ES2614891T3 - Inmovilización de psicosa-epimerasa y método para producir D-psicosa utilizando la misma - Google Patents

Inmovilización de psicosa-epimerasa y método para producir D-psicosa utilizando la misma Download PDF

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Abstract

Método para preparar D-psicosa a partir de D-fructosa mediante el uso de una psicosa-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens y expresada en una cepa GRAS (Generally Recognized as Safe - generalmente considerada inocua), siendo la cepa GRAS de Corynebacterium glutamicum KCCM 11046, que incluye los pasos de: expresar la psicosa-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens en una cepa GRAS; y preparar D-psicosa a partir de D-fructosa utilizando la psicosa-epimerasa expresada contenida en un cultivo de la cepa GRAS, inmovilizada sobre un soporte.

Description

DESCRIPCIÓN
Inmovilización de psicosa-epimerasa y método para producir D-psicosa utilizando la misma
Campo Técnico
La presente invención se refiere a un método para producir sucesivamente D-psicosa a partir de D-fructosa o 5 D-glucosa utilizando una psicosa-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens expresada en una forma segura para la alimentación.
Antecedentes Técnicos
La D-psicosa ha sido muy utilizada como edulcorante funcional, con un sabor dulce similar al del azúcar, pero que es un azúcar monosacárido de energía ultrabaja. En particular, la D-psicosa es conocida como "azúcar 10 rara", ya que es muy poco común en la naturaleza y, cuando se encuentra, sólo es en cantidades pequeñas.
La D-psicosa es un epímero de D-fructosa y la intensidad y tipo de dulzor son bastante similares a los de la D-fructosa. Sin embargo, al contrario que la D-fructosa, dado que la D-psicosa raramente se metaboliza cuando es absorbida en el cuerpo, prácticamente tiene cero calorías. Además, gracias a su acción de mitigación de la obesidad abdominal mediante la supresión de actividades enzimáticas relativas con la 15 síntesis de lípidos, la D-psicosa puede emplearse como ingrediente efectivo en los alimentos de dieta. Por otro lado, mientras que los alcoholes de azúcar, muy utilizados como sucedáneos del azúcar, tienen el problema de provocar efectos secundarios, tales como diarrea, cuando se toman en cantidades excesivas, la D-psicosa prácticamente no tiene efectos secundarios (Matsue, T., Y. Baba, M. Hashiguchi, K. Takeshita, K. Izumori y H. Suzuki. 2001. Dietary D-psicose, a C-3 epimer of D-fructose, suppresses the activity of hepatic 20 lipogenic enzymes in rats. Asia Pac. J. Clin. Nutr. 10:233-237.; Matsuo, T., and K. Izumori. 2004. D-psicose, a rare sugar that provides no energy and additionally beneficial effects for clinical nutrition. Asia Pac. J. Clin. Nutr. 13:5127).
Por estas razones, la D-psicosa se está convirtiendo en el centro de atención del sector de la industria alimentaria como edulcorante para dieta y, en consecuencia, existe una necesidad creciente de desarrollar un 25 método para producir D-psicosa de forma eficaz.
Los métodos convencionales para producir D-psicosa mediante el uso de una psicosa-epimerasa se han centrado en el desarrollo de un proceso de epimerización de D-psicosa a partir de D-fructosa empleando una enzima recombinante expresada masivamente en una E. coli recombinante o una célula huésped que la contiene. Sin embargo, la producción biotecnológica de C-psicosa utilizando dicha E. coli recombinante es 30 inadecuada para la obtención de D-psicosa como material alimentario en términos de seguridad alimentaria. Para producir D-psicosa adecuada para su uso como material alimentario es necesario desarrollar un método de producción en masa utilizando una psicosa-epimerasa expresada en una célula huésped perteneciente a una cepa GRAS (Generally Recognized as Safe - generalmente considerada inocua) y una cepa que permita una producción industrial en masa, o utilizando un huésped que incluya la misma. 35
La calificación GRAS se otorga a sustancias generalmente consideradas inocuas cuando expertos cualificados por una formación y una experiencia científicas evalúan su seguridad mediante procedimientos científicos bajo las condiciones de su uso previsto. La calificación GRAS es un sistema único aplicado exclusivamente en EEUU, pero su importancia y necesidad han sido reconocidas internacionalmente al igual que en EEUU. Por ello, se está prestando atención al desarrollo de la calificación GRAS. 40
Además, para la producción industrial de D-psicosa es necesario desarrollar un método para producir D-psicosa a partir de un sustrato menos costoso. Actualmente, debido a la alta especificidad de sustrato de la psicosa-epimerasa, como sustrato para la producción de D-psicosa únicamente se utiliza la costosa D-fructosa.
La US 2008/124770 A1 describe una arabinosa isomerasa termófila y un método para producir tagatosa 45 utilizando la misma. En concreto, se refiere a un gen codificador de arabinosa isomerasa procedente de la Thermotoga neapolitana termófila DSM 5068, un vector de expresión recombinante que contiene el gen, a un método para preparar una arabinosa isomerasa termófila de uso alimentario a partir de la cepa GRAS recombinante transformada con dicho vector de expresión, y a un método para preparar tagatosa a partir de galactosa utilizando dicha enzima. 50
Además se conoce un método para utilizar L-arabinosa isomerasa derivada de Geobacillus stearothermophilus (GSAI) y expresada en un huésped GRAS de Bacillus subtilis para la producción de
tagatosa comestible. (Cheon Jina y col., "Characterization of L-Arabinose Isomerase in Bacillus subtilis, a GRAS Host, for the Production of Edible Tagatose").
