CN109196110A

CN109196110A - 莱苞迪甙a的制备方法、莱苞迪甙a制备用酶及应用

Info

Publication number: CN109196110A
Application number: CN201880001964.4A
Authority: CN
Inventors: 傅荣昭; 李振伟; 刘文山; 刘玉凤
Original assignee: Jiangxi Bang Tai Green Biosynthesis Eco Industrial Park Development Co Ltd; BONTAC BIO-ENGINEERING (SHENZHEN) Co Ltd
Current assignee: BONTAC BIO-ENGINEERING (SHENZHEN) Co.,Ltd.
Priority date: 2018-07-19
Filing date: 2018-07-19
Publication date: 2019-01-11
Also published as: WO2019161634A1

Abstract

本发明提供了一种莱苞迪甙A的制备方法，包括：在二磷酸尿苷葡萄糖和葡萄糖基转移酶存在下，以甜菊糖原料为底物配制反应液，调节所述反应液的pH为6.0‑8.0，在恒定温度20‑45℃下进行搅拌反应后，收集得到莱苞迪甙A；所述甜菊糖原料包括甜菊苷，所述葡萄糖基转移酶的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。该制备方法是一个高效简便，成本低，转化率高，绿色环保的生物酶法，可以广泛适用于工业化规模生产。本发明还提供了莱苞迪甙A制备用酶及应用。

Description

莱苞迪甙A的制备方法、莱苞迪甙A制备用酶及应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及莱苞迪甙A的制备方法、莱苞迪甙A制备用酶及应用。

背景技术

甜菊糖(Steviol glycoside)，又名甜菊糖苷，是一种低热量高倍甜味剂，其甜度为蔗糖的150-300倍，热量约为蔗糖的1/300。研究表明，具有无毒副作用，食用安全，并且研究表明甜菊糖可用于预防高血压、糖尿病、肥胖症、心脏病和龋齿等病症，是一种可替代蔗糖非常理想的甜味剂。然而，甜菊糖各组分的甜度倍数和口感参差不齐；例如主要组分之一的甜菊苷(Stevioside，St)具有后苦味和余味，极大地局限了其应用；而莱苞迪甙A(Rebaudioside A，RA)在甜度、热量和理化性质上均优于甜菊苷，而且口感最接近蔗糖。

现有技术中，莱苞迪甙A生产方法大多集中在培育高产莱鲍迪苷A的甜叶菊品种、树脂吸附或重结晶提纯莱鲍迪苷A，或使用环糊精转移酶等酶对甜菊糖进行改性。然而上述工艺步骤繁琐，能耗高，污染大，纯度与产率均偏低。因此，有必要发展一种工艺简单、成本低、产率高且绿色环保的莱苞迪甙A的制备方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了莱苞迪甙A的制备方法、莱苞迪甙A制备用酶及应用；该制备方法工艺简单、产量高、成本低和绿色安全。

第一方面，本发明提供了莱苞迪甙A的制备方法，包括：

在二磷酸尿苷葡萄糖(Uridine diphosphate glucose，UDPG)和葡萄糖基转移酶存在下，以甜菊糖原料为底物配制反应液，调节所述反应液的pH为6.0-8.0，在恒定温度20-45℃下进行搅拌反应后，收集得到莱苞迪甙A；所述甜菊糖原料包括甜菊苷，所述葡萄糖基转移酶的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。本发明所述葡萄糖基转移酶来源于栀子花(Gardenia jasminoides)。所述二磷酸尿苷葡萄糖(UDPG)也可称为尿苷-5'-二磷酸葡萄糖或尿苷二磷酸葡萄糖。

本发明中，所述甜菊苷(St)，或称甜菊甙，分子式为C₃₈H₆₀O₁₈，化学结构如式Ⅰ所示。所述莱苞迪甙A(RA)，或称甜菊A苷、A苷甜菊糖，分子式为C₄₄H₇₀O₂₃，化学结构如式Ⅱ所示：

本发明中，所述莱苞迪甙A的制备方法的工艺路线如式(1)所示：

其中，所述甜菊糖原料包括甜菊苷(St)，所述甜菊苷和所述二磷酸尿苷葡萄糖经葡萄糖基转移酶的催化作用下得到莱苞迪甙A(RA)，而所述二磷酸尿苷葡萄糖在反应中生成尿苷二磷酸(Uridine triphosphate，UDP)。所述尿苷二磷酸也可称为尿苷-5'-二磷酸。

