com vetores recombinantes incluindo cada um dos genes acima descritos.
“% 12/21 Numa configuração da presente invenção, a linhagem GRAS pode ser a bactéria Corynebacterium sp.
Numa configuração da presente invenção, a linhagem GRAS expressando a psicose- epimerase derivada da Agrobacterium tumefaciens pode ser a linhagem recombinante da Cornnebacterium glutamicum KCCM 11046. Numa configuração da presente invenção, o transportador para a imobilização pode ser alginato de sódio.
Numa configuração da presente invenção, a imobilização pode ser efetuada utilizando-se 1,5% a 4,0% de alginato de sódio como transportador.
Numa configuração da presente invenção, a imobilização pode ser efetuada utilizando-se 2% de alginato de sódio como transportador.
Numa configuração da presente invenção, se o alginato de sódio for utilizado como transportador para a imobilização, a referida imobilização pode ser levada a efeito adicionando-se | a 2 vezes o volume de uma solução aquosa de alginato de sódio para uma amostra contendo a enzima ou a massa celular, reduzindo a mistura resultante para uma solução de íons cálcio de 0,1 M para criar a enzima ou o complexo de massa celular de alginato em grânulos utilizando-se uma bomba de seringa e uma bomba de Vácuo.
Numa configuração da presente invenção, o gene que codifica a psicose-epimerase e ogene que codifica a isomerase D-glucose podem ser expressos na mesma linhagem GRAS ou em duas diferentes linhagens GRAS, respectivamente, e a etapa de imobilização pode ser feita pela imobilização das células das linhagens GRAS cultivadas ou uma mistura de duas enzimas separadas das células nos transportadores.
Numa configuração da presente invenção, a cultura da linhagem GRAS expressando à psicose-epimerase ou a massa celular ou a psicose-epimerase separada da | E
. 13/21 cultura; e a isomerase D-glucose podem ser imobilizadam nos transportadores, respectivamente.
Numa configuração da presente invenção, o método da invenção pode compreender ainda a etapa de preenchimento da coluna com o transportador no qual as células ou as enzimasestãoimobilizadas. O método de preparação da D-psicose a partir da D-glucose de acordo com a presente invenção pode ainda compreender as etapas de preenchimento da coluna com psicose-epimerase imobilizada e isomerase D-glucose e o abastecimento da coluna preenchida com uma solução de D-glucose. Numa configuração da presente invenção, a coluna de preenchimento pode ser preparada pelo preenchimento da coluna com as enzimas imobilizadas. A reação enzimática, ou seja, a conversão da D-glucose em D-psicose pode ser feita através do abastecimento da coluna de preenchimento com a solução de D-glucose, que é seu substrato. Numa configuração da presente invenção, a psicose-epimerase imobilizada e a —isomerase D-glucose podem ser preenchidas em colunas separadas, respectivamente. A coluna a ser preenchida com o transportador no qual as enzimas ou as células estão imobilizadas e o método de preenchimento da coluna com o mesmo podem ser facilmente selecionados pelos peritos na arte, dependendo das enzimas ou da massa celular, ou o transportador utilizado para a imobilização. Numa configuração da presente invenção, é possível preencher duas colunas separadas com o transportador imobilizado da psicose- epimerase e o transportador imobilizado da isomerase D-glucose, respectivamente, conectar estas duas colunas entre si para transportar a D-frutose como um produto de isomerização da coluna preenchida com a isomerase D-glucose para a coluna preenchida com a psicose- epimerase, e induzir a reação de conversão da D-frutose em D-psicose. Quando a solução de —D-glucose como um substrato é fornecida para o reator de imobilização composto por estas o
Sa 14/21 | duas colunas comunicadas, a D-glucose é convertida em D-frutose na coluna preenchida com isomerase D-glucose, e a D-frutose transferida para a coluna preenchida com psicose- epimerase é convertida em D-psicose, Assim, é possível obter a D-psicose como um produto final da D-glucose.
Efeitos vantajosos | O método de preparação da D-psicose de acordo com a presente invenção pode produzir maciça e sucessivamente a D-psicose em termos de segurança alimentar que pode , ser utilizada como um produto alimentício resultante da D-glucose ou da D-frutose.
