JP2000245279A - 植物の耐冷性の増強方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ショ糖を分解する酵素をコードする遺伝子を
含む発現ベクター、この発現ベクターを利用した植物へ
の耐冷性を付与する方法を提供する。 【解決手段】 ショ糖を分解する酵素の遺伝子を少なく
とも葯で発現するプロモーターの下流に接続した発現ベ
クターを構築し、この発現ベクターを植物に組み込むこ
とで、植物体内でショ糖を分解する酵素発現させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、植物の遺伝子工学
的手法、具体的には遺伝子組換えによる形質転換植物の
作出や高機能植物の育成に関する。

【０００２】

【従来の技術】作物の生育・生産は環境温度に大きく依
存しており、従って、異常気象などによって生育適温を
大きくはずれた場合には、作物の生産は大きく低下する
か、あるいは皆無となることもある。現在、異常気象に
よる農作物の被害は世界各地で頻繁に起こっており、そ
のような地域では食糧不足が現実的な問題となってい
る。

【０００３】作物によって生育適温は多様で、温度に対
する反応は相対的なものであるが、例えば、適温を下回
る低温に遭遇した場合、種子の発芽、植物体の生育、開
花結実などが著しく阻害される。特に、熱帯や亜熱帯起
源の作物の多くは低温に敏感で、０〜１２℃程度で生育
は大きく阻害される。例えば、熱帯起源のイネは３０℃
前後が生育適温であり、１４〜１６℃の低温で成長の抑
制・停止が起こり、さらに花粉は致命的な打撃を受け
る。これに対して、温帯起源の麦類はイネよりも低温で
良好な生育を示し、０℃程度の低温でも生育障害を起こ
すことは稀である。前者のように低温障害を受けやすい
作物として、例えば、イネ、トウモロコシ、サツマイ
モ、バナナ、カボチャ、キュウリ、ナス等が挙げられ
る。また、後者のように低温耐性のある作物として、コ
ムギ、オオムギ、ダイコン、ホウレンソウ、キャベツ、
エンドウ等が挙げられる。

【０００４】全世界人口の４５％をまかなっている４大
作物の一つであるイネは熱帯起源の作物で、品種改良に
よって低温への適応性は向上してはいるものの、生育期
間中に低温に見舞われると生産は大きく減少する。この
現象は冷害と呼ばれるが、イネの冷害は大きく２つに分
類されている。すなわち、生育初期の低温によって成長
が抑制される遅延型冷害と、穂孕み期と呼ばれる花粉形
成時の低温によって不稔が多発する障害型冷害である。
イネの収量に最も大きな影響を及ぼすのが後者の障害型
冷害で、耐冷性の低いとされる品種の「ササニシキ」で
は穂孕み期の平均気温が２１．５℃前後でも障害を受け
る。

【０００５】低温による障害型不稔発生のメカニズムは
未だ明らかではなく、多数の仮説があるが未だ推測の域
を出ていない。例えば、穂孕み期の低温によるイネ葯中
の生理的変化について精力的な解析が進められ、還元
糖、デンプン、タンパク質、アミノ酸、リン脂質、核酸
の含有量が低下することや、ショ糖が蓄積することが明
らかにされていた。また、イネの葯には不飽和脂肪酸で
あるリノレン酸が殆ど含まれていないことなども解析の
結果判明している。しかしながら、これらの生理的変化
と低温による不稔の誘発との直接的な関連は全く不明で
あった。

【０００６】従来、障害型冷害を克服するため、比較的
低温に強い品種の交配による耐冷性品種の育種が試みら
れてきた。この品種改良では耐冷性と共に収量性や品質
などの実用形質面でも優れた品種の育成が求められてき
た。交配育種によって育成された耐冷性の実用品種の一
つに「ひとめぼれ」が挙げられ、低温耐性限度温度は１
９．５℃にまで向上している。このような品種改良の成
果はイネ栽培の北限を北上させ、北海道南部でもイネの
栽培が可能となっている。しかしながら、北海道では４
年に１度は冷害に見舞われ、米生産は大きな打撃を受け
ている。このため、さらなる耐冷性向上が求められてい
る。そのため、交配の遺伝資源として日本国外の高度耐
冷性品種の利用がはかられている。しかしながら、実用
形質を維持しながら極めて多数の劣悪形質を有する日本
国外の高度耐冷性品種から耐冷性のみを導入することは
難しい。