可选地，所述反应液中的所述二磷酸尿苷葡萄糖通过在所述反应液中直接加入或通过在所述反应液中加入混合原料获得，所述混合原料包括尿苷二磷酸(UDP)和所述二磷酸尿苷葡萄糖中的一种或两种、蔗糖(Sucrose)和蔗糖合成酶(Sucrose Synthase，SuS)。例如，所述混合原料包括尿苷二磷酸、二磷酸尿苷葡萄糖、蔗糖和蔗糖合成酶，或所述混合原料包括二磷酸尿苷葡萄糖、蔗糖和蔗糖合成酶，或所述混合原料包括尿苷二磷酸、蔗糖和蔗糖合成酶。所述所述蔗糖合成酶(SuS)，又称蔗糖合酶，是植物中广泛存在的一种糖基转移酶。

可选地，所述莱苞迪甙A的制备方法的工艺路线还可以如式(2)所示：

其中，所述尿苷二磷酸、所述蔗糖和所述蔗糖合成酶可以在所述反应液中反应得到所述二磷酸尿苷葡萄糖并形成所述二磷酸尿苷葡萄糖的循环再生体系；所述甜菊苷在所述葡萄糖基转移酶的催化作用下制备得到莱苞迪甙A，所述葡萄糖基转移酶能够在所述甜菊糖苷的13位的碳原子的糖基上再引入一葡糖糖基；所述蔗糖在所述蔗糖合成酶的催化下生成果糖。

可选地，所述葡萄糖基转移酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。可选的，所述葡萄糖基转移酶的氨基酸序列的基因编码序列应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:2具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:1。

可选地，当所述混合原料包括尿苷二磷酸、蔗糖和蔗糖合成酶时，所述尿苷二磷酸、所述蔗糖和所述蔗糖合成酶的质量比为(0.0001-0.04)：(0.1-2)：(0.1-1)。进一步地，可选地，所述尿苷二磷酸、所述蔗糖和所述蔗糖合成酶的质量比为(0.005-0.01)：1：(0.2-1)。

可选地，当所述反应液中的所述二磷酸尿苷葡萄糖通过在所述反应液中直接加入时，所述二磷酸尿苷葡萄糖和所述甜菊苷的质量比为(0.001-1):1。进一步地，可选地，所述二磷酸尿苷葡萄糖和所述甜菊苷的质量比为(0.01-0.3):1。

可选地，当所述混合原料包括所述二磷酸尿苷葡萄糖、蔗糖和蔗糖合成酶时，由于所述二磷酸尿苷葡萄糖在所述葡萄糖基转移酶催化下在所述反应液中得到尿苷二磷酸，所述蔗糖、所述蔗糖合成酶和是尿苷二磷酸可以反应生成二磷酸尿苷葡萄糖，并在所述反应液中形成所述二磷酸尿苷葡萄糖的循环再生体系。可选地，所述蔗糖合成酶来源于拟南芥、大豆和马铃薯中的一种或多种。进一步地，可选地，所述蔗糖合成酶来源于拟南芥。

可选地，所述甜菊糖原料在所述反应液中的质量分数为10％-30％。进一步地，可选地，所述甜菊糖原料在所述反应液中的质量分数为20％-30％。例如，所述甜菊糖原料在所述反应液中的质量分数为10％，或为18％，或为25％，或为30％。

可选地，所述甜菊糖原料与所述葡萄糖基转移酶的质量比为1：(0.1-1)；所述葡萄糖基转移酶的添加形式包括粗酶液或酶粉。所述葡萄糖基转移酶的粗酶液是指含有葡萄糖基转移酶的微生物破碎缓冲液，所述微生物可以合成所述葡萄糖基转移酶。所述葡萄糖基转移酶的酶粉是指所述葡萄糖基转移酶纯化后的冷冻干燥酶粉。

可选地，所述反应液的反应温度维持在20-45℃。进一步地，可选地，所述反应液的反应温度维持在35-40℃。例如，所述反应液的反应温度维持在20℃，或为30℃，或为35℃，或为38℃，或为40℃。所述温度范围下的所述葡萄糖基转移酶的催化活性高，所述甜菊苷的转化率高。

