CN105164270A - 由甜菊苷制备莱苞迪甙a的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及由蔗糖和甜菊苷通过蔗糖合成酶和糖基转移酶来制备莱苞迪甙A的原位方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种由蔗糖和甜菊苷作为原料通过蔗糖合成酶和糖基转移酶来制备莱苞迪甙A的方法。
背景技术
甜菊是一种高效能甜味剂，甜度为糖的200倍以上，其是经热水提取属于菊科(Compositae)的甜叶菊(SteviarebaudianaBertoni)而获得的。在甜菊提取物的甜味剂成分中，已知莱苞迪甙A具有较少苦味并且具有与糖最相似的甜味剂品质，并且莱苞迪甙A比糖甜400倍，在非改造的植物的情况下，莱苞迪甙A占提取物的约20％左右。在提取物中最主要的成分是甜菊苷，其是莱苞迪甙A的前体。为了生产高纯度莱苞迪甙A，有必要对具有高含量莱苞迪甙A的种子、种植、收获、培育管理等进行改进，这会牵涉到时间和成本方面的经济问题。
为了解决这些问题，已经进行了将甜菊苷转化成莱苞迪甙A的研究。典型的例子包括一种方法：利用衍生自土壤微生物的β-1,3-葡聚糖酶，通过酶转化，将葡萄糖分子结合至甜菊苷，从而将甜菊苷转化成莱苞迪甙A(韩国专利公布2004-0026747A和美国专利6469947)。用于酶转化的糖供体底物的典型例子可以包括凝胶多糖(β-1,3-葡聚糖)。凝胶多糖是一种高成本的材料，其具有低的溶解度并且缺点在于：其工业应用是困难的。此外，虽然有报道称该凝胶多糖通过真菌发酵将甜菊苷转化成莱苞迪甙配糖体，但是微生物的培养需要花费约15天，并且还会产生其他的甜菊糖苷，如莱苞迪甙B等，这使得转化至最终的莱苞迪甙A的转化率仅为40％左右。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是克服源自微生物的酶转化中的低产率的限制，提供一种以高产率制备莱苞迪甙A的方法。
本发明的另一个目的是提供一种用于制备莱苞迪甙A的方法，该方法具有高工业应用性，因为制备过程简单、节省成本并且耗时较短。
技术方案
根据本发明的一个方面，提供了一种制备莱苞迪甙A的方法，包括：
(1)在蔗糖合成酶的存在下，使蔗糖与二磷酸核苷酸反应，从而制备结合有葡萄糖的二磷酸核苷酸；以及
(2)在糖基转移酶的存在下，使所述结合有葡萄糖的二磷酸核苷酸与甜菊苷反应，从而制备莱苞迪甙A。
根据本发明的另一方面，提供了一种由甜菊苷制备莱苞迪甙A的原位方法，包括：使蔗糖、二磷酸核苷酸、甜菊苷、蔗糖合成酶以及糖基转移酶反应，从而制备莱苞迪甙A。
根据本发明的另一方面，提供了通过本发明的用于制备莱苞迪甙A的方法而制备的莱苞迪甙A。
有益效果
根据本发明的制备莱苞迪甙A的方法提供高纯度的莱苞迪甙A，几乎不产生副产物，并且产量高。
根据本发明的用于制备莱苞迪甙A的方法适于大量生产，这是因为，该方法使用了廉价原料，并且过程简单且耗时较短，因此该方法是经济的。
附图说明
图1示出了HPLC分析结果，其证明了果糖和结合有葡萄糖的二磷酸尿苷是通过蔗糖合成酶制成的。在图1中，(a)示出了甜菊苷(1)只有在反应时间为0小时是存在的，(b)示出了在反应时间1小时完成之后，结合有葡萄糖的二磷酸尿苷(2)通过蔗糖合成酶产生。
图2示出了HPLC分析结果，其证明了：通过糖基转移酶，甜菊苷转化成了莱苞迪甙A。在图2中，(a)示出了甜菊苷(1)只有在反应时间为0小时是存在的，(b)示出了甜菊苷(1)和莱苞迪甙A(2)两者在反应时间为0.5小时之后存在，以及(c)示出了在反应时间为1小时之后，所有甜菊苷(1)被转化为莱苞迪甙A(2)。