Kim, H.-J. y col., "Characterization of an Agrobacterium tumefaciens D-Psicose 3-Epimerase That Converts D- Fructose to D-Psicose", Appl. Environ. Microbiol. (2006), Vol. 72, Nº 2, pp. 981-985, describen un gen no caracterizado previamente propuesto como el gen de D-tagatosa 3-epimerasa de Agrobacterium tumefaciens. 5 Este gen fue clonado y expresado en Escherichia coli. La enzima expresada produce D-psicosa a partir de D-fructosa.
La US 2005/0250937 A9 se refiere a la producción de lisina y proporciona varias moléculas de polinucleótido aisladas útiles para la producción de L-lisina. También se refiere a métodos para producir y utilizar los polinucleótidos y métodos para aumentar la producción de L-lisina. La L-lisina se puede obtener por 10 fermentación a escala industrial utilizando los polinucleótidos y métodos para aumentar la producción de L-lisina. La L-lisina se puede obtener por fermentación a escala industrial utilizando Corynebacterium glutamicum Gram positiva, Brevibacterium flavum y Brevibacterium lactofermentum.
De la EP 1 357 182 A1 se conoce un proceso para producir UDP-N-acetilgalactosamina y un carbohidrato que contiene N-acetilgalactosamina. Algunos carbohidratos que contienen N-acetilgalactosamina son 15 expresados específicamente en células cancerosas, etc. y, por tanto, son útiles como vacunas contra el cáncer, etc. para el tratamiento contra el cáncer.
Descripción
Problema Técnico
La presente invención se ha estudiado activamente para producir D-psicosa en masa, que puede utilizarse 20 como un material alimentario, y se ha comprobado que es posible una producción sucesiva de D-psicosa a partir de D-fructosa o D-glucosa empleando una inmovilización con el fin de proporcionar un entorno estable para la activación enzimática, con el fin de producir en masa de D-psicosa, y utilizando una D-glucosa isomerasa junto con una psicosa-epimerasa.
Un objeto de la presente invención es proporcionar una psicosa-epimerasa en una forma segura para la 25 alimentación para la preparación de D-psicosa, que puede ser utilizada como material alimentario.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para producir sucesivamente D-psicosa a partir de D-glucosa o D-fructosa mediante el uso de una psicosa-epimerasa y una D-glucosa isomerasa en una forma inmovilizada segura para la alimentación.
Solución Técnica 30
La presente invención proporciona un método para preparar D-psicosa a partir de D-fructosa mediante el uso de una psicosa-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens que es expresada en una cepa GRAS.
El método de la presente invención incluye los pasos de: expresar una psicosa-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens en una cepa GRAS; y preparar D-psicosa a partir de D-fructosa utilizando la psicosa-epimerasa expresada contenida en un cultivo de la cepa GRAS inmovilizada sobre un soporte. 35
La cepa GRAS que expresa una psicosa-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens puede ser una cepa transformada con un vector de expresión recombinante que incluye un gen codificador de la enzima arriba mencionada.
La psicosa-epimerasa utilizada en la preparación de D-psicosa de acuerdo con la presente invención puede estar en una forma contenida en un cultivo de la cepa GRAS, inmovilizada sobre un soporte que expresa la 40 psicosa-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens o aislada del cultivo. La cepa GRAS puede ser una cepa transformada con un vector de expresión recombinante que incluye un gen codificador de una psicosa-epimerasa. La cepa GRAS puede ser de Corynebacterium sp., preferentemente de Corynebacterium glutamicum KCCM 11046.
Preferentemente, la psicosa-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens utilizada en el método de la 45 presente invención tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1.
El método para preparar D-psicosa de acuerdo con la presente invención puede comprender además el paso de inmovilizar la cepa GRAS que expresa la psicosa-epimerasa sobre un soporte. El soporte adecuado para la presente invención puede incluir alginato, preferentemente alginato de sodio, pero no está limitado a éste.
El método para preparar D-psicosa de acuerdo con la presente invención puede comprender además los pasos de empaquetar una columna con el soporte sobre el que está inmovilizada la psicosa-epimerasa y suministrar una solución de D-fructosa a la columna de lecho fijo.
Además, la presente invención proporciona adicionalmente un método para preparar D-psicosa a partir de D-glucosa, que incluye el paso de inmovilizar una psicosa-epimerasa y una D-glucosa isomerasa sobre 5 soportes. El soporte adecuado para la presente invención puede incluir alginato, preferentemente alginato de sodio, pero no está limitado a éste.
En el método arriba descrito, la psicosa-epimerasa puede estar contenida en un cultivo de la cepa GRAS, inmovilizada sobre un soporte que puede expresar psicosa-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens o aislada del cultivo. La cepa GRAS puede ser una cepa transformada con un vector de 10 expresión recombinante que incluye un gen codificador de psicosa-epimerasa. Además, la cepa GRAS puede ser de Corynebacterium sp., preferentemente de Corynebacterium glutamicum KCCM 11046.
Preferentemente, la psicosa-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens utilizada en el método de la presente invención tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1.
Además, la presente invención proporciona también un método para preparar D-psicosa a partir de D-glucosa 15 que comprende los pasos de: inmovilizar una psicosa-epimerasa y una D-glucosa isomerasa sobre soportes; empaquetar una columna con los soportes sobre los que están inmovilizadas la cepa GRAS que expresa la psicosa-epimerasa y la D-glucosa isomerasa; y suministrar una solución de D-glucosa a la columna de lecho fijo. Los soportes sobre los que están inmovilizadas la psicosa-epimerasa y la D-glucosa isomerasa se pueden empaquetar en la misma columna o se pueden empaquetar respectivamente en dos columnas 20 separadas. No obstante, es preferible que el soporte esté empaquetado en una columna independiente y, en este caso, las dos columnas independientes están conectadas entre sí.