进一步地，可选地，本发明所述制备方法中，调节所述反应液的pH为7.0-8.0。例如，调节所述反应液的pH为7.2，或为7.4，或为8.0。

可选地，所述搅拌反应的反应时间为4-25小时。所述搅拌反应的搅拌速率为200-300rpm。进一步地，可选地，所述搅拌反应的反应时间为10-20小时。例如，所述搅拌反应的反应时间为4小时，或为10小时，或为15小时，或为20小时。

可选地，所述收集得到莱苞迪甙A的过程包括：对所述反应液加热以使所述葡萄糖基转移酶变性，过滤并收集滤液，将所述滤液纯化处理后得到莱苞迪甙A，其中，所述加热的温度为85-100℃，时间为0.3-1小时。所述莱苞迪甙A在纯化处理过程中会存在部分损失，纯化处理后得到的所述莱苞迪甙A的甜度、热量和理化性质均符合实际理论参数。

可选地，所述反应液至少包括二磷酸尿苷葡萄糖再生体系时，所述甜菊苷与所述蔗糖的质量比为1：(0.2-1)。

可选地，所述反应液中还包括缓冲液，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和Tris-HCl缓冲液中的一种或多种。可选地，所述缓冲液的浓度为10-500mmol/L。进一步地，可选地，所述缓冲液的浓度为100-500mmol/L。例如，所述缓冲液的浓度为100mmol/L，或为200mmol/L，或为500mmol/L。可选地，所述缓冲液还包括其他种类缓冲液。

本发明第一方面所提供的莱苞迪甙A的制备方法，工艺简单，成本低廉，绿色环保；所述莱苞迪甙A具有极高的产率。相比于现有技术中的10-60％转化率，本发明所述制备方法的转化率高达90％以上，甚至达到99％。现有技术中莱苞迪甙A的制备方法只能利用千分之几底物浓度，加之转化率低；即使通过补加原料等方式，转化率的提高幅度仍然有限，因此，现有技术整体的成本偏高，不利于工业化生产。本发明所述制备方法，未使用大量有机试剂，并且本发明所述底物浓度可以高达10-30％，同时可以通过二磷酸尿苷葡萄糖再生体系用来循环得到原料成本较高的二磷酸尿苷葡萄糖(UDPG)；因此，本发明所述制备方法成本低廉，绿色环保，纯化步骤少，具有很大的应用前景。

第二方面，本发明还提供了一种莱苞迪甙A的制备用酶，所述制备用酶为葡萄糖基转移酶，所述葡萄糖基转移酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。可选地，所述葡萄糖基转移酶的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

可选地，所述葡萄糖基转移酶通过微生物表达生成，所述微生物包括大肠杆菌、毕赤酵母和枯草芽孢杆菌中的一种或多种。进一步地，可选地，所述葡萄糖基转移酶通过大肠杆菌表达生成。所述葡萄糖基转移酶在所述大肠杆菌表达生成的体系中均属于异源表达。本发明优选地大肠杆菌表达系统，简单可行，培养周期短，发酵成本低，酶产量高。本发明所述葡萄糖基转移酶可以以酶粉形式或粗酶液形式添加至所述反应液中。

本发明所述葡萄糖基转移酶来源于栀子花，是通过大量实验筛选得到所述葡萄糖基转移酶的基因编码序列，并通过优化微生物表达体系纯化得到。由于不同种属来源的葡萄糖基转移酶的酶学性质存在差异，包括酶的比活性、酶作用的底物范围、最适pH、最适温度、作用时间和酶的稳定性等方面。同时，来自相同种属的具有相同名称的酶的酶学性质也存在巨大差异；例如本发明通过实验发现来源于栀子花的另一种葡萄糖基转移酶不具有催化甜菊苷转化成莱苞迪甙A的功能。所述本发明所述葡萄糖基转移酶具有极强的专一性，可以高效地所述甜菊糖苷催化得到所述莱苞迪甙A。可选地，所述甜菊糖原料还可以为包括甜菊苷为主要成份的混合物，本发明所述的葡萄糖基转移酶可以高效专一的催化所述甜菊苷转化为莱苞迪甙A。