图3示出了HPLC分析结果，其证明了：莱苞迪甙A(2)是由甜菊苷(1)通过蔗糖合成酶和糖基转移酶制备的。在图3中，(a)示出了当甜菊苷底物浓度为100mM时，甜菊苷(1)只有在反应时间为0小时是存在的，(b)示出了当甜菊苷底物浓度为100mM时，莱苞迪甙A(2)只有在反应时间为24小时之后是存在的，以及(c)示出了当甜菊苷底物浓度为250mM时，甜菊苷(1)和莱苞迪甙A(2)两者在反应时间为24小时之后是存在的。
图4示出了证明用于蔗糖合成酶和糖基转移酶的合适的pH评价结果的图表。
图5示出了证明用于蔗糖合成酶和糖基转移酶的合适的温度评价结果的图表。
具体实施方式
本发明的一个实施方案涉及一种用于制备莱苞迪甙A的方法，包括：
(1)在蔗糖合成酶的存在下，使蔗糖与二磷酸核苷酸反应，从而制备结合有葡萄糖的二磷酸核苷酸；以及
(2)在糖基转移酶的存在下，使所述结合有葡萄糖的二磷酸核苷酸与甜菊苷反应，从而制备莱苞迪甙A。步骤(1)和步骤(2)是原位相继(sequentially)或连续(consecutively)进行的，优选是原位连续进行的。
本发明的另一个实施方案涉及一种由甜菊苷制备莱苞迪甙A的方法，包括：使蔗糖、二磷酸核苷酸、甜菊苷、蔗糖合成酶以及糖基转移酶反应，从而制备莱苞迪甙A。蔗糖、二磷酸核苷酸、甜菊苷、蔗糖合成酶以及糖基转移酶的反应可以是原位进行的。
本文所用的术语“原位”是指反应是在单个反应体系中连续进行的。
在植物糖代谢中，蔗糖合成酶通过可逆地将结合至二磷酸核苷酸的葡萄糖转化至果糖而在蔗糖生产中发挥作用。在本发明中，蔗糖合成酶显示了：在pH5至pH10的范围内使蔗糖与二磷酸核苷酸反应，将结合有葡萄糖的二磷酸核苷酸与果糖分开的活性。
[化学反应1]
通过糖基转移酶，结合有葡萄糖的二磷酸核苷酸能够与甜菊苷反应，从而制备莱苞迪甙A。
[化学反应2]
本发明中的化学反应1和2可以在分开的反应器中相继进行，但优选在一个反应器中连续进行。
在本发明中，化学反应1和2可以合并成如下所示的一个反应式：
[化学反应3]
本发明提供了连续反应系统，其中，根据上述化学反应3，一个葡萄糖特异性地结合至甜菊苷13-O-葡萄糖的C-3’位置，从而以高产量合成莱苞迪甙A。
在本发明中，蔗糖合成酶可以源自稻米(rice)、玉米(corn)、小麦、竹子、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、草、大麦(barley)、高粱或马铃薯。优选地，蔗糖合成酶是源自稻米、玉米、小麦或大麦，特别优选源自稻米，尤其是水稻(Oryzasativa)。蔗糖合成酶可由利用含有蔗糖合成酶基因的载体转化的重组大肠杆菌(Escherichiacoli)、芽孢杆菌(Bacillus)、酵母、棒状杆菌(Corynebacterium)或土壤杆菌(Agrobacterium)产生。蔗糖合成酶从大肠杆菌(Escherichiacoli)等产生后可以经进一步纯化。蔗糖合成酶是本领域熟知的现有技术。虽然没有特别的限制，但是蔗糖合成酶可以包括在SEQIDNO:3中所示的基本序列。
在本发明中，蔗糖没有特别限制，只要它可以作为蔗糖合成酶的底物向二磷酸核苷酸提供葡萄糖即可。蔗糖的例子可以包括粗糖或糖。
在本发明中，嘌呤或嘧啶可用作二磷酸核苷酸。优选的是，使用二磷酸尿苷作为二磷酸核苷酸。
在本发明中，在步骤(1)或化学反应1中的反应温度可以是20℃至60℃，并且反应pH可以在pH5至pH10的范围内。优选的是，反应温度为30℃至55℃，反应pH在pH6至pH9的范围内，特别优选的是，反应温度为35℃至50℃，并且反应pH在pH7至pH8的范围内。本发明中，在步骤(1)或化学反应1中的反应时间为30分钟至48小时，优选为1小时至36小时，特别优选为1小时至24小时，但不限于此。