La presente invención proporciona una cepa de Corynebacterium glutamicum KCCM 11046 útil para la preparación de D-psicosa a partir de D-fructosa o D-glucosa.
Tal como se utiliza aquí, el concepto "forma segura para la alimentación" significa que es suficientemente 25 segura para ser utilizada como material alimentario. Por tanto, el concepto "expresado en una forma segura para la alimentación" significa que un gen diana ha sido expresado en una cepa considerada como segura y no causante de efectos nocivos aunque sea utilizada como material alimentario, por ejemplo una cepa GRAS.
En una realización de la presente invención, un método para transformar la cepa GRAS con un vector recombinante puede incluir una electroperforación, pero la invención no está limitada a este método y se 30 puede llevar a cabo empleando cualquier método de transformación conocido por los especialistas en la técnica a la que pertenece la presente invención.
En una realización de la presente invención, el vector recombinante que incluye el gen codificador de la psicosa-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens puede incluir el gen codificador de psicosa-epimerasa unido funcionalmente con un promotor que es activo en bacterias Corynebacterium sp. El 35 promotor puede presentar una de las secuencias de SEQ ID Nº: 2 a 8, que de forma confirmada expresan un gen diana más eficientemente que un promotor tac en bacterias Corynebacterium sp. (Publicación de Patente Coreana Nº 2006-0068505).
El término "psicosa-epimerasa", tal como se utiliza aquí, significa una D-psicosa-3-epimerasa que presenta una actividad de conversión de D-fructosa a D-psicosa. 40
En una realización de la presente invención, la psicosa-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1 o consistir en fragmentos funcionales de ésta. Un fragmento funcional significa un fragmento que incluye mutaciones por sustitución, inserción, deleción o similares de algunos aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1, y que presenta una actividad de conversión de D-fructosa a D-psicosa. 45
En una realización de la presente invención, la cepa GRAS puede ser una cepa de Corynebacterium sp.
La cepa de Corynebacterium sp. es un microorganismo industrial que produce sustancias químicas de diversos usos en el campo de los piensos, la medicina y la alimentación, etc., incluyendo L-lisina, L-treonina y diversos ácidos nucleicos. Dicha cepa de Corynebacterium sp. es una cepa GRAS (Generally Recognized as Safe - generalmente considerada inocua) y tiene la propiedad de ser fácil de manipular genéticamente y de 50 cultivar en masa. Además, la cepa de Corynebacterium sp. tiene una alta estabilidad bajo diversas condiciones de proceso, tiene una estructura de pared celular relativamente rígida en comparación con otras
bacterias, con lo que tiene la propiedad biológica de existir en una masa celular en un estado estable incluso bajo una alta presión osmótica por una alta concentración de azúcar, etc.
En una realización de la presente invención, la cepa de Corynebacterium sp. puede ser Corynebacterium glutamicum.
En una realización de la presente invención, la cepa GRAS que expresa la psicosa-epimerasa derivada de 5 Agrobacterium tumefaciens puede ser una cepa recombinante de Corynebacterium glutamicum KCCM 11046.
La psicosa-epimerasa se puede modificar fácilmente mediante una mutagénesis conocida convencionalmente por los especialistas, como evolución dirigida y mutagénesis dirigida, etc. Por tanto, se debe considerar que las enzimas recombinantes que tienen una homología de secuencia de una magnitud determinada, como una 10 homología de secuencia de un 70% o más, preferentemente un 80% o más, de forma especialmente preferente un 90% o más, con respecto a la secuencia de aminoácidos de la psicosa-epimerasa representada por la SEQ ID Nº: 1 y que son expresadas como una forma activa en la cepa GRAS, y una célula huésped que incluye las mismas, están dentro del alcance de la presente invención.
El cultivo de la cepa GRAS que expresa la psicosa-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens se 15 puede obtener cultivando las bacterias transformadas en un medio y bajo condiciones de cultivo fácilmente seleccionadas por los especialistas en la técnica a la que pertenece la presente invención, en función de las propiedades de la cepa. El método de cultivo puede incluir cualquier método de cultivo conocido por los especialistas, como cultivo por lotes, continuo o por lotes alimentados, pero no está limitado a éstos.
El método para preparar D-psicosa de acuerdo con una realización de la presente invención puede incluir el 20 paso de separar la psicosa-epimerasa del cultivo de la cepa GRAS que expresa la psicosa-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens.
En una realización de la presente invención, las células separadas del cultivo de la cepa que expresa la psicosa-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens por centrifugación, filtración etc.; o el sobrenadante obtenido por homogeneización y centrifugación de las células separadas; o la psicosa-25 epimerasa separada y purificada del sobrenadante por fraccionamiento, cromatografía, etc. pueden emplearse como una enzima para convertir D-fructosa en D-psicosa.
En una realización de la presente invención, la psicosa-epimerasa puede estar en forma de la masa celular en el cultivo o de la psicosa-epimerasa separada de la masa celular.
En una realización de la presente invención, el paso de preparación de D-psicosa puede comprender 30 adicionalmente el paso de inmovilizar la psicosa-epimerasa, o la masa celular que la expresa, sobre un soporte.
Dado que en caso de inmovilización de la enzima o la masa celular sobre un soporte se puede proporcionar un entorno para mantener la actividad durante mucho tiempo, la inmovilización ha sido utilizada en el método de producción industrial utilizando una enzima o un microorganismo. El soporte que puede ser utilizado para 35 la inmovilización puede incluir alginatos tales como alginato de sodio, pero no está limitado a éstos.