可选地，所述葡萄糖基转移酶通过构建重组质粒在微生物中表达，所述重组质粒的载体质粒为pET28a(+)载体质粒。将所述葡萄糖基转移酶的基因编码序列插入至所述pET28a(+)载体质粒中得到重组质粒，所述重组质粒可以高效、高产的在微生物细胞中的异源表达得到所述葡萄糖基转移酶。

可选地，所述葡萄糖基转移酶的基因编码序列上增设His标签(组氨酸标签)的核苷酸序列，能使表达后的蛋白带上His标签，His标签有利于表达后蛋白的分离纯化，及在实验中的分析和追踪，比如用于免疫印迹实验时的分析。

可选地，所述葡萄糖基转移酶的基因编码序列插入到pET28a(+)载体质粒的BamHI和Hind III酶切位点之间。所述葡萄糖基转移酶的基因编码序列插入到pET28a(+)载体质粒时，所述葡萄糖基转移酶的基因编码序列的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pET28a(+)载体质粒中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pET28a(+)载体质粒中Hind III酶切位点相连。

第三方面，本发明还提供了葡萄糖基转移酶以及含有所述葡萄糖基转移酶的基因的微生物菌株在生物催化中的应用，所述葡萄糖基转移酶的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；所述葡萄糖基转移酶催化甜菊苷转化成莱苞迪甙A。可选地，所述葡萄糖基转移酶由来源于栀子花的葡萄糖基转移酶基因编码，所述葡萄糖基转移酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

本发明的有益效果包括以下几个方面：

1、本发明所述莱苞迪甙A的制备方法为生物酶法，该制备方法简单高效，成本低，转化率高和绿色安全，可以广泛适用于工业化规模生产；

2、本发明所述的制备方法，底物(甜菊糖原料)的终浓度远远大于现有技术，底物的终浓度可高到达10％-30％；

3、由本发明所述的制备方法制得的所述莱苞迪甙A，纯度高，产量高，可广泛应用在食品工业及制药领域；

4、本发明所述莱苞迪甙A的制备方法的制备用酶—葡萄糖基转移酶，特异性强，能够高效地将所述甜菊苷转化生成莱苞迪甙A。

附图说明

图1为本发明一实施例提供的pET28a-RA07重组质粒的质粒图谱。

具体实施方式

以下所述是本发明实施例的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。

若无特别说明，本发明实施例所采用的原料及其它化学试剂皆为市售商品。

(1)构建重组质粒

a)提供上游引物和下游引物，通过实验得到葡萄糖基转移酶(RA07)；所述葡萄糖基转移酶(RA07)的基因编码序列包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述葡萄糖基转移酶的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；所述葡萄糖基转移酶来源于栀子花。

b)将所述RA07的基因编码序列插入到pET28a(+)载体质粒的BamH I和Hind III酶切位点之间。所述RA07的基因编码序列插入到pET28a(+)载体质粒时，所述RA07的基因编码序列的5’端添加起始密码子(如ATG)与pET28a(+)载体质粒中BamHⅠ酶切位点相连，3’端还添加有终止密码子(如TAA)与pET28a(+)载体质粒中Hind III酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建pET28a-RA07重组质粒。如图1是所示为pET28a-RA07重组质粒图谱。

(2)葡萄糖基转移酶的表达

将构建的重组质粒pET28a-RA07转入大肠杆菌BL21(DE3)中，并以1％的接种量接种至含有4mL的LB培养基中，维持恒定的37℃，200rpm的摇晃速率，过夜培养后，将菌液以1％的接种量转接到含有1L的LB培养基(50μg/mL卡那霉素)的2L三角瓶中，继续37℃恒温培养至培养基中的OD600值达到0.6左右，加入终浓度为度0.1mM-1mM的诱导剂IPTG，在20-37℃条件培养12-16小时后离心收集菌体。将菌体用50mM磷酸缓冲液(pH＝7.4)进行重悬并经超声破碎和离心，收集上清液得到含有RA07的粗酶液。

将表达获得的含有RA07的粗酶液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。本实施方式表达获得的粗酶液中，所述RA07的分子大小与理论计算值相符合，所述RA07的理论分子量为53KD。此外，对收集得到的粗酶液进行冷冻干燥，可进一步制得RA07的酶粉。