在本发明中，糖基转移酶可以获自水稻(Oryzasativa)、甜叶菊(SteviarebaudianaBertoni)、绿竹(Bambusaoldhamii)，二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、大麦(Hordeumvulgare)、二色高粱(Sorghumbicolor)、玉蜀黍(Zeamays)、或拟南芥(Arabidopsisthaliana)。优选地，糖基转移酶获自水稻(Oryzasativa)、甜叶菊(SteviarebaudianaBertoni)或绿竹(Bambusaoldhamii)。特别优选地，糖基转移酶获自甜叶菊(SteviarebaudianaBertoni)。糖基转移酶可以利用含有糖基转移酶基因的载体转化的重组大肠杆菌(Escherichiacoli)、芽孢杆菌(Bacillus)、酵母、棒状杆菌(Corynebacterium)或土壤杆菌(Agrobacterium)产生。糖基转移酶在得自大肠杆菌等后可经进一步纯化。糖基转移酶是本领域熟知的。虽然没有特别的限制，但是糖基转移酶可以包括SEQIDNO:4中所示的基本序列。
在本发明中，甜菊苷是来自甜叶菊(SteviarebaudianaBertoni)的热水或者水醇溶液提取物或者是其纯化的材料，或者是从提取物生产莱苞迪甙A之后的副产物。甜菊苷的用量可以是10wt％或更多，优选50wt％或更多，特别优选为70wt％或更多，更特别优选80wt％或更多，基于甜菊糖苷的总重量。
在本发明中，在步骤(2)或化学反应2中的反应温度可以是20℃至60℃，并且反应pH可以在pH5至pH10的范围内。优选地，反应温度为30℃至55℃，反应pH在pH6至pH9的范围内。特别优选的是，反应温度为35℃至50℃，反应pH在pH7至pH8的范围内。在本发明中，在步骤(2)或化学反应2中的反应时间可以是30分钟至48小时，优选为1小时至36小时，特别优选为1小时至24小时，但不限于此。
在本发明中，通过使蔗核、二磷酸核苷酸、甜菊苷、蔗糖合成酶和糖基转移酶在原位进行反应来制备莱苞迪甙A的步骤的反应温度可以是20℃至60℃，反应pH可以在pH5至pH10的范围内。优选的是，反应温度为30℃至55℃，反应pH在pH6至pH9的范围内。特别优选的是，反应温度为35℃至50℃，并且反应pH在pH7至pH8的范围内。
在本发明中，嘌呤或嘧啶可用作二磷酸核苷酸。优选的是，使用二磷酸尿苷作为二磷酸核苷酸。
本发明的另一个实施方案提供了通过本文中所描述的方法制备的莱苞迪甙A。
根据本发明的莱苞迪甙A的特征在于：它是通过使用位于甜菊糖苷中的全部量的甜菊苷产生。这样的特性可以允许糖苷中的甜菊苷含量为5wt％或更少，优选3wt％或更少，特别优选为1wt％或更少，由此能够省略在纯化过程中将莱苞迪甙A与甜菊苷分离的步骤，这导致成本节约。此外，在除本发明原料中的甜菊苷之外只有少量的莱苞迪甙A作为糖苷存在的情况下，该制备方法的优点在于高纯度的产品，其中，通过酶促转化获得的甜菊糖苷中的莱苞迪甙A的含量是99％或更多。此外，用来作为本发明糖供体的蔗糖可以以比作为现有发明原料的凝胶多糖低50倍的价格购买到。结果是，相比于现有技术，本发明能够以高纯度、低成本/高效率来生产莱苞迪甙A。
下文将参照以下实施例对本发明进行更详细的说明。应当理解的是，这些实施例仅用作说明，而不以任何方式限制本发明。
实施例1
基因采集和重组蛋白的生产
1)蔗糖合成酶基因重组体大肠杆菌(Escherichiacoli)的制备
用于PCR(聚合酶链式反应)的引物具有用于NdeⅠ和HindⅢ(分别与蔗糖合成酶的两端的部分碱基序列反应)的限制酶识别序列。
(正向)5'-CATATGGCTGCCAAGCTAGCTCG-3'
(反向)5'-AAGCTTTTACTTGGATGTGCTCTCTC-3'
用于基因扩增的等温扩增过程重复30个循环，包括在94℃下变性30秒，在60℃下退火30秒，以及在72℃下延伸2分钟，由此得到约2.5kb的PCR产物。