En una realización de la presente invención, la inmovilización se puede llevar a cabo utilizando alginato de sodio como soporte. El alginato de sodio es un polisacárido coloidal natural que está presente abundantemente en la pared celular de algas, que consiste en ácido -D-manurónico y ácido -L-gulurónico, y que está formado por enlaces -1,4 aleatorios en contenido y, por tanto, resulta ventajoso que la masa 40 celular o las enzimas se puedan inmovilizar de forma estable sobre el mismo.
En una realización de la presente invención, la inmovilización se puede llevar a cabo utilizando entre un 1,5% y un 4,0% de alginato de sodio como soporte.
En una realización de la presente invención, la inmovilización se puede llevar a cabo utilizando un 2% de alginato de sodio como soporte. 45
En una realización de la presente invención, empleando alginato de sodio como soporte para la inmovilización, la inmovilización se puede llevar a cabo añadiendo un volumen entre igual y doble de una solución acuosa de alginato de sodio a una muestra que contiene la enzima o la masa celular, añadiendo gota a gota la mezcla resultante a una solución 0,1M de iones calcio para crear la enzima o el complejo de masa celular-alginato en perlas utilizando una bomba de jeringa y una bomba de vacío. 50
En una realización de la presente invención, el paso de inmovilizar la psicosa-epimerasa sobre el soporte puede comprender además los pasos de empaquetar una columna con la enzima inmovilizada y suministrar una solución de D-fructosa a la columna empaquetada.
La columna a empaquetar con el soporte sobre el que está inmovilizada la enzima o la masa celular y el método de empaquetamiento de la columna con el mismo pueden seleccionarse adecuada y fácilmente por 5 los especialistas en la técnica a la que pertenece la presente invención, en función de la enzima o la masa celular, o del soporte de inmovilización utilizado.
En una realización de la presente invención es posible preparar una columna de lecho fijo empaquetando la columna con la enzima inmovilizada. La reacción enzimática, es decir, la conversión de D-fructosa en D-psicosa, se puede llevar a cabo suministrando a la columna de lecho fijo una solución de D-fructosa que es 10 un sustrato de la misma.
En una realización de la presente invención, cuando a la columna de lecho fijo que está empaquetada con la masa celular que incluye la psicosa-epimerasa se le suministra la solución de D-fructosa en una concentración constante, la masa celular inmovilizada continúa la reacción de epimerización, lo que conduce a la conversión de D-fructosa en D-psicosa. La D-psicosa convertida se somete a separación y purificación 15 utilizando columnas de separación, y después está disponible como D-psicosa pura.
El concepto "reactor de inmovilización" tal como se utiliza aquí significa un reactor en el que la reacción para la producción de D-psicosa tiene lugar mediante la masa celular o la enzima inmovilizada sobre el soporte, o la columna empaquetada con la masa celular o la enzima inmovilizada sobre el soporte. en concreto, la inmovilización significa que una sustancia que proporciona actividades biológicas, en este caso una psicosa-20 epimerasa o una D-glucosa epimerasa o una masa celular que la incluye, se inmoviliza sobre el soporte.
El término "estabilidad operativa" tal como se utiliza aquí significa que un reactor biológico para la producción sucesiva de un producto diana tal como D-psicosa puede funcionar manteniendo un nivel adecuado de productividad en comparación con la actividad inicial del mismo, y generalmente está representado por un período de operación. 25
En una realización de la presente invención, a la columna empaquetada con el soporte sobre el que están inmovilizadas las células que expresan la psicosa-epimerasa se le suministran 300 g/l de D-fructosa con un caudal de entrada de 0,1 ml/min a 50ºC, lo que permite garantizar 25 días o más de estabilidad operativa.
La presente invención también proporciona un método para preparar D-psicosa a partir de D-glucosa, que incluye el paso de inmovilizar una psicosa-epimerasa y una D-glucosa isomerasa sobre soportes. 30
Tal como se describe más arriba, dado que la D-fructosa utilizada como sustrato para la psicosa-epimerasa es cara, es necesario producir D-psicosa a partir de un sustrato barato como D-glucosa para la producción industrial en masa de D-psicosa. La D-glucosa isomerasa es una enzima para convertir D-glucosa en D-fructosa. Por ello es posible producir D-psicosa a partir de D-glucosa utilizando estas dos enzimas.
En una realización de la presente invención, la psicosa-epimerasa puede ser el cultivo de la cepa GRAS, 35 inmovilizada sobre un soporte, que expresa la psicosa-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens, o la masa celular o la psicosa-epimerasa separada del cultivo.
En una realización de la presente invención, la D-glucosa isomerasa puede ser el cultivo de la cepa GRAS que expresa la D-glucosa isomerasa, o la masa celular o la D-glucosa isomerasa separada del cultivo.
En una realización de la presente invención, la psicosa-epimerasa puede tener la secuencia de aminoácidos 40 de SEQ ID Nº: 1.
En una realización de la presente invención, la D-glucosa isomerasa puede ser comercial. Por ejemplo, se puede utilizar la D-glucosa isomerasa o la D-glucosa isomerasa inmovilizada comercial de Novozymes A/S (Bagsvaerd, Dinamarca).
La D-glucosa isomerasa es una enzima representativa para convertir D-glucosa en D-fructosa y actualmente 45 se utiliza para producir fructooligosacáridos. Ente las enzimas actualmente utilizadas para la producción industrial, la D-glucosa isomerasa es una de las enzimas cuyas actividades y mecanismos han sido claramente identificados.