(3)葡萄糖基转移酶的筛选

a)通过实验得到的来源于不同种属的葡萄糖基转移酶RA01-RA11；其中，每个所述葡萄糖基转移酶的具体来源参见下表；其中，RA01来源于甜叶菊(Stevia rebaudiana)，RA02来源于向日葵(Helianthus annuus)，RA03来源于水稻(Oryza sativa)，RA04来源于二穗短柄草(Brachypodium distachyon)，RA05来源于甜叶菊(Stevia rebaudiana)，RA06来源于萝芙木(Rauvolfia serpentina)，RA07来源于栀子花(Gardenia jasminoides)，RA08来源于长春花(Catharanthus roseus)，RA09来源于栀子花(Gardenia jasminoides)，RA10来源于胡黄连(Picrorhiza kurrooa)，RA11来源于乳杆菌(Lactobacillus reuteri 180)，RA12来源于大麦(Hordeum vulgare subsp.Vulgare)；

b)基本按照上述步骤(1)及步骤(2)的操作过程，构建上述葡萄糖基转移酶RA01-RA11分别对应的的重组质粒，得到RA系列的重组质粒，将所述RA系列的重组质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中，利用IPTG诱导目的蛋白表达，调控最适的诱导剂用量和酶表达温度，得到RA系列的重组大肠杆菌表达菌株；并进一步得到RA系列的重组大肠杆菌的粗酶液；

c)设计反应体系：在1mL的磷酸钠缓冲液中，分别加入甜菊苷5mg、UDPG5mg，搅拌至完全溶解；继续加入上述RA系列的重组大肠杆菌的粗酶液(包括RA01-RA11)中的任意一种葡萄糖基转移酶的粗酶液200μL(50mg)，调节pH至7.4；在37℃、250rpm转速下反应16h，并检测并收集莱苞迪甙A，计算转化率并评估每种葡萄糖基转移酶的酶活情况，见下表所示：

实验结果表明，不同种属来源的葡萄糖基转移酶的酶学性质存在巨大差异，其中，RA02-RA06、RA08-RA12均基本不具有酶活性，不能催化甜菊苷转化成莱苞迪甙A，RA01的酶活性较低，催化效果较差，而RA07具有极高的酶活性，催化性能强，转化率高达99％，可以高效地所述甜菊糖苷催化得到所述莱苞迪甙A；同时，来自相同种属的酶的酶学性质也存在巨大差异，例如RA01和RA05都来源于甜叶菊，以及RA07和RA09都来源于栀子花，但两者的催化性能差别巨大。本实施方式中，所述转化率是在所述搅拌反应结束后通过液相色谱测定反应液中的甜菊苷含量后进行计算得到。

实施例1

一种莱苞迪甙A的制备方法，包括：

在磷酸钠缓冲液中，分别加入甜菊苷100g、蔗糖80g和UDP 1g，搅拌至完全溶解；继续加入葡萄糖基转移酶RA07酶粉50g和蔗糖合成酶(来源于拟南芥，NP_197583)50g，反应总体系体积为1L，调节体系pH至7.4；在恒温37℃、200rpm搅拌速率下反应16h，通过实验测得转化率为99％，反应完成后将反应液加热至100℃热处理0.5h，使RA07蛋白变性并过滤除去蛋白，收集滤液后进行喷雾干燥得到莱苞迪甙A粗品，将所述莱苞迪甙A粗品经硅胶树脂分离、结晶等后处理纯化后得到莱苞迪甙A96.22g，纯度＞95％。

实施例2

一种莱苞迪甙A的制备方法，包括：

在磷酸钠缓冲液中，分别加入甜菊苷100g和UDPG 1.5g，搅拌至完全溶解；继续加入葡萄糖基转移酶RA07酶粉50g，反应总体系体积为1L，调节体系pH至7.4；在恒温37℃、250rpm搅拌速率下反应16h，通过实验测得转化率为99％，反应完成后将反应液加热至100℃热处理0.5h，使RA07蛋白变性并过滤除去蛋白，收集滤液后进行喷雾干燥得到莱苞迪甙A粗品，将所述莱苞迪甙A粗品经硅胶树脂分离、结晶等后处理纯化后得到莱苞迪甙A95.82g，纯度＞95％。