将得到的cDNA片段插入到pET-28a(+)载体中，并转化到大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)中。转化的大肠杆菌划线接种到含有卡那霉素的平板培养基上以开始选择耐受卡那霉素的菌株。所选出的菌株进行液体培养，接着进行DNA的纯化。最后，当用NdeI和HindIII对DNA进行双重切割时，选择出被证实具有约2.5kb的DNA片段的菌株。使用自动化DNA测序仪进行的碱基序列分析的结果显示，在本发明中得到的蔗糖合成酶基因的碱基序列的结果(SEQIDNO：1)与所报导的以下蔗糖合成酶基因相同：
SEQIDNO:1
TGCCAACAATCGCAACATGCCATGGTGGCCCTGCTGAGATTATTGTTGATGGGGTGTCTGGTCTGCACATTGATCCTTACCACAGTGACAAGGCTGCTGATATCTTGGTCAACTTCTTTGAGAAGTGCAAGCAGGATTCAACCTACTGGGACAATATTTCACAGGGAGGTCTGCAGAGGATTTACGAGAAGTACACCTGGAAGCTGTACTCTGAGAGGCTGATGACCTTGACTGGTGTATACGGATTCTGGAAGTACGTAAGCAACCTTGAGAGGCGCGAGACTCGCCGTTACATTGAGATGTTCTATGCTCTGAAATACCGCAGCCTGGCCAGCGCCGTCCCATTGGCTGTCGATGGAGAGAGCACATCCAAGTAA
2)糖基转移酶基因重组大肠杆菌的制备
在PCR中使用的引物具有用于NdeⅠ和HindⅢ的限制酶识别序列，分别与获自甜叶菊的糖基转移酶基因两端的部分碱基序列反应。
(正向)5'-CATATGGAAAATAAAACGGA-3'
(反向)5'-AAGCTTTTACAACGATGAAATGT-3'
用于基因扩增的等温扩增步骤重复30个循环，包括在94℃变性30秒，在60℃退火30秒，以及在72℃延伸2分钟，由此得到约1.4kb的PCR产物。将得到的cDNA片段插入到pET-28a(+)载体中，并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。将转化的大肠杆菌划线接种到含有卡那霉素的平板培养基上以开始选择耐受卡那霉素的菌株。将最初选择出的菌株进行液体培养，接着进行DNA纯化。最后，当用NdeI和HindIII对菌株DNA进行双重切割时，选择出被证实具有约1.4kbDNA片段的菌株。使用自动化DNA测序仪进行碱基序列分析的结果显示，本发明获得的糖基转移酶的碱基序列(SEQIDNO：2)与如下报导的糖基转移酶基因是相同的：
SEQIDNO:2
AGAAGTGCTAGCTCATGGAGCAATAGGCGCATTCTGGACTCATAGCGGATGGAACTCTACGTTGGAAAGCGTTTGTGAAGGTGTTCCTATGATTTTCTCGGATTTTGGGCTCGATCAACCGTTGAATGCTAGATACATGAGTGATGTTTTGAAGGTAGGGGTGTATTTGGAAAATGGGTGGGAAAGAGGAGAGATAGCAAATGCAATAAGAAGAGTTATGGTGGATGAAGAAGGAGAATACATTAGACAGAATGCAAGAGTTTTGAAACAAAAGGCAGATGTTTCTTTGATGAAGGGTGGTTCGTCTTACGAATCATTAGAGTCTCTAGTTTCTTACATTTCATCGTTGTAA
3)重组蛋白质的生产
在含有5mlLB培养基的试管中接种冻干重组大肠杆菌BL21(DE3)，然后在37℃培养箱中进行种子培养，直至在600nm处吸光度为2.0。将种子培养的溶液加入到2000ml盛有500mlLB培养基的烧瓶中，然后进行培养。此外，加入0.1mMIPTG(异丙基β-D-1-硫代吡喃硫代半乳糖苷)直至吸光度在600nm处达到0.4，从而诱导蔗糖合成酶和糖基转移酶分别大量表达。对培养条件进行调节，以使在此过程中搅拌速度为180rpm和培养温度为37℃，同时使得在加入IPTG之后搅拌速度为120rpm以及培养温度为16℃。