En una realización de la presente invención, la cepa GRAS puede ser una cepa transformada con un vector recombinante que incluye un gen codificador de la psicosa-epimerasa y un gen codificador de la D-glucosa 50
isomerasa o una cepa cotransformada con vectores recombinantes que incluyen cada uno de los genes arriba descritos.
En una realización de la presente invención, la cepa GRAS puede ser la bacteria Corynebacterium sp.
En una realización de la presente invención, la cepa GRAS que expresa la psicosa-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens puede ser la cepa recombinante Corynebacterium glutamicum KCCM 11046. 5
En una realización de la presente invención, el soporte para la inmovilización puede ser alginato de sodio.
En una realización de la presente invención, la inmovilización se puede llevar a cabo utilizando entre un 1,5% y un 4,0% de alginato de sodio como soporte.
En una realización de la presente invención, la inmovilización se puede llevar a cabo utilizando un 2% de alginato de sodio como soporte. 10
En una realización de la presente invención, mediante el uso de alginato de sodio como soporte para la inmovilización, la inmovilización se puede llevar a cabo añadiendo un volumen entre igual y doble de la solución acuosa de alginato de sodio a la muestra que contiene la enzima o la masa celular, añadiendo gota a gota la mezcla resultante a una solución 0,1M de iones calcio para crear la enzima o el complejo de masa celular-alginato en perlas utilizando la bomba de jeringa y la bomba de vacío. 15
En una realización de la presente invención, el gen codificador de la psicosa-epimerasa y el gen codificador de la D-glucosa isomerasa se pueden expresar en la misma cepa GRAS o en dos cepas GRAS diferentes, respectivamente, y el paso de inmovilización se puede llevar a cabo inmovilizando las células de las cepas GRAS cultivadas o una mezcla de dos enzimas separadas de las células sobre los soportes.
En una realización de la presente invención, el cultivo de la cepa GRAS que expresa la psicosa-epimerasa o 20 la masa celular de la psicosa-epimerasa separada del cultivo y la D-glucosa isomerasa se pueden inmovilizar sobre soportes, respectivamente.
En una realización de la presente invención, el método de la presente invención puede incluir además el paso de empaquetar la columna con el suporte sobre el que están inmovilizadas las células o las enzimas.
El método para preparar D-psicosa a partir de D-glucosa de acuerdo con la presente invención puede incluir 25 además los pasos de empaquetar la columna con la psicosa-epimerasa y la D-glucosa isomerasa inmovilizadas y suministrar la solución de D-glucosa a la columna empaquetada.
En una realización de la presente invención, la columna de lecho fijo se puede preparar empaquetando la columna con las enzimas inmovilizadas. La reacción enzimática, es decir, la conversión de D-glucosa en D-psicosa se puede llevar a cabo suministrando a la columna de lecho fijo la solución de D-glucosa que es un 30 sustrato de la misma.
En una realización de la presente invención, la psicosa-epimerasa y la D-glucosa isomerasa inmovilizadas se pueden empaquetar en columnas independientes respectivas.
La columna a empaquetar con el soporte sobre el que están inmovilizadas las enzimas o las células y el método de empaquetamiento de la columna con el mismo pueden seleccionarse adecuada y fácilmente por 35 los especialistas en la técnica a la que pertenece la presente invención, en función de las enzimas o la masa celular o del soporte de inmovilización utilizado. En una realización de la presente invención es posible empaquetar dos columnas independientes con el soporte inmovilizado con psicosa-epimerasa y el soporte inmovilizado con D-glucosa isomerasa, respectivamente, conectar estas dos columnas poniéndolas en comunicación entre sí para transferir D-fructosa como un producto de isomerización desde la columna 40 empaquetada con la D-glucosa isomerasa a la columna empaquetada con la psicosa-epimerasa, e inducir la reacción de conversión de la D-fructosa en D-psicosa. Cuando la solución de D-glucosa como sustrato se suministra al reactor de inmovilización consistente en dichas dos columnas comunicadas, la D-glucosa se convierte en D-fructosa en la columna empaquetada con la D-glucosa isomerasa, y la D-fructosa transferida a la columna empaquetada con la psicosa-epimerasa se convierte en D-psicosa. Por tanto, es posible obtener 45 D-psicosa como producto final a partir de D-glucosa.
Efectos Ventajosos
El método para preparar D-psicosa de acuerdo con la presente invención permite producir de forma masiva y con éxito D-psicosa en una forma segura para la alimentación, que puede ser utilizada como material alimentario, a partir de D-glucosa o D-fructosa. 50
Breve Descripción de las Figuras
Fig. 1: ilustra esquemáticamente un proceso para construir un vector de expresión recombinante pCJ-1-ATPE que incluye un gen codificador de una psicosa-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens.
Fig. 2: ilustra los resultados de la medida de la actividad de la psicosa-epimerasa derivada de 5 Agrobacterium tumefaciens por HPLC para el método de acuerdo con una realización de la presente invención, mostrando la Fig. 2a un patrón de referencia para cada azúcar y la Fig. 2b la conversión mediante una o más reacciones.
Fig. 3: ilustra el porcentaje de conversión de D-fructosa en D-psicosa utilizando la cepa recombinante para el método de acuerdo con una realización de la presente invención bajo condiciones 10 combinadas de 100 g/l (3a), 300 g/l (3b) o 500 g/l (3c) de D-fructosa, y 40ºC, 45ºC o 50ºC de temperatura de reacción.
Fig. 4: ilustra la productividad de D-psicosa dependiendo del caudal de entrada de D-fructosa como sustrato para el método de acuerdo con una realización de la presente invención.