实施例3

一种莱苞迪甙A的制备方法，包括：

在磷酸钠缓冲液中，分别加入甜菊苷100g和UDPG 1.5g，搅拌至完全溶解；继续加入葡萄糖基转移酶RA07酶粉50g，反应总体系体积为1L，调节体系pH至6.0；在恒温20℃、200rpm搅拌速率下反应16h，通过实验测得转化率为97％，反应完成后将反应液加热至100℃热处理0.5h，使RA07蛋白变性并过滤除去蛋白，收集滤液后进行喷雾干燥得到莱苞迪甙A粗品，将所述莱苞迪甙A粗品经硅胶树脂分离、结晶等后处理纯化后得到莱苞迪甙A93.17g，纯度＞95％。

实施例4

一种莱苞迪甙A的制备方法，包括：

在磷酸钠缓冲液中，分别加入甜菊苷100g、蔗糖100g和UDP 0.5g，搅拌至完全溶解；继续加入葡萄糖基转移酶RA07酶粉50g和蔗糖合成酶(来源于拟南芥，NP_197583)50g，反应总体系体积为1L，调节体系pH至8.0；在恒温40℃、300rpm搅拌速率下反应8h，通过实验测得转化率为98％，反应完成后将反应液加热至100℃热处理0.5h，使RA07蛋白变性并过滤除去蛋白，收集滤液后进行喷雾干燥得到莱苞迪甙A粗品，将所述莱苞迪甙A粗品经硅胶树脂分离、结晶等后处理纯化后得到莱苞迪甙A 94.37g，纯度＞95％。

实施例4

一种莱苞迪甙A的制备方法，包括：

在磷酸钠缓冲液中，分别加入甜菊苷100g、蔗糖100g和UDP 0.5g，搅拌至完全溶解；继续加入葡萄糖基转移酶RA07酶粉50g和蔗糖合成酶(来源于拟南芥，NP_197583)50g，反应总体系体积为1L，调节体系pH至7.4；在恒温45℃、300rpm搅拌速率下反应8h，通过实验测得转化率为98％，反应完成后将反应液加热至100℃热处理0.5h，使RA07蛋白变性并过滤除去蛋白，收集滤液后进行喷雾干燥得到莱苞迪甙A粗品，将所述莱苞迪甙A粗品经硅胶树脂分离、结晶等后处理纯化后得到莱苞迪甙A 95.01g，纯度＞95％。

实施例5

一种莱苞迪甙A的制备方法，包括：

在硼酸缓盐冲液中，分别加入甜菊苷200g、蔗糖120g和UDP 1.5g，搅拌至完全溶解；继续加入葡萄糖基转移酶RA07酶粉80g和蔗糖合成酶(来源于拟南芥，NP_197583)60g，反应总体系体积为1L，调节体系pH至7.4；在恒温37℃、250rpm搅拌速率下反应20h，通过实验测得转化率为98％，反应完成后将反应液加热至100℃热处理0.5h，使RA07蛋白变性并过滤除去蛋白，收集滤液后进行喷雾干燥得到莱苞迪甙A粗品，将所述莱苞迪甙A粗品经硅胶树脂分离、结晶等后处理纯化后得到莱苞迪甙A 190.02g，纯度＞95％。

实施例6

一种莱苞迪甙A的制备方法，包括：

在硼酸缓盐冲液中，分别加入甜菊苷300g、蔗糖150g和UDP 2g，搅拌至完全溶解；继续加入葡萄糖基转移酶RA07酶粉100g和蔗糖合成酶(来源于拟南芥，NP_197583)80g，反应总体系体积为1L，调节体系pH至7.4；在恒温37℃、300rpm搅拌速率下反应20h，通过实验测得转化率为96％，反应完成后将反应液加热至100℃热处理0.5h，使RA07蛋白变性并过滤除去蛋白，收集滤液后进行喷雾干燥得到莱苞迪甙A粗品，将所述莱苞迪甙A粗品经硅胶树脂分离、结晶等后处理纯化后得到莱苞迪甙A 290.25g，纯度＞95％。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 邦泰生物工程（深圳）有限公司

江西邦泰绿色生物合成生态产业园发展有限公司

<120> 莱苞迪甙A的制备方法、莱苞迪甙A制备用酶及应用

<150> PCT/CN2018/096211

<151> 2018-07-19

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 480

<212> PRT

<213> 栀子花(Gardenia jasminoides)