【０００７】その一方で、遺伝子操作による耐冷性の向
上も試みられている。上記のようにイネの葯では不飽和
脂肪酸のリノレン酸が極度に少ないことが知られてお
り、このことがイネの穂孕み期の耐冷性が弱い原因の一
つと推測されていた。そこで、脂肪酸の不飽和度を向上
させることで膜の相転移温度を改変し、耐冷性を向上さ
せる事が試みられている。そのため、ω−３脂肪酸不飽
和化酵素やアシルトランスフェラーゼの遺伝子を操作し
た形質転換植物が作出され、低温に対する感受性が変化
することが報告されている。しかしながら、これらの方
法でイネで穂孕み期の耐冷性が向上した例は無く、実用
上有効な耐冷性が得られるか否かについては全く不明で
あった。

【０００８】また、低温で影響を受けるとされる糖代謝
に至っては、不稔との直接的な関係はまったく不明で、
従って、糖代謝を制御することで耐冷性が向上するか否
かについては、全く不明であった。さらには、遺伝子工
学的手法で糖代謝を改変することで耐冷性を向上させる
試みは皆無であった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、植物
の耐冷性、特に、イネの穂孕み期の耐冷性を向上させる
ことにある。そこで本発明では、葯に蓄積したショ糖を
分解することによって耐冷性を向上させる方法およびこ
れによって得られる耐冷性植物を提供することを目的と
する。さらに言えば、本発明はショ糖を分解する酵素の
遺伝子を植物体内、特に葯で発現するプロモーターの下
流に連結した発現ベクターを提供し、さらに、該発現ベ
クターを組み込むことによって穂孕み期の耐冷性を向上
させたイネを提供する事を目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、低温条件
で葯に蓄積するショ糖に着目した。このショ糖を分解す
る酵素の遺伝子を用い、イネの葯で発現するプロモータ
ーの下流に連結した発現ベクターを構築した。この発現
ベクターを植物に遺伝子導入することで、葯でのショ糖
分解活性を向上させることに成功し、さらに、発現ベク
ターを組み込んだ形質転換植物が低温条件下でも不稔と
はならず、正常に稔実出来ることを見出し、本発明を完
成するに至った。

【００１１】則ち、本発明は、以下の［１］〜［５］に
関するものである。 ［１］ ショ糖を分解する酵素をコードする遺伝子を植
物の体内で発現可能なプロモーターの下流に連結させた
ＤＮＡを有する発現ベクターを植物に導入し、ショ糖を
分解する酵素を植物体内で発現させることによって、植
物の耐冷性を向上させる方法。 ［２］ 上記［１］に記載の方法に使用される発現ベク
ター。 ［３］ 上記［２］に記載の発現ベクターを保持する形
質転換植物。 ［４］ 上記［２］に記載の発現ベクターを保持する形
質転換イネ。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明で言う耐冷性とは、低温に
よって引き起こされる様々な生育障害のうち、特に、花
粉の発達が影響を受ける事によって不稔が多発する障害
型冷害に対して、低温条件下でも不稔を軽減または回避
できる特性を指す。

【００１３】また、本発明で言うショ糖を分解する酵素
とは、二糖類であるショ糖を単糖のフルクトースとグル
コースに分解する反応を触媒する酵素を指す。この反応
を触媒する酵素としては、スクラーゼ（α−Ｄ−グルコ
ヒドラーゼ；ＥＣ３．２．１．４８）、インベルターゼ
（β−Ｄ−フルクトフラノシダーゼ；ＥＣ３．２．１．
２６）およびスクロースシンターゼ（ＵＤＰグルコース
−フルクトースグルコシルトランスフェラーゼ；ＥＣ
２．４．１．１３）が知られている。さらに、ショ糖を
加リン酸分解するスクロースホスホリラーゼ（ＥＣ２．
４．１．７）も微生物で見出されている。特に、インベ
ルターゼとスクロースシンターゼは植物において機能し
ている酵素である。スクロースシンターゼはショ糖をＵ
ＤＰを利用してＵＤＰグルコースとフルクトースに可逆
的に分解する反応を触媒する。また、インベルターゼは
ショ糖を不可逆的にグルコースとフルクトースに分解す
る反応を触媒する。スクロースシンターゼは植物のみに
存在する酵素であるが、インベルターゼは植物のみなら
ず、微生物にも存在している。本発明に言うショ糖を分
解する酵素とは実質的に植物体内でショ糖を分解する機
能を有すれば、何れの生物由来の酵素であってもかまわ
ない。