Fig. 5: ilustra la estabilidad operativa de un reactor de inmovilización a una temperatura de reacción de 15 50ºC para el método de acuerdo con una realización de la presente invención. Una actividad relativa (%) significa una actividad relativa a la actividad en el momento en el que se inicia la operación.
Fig. 6: ilustra el porcentaje de conversión de D-glucosa en D-psicosa utilizando la cepa recombinante inmovilizada que expresa la psicosa-epimerasa y la D-glucosa isomerasa inmovilizada bajo 20 condiciones combinadas de 100 g/l (6a), 300 g/l (6b) o 500 g/l (6c) de D-glucosa, y 40ºC, 45ºC o 50ºC de temperatura de reacción para el método de acuerdo con una realización de la presente invención.
Fig. 7: ilustra la productividad de D-psicosa dependiendo del caudal de entrada de D-glucosa para el método de acuerdo con una realización de la presente invención. 25
Mejor forma de realización
La presente invención se ilustra más detalladamente a continuación mediante los siguientes ejemplos específicos. No obstante, dichos ejemplos son ilustrativos y el alcance de la invención no está limitado por los mismos.
Medida de las actividades de psicosa-epimerasa y D-glucosa isomerasa 30
Las actividades de una psicosa-epimerasa y una D-glucosa isomerasa se midieron utilizando D-fructosa y D-glucosa como sustrato, respectivamente. Las enzimas o muestras que las contienen se añadieron a un tampón 50 mM de PIPES (ácido piperazin-N,N'-bis(2-etanosulfónico)) (pH 8,0) que contenía 100 g/l de los sustratos. Después tuvo lugar la reacción a 50ºC durante una hora y la reacción se interrumpió calentando a 100ºC durante 5 minutos. Las concentraciones de D-fructosa, D-glucosa y D-psicosa se midieron por HPLC 35 equipada con un detector de RI (Refractive Index - Índice de Refracción). El análisis por HPLC se llevó a cabo inyectando una muestra en una columna Supelcogel Pb a 80ºC y pasando después agua destilada como fase móvil a través de la columna, a un caudal de 0,5 ml/min. La D-psicosa se separó en un tiempo de retención de aproximadamente 32 minutos y su porcentaje de conversión y productividad se calcularon en base a la cantidad cuantitativa de un patrón de referencia de D-psicosa. Para el análisis comparativo de actividades 40 enzimáticas, una unidad de una enzima se definió como la cantidad de la enzima para producir un µmol de D-psicosa a pH 8,0 y 50ºC.
Ejemplo 1: Cepa recombinante que expresa una psicosa-epimerasa
(1) Preparación de una cepa recombinante
Se llevó a cabo una reacción en cadena de la polimerasa (PCR - polymerase chain reaction) para amplificar 45 un gen codificador de una psicosa-epimerasa utilizando un ADN genómico de Agrobacterium tumefaciens ATCC 33970 como plantilla y oligonucleótidos de las SEQ ID Nº: 9 y 10 con sitios de reconocimiento de enzima de restricción PstI y XbaI, respectivamente, como cebadores. Las condiciones de PCR fueron las siguientes: después de desnaturalización a 95ºC durante 30 segundos, 26 ciclos de 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a 55ºC y 1 minuto a 68ºC, después extensión a 68ºC durante 10 minutos. Para la expresión en 50 masa de la psicosa-epimerasa codificada por el gen amplificado, el producto de PCR amplificado se digirió con las enzimas de restricción PstI y XbaI, y se insertó en un vector transportador pCJ-1 derivado de bacterias Corynebacterium sp. (depositado en el Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM), una institución depositaria internacional, el 6 de noviembre de 2004, bajo el número de depósito KCCM-10611), para construir un vector de expresión recombinante pCJ-1-ATPE. La Fig. 1 muestra esquemáticamente el 55
método para preparar el vector de expresión recombinante pCJ-1-ATPE que incluye el gen codificador de la psicosa-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens.
El vector de expresión recombinante pCJ-1-ATPE se introdujo en Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 mediante transformación utilizando electroperforación, para preparar la cepa recombinante que expresa el gen codificador de la psicosa-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens. La cepa recombinante se 5 designó Corynebacterium glutamicum ATPE y se depositó en el Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM, Hongje-1-dong, Seodae-mum-gu, Seúl, Corea) bajo el número de depósito KCCM 11046 el 26 de octubre de 2009, bajo el Tratado de Budapest.
(2) Expresión de una psicosa-epimerasa
En un medio MB (Bacto-trypton 10 g/l, Bacto-yeast extract 5 g/l, NaCl 5 g/l, Soytone 5 g/l) que incluía 10 10 µg/ml de kanamicina se inocularon las cepas recombinantes obtenidas en el punto (1) más arriba, respectivamente, en una concentración inicial de OD600 = 0,1, seguida por incubación a 30ºC durante 24 horas para inducir la expresión de la recombinación de psicosa-epimerasa. En un fermentador con recipiente de 5 litros que contenía 3 litros de un medio de modificación (80 g/l de D-glucosa, 20 g/l de soytone, 10 g/l de (NN4)2SO4, 1,2 g/l de KH2PO4, 1,4 g/l de MgSO4), incluyendo 10 mg/ml de kanamicina, se inoculó el cultivo 15 arriba obtenido a OD600 = 0,6, seguido por una incubación a 30ºC durante 20 horas. Con el fin de medir la actividad de la psicosa-epimerasa expresada, el cultivo se sometió a centrifugación a 8000xg durante 10 minutos para cosechar células. Después, las células cosechadas se resuspendieron en un tampón EPPS 50 mM (pH 8,0) (Sigma-Aldrich) y la suspensión resultante se sometió a ultrasonicación, lo que condujo a la lisis de las células. El lisado celular se sometió a centrifugación para obtener un sobrenadante que contenía la 20 psicosa-epimerasa, y se llevó a cabo una reacción de epimerización de D-fructosa utilizando el sobrenadante como enzima. En la reacción de epimerización se utilizó la medición de la actividad de la psicosa-epimerasa tal como se describe más arriba. La Fig. 2b muestra los resultados del análisis por HPLC de la reacción de epimerización.