<400> 1

Gly Ser Ile Ser Leu Pro Glu Lys His His Ala Val Cys Ile Pro Tyr

1 5 10 15

Pro Ala Gln Gly His Ile Asn Pro Met Leu Lys Leu Ala Lys Ile Leu

20 25 30

His His Lys Gly Phe His Ile Thr Phe Val Asn Thr Glu Phe Asn His

35 40 45

Lys Arg Leu Leu Lys Ser Arg Gly Pro Asp Ala Leu Asn Gly Leu Pro

50 55 60

Asp Phe Gln Phe Lys Thr Ile Pro Asp Gly Leu Pro Pro Ser Asp Val

65 70 75 80

Asp Ala Thr Gln Asp Ile Pro Ser Leu Cys Glu Ser Thr Thr Thr Arg

85 90 95

Cys Leu Asp Pro Phe Arg Asn Leu Leu Ala Glu Leu Asn Gly Pro Ser

100 105 110

Ser Ser Gln Val Pro Pro Val Ser Cys Ile Val Ser Asp Gly Val Met

115 120 125

Ser Phe Thr Leu Glu Ala Ala Ala Glu Leu Gly Val Pro Glu Ile Leu

130 135 140

Phe Trp Thr Thr Ser Ala Cys Gly Phe Leu Gly Tyr Met His Tyr Ala

145 150 155 160

Lys Leu Ile Glu Lys Gly Leu Thr Pro Leu Lys Asp Ala Ser Tyr Leu

165 170 175

Ser Asn Gly Tyr Leu Glu Gln Ser Leu Asp Trp Ile Pro Gly Met Lys

180 185 190

Asp Ile Arg Leu Lys Asp Leu Pro Ser Phe Leu Arg Thr Thr Asn Pro

195 200 205

Asp Asp Tyr Met Val Lys Phe Val Leu Gln Glu Thr Glu Arg Ala Lys

210 215 220

Lys Ala Ser Ala Ile Ile Leu Asn Thr Phe Gln Glu Leu Glu Asp Asp

225 230 235 240

Val Ile Asn Ala Leu Ser Ala Ile Leu Pro Pro Ile Tyr Thr Ile Gly

245 250 255

Pro Leu Gln Phe Leu Gln Lys Glu Val Lys Asp Glu Arg Leu Ser Val

260 265 270

Leu Gly Ser Asn Leu Trp Lys Glu Glu Pro Glu Cys Leu Asp Trp Leu

275 280 285

Asp Ser Lys Asp Pro Asn Ser Val Val Tyr Val Asn Phe Gly Ser Ile

290 295 300

Thr Val Met Thr Pro Gly Gln Leu Val Glu Phe Ala Trp Gly Leu Ala

305 310 315 320

Asn Ser Lys Gln Thr Phe Leu Trp Ile Ile Arg Pro Asp Leu Val Ser

325 330 335

Gly Asp Ser Ala Ile Leu Pro Pro Glu Phe Leu Glu Glu Thr Lys Asp

340 345 350

Arg Gly Leu Leu Ala Ser Trp Cys Pro Gln Glu Gln Val Leu Ser His

355 360 365

Pro Ala Ile Gly Gly Phe Leu Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu

370 375 380

Glu Ser Ile Cys Ser Gly Val Pro Met Ile Cys Trp Pro Phe Phe Ala

385 390 395 400

Glu Gln Gln Thr Asn Cys Trp Phe Cys Cys Thr Lys Trp Tyr Asn Gly

405 410 415

Leu Glu Ile Asp Asn Asn Val Lys Arg Asp Glu Val Glu Ser Leu Val

420 425 430

Thr Glu Leu Met Val Gly Glu Lys Gly Met Asp Met Lys Lys Lys Ala

435 440 445

Leu Glu Trp Lys Asn Lys Ala Glu Glu Ala Ala Lys Ser Ser Gly Gly

450 455 460

Ser Ser Tyr Ser Asn Leu Glu Lys Val Val Gln Val Leu Leu Ser Lys

465 470 475 480

<210> 2

<211> 1440

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggcagcatca gtctgcccga aaaacaccat gccgtttgca tcccgtaccc ggcacaaggt 60