【００１４】これらショ糖を分解する酵素をコードする
遺伝子が様々な生物種から単離され、それらの塩基配列
が明らかとなっている。例えば、スクロースシンターゼ
をコードする遺伝子は多くの植物種から単離されてお
り、また、同一植物でも複数のアイソザイムが存在する
事が知られている。イネには３種類のアイソザイムが存
在するが、それらに対応する遺伝子も明らかにされ、さ
らには、生体内での役割分担についても推測されてい
る。しかしながら、本発明ではショ糖の分解を触媒する
酵素であれば如何なるものでも使用可能であるので、従
って、これらの酵素をコードする遺伝子であれば如何な
るものでも使用できる。

【００１５】例えば、本発明に言うスクロースシンター
ゼをコードする遺伝子として配列番号１で示されるイネ
由来のｃＤＮＡが挙げられる。また、インベルターゼを
コードする遺伝子として配列番号２で示されるトウモロ
コシ由来の遺伝子が利用できる。

【００１６】一方、本発明に言う、葯で機能するプロモ
ーターとは、少なくとも植物の葯組織で遺伝子を発現さ
せうるＤＮＡを指し、葯組織で機能するもであれば如何
なるものでも構わないが、葯組織で特異的に機能するも
のであればより好ましい。これまでに、イネデンプン枝
付け酵素１、イネ顆粒結合性デンプン合成酵素、イネＯ
ｓｇ６Ｂ等葯組織で発現する遺伝子が幾つか知られてお
り、これら遺伝子の上流領域に存在するものが本発明に
係るプロモーターとして利用できる。

【００１７】以下に、本発明の実施形態として、発現ベ
クターの構築方法ならびに形質転換植物の作製方法につ
いて説明する。 （１）ショ糖を分解する酵素遺伝子の単離 ショ糖を分解する酵素の遺伝子は対応する遺伝子を有す
る生物種から単離する事が出来る。例えば、スクロース
シンターゼはあらゆる植物種から単離する事が出来る。
また、インベルターゼは植物のみならず、微生物からも
遺伝子を単離する事が出来る。

【００１８】ショ糖を分解する酵素をコードする遺伝子
の単離方法について説明する。公知となっている遺伝子
の配列に基づいて互いに向かい合うオリゴヌクレオチド
を合成する。合成したオリゴヌクレオチドをプライマー
とし、ＰＣＲによって遺伝子の一部分または全体を増幅
する。ＰＣＲの鋳型としては、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、全
ＤＮＡ等を用いることができるが、これらから作製した
ｃＤＮＡライブラリーやゲノミックライブラリーも用い
ることができる。

【００１９】あるいは、遺伝子の配列が知られていない
生物種からでもショ糖を分解する酵素の遺伝子を単離す
る事が出来る。すなわち、単離しようとする酵素の公知
となっているアミノ酸配列に対応する複数の配列を持つ
オリゴヌクレオチドが混合された、いわゆる、デジェネ
レートプライマーを用いてＰＣＲによって対応する遺伝
子の一部分もしくは全体を増幅する。さらに、Ｎｅｓｔ
ｅｄ−ＰＣＲと呼ばれるデジェネレートプライマーの内
側の配列を用いて２回目のＰＣＲを実施することで、デ
ジェネレートプライマーを用いた方法の精度を更に高め
ることができる。この場合でも、ＰＣＲの鋳型として
は、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＤＮＡ等を用いることがで
きるが、これらから作製したｃＤＮＡライブラリーやゲ
ノミックライブラリーも用いることができる。