Ejemplo 2: Inmovilización de una cepa recombinante y preparación de D-psicosa 25
(1) Inmovilización de una cepa recombinante
Para la producción en masa de D-psicosa, en este ejemplo se inmovilizó sobre el soporte una Corynebacterium glutamicum ATPE (KCCM 11046) que expresa la psicosa-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens y preparada en el Ejemplo 1 mostrado más arriba. Para la inmovilización de la cepa recombinante, en primer lugar el medio de modificación para Corynebacterium utilizado en el Ejemplo 1 30 se inoculó en la cepa recombinante en una concentración inicial de OD600 = 0,6 y después se llevó a cabo la incubación a 30ºC durante 20 horas. Una vez completa la incubación, el cultivo resultante se sometió a centrifugación para recuperar las células, que se resuspendieron en el tampón EPPS 50 mM (pH 8,0) hasta un 20%. Las células resuspendidas de la cepa recombinante se añadieron a un 2% (v/v) de una solución acuosa de alginato de sodio. La mezcla resultante se añadió gota a gota a una solución de CaCl2 100 mM 35 utilizando la bomba de jeringa y la bomba de vacío para crear un complejo de células-alginato en el que las células estaban atrapadas en perlas de alginato de sodio.
(2) Preparación de D-psicosa utilizando la cepa recombinante inmovilizada
Una columna de lecho fijo XK16 (16 mm X 20 mm, Amersham pharmacia) se empaquetó con la cepa recombinante inmovilizada sobre alginato de sodio obtenida en el anterior punto (1) y después se midió el 40 porcentaje de conversión de D-fructosa en D-psicosa. Con el fin de determinar una temperatura de reacción óptima de un reactor de inmovilización y una concentración de sustrato de D-fructosa, la reacción de conversión de D-fructosa en D-psicosa se llevó a cabo bajo condiciones combinadas de 40ºC, 45ºC y 50ºC de temperatura de reacción y 100 g/l, 300 g/l y 500 g/l de concentración de D-fructosa. De acuerdo con las Fig. 3a a 3c se comprobó que la mejor conversión se logra a una temperatura de 50ºC y con una 45 concentración de D-fructosa de 100 g/l, y las concentraciones de D-fructosa de 300 g/l y 500 g/l también produjeron una alta conversión. Además, a diferencia de otras reacciones de conversión de D-glucosa, la reacción de epimerización de D-psicosa presentaba una baja dependencia de la temperatura.
(2-1) Productividad en función del caudal de entrada de D-fructosa
La columna de lecho fijo XK16 se empaquetó con la cepa recombinante inmovilizada tal como se describe 50 más arriba y después se midió la productividad de D-psicosa en función del caudal de entrada de D-fructosa. En base a los resultados del anterior punto (2), la concentración de D-fructosa y la temperatura de reacción se ajustaron a 300 g/l y 50ºC, respectivamente. La productividad se midió ajustando el caudal de entrada de D-fructosa, siendo un sustrato de 0,4, 1, 2, 4 y 8 h-1 de velocidad espacial (1/h). Los resultados se muestran más abajo en la Tabla 1 y en la Fig. 4. 55
Tabla 1. Productividad y porcentaje de conversión en función del caudal de entrada de D-fructosa
Caudal de entrada (ml/min)
D-fructosa (g/l) D-psicosa (g/l) Productividad (g/l/h) Conversión (%)
3
281,388 3,693 33 1,30
2
289,215 3,309 20 1,13
1
291,268 7,579 23 2,54
0,5
284,639 12,055 18 4,06
0,25
286,463 20,579 15 6,70
0,1
260,096 38,041 11 12,76
(2-2) Estabilidad operativa
La operación se llevó a cabo a 50ºC utilizando las cepas recombinantes inmovilizadas, que se empaquetaron en la columna de lecho fijo XK16 hasta que las actividades específicas de las mismas llegaron al 50%, 5 respectivamente, con el fin de medir la estabilidad operativa de las cepas recombinantes inmovilizadas empaquetadas en la columna. La concentración de sustrato de D-fructosa era de 300 g/l y su caudal de entrada era de 0,1 min/ml (velocidad espacial 0,4 h-1). Se comprobó que bajo estas condiciones de reacción se podía mantener una estabilidad operativa durante 25 días o más.
La Fig. 5 muestra la estabilidad operativa de la o las cepas recombinantes inmovilizadas a una temperatura 10 de reacción de 50ºC.