Breve descrição dos desenhos A Fig. | ilustra esquematicamente um processo de construção de um vetor de expressão recombinante pCJ-1-ATPE incluindo um gene que codifica uma psicose-epimerase derivada da Agrobacterium tumefaciens.
A Fig. 2 ilustra os resultados da medição da atividade de psicose-epimerase derivada da Agrobacterium rumefaciens port HPLC para o método de acordo com uma configuração da — presente invenção, onde a Fig. 2a mostra uma referência padrão para cada açúcar, é a Fig. 2b ; mostra a conversão por reações. | A Fig, 3 ilustra % de conversão da D-frutose em D-psicose utilizando a linhagem ' | recombinante para o método de acordo com uma configuração da presente invenção sob condições combinadas de 100 g/L (3a), 300 g/L (3b) ou 500 g/L (3 c) de D-frutose, e 40ºC, 45ºCou50ºCde uma temperatura de reação.
A Fig. 4 ilustra a produtividade da D-psicose dependendo de uma taxa de influxo de ' D-frutose como substrato para o método de acordo com uma configuração da presente invenção.
A Fig, 5 ilustra a estabilidade operacional de um reator de imobilização a uma temperatura de reação de 50ºC para o método de acordo com uma configuração da presente ps a
. 15/21 invenção.
Uma atividade relativa (%) significa uma atividade relativa à atividade no momento em que a operação é iniciada.
A Fig. 6 ilustra a conversão da % de D-glucose em D-psicose através da utilização da linhagem recombinante imobilizada expressando a psicose-epimerase e a isomerase-D- — glucoseimobilizada em condições combinadas de 100 g/L (6a), 300 g/L (6b) ou 500 g/L (6 c) de D-glucose, e 40ºC, 45 ºC ou 50ºC de temperatura de reação para o método de acordo com uma configuração da presente invenção.
A Fig. 7 ilustra a produtividade da D-psicose dependendo de uma taxa de influxo de D-glucose para o método de acordo com uma configuração da presente invenção.
Melhor Modo A seguir, a presente invenção é ilustrada em maiores detalhes pelos exemplos específicos que se seguem.
No entanto, estes exemplos se destinam a fins ilustrativos e não limitam o escopo da presente invenção.
Medição das atividades da psicose-epimerase e da D-glucose isomerase As atividades de uma psicose-epimerase e de uma isomerase D-glucose foram mensuradas utilizando D-frutose e D-glucose como um substrato, respectivamente.
As enzimas ou amostras contendo as mesmas foram adicionadas a 50 mM de PIPES (piperazina- N,N'-bis(ácido2-etanosulfônico)) buffer (pH 8.0) contendo 100 g/L, de substratos, seguidos pela reação à 50ºC por uma hora e a reação foi então interrompida através do aquecimento da reação a 100ºC por 5 minutos.
Concentrações de D-frutose, D-glucose e D-psicose foram mensuradas por HPLC equipado com um detector de R] (índice de refração). Foi realizada a análise por HPLC, injetando uma amostra na coluna Supelcogel Pb a 80ºC e, em seguida, passando água destilada como uma fase móvel através da coluna a uma taxa de 0,5 ml/min.
À D-psicose foi separada num tempo de retenção de cerca de 32 minutos, e sua % de conversão e produtividade foram calculadas com base na quantidade de D-psicose como padrão de |
. 16/21 referência. Para a análise comparativa das atividades enzimáticas, uma unidade de uma enzima foi definida como a quantidade da enzima para produzir 1 umole de D-psicose por minuto a um pH 8.0 e 50ºC. Exemplo 1: Linhagem recombinante expressando uma psicose-epimerase (1) Preparação de uma linhagem recombinante A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada para amplificar um gene codificando uma psicose-epimerase utilizando um DNA genômico da Agrobacterium tumefaciens ATCC 33970 como um modelo e oligonucleotídeos de SEQ ID NOs: 9 e 10 com sítios de reconhecimento de enzima de restrição introduzidos Pstl e Xbal, respectivamente, como primers. As condições do PCR foram as seguintes: após a desnaturação a 95ºC por 30 segundos, 26 ciclos de 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a 55ºC e | minuto a 68ºC, e então extensão a 68ºC por 10 minutos. Para a expressão de massa da psicose-epimerase codificada pelo gene amplificado, o produto do PCR amplificado foi digerido com as enzimas de restrição Pstl e Xbal e inserido num vetor shuttle pCJ-l derivado da bactéria Corynebacterivm sp (depositado no Centro Coreano de Cultura de Microorganismos (KCCM), uma instituição depositária internacional, em 6 de novembro de 2004, sob o número de depósito KCCM-10611), para construir um vector de expressão recombinante PpCJ-I-ATPE, A Fig. | mostra esquematicamente o método de preparação do vetor de expressão recombinante pCJ-1-ATPE incluindo o gene que codifica a psicose-epimerase derivado da Agrobacterium tumefaciens.