将转化菌株的培养液于6000g在4℃下进行离心分离20分钟，然后用50mMTris-盐酸缓冲液洗涤两次，然后加入pH7.5的50mMTris盐酸缓冲液，从而利用超声仪裂解细胞溶液。将细胞裂解物在13000g、4℃下再次离心分离20分钟，从而分离出细胞上清液作为酶溶液。为了准确确定酶的性质，使用Ni-NTA超流柱纯化酶溶液。用SDS-PAGE测定经纯化的酶的分子量。结果确认了，来自于稻米(水稻)的蔗糖合成酶具有92kDa的(SEQIDNO:3)的长度，并且获自甜叶菊(Steviarebaudiana)的糖基转移酶(UDP-糖基转移酶)的长度为57kDa(SEQIDNO：4)。
实施例2
利用HPLC测量酶活性
1)蔗糖合成酶活性的测量
通过HPLC测定获自稻米(水稻)的蔗糖合成酶的活性。用于测量获自稻米(水稻)的蔗糖合成酶的活性的HPLC的分析条件如下：
HPLC分析的条件
-检测器波长：260nm
-流速：1Ml/min
-样品注射体积：10μl
-柱：C184.6×250mM(5μm孔径)
-溶剂：A：8mM四丁基铵过硫酸盐的100mM磷酸钾溶液[pH5.3]
B：70％溶剂A+30％甲醇
总分析时间设为30分钟，其中所述分析开始梯度使用100％溶剂A，运行时间15分钟时，溶剂B的梯度增加至20％，在运行时间为17分钟时梯度返回至100％溶剂A。
获自稻米(水稻)的蔗糖合成酶的活性通过酶促反应进行确认，从而查看粗糖或糖(蔗糖)是否和二磷酸尿苷进行反应，以产生结合有葡萄糖的二磷酸尿苷。酶促反应的条件如下：
溶于50mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)的100mM蔗糖、10mM二磷酸尿苷和0.1mg/ml蔗糖合成酶(在实施例1-3中制备)在37℃下进行酶促反应1小时。在加热至100℃5分钟，使反应停止后，进行HPLC分析以测量结合有葡萄糖的二磷酸尿苷的产量。结果确认，二磷酸尿苷转化成了结合有葡萄糖的二磷酸尿苷，表明相比于初始摩尔浓度，转化率为90％(图1)。在图1中，(a)示出在0小时的反应时间只有二磷酸尿苷(1)的存在，(b)示出结合有葡萄糖的二磷酸尿苷(2)是在反应时间1小时完成之后通过蔗糖合成酶产生的。
2)糖基转移酶活性的测量
用于测量获自甜叶菊(Steviarebaudiana)的糖基转移酶(UDP-糖基转移酶)的HPLC分析的条件如下：
HPLC分析的条件
-检测器波长：210nm
-流速：1Ml/min
-样品注射体积：10μl
-柱：C184.6×250mM(5μm孔径)
-溶剂：乙腈：10mM磷酸钠[pH2.6]＝32:68
获自甜叶菊(Steviarebaudiana)的糖基转移酶(UDP-糖基转移酶)的活性通过酶转化确定，从而查看将一分子葡萄糖结合至甜菊苷是否会导致转化成莱苞迪甙A。酶促反应的条件如下：使溶于50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)的2mM甜菊苷(>96％)、10mM二磷酸尿苷葡萄糖，以及获自甜叶菊的0.1mg/ml的糖基转移酶(在实施例1-3制备)在37℃下进行酶促反应1小时。用作酶促反应底物的甜菊苷是纯甜菊苷，纯度为96％或更高。使用含有约3％莱苞迪甙A的混合试样作为HPLC分析时反应前后的标准物质。通过加热至100℃5分钟来停止酶反应，随后进行HPLC来测量莱苞迪甙A的产生量。分析结果确认，相比于摩尔浓度，甜菊苷100％转化成莱苞迪甙A(图2)。图2示出的HPLC分析结果证明了甜菊苷通过糖基转移酶转化成了莱苞迪甙A。在图2中，(a)示出了甜菊苷(1)仅在反应时间为0小时存在，(b)示出在0.5小时的反应时间，甜菊苷(1)和莱苞迪甙A(2)二者都存在，以及(c)示出1小时的反应时间后，所有甜菊苷(1)转化成莱苞迪甙A(2)。
实施例3
通过蔗糖合成酶和糖基转移酶的原位反应将甜菊苷转化成莱苞迪甙A的转化率的测量