【００２０】増幅された遺伝子が遺伝子の一部分である
場合には、増幅された遺伝子の一部分をプローブとし
て、ｃＤＮＡライブラリーやゲノミックライブラリーか
ら完全長の遺伝子を含むクローンを単離することができ
る。また、増幅された遺伝子の一部分に対応する塩基配
列を基にプライマーを合成し、ＴＡＩＬ−ＰＣＲやＩｎ
ｖｅｒｓｅ−ＰＣＲ等の方法を用いて、全ＤＮＡを鋳型
として遺伝子全体を単離することもできる。

【００２１】また、公知となっている遺伝子の塩基配列
を元にオリゴヌクレオチドを作成し、これをラベルして
プローブとして用いる事ができる。合成したプローブを
用いて、ゲノミックライブラリーあるいはｃＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングし、遺伝子を直接単離するこ
とができる。

【００２２】スクリーニングやＰＣＲの鋳型に供するＤ
ＮＡライブラリーは、遺伝子単離を目的とする生物種の
組織から抽出したＤＮＡやＲＮＡを定法に従って前処理
した後、ｐＵＣ等のプラスミドベクターやあるいはＢＡ
Ｃベクター・λファージベクター等の市販のベクターに
挿入し、大腸菌に導入または感染させることによって構
築することができる。

【００２３】（２）発現ベクターの構築 本発明に言う発現ベクターとは、実質的にショ糖を分解
する酵素をコードしうるｃＤＮＡもしくは遺伝子を植物
体内で機能しうるプロモーターの下流に連結し、その下
流にターミネーターと呼ばれるポリアデニル化シグナル
配列を接続したＤＮＡを、さらに、植物形質転換に用い
ることの出来るベクターに組み込んだものを言う。

【００２４】植物体内でその下流に接続した遺伝子を発
現できるもので有れば如何なるプロモーターであっても
用いることができるが、特に、植物の葯において発現す
るプロモーターが望ましい。さらに、プロモーターが葯
で特異的に発現するものがより好ましい。例えば、葯組
織でも発現するプロモーターとして、デンプン枝付け酵
素１の遺伝子やデンプン合成酵素遺伝子の５’上流領域
のプロモーター活性を有するＤＮＡが利用できる。ま
た、葯特異的に発現するプロモーターとして、例えば、
イネ葯から単離されたＯｓｃ４，Ｏｓｃ６，Ｏｓｇ６Ｂ
プロモーターが利用できる。

【００２５】一方、ターミネーターとしては一般に用い
られている植物で機能するポリアデニレーションシグナ
ルの配列を用いることができる。この様な配列の一例と
して、例えば、ノパリン合成酵素やデンプン合成酵素の
遺伝子のポリアデニレーションシグナル等が挙げられ
る。

【００２６】また、植物の形質転換に用いる事の出来る
ベクターとしては、例えば、市販のｐＵＣ１９等の大腸
菌で増幅可能なベクターやアグロバクテリウムの保持し
ているＴｉプラスミド由来のｐＢＩ１２１（Clonetech
社）等のバイナリーベクターが挙げられる。

【００２７】（３）形質転換植物の作出 構築した上記ベクターを高等植物に導入する方法として
は、植物の形質転換方法として確立している任意の方法
が利用できる。例えば、電気穿孔法、ポリエチレングリ
コール法、マイクロインジェクション法による植物プロ
トプラストへの直接導入法、シリコンカーバイドウィス
カーやパーティクルガンを用いた植物組織への直接導入
法やアグロバクテリウムを介した導入方法を用いる事が
出来る。

【００２８】また、形質転換される植物細胞としては、
導入方法に適した細胞や組織を用いることが出来る。本
発明の発現ベクターを使用でる植物種としては、例え
ば、イネ・トウモロコシ等の単子葉植物、サツマイモ、
バナナ、カボチャ、キュウリ、ナス等の双子葉植物、ま
た、ユーカリ等の木本生植物等が挙げられるが、形質転
換による外来遺伝子の組み込みが可能で有れば、如何な
る植物種であっても構わない。