Ejemplo 3: Preparación de D-psicosa a partir de D-glucosa utilizando la cepa/enzima recombinante inmovilizada
(1) Productividad en función de la temperatura de reacción y la concentración de D-glucosa
Las columnas de lecho fijo XK16 (16 mm X 20 mm, Amersham pharmacia) se empaquetaron con la cepa 15 recombinante inmovilizada sobre alginato de sodio obtenida en el anterior Ejemplo 2 y con 10 g de la D-glucosa isomerasa inmovilizada (Novozymes, Dinamarca), respectivamente, y después se midió el porcentaje de conversión de D-glucosa en D-psicosa. Con el fin de determinar las condiciones de reacción óptimas para las dos enzimas mezcladas, la reacción de conversión de D-glucosa en D-psicosa se llevó a cabo bajo condiciones combinadas de 40ºC, 45ºC o 50ºC de temperatura de reacción y 100 g/l, 300 g/l y 500 g/l de 20 concentración de D-glucosa. La Fig. 6 muestra el porcentaje de conversión de D-glucosa en D-psicosa en función de cambios en la temperatura de reacción y la concentración de sustrato. De acuerdo con las Fig. 6a a 6c, a diferencia de la reacción de epimerización para la D-psicosa, la reacción de isomerización para la D-glucosa era una reacción dependiente de la temperatura. Es decir, cuanto más alta era la temperatura de reacción, más rápida era la velocidad de conversión de D-glucosa en D-psicosa. Se comprobó que esto 25 influía finalmente en la productividad de la D-psicosa. La mejor conversión de D-glucosa en D-fructosa se logró a una temperatura de 50ºC y no había ninguna diferencia significativa en la velocidad de reacción al aumentar la concentración del sustrato. Estos resultados demuestran que es posible utilizar el reactor de inmovilización con una concentración de sustrato más alta y aumentar la productividad de D-psicosa a partir de D-glucosa. 30
(2) Productividad en función del caudal de entrada de D-glucosa
Las dos columnas de lecho fijo se empaquetaron con la cepa recombinante inmovilizada incluyendo una psicosa-epimerasa y D-glucosa isomerasa inmovilizada, respectivamente, y después se midió la productividad de D-psicosa en función del caudal de entrada de D-glucosa. En base a los resultados de los ejemplos anteriores, la concentración de D-glucosa y la temperatura de reacción se ajustaron a 300 g/l y 35 50ºC, respectivamente. La productividad se midió ajustando el caudal de entrada de D-fructosa, siendo un sustrato de 0,4, 1, 2, 4 y 8 h-1 de velocidad espacial (1/h). Los resultados se muestran más abajo en la Tabla 2 y en la Fig. 7.
Tabla 2. Productividad y porcentaje de conversión en función del caudal de entrada de D-glucosa
Caudal de entrada (ml/min)
D-glucosa (g/l) D-fructosa (g/l) Productividad (g/l/h) Conversión (%)
4
281,465 31,136 374 9,96
3
278,849 40,042 360 12,56
2
267,061 50,196 301 15,82
1
238,615 78,854 237 24,84
0,5
207,168 113,081 170 35,31
0,1
172,826 155,850 47 47,42

Claims (12)

  1. Reivindicaciones
    1. Método para preparar D-psicosa a partir de D-fructosa mediante el uso de una psicosa-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens y expresada en una cepa GRAS (Generally Recognized as Safe - generalmente considerada inocua), siendo la cepa GRAS de Corynebacterium glutamicum KCCM 11046, 5
    que incluye los pasos de: expresar la psicosa-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens en una cepa GRAS; y preparar D-psicosa a partir de D-fructosa utilizando la psicosa-epimerasa expresada contenida en un cultivo de la cepa GRAS, inmovilizada sobre un soporte.
  2. 2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la psicosa-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1. 10
  3. 3. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de preparar D-psicosa incluye el paso de inmovilizar la cepa GRAS que expresa la psicosa-epimerasa sobre un soporte.
  4. 4. Método según la reivindicación 3, caracterizado porque el soporte es alginato de sodio.
  5. 5. Método según la reivindicación 3, caracterizado porque incluye además los pasos de empaquetar una columna con el soporte sobre el que está inmovilizada la cepa GRAS que expresa la psicosa-15 epimerasa y suministrar una solución de D-fructosa a la columna empaquetada.
  6. 6. Método para preparar D-psicosa a partir de D-glucosa, que incluye el paso de inmovilizar una psicosa-epimerasa y una D-glucosa isomerasa sobre soportes, donde la psicosa-epimerasa se deriva de Agrobacterium tumefaciens y se expresa en una cepa GRAS (Generally Recognized as Safe - generalmente considerada inocua), donde la cepa GRAS es de Corynebacterium glutamicum 20 KCCM 11046, y donde la psicosa-epimerasa está contenida en un cultivo de la cepa GRAS, inmovilizada sobre un soporte.
  7. 7. Método según la reivindicación 6, caracterizado porque la cepa GRAS es una cepa transformada con un vector recombinante que incluye un gen codificador de una psicosa-epimerasa.
  8. 8. Método según una de las reivindicaciones 6 o 7, caracterizado porque la psicosa-epimerasa 25 derivada de Agrobacterium tumefaciens tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1.
  9. 9. Método según la reivindicación 6, caracterizado porque el soporte es alginato de sodio.
  10. 10. Método según una de las reivindicaciones 6 o 7, caracterizado porque incluye además los pasos de empaquetar una columna con los soportes sobre los que están inmovilizadas la cepa GRAS que expresa la psicosa-epimerasa y la D-glucosa isomerasa y suministrar una solución de D-fructosa a la 30 columna empaquetada con los soportes.
  11. 11. Método según la reivindicación 10, caracterizado porque cada uno de los soportes sobre los que están inmovilizadas la cepa GRAS que expresa la psicosa-epimerasa y la D-glucosa isomerasa, respectivamente, se empaqueta en una columna independiente, y las dos columnas se conectan en comunicación entre sí. 35
  12. 12. Cepa de Corynebacterium glutamicum KCCM 11046 para su uso en la preparación de D-psicosa a partir de D-fructosa o D-glucosa.
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