O vetor de expressão recombinante pCJ-I-ATPE foi introduzido numa Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 por transformação utilizando eletroperfuração para preparar a linhagem recombinante expressando o gene que codifica a psicose-epimerase derivada da Agrobacterium tumefaciens. A linhagem recombinante foi designada como —Corynebacterium glutamicum ATPE e depositada no Centro Coreano de Cultura de
- 17/21 Microorganismos (KCCM, Hongje-1-dong, Seodaemum-gu, Seoul, Coréia) sob o número KCCM 11046 em 26 de outubro de 2009 nos termos do Tratado de Budapeste. (2) Expressão de uma psicose-epimerase MB (Bacto-triptona 10 g/L, extrato de levedura Bacto 5 g/L, NaCl 5 g/L, Soytona 5 &L) incluindolOvg/ml de canamicina foram inoculados com as linhagens recombinantes obtidas acima (1), respectivamente, na concentração inicial de OD600 = 0.1, seguido de incubação a 30ºC por 24 horas para induzir a expressão de psicose-epimerase recombinante.
Um fermentador 5 L-jar contendo 3 L de um meio de modificação (D-glucose 80 g/L, Soytona 20 g/L, (NH4)2SO,s 10 g/LKH3;PO, 1,2 g/L, MgSOa 1,4 g/L) incluíndo 10 pg/ml de —canamicina foi inoculado com a cultura obtida acima a OD600 = 0.6, seguido de incubação a 30ºC durante 20 horas.
A fim de medir a atividade da psicose-epimerase expressa, a cultura foi centrifugada a 8000x g durante 10 minutos para as células colhidas.
As células colhidas foram em seguida resuspensas num buffer EPPS de SO mM (pH 8.0) (Sigma-Aldrich) e a suspensão resultante foi submetida a ultrasom resultando em lise celular.
O lisado celular foi submetido a centrifugação para obter um sobrenadante contendo a psicose-epimerase, e a reação de epimerization da D-frutose foi realizada utilizando o sobrenadante como uma enzima.
A mensuração da atividade de psicose-epimerase conforme descrito acima foi utilizada na reação de epimerização.
A Fig. 2b mostra os resultados da análise de HPLC da reação de epimerização. —Exemplo2: Imobilização de uma linhagem recombinante e preparação da D-psicose (1) Imobilização de uma linhagem recombinante Para a produção da D-psicose em escala industrial, a Corynebacterium glutamicum ATPE (KCCM 11046) expressando a psicose-epimerase derivada da Agrobacterium tumefaciens e preparada no exemplo acima 1 foi imobilizada no transportador neste exemplo. —Paraaimobilização da linhagem recombinante, o meio de modificação da Corynebacterium | utilizada no exemplo 1 foi primeiramente inoculado com a linhagem recombinante com uma concentração inicial de OD600 = 0.6 seguida pela incubação a 30ºC por 20 horas.
Após a conclusão da incubação, a cultura resultante foi submetida a centrifugação para recuperar as células, que foram resuspensas no buffer EPPS de 50 mM (pH 8.0) para 20%. As células —resuspensas da linhagem recombinante foram adicionadas em 2% (v/v) de uma solução aquosa de alginato de sódio.
A mistura resultante foi reduzida para uma solução de 100 mM CaCl, através da utilização de uma bomba de seringa e de uma bomba de vácuo para criar um complexo de alginato celular no qual as células foram retidas em grânulos de alginato de sódio. (2) Preparação da D-psicose utilizando a linahgem recombinante imobilizada Uma coluna packed-bed XK16 (16 mm X 20 mm, Amersham pharmacia) foi preenchida com a linhagem recombinante imobilizada em alginato de sódio acima (1) seguida da medição da % da conversão da D-frutose em D-psicose.