【００２９】

【実施例】以下に本発明を実施例に基づき更に詳細に説
明する。 ［実施例１］ （１）ＰＣＲによるスクロースシンターゼ遺伝子の部分
配列の増幅 イネ品種"日本晴”の成葉から、 Lichtenstein & Drape
r （（1985） DNA cloning vol.3 Practical approac
h, pp. 67-119, IRL Press, Oxford）の方法に従い、Ｃ
ＴＡＢ法によってＤＮＡを抽出した。配列番号３と配列
番号４で示される配列を持つオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとし、上記ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによってＤ
ＮＡ断片を増幅させた。ＰＣＲはＧｅｎｅＡｍｐ９６０
０システム(ABI社)を使用して行った。 反応液２０μｌ
中には１０ｎｇのＤＮＡ、０．５ｕｎｉｔｓのＡｍｐｌ
ｉＴａｑ(ABI社)、１．５ｎｍｏｌｅのｄＮＴＰ、４ｐ
ｍｏｌｅのｐｒｉｍｅｒ（配列番号３）、４ｐｍｏｌｅ
のｐｒｉｍｅｒ（配列番号４）、１０ｍＭのＴｒｉｓ−
Ｈｃｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭ
のＭｇＣｌ₂が含まれる。ＰＣＲ条件は、９５℃で１０
秒間のディネーチャー、６０℃で３０秒間のアニール、
７２℃で１分間の伸長反応を１サイクルとし、４０サイ
クル反応させた。反応液を０．８％Ａｇａｒｏｓｅで分
画し、増幅された分子量が約９００ｂｐのＤＮＡ断片を
ゲルから回収した。回収したＤＮＡ断片をＴＡクローニ
ングキット（In Vitrogen社）を用いｐＣＲ^TMＩＩにサ
ブクローニングし、得られたクローンの塩基配列を３７
３Ａ ＤＮＡシークエンサー（ABI社）を用いて決定し
た。増幅されたＤＮＡ断片は配列番号５に示すように８
５７ｂｐからなり、イネのスクロースシンターゼ遺伝子
の一部分に対応していた。このプラスミドをＳＳ７８と
名付けた。

【００３０】（２）ｃＤＮＡライブラリーの構築 イネ品種‘日本晴’の出穂後１５日目の未熟種子からｍ
ＲＮＡを抽出した。未熟種子３０ｇを液体窒素中で完全
に磨砕し、等量のフェノール添加・攪拌後、さらに、等
量のクロロフォルムを添加・懸濁した。遠心後、上清を
取り、再びフェノール／クロロフォルムで精製した。遠
心後、上清に最終濃度２Ｍとなるように塩化リチウムを
添加し、全ＲＮＡを沈殿回収した。さらに、全ＲＮＡか
らＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０（Takara社）を用いてｐ
ｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡ合成キット
（Amersham社）を用いてｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡから２本
鎖のｃＤＮＡを合成した。２本鎖のｃＤＮＡをブラント
エンド化し、さらに、ＥｃｏＲＩメチレースでメチル化
した後、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩリンカー（Takara社）を
ライゲーションした。リンカーを連結したｃＤＮＡをλ
ｇｔ１１（Stratagene社）のＥｃｏＲＩサイトに組み込
んだ後、Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩ Ｇｏｌｄ（Stratage
ne社）を用いてパッケージングし、さらに、大腸菌Ｙ１
０９０株に感染させｃＤＮＡライブラリーを作製した。

【００３１】（３）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニ
ング ５×１０⁴個の組換えファージをプラークハイブリダイ
ゼーションによってスクリーニングした。プローブは、
上記ＳＳ７８をＤＩＧラベリングキット（Boehringer M
annheim社）を用いてＤｉｇｏｘｙｇｅｎｅｉｎで標識
したものを用いた。４２℃で１５時間ハイブリダイゼー
ションを行った後、ＤＩＧディテクションキット（Boeh
ringer Mannheim社）を用いて、陽性プラークを検出し
た。その結果、４個の陽性クローンが得られた。

【００３２】（４）インサートのサブクローニングと塩
基配列の決定 陽性クローンに組み込まれたｃＤＮＡ断片は制限酵素Ｎ
ｏｔＩを用いて切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｉ
Ｉ ＫＳ＋（Stratagene社）のＮｏｔＩサイトにサブク
ローニングした。最長クローンｐＳＳ３の全塩基配列を
３７３Ａ ＤＮＡシークエンサー（ABI社）を用いて決
定した。決定した塩基配列を配列番号６で示した。得ら
れたクローンｐＳＳ３はｃＤＮＡの翻訳開始点から１２
０ｂｐを欠いていた。