catattaatc ctatgctgaa actggccaaa attttacatc acaagggctt tcacatcacc 120

ttcgtgaaca ccgagttcaa ccacaaacgt ttactgaaaa gtcgcggccc cgatgcttta 180

aacggtttac cggactttca gtttaagacc atccccgatg gtctgccgcc gagcgatgtg 240

gacgccaccc aagatatccc ttctttatgt gagagcacca ccacccgctg tttagaccct 300

tttcgcaatt tactggccga gctgaacggt ccgagcagta gccaagttcc gcccgttagt 360

tgtattgtga gcgacggcgt gatgagcttt accttagaag cagccgccga gctgggcgtt 420

ccggaaattt tattttggac aaccagcgct tgtggttttc tgggctatat gcattacgcc 480

aaactgattg agaaaggttt aaccccgctg aaagacgcca gttatctgag caacggctat 540

ttagaacaat ctttagactg gattcccggt atgaaagaca ttcgtttaaa ggatctgccg 600

agttttttac gtaccaccaa ccccgatgat tacatggtga agtttgttct gcaagaaacc 660

gagcgcgcca aaaaggccag cgccatcatt ctgaacacat tccaagaact ggaggatgac 720

gttatcaacg ctttaagcgc aattctgccg ccgatttaca ccattggtcc gctgcagttt 780

ctgcagaagg aagtgaagga cgaacgttta agcgttctgg gtagcaattt atggaaagag 840

gaaccggaat gtctggattg gctggacagc aaggacccta atagtgtggt gtacgtgaat 900

ttcggcagca ttacagttat gaccccgggt cagctggtgg aatttgcatg gggtttagcc 960

aatagcaagc agaccttttt atggatcatt cgcccggatt tagtgagcgg cgatagtgcc 1020

attctgcctc cggagtttct ggaagaaacc aaagatcgtg gtttactggc aagctggtgc 1080

cctcaagaac aagttctgag ccaccccgct attggtggtt ttctgacaca cagcggttgg 1140

aacagcactt tagaaagcat ttgtagcggc gtgccgatga tctgctggcc gttttttgcc 1200

gagcagcaga ccaattgctg gttctgctgc accaagtggt acaatggttt agagatcgac 1260

aacaacgtga aacgtgacga ggttgagagt ctggttacag agctgatggt gggcgagaaa 1320

ggtatggata tgaagaaaaa ggctttagaa tggaagaaca aagccgagga agccgccaaa 1380

agcagcggcg gtagcagcta cagcaattta gagaaagtgg tgcaagttct gctgagtaaa 1440

Claims

1.一种莱苞迪甙A的制备方法，其特征在于，包括：

在二磷酸尿苷葡萄糖和葡萄糖基转移酶存在下，以甜菊糖原料为底物配制反应液，调节所述反应液的pH为6.0-8.0，在恒定温度20-45℃下进行搅拌反应后，收集得到莱苞迪甙A；所述甜菊糖原料包括甜菊苷，所述葡萄糖基转移酶的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述葡萄糖基转移酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反应液中的所述二磷酸尿苷葡萄糖通过在所述反应液中直接加入或通过在所述反应液中加入混合原料获得，所述混合原料包括尿苷二磷酸和所述二磷酸尿苷葡萄糖中的一种或两种、蔗糖和蔗糖合成酶。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，当所述混合原料包括尿苷二磷酸、蔗糖和蔗糖合成酶时，所述尿苷二磷酸、所述蔗糖和所述蔗糖合成酶的质量比为(0.0001-0.04)：(0.1-2)：(0.1-1)。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述搅拌反应的反应时间为4-25小时。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述甜菊糖原料在所述反应液中的质量分数为10％-30％。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述甜菊糖原料与所述葡萄糖基转移酶的质量比为1：(0.1-1)；所述葡萄糖基转移酶的添加形式包括粗酶液或酶粉。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述收集得到莱苞迪甙A的过程包括：对所述反应液加热以使所述葡萄糖基转移酶变性，过滤并收集滤液，将所述滤液纯化处理后得到莱苞迪甙A，其中，所述加热的温度为85-100℃，时间为0.3-1小时。

9.一种莱苞迪甙A制备用酶，其特征在于，所述制备用酶为葡萄糖基转移酶，所述葡萄糖基转移酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；所述葡萄糖基转移酶来源于栀子花。

10.葡萄糖基转移酶以及含有所述葡萄糖基转移酶的基因的微生物菌株在生物催化中的应用，其特征在于，所述葡萄糖基转移酶的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；所述葡萄糖基转移酶催化甜菊苷转化成莱苞迪甙A。