通过蔗糖合成酶和糖基转移酶(UDP-糖基转移酶)的原位反应来确定甜菊苷转化成莱苞迪甙A的转化率。酶促反应的条件如下：
酶促反应如下进行：使用50mM的磷酸盐缓冲液(pH6.5)，其含有1M蔗糖、200mM的二磷酸尿苷、100～250mM甜菊苷和0.1mg/ml蔗糖合成酶(在实施例1-3中制备)以及0.1mg/ml糖基转移酶(在实施例1-3中制备)，在45℃的温度下反应24小时。本发明中使用的底物是实施例2中指定的甜菊苷混合物。反应完成后，该反应通过加热至100℃5分钟来停止。在这之后，进行HPLC分析以根据甜菊苷的浓度测量产生的莱苞迪甙A的浓度。由相比于所用甜菊苷的摩尔浓度，产生的莱苞迪甙A的摩尔浓度计算从甜菊苷转化成莱苞迪甙A的转化率(图3和表1(反应24小时后的转化率))。
[表1]
| 甜菊苷的浓度(mM) | 转化率(％) |
| 100 | 100 |
| 150 | 63.90 |
| 200 | 56.72 |
| 250 | 39.96 |
图3示出了HPLC分析的结果，证明了莱苞迪甙A(2)是从甜菊苷(1)通过蔗糖合成酶和糖基转移酶产生的。在图3中，(a)示出了当底物浓度为100mM时，甜菊苷(1)仅在反应时间为0小时存在，(b)示出当底物浓度为100mM时，莱苞迪甙A(2)仅在反应时间为24小时存在，以及(c)示出当底物浓度为250mM时，甜菊苷(1)和莱苞迪甙A(2)两者均在24小时的反应时间后存在。
实施例4
蔗糖合成酶和酶基转移酶在原位反应中的pH稳定性
获自稻米(水稻)的蔗糖合成酶制备的结合有葡萄糖的二磷酸尿苷通过糖基转移酶与甜菊苷反应，解离二磷酸尿苷，转化成莱苞迪甙A。当两种酶存在于单一的反应器中，并且生成了莱苞迪甙A，检查最佳pH。用于测量最佳pH值的HPLC分析条件如下：
HPLC分析的条件
-检测器波长：210nm
-流速：1Ml/min
-样品注射体积：10μl
-柱：C184.6×250mM(5μm孔径)
-溶剂：乙腈∶10mM磷酸钠[pH2.6]＝32∶68
通过蔗糖合成酶和糖基转移酶(UDP-糖基转移酶)的复合反应来确定最佳pH。酶促反应的条件如下：酶促反应通过使用含有1M蔗糖、200mM的二磷酸尿苷、40mM的甜菊苷和0.1mg/ml蔗糖合成酶(在实施例1-3中制备)以及0.1mg/ml的糖基转移酶(在实施例1-3中制备)的50mM的磷酸盐缓冲液(pH6.5)在45℃下反应24小时。作为pH2.5至pH12.0的缓冲液，使用通用的缓冲液。反应通过加热到100℃5分钟来停止。在这之后，进行HPLC分析以测量莱苞迪甙A的产率。通过比较莱苞迪甙A的产量，反应体系的最大反应pH值为被认为是复合反应的最佳pH。蔗糖合成酶和糖基转移酶的复合反应的最佳pH被确定为：在45℃的温度下进行60分钟(图4和表2)的反应中是大约pH7.5。
[表2]
| pH | 酶相对活性(％) |
| 2.5 | 2.99 |
| 3.0 | 2.85 |
| 4.0 | 2.66 |
| 5.0 | 38.55 |
| 5.5 | 78.66 |
| 6.0 | 84.54 |
| 6.5 | 85.45 |
| 7.0 | 93.24 |
| 7.5 | 100 |
| 8.0 | 93.04 |
| 8.5 | 86.42 |
| 9.0 | 85.12 |
| 10.0 | 84.01 |
| 11.0 | 80.47 |
| 12.0 | 52.34 |
实施例4
蔗糖合成酶和糖基转移酶的原位反应的温度稳定性
通过获自稻米(水稻)的蔗糖合成酶产生的结合有葡萄糖的二磷酸尿苷通过糖基转移酶与甜菊苷反应、解离二磷酸尿苷，被转化为莱苞迪甙A。当两种酶存在于单一的反应器中并生成莱苞迪甙A时，检查最佳温度。用于测量最佳温度的HPLC分析的条件如下：
HPLC分析的条件
-检测器波长：210nm
-流速：1Ml/min
-样品注射体积：10μl
-柱：C184.6×250mM(5μm孔径)