【００３３】（５）完全長ｃＤＮＡの合成 スクロースシンターゼのｃＤＮＡの５’側をＰＣＲで増
幅した。すなわち、配列番号７と配列番号８で示される
オリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、上記のｃ
ＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行った。配列
番号７のオリゴヌクレオチドには制限酵素ＫｐｎＩとＸ
ｂａＩの認識部位を付加した。ＰＣＲはＧｅｎｅＡｍｐ
９６００システム（ABI社）を使用し、２０μＬの反応
量で行った。反応液２０μＬ中には１０ｎｇの鋳型ＤＮ
Ａ、０．５ｕｎｉｔｓのＴａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ
（Takara社）、４ｎｍｏｌｅのｄＮＴＰ、１０ｐｍｏｌ
ｅのｐｒｉｍｅｒが含まれる。反応バッファーはＴａｋ
ａｒａ Ｅｘ Ｔａｑに添付のバッファーを用いた。Ｐ
ＣＲの条件は、９５℃１０秒間のディネーチャー、６０
℃で３０秒間のアニール、７２℃で２分間の伸長反応を
１サイクルとし、３０サイクル反応させた。増幅された
ＤＮＡ断片をＴＡクローニングキット（In Vitrogen
社）を用いプラスミドｐＣＲＴＭＩＩにサブクローニン
グした。３７３Ａ ＤＮＡシークエンサー（ABI社）を
用いて塩基配列を解析し、完全な配列を持つクローンｐ
ＳＳＫＥを選抜した。その塩基配列を配列番号９に示し
た。ｐＳＳ３をＰｖｕＩＩで切断し、約１．８ｋｂのｃ
ＤＮＡを切り出した。切り出したｃＤＮＡ断片を平滑末
端処理し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋（St
ratagene社）のＳｍａＩサイトにサブクローニングし、
ｐＳＳＰｖを得た。ｐＳＳＰｖをＥｃｏＲＩとＫｐｎＩ
で切断・開環させ、ｐＳＳＫＥからＫｐｎＩとＥｃｏＲ
Ｉで切り出したインサートを挿入した。これによって、
完全長のｃＤＮＡを含むクローンｐＳＳ２．４を得た。
完全長ｃＤＮＡの配列を配列番号１に示した。

【００３４】［実施例２］ （１）トウモロコシのインベルターゼｃＤＮＡの単離 トウモロコシの種子を暗所において発芽させ、１週間後
に明所に移した。光照射１５時間後に子葉を収穫し、Ｒ
ＮＡ抽出に用いた。全ＲＮＡはChomcynski & Sacchi
((1987) Anal Biochem 162:156-159)の方法に従って抽
出した。すなわち、トウモロコシの子葉５ｇを２０ｍｌ
のｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｄ（４Ｍ グアニニジンイソチオシ
アネート、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５％
（ｗ／ｖ）のザルコシル、０．１Ｍの２−メルカプトエ
タノール）中で磨砕した。抽出液に１／１０量の２Ｍ酢
酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を加え、これに、等量の水
飽和フェノールと１／５量のクロロホルム：イソアミル
（４９：１）を添加・激しく混和した。１５分間氷冷し
た後、４℃、１００００×ｇ、２０分間遠心分離した。
水相を別のチューブに移し、これに等量のイソプロパノ
ールを加え、−２０℃で１時間静置した。４℃、１００
００×ｇで２０分間遠心分離してＲＮＡを沈殿させた。
沈殿を１０ｍｌのｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｄに溶解した。こ
れに等量のイソプロパノールを添加し、−２０℃で１時
間静置した後、４℃、１００００×ｇで１５分間遠心分
離してＲＮＡを再び沈殿させた。沈殿を７０％エタノー
ルでリンスし、減圧乾燥後、５００μｌの水に溶解し、
全ＲＮＡ溶液とした。上記全ＲＮＡを鋳型として、ＲＴ
−ＰＣＲ法でインベルターゼのｃＤＮＡを取得した。Ｒ
Ｔ−ＰＣＲはＧｅｎｅＡｍｐ ＥＺ ｒＴｔｈ ＲＮＡ Ｐ
ＣＲ ｋｉｔ（Perkin Elmer社）を用いて行った。アン
チセンスプライマーとして配列番号１０で示す配列のオ
リゴヌクレオチドを、また、センスプライマーとして配
列番号１１で示す配列のオリゴヌクレオチドを用いた。
反応液５０μｌ中には５００ｎｇのＲＮＡ、１×ＥＺ
Ｂｕｆｆｅｒ、１．２ｍＭのｄＮＴＰ、２．５ｍＭのＭ
ｎ（ＯＡｃ）₂、５ｕｎｉｔｓのｒＴｔｈ ＤＮＡ Ｐｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅ、０．４５μＭのセンスプライマー、
０．４５μＭのアンチセンスプライマーが含まれる。Ｐ
ＣＲはＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００
を用い、以下の反応条件で行った。すなわち、６０℃で
３０分間逆転写反応させた後、９４℃で１５秒間、６０
℃で３０秒間の連続反応を１サイクルとする反応を４０
サイクル行った。引き続いて６０℃で７分間反応させた
後、４℃に保った。反応液を０．８％アガロースで分画
し、約２５０ｂｐの増幅ＤＮＡ断片をゲルから回収し、
ＴＡクローニングキット（In Vitrogen社）を用いプラ
スミドｐＣＲＴＭＩＩにサブクローニングした。増幅さ
れたＤＮＡ断片を含むクローンの塩基配列を３７３Ａ
ＤＮＡシークエンサー（ABI社）を用いて決定した。ト
ウモロコシのインベルターゼのｃＤＮＡを含むクローン
ｐＺＭＩＮＶの配列を配列番号２に示した。