A fim de determinar uma temperatura ótima de reação de um reator de imobilização e uma concentração de substrato de D-frutose, a reação de conversão da D-frutose em D-psicose foi feita em condições combinadas de 40ºC, 45 ºC e 50ºC de temperaturas de reação, e 100 g/L, 300 g/L e 500 g/L de concentração de D-frutose.
De acordo com as Figs. 3a a 3C, verificou-se que a melhor conversão é obtida a uma temperatura de 50ºC e 100 g/L de concentração de D-frutose, e que 300 g/L e 500 g/L de concentração de D-frutose também promove uma alta conversão.
Além disso, diferentemente de outras reações de conversão da D-glucose, a reação de epimerização para a D-psicose mostrou baixa dependência na temperatura. (2 - 1) Produtividade em função de uma taxa de influxo de D-frutose A coluna packed-bed XK16 foi preenchida com a linhagem recombinante imobilizada conforme acima descrito através da medição da produtividade da D-psicose — dependendo de uma taxa de influxo de D-frutose.
Neste momento, com base nos resultados
. 19/21 acima (2), a concentração de D-frutose e a temperatura de reação foram fixados em 300 g/L e 50ºC, respectivamente. A produtividade foi medida pelo ajuste da taxa de influxo de D- frutose, um substrato com 0.4, 1, 2, 4 e 8 h" de velocidade espacial (1/h). Os resultados estão ilustrados na Tabela | abaixo e na Fig. 4. Tabelal. Produtividade e % de conversão dependendo de uma taxa de influxo de D- frutose Taxa de fluxo — | D-frutose (g/1) | D-psicose (g/1) | Produtividade — | Conversão (%)
EFEEF
EEE ss a Loo (2-2) Estabilidade operacional A operação foi realizada a 50 C utilizando as linhagens recombinantes imobilizadas — que foram preenchidas na coluna de preenchimento XK16 até que suas atividades específicas atingissem 50%, respectivamente, a fim de medir a estabilidade operacional das linhagens recombinantes imobilizadas que foram preenchidas na coluna, Neste momento, a concentração de substrato de D-frutose foi 300 g/L e sua taxa de influxo foi de 0,1 min/ml (velocidade espacial 0.4 h"). Verificou-se que 25 dias ou mais de estabilidade operacional — poderiam ser mantidos sob estas condições de reação. A Fig. 5 mostra a estabilidade operacional para uma linhagem recombinante imobi! izada a uma temperatura de reação de 50ºC.
- 20/21 Exemplo 3: Preparação da D-psicose a partir da D-glucose utilizando a linhagem/enzima recombinante imobilizada (1) Produtividade em função de uma temperatura de reação e uma concentração de D-glucose As colunas de preenchimento XK16 (16 mm X 20 mm, Amersham pharmacia) foram S — preenchidas com a linhagem recombinante imobilizada em alginato de sódio no exemplo 2 acim, e em 10 g da isomerase D-glucose imobilizada (Novozymes, Dinamarca), respectivamente, seguindo-se a medição da % de conversão da D-glucose em D-psicose.
À fim de determinar a condição de reação ideal para as duas enzimas misturadas, a reação de conversão da D-glucose em D-psicose foi conduzida sob condições combinadas de 40ºC, 45 ºCou50ºC de temperatura de reação e 100 g/L, 300 g/L ou 500 g/L de concentração de D- glucose.
À Fig. 6 mostra a conversão da % de D-glucose em D-psicose dependendo de mudanças na temperatura de reação e a concentração de substrato.
De acordo com as Figs. 6a a 6c, diferentemente da reação de epimerização para D-psicose, a reação de isomerização da D-glucose foi uma reação dependente da temperatura.
Ou seja, quanto maior a temperatura dereação mais rápida a taxa de conversão de D-glucose para D-psicose.
Verificou-se que isto teve efeito sobre a produtividade da D-psicose.
A melhor conversão da D-glucose para D- frutose foi alcançada a uma temperatura de 50ºC e não houve nenhuma diferença significativa na taxa de reação à medida que a concentração de substrato aumentava.