-溶剂：乙腈∶10mM磷酸钠[pH2.6]＝32∶68
最佳温度是通过蔗糖合成酶与糖基转移酶(UDP-糖基转移酶)的复合反应确定的。酶促反应的条件如下：通过使用含有1M蔗糖，200mM的二磷酸尿苷，40mM甜菊苷和0.1mg/ml的蔗糖合成酶以及0.1mg/ml糖基转移酶的50mM的磷酸缓冲液(pH6.5)在温度为4℃、20℃、30℃、37℃、45℃、60℃、70℃和80℃下进行酶反应。反应通过加热到100℃进行5分钟来停止。在这之后，进行HPLC分析以测量莱苞迪甙A的产率。通过比较莱苞迪甙A的产生量，显示反应体系最大反应温度的值被认为是复合反应的最佳温度。蔗糖合成酶和糖基转移酶的复合反应的最佳温度被确定为：在pH6.5进行60分钟的反应中为大约45℃。相对酶活性总结于图5和表3中。
[表3]
| 温度(℃) | 相对酶活性(％) |
| 4 | 10.19 |
| 20 | 17.20 |
| 30 | 31.21 |
| 37 | 80.48 |
| 45 | 100 |
| 60 | 39.24 |
| 70 | 9.71 |
| 80 | 10.40 |
Claims (14)
1.一种制备莱苞迪甙A的方法，包括：
(1)在蔗糖合成酶的存在下使蔗糖与二磷酸核苷酸反应，从而制备结合有葡萄糖的二磷酸核苷酸；以及
(2)在糖基转移酶的存在下，使所述结合有葡萄糖的二磷酸核苷酸与甜菊苷反应，从而制备莱苞迪甙A。
2.根据权利要求1所述的制备莱苞迪甙A的方法，其中蔗糖合成酶获自稻米、玉米、小麦、竹、拟南芥、草、大麦、高粱或马铃薯。
3.根据权利要求1或2所述的制备莱苞迪甙A的方法，其中蔗糖合成酶由含有蔗糖合成酶基因的载体转化的重组大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、棒状杆菌或土壤杆菌产生。
4.根据权利要求3所述的制备莱苞迪甙A的方法，其中蔗糖合成酶具有SEQIDNO:3所示的基本序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备莱苞迪甙A的方法，其中糖基转移酶获自水稻、甜叶菊、绿竹、二穗短柄草、大麦、高粱、玉蜀黍或拟南芥。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备莱苞迪甙A的方法，其中糖基转移酶获自利用含有糖基转移酶基因的载体转化的重组大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、棒状杆菌或土壤杆菌。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的制备莱苞迪甙A的方法，其中糖基转移酶具有SEQIDNO:4所示的基本序列。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的制备莱苞迪甙A的方法，其中步骤(1)和(2)是原位连续进行的。
9.根据权利要求8中任一项所述的制备莱苞迪甙A的方法，其中原位反应温度为20℃至60℃，反应pH在pH5至pH10的范围内。
10.一种由甜菊苷制备莱苞迪甙A的方法，包括：
使蔗糖、二磷酸核苷酸、甜菊苷、蔗糖合成酶和糖基转移酶原位反应，从而制备莱苞迪甙A。
11.根据权利要求10所述的由甜菊苷制备莱苞迪甙A的方法，其中反应温度为20℃至60℃，反应pH在pH5至pH10的范围内。
12.根据权利要求10或11所述的制备莱苞迪甙A的方法，其中蔗糖合成酶获自稻米、玉米、小麦、竹、拟南芥、草、大麦、高粱或马铃薯。
13.根据权利要求10至12任一项所述的由甜菊苷制备莱苞迪甙A的方法，其中糖基转移酶获自水稻、甜叶菊、绿竹、二穗短柄草、大麦、二色高粱、玉蜀黍或拟南芥。
14.通过权利要求1-13中任一项所述的方法制备的莱苞迪甙A。
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