【００３５】［実施例３］ （１）イネのデンプン枝付け酵素１の遺伝子のプロモー
ターの単離 イネ品種“日本晴”の葉から、Lichtenstein & Draper
（(1985) DNA cloningvol.3 Practical approach, pp.
67-119, IRL Press, Oxford）の方法に従い、ＣＴＡＢ
法によって全ＤＮＡを抽出した。全ＤＮＡを鋳型として
ＰＣＲによってイネのデンプン枝付け酵素１をコードす
る遺伝子のプロモーター領域を増幅した。すなわち、配
列番号１２と配列番号１３のプライマーを用いて、以下
の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲはＧｅｎｅＡｍｐ９６
００システム（ABI社）を使用し、２０μｌの反応量で
行った。反応液２０μｌ中には１０ｎｇのＤＮＡ、０．
５ｕｎｉｔｓのＴＡＫＡＲＡ Ｔａｑ（Takara社）、４
ｎｍｏｌｅのｄＮＴＰ、１０ｐｍｏｌｅのｐｒｉｍｅ
ｒ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０
ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂が含まれる。Ｐ
ＣＲ条件は、９５℃で１０秒間のディネーチャー、６０
℃で３０秒間のアニール、７２℃で３０秒間の伸長反応
を１サイクルとし、３５サイクル反応させた。反応後、
０．８％アガロースで分画し、増幅断片を回収した。回
収した断片をＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇキット（Takara
社）を用いて平滑化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ
ＫＳ＋のＥｃｏＲＶサイトにクローニングした。得ら
れたクローンｐＢＥ１Ｐの挿入断片の塩基配列を３７３
Ａ ＤＮＡシークエンサー（ABI社）を用いて決定し、
配列番号１４で示されるイネのデンプン枝付け酵素１の
遺伝子のプロモーター領域が含まれていることを確認し
た。次に、ｐＢＥ１ＰからＨｉｎｃＩＩとＳｍａＩ切り
出したインサートを、ＸｂａＩで開環後、平滑化したｐ
ＵＣ１９に挿入し、ｐＳａｔｏ１を得た。