Estes resultados demonstram que é possível operar o reator de imobilização nas condições de uma maior — concentração de substrato e aumentar a produtividade da D-psicose a partir da D-glucose. (2) Produtividade em função de uma taxa de influxo de D-glucose As duas colunas preenchimento foram preenchidas com a linhagem recombinante imobilizada, incluindo uma psicose-epimerase e uma isomerase D-glucose imobilizada, | respectivamente, e a produtividade da D-psicose foi medida em função de uma taxa de | . 25 influxo de D-glucose.
Com base nos resultados dos exemplos acima, a concentração de D- |
' 21/21 glucose e a temperatura de reação foram fixadas em 300 g/L e 50ºC, respectivamente. À produtividade foi medida ajustando-se a taxa de influxo de D-frutose, um substrato com 0.4, 1,2,4e 8 h' de velocidade espacial (1/h). Os resultados estão ilustrados abaixo na tabela 2 e na Fig. 7. —Tabela2. Produtividade e % de conversão dependendo de uma taxa de influxo de D-glucose Taxa de fluxo —|D-glucose (g/1)| D-frutose (g/1) Produtividade — | Conversão (%)
EFE E Es o
A |

Claims (18)

' 1/2 REIVINDICAÇÕES
1. Um método de preparação da D-psicose a partir da D-frutose utilizando uma psicose- epimerase derivada da Agrobacierium fumefaciens, e expressa numa linhagem GRAS (geralmente reconhecida como segura) compreendendo as seguintes etapas: expressar a psicose-epimerase derivada da Agrobacterium tumefaciens na linhagem GRAS; e -preparar a D-psicose a partir da D-frutose utilizando a psicose-epimerase expressa.
2. O método de acordo com a reivindicação 1, onde a psicose-epimerase utilizada na preparação da D-psicose é contida numa cultura da linhagem GRAS ou separada da cultura.
3. O método de acordo com a reivindicação 1, onde a linhagem GRAS é Corynebacterium sp.
4, O método de acordo com a reivindicação 3, onde a linhagem GRAS é Corynebacterium glutamicum KCCM 11046.
5. O método de acordo com uma das reivindicações de 1 a 4, onde a psicose-epimerase derivada da Agrobacterium tumefaciens tem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO; |.
6. O método de acordo com uma das reivindicações de 1 a 4, onde a etapa de preparação da D-psicose compreende a etapa de imobilização da psicose-epimerase num transportador.
7. O método de acordo com a reivindicação 6, onde o transportador é o alginato de sódio.
8. O método de acordo com a reivindicação 6, onde o método compreende aínda as etapas de preenchimento de uma coluna com o transportador no qual a psicose-epimerase está imobilizada e abastecimento da coluna preenchida com uma solução D-frutose,
9. Um método de preparação da D-psicose a partir da D-glucose, compreendendo a etapa de imobilização de uma psicose-epimerase e de uma isomerase D-glucose nos transportadores.
| o
. 2/2
10. O método de acordo com a reivindicação 9, onde a psicose-epimerase está contida numa cultura de linhagem GRAS expressando uma psicose-epimerase derivada da Agrobacterium tumefaciens ou separada da cultura.
11. O método de acordo com a reivindicação 10, onde a linhagem GRAS é uma linhagem transformada com um vetor recombinante incluindo um gene que codifica uma psicose- epimerase.
12. O método de acordo com a reivindicação 10, onde a linhagem GRAS é à Corynebacterium Sp.
13. O método de acordo com a reivindicação 12, onde a linhagem GRAS é a Corynebacterium glutamicum KCCM 11046,
14, O método de acordo com uma das reivindicações de 10 a 13, onde a psicose-epimerase derivada da Agrobacterium tumefaciens tem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1.
15, O método de acordo com a reivindicação 9, onde o transportador é o alginato de sódio.
16. O método de acordo com uma das reivindicações de 9 a 13, onde o método compreende —aindaas etapas de preenchimento de uma coluna com os transportadores nos quais a psicose- epimerase e a isomerase D-glicose estão imobilizadas e abastecimento da coluna de preenchimento com uma solução de D-frutose.
17, O método de acordo com a reivindicação 16, onde cada um dos transportadores nos quais a psicose-epimerase e a isomerase D-glucose estão imobilizadas, respectivamente, é — preenchido numa coluna separada, e as duas colunas são conectadas entre si,
18. A linhagem de Corynebacterium glutamicum KCCM 11046 é útil na preparação da D- psicose a partir da D-frutose ou da D-glucose. a = Ar
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