【００３６】（２）イネの顆粒結合性デンプン合成酵素
遺伝子のターミネーターの単離 配列番号１５と配列番号１６で示すオリゴヌクレオチド
をプライマーとし、上記“日本晴”の全ＤＮＡを鋳型と
してＰＣＲによってイネの顆粒結合性デンプン合成酵素
遺伝子のターミネーター領域を増幅した。ＰＣＲはＧｅ
ｎｅＡｍｐ９６００システム（ABI社）を使用し、２０
μｌの反応量で行った。反応液２０μｌ中には１０ｎｇ
のＤＮＡ、０．５ｕｎｉｔｓのＴＡＫＡＲＡ Ｔａｑ
（Takara社）、４ｎｍｏｌｅのｄＮＴＰ、１０ｐｍｏｌ
ｅのｐｒｉｍｅｒ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂
が含まれる。ＰＣＲ条件は、９５℃で１０秒間のディネ
ーチャー、６０℃で３０秒間のアニール、７２℃で３０
秒間の伸長反応を１サイクルとし、３５サイクル反応さ
せた。反応液を０．８％アガロースで分画し、約７００
ｂｐの増幅ＤＮＡ断片をゲルから回収し、ＴＡクローニ
ングキット（InVitrogen社）を用いプラスミドｐＣＲＴ
ＭＩＩにサブクローニングした。増幅されたＤＮＡ断片
を含むクローンの塩基配列を３７３Ａ ＤＮＡシークエ
ンサー（ABI社）を用いて決定した。イネの顆粒結合性
デンプン合成酵素遺伝子のターミネーターを含むクロー
ンｐＷＡＸＴの配列を配列番号１７に示した。ｐＷＡＸ
Ｔを制限酵素ＳｃａＩとＢｇｌＩＩで切断した後、切り
出されたイネの顆粒結合性デンプン合成酵素遺伝子のタ
ーミネーター領域を含む断片を、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉ
ｎｇキット（Takara社）を用いて平滑化し、ｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋のＨｉｎｃＩＩサイトにク
ローニングし、ｐＳａｔｏ３を得た。

【００３７】［実施例４］ （１）発現ベクターの構築 実施例３で得られた、イネのデンプン枝つけ酵素１遺伝
子のプロモーター部分をｐＳａｔｏ１からＳａｌＩとＢ
ａｍＨＩで切り出した。次に、実施例３で得た顆粒結合
性デンプン合成酵素の遺伝子のターミネーターを含むｐ
Ｓａｔｏ３をＳａｌＩとＢａｍＨＩで開環させ、切り出
したデンプン枝つけ酵素１遺伝子のプロモーター部分を
挿入しｐＳａｔｏ２を得た。実施例１で得られたイネの
スクロースシンターゼの完全長ｃＤＮＡを含むクローン
ｐＳＳ２．４を制限酵素ＸｂａＩで切断し、ｃＤＮＡを
含むＤＮＡ断片を切り出した。これをＸｂａＩで開環さ
せたｐＳａｔｏ２に組み込み、得られたクローンのｃＤ
ＮＡの挿入方向を確認後、ｐＢＥＳＳとした。次に、ｐ
ＢＥＳＳをＢｓｓＨＩＩで処理し、切り出したインサー
トを平滑末端化した。これを、ｐＵＣ１９のＳｍａＩサ
イトにサブクローニングし、ｐＳＢＥＳＳＳを得た。ｐ
ＳＢＥＳＳＳからデンプン枝つけ酵素１のプロモータ
ー、スクロースシンターゼのｃＤＮＡ、顆粒結合性デン
プン合成酵素のターミネーターを連結したＤＮＡ断片を
ＳａｌＩを用いて切り出した。一方、ｐＢＩ１０１から
ＥｃｏＲＩとＳｍａＩでＧＵＳ遺伝子とＮＯＳのターミ
ネーターを含む部分を除去し、平滑末端処理後、ベクタ
ー部分のみを再結合させた。得られたプラスミドをｐＢ
ＩＮＳｍＥとした。このｐＢＩＮＳｍＥをＳａｌＩで開
環させ、上記のｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片と連結するこ
とによって、植物形質転換用バイナリーベクターｐＢＩ
ＮＳＳＫを構築した。構築した発現ベクターｐＢＩＮＳ
ＳＫはエレクトロポレーションによって、アグロバクテ
リウム（ＬＢＡ４４０４）に導入した。

【００３８】（２）形質転換タバコの作製 ｐＢＩＮＳＳＫを保有するアグロバクテリウムを用い、
タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｃｕｍ Ｘａ
ｎｔｈｉｎ）の葉ディスク法によって行った。切り取っ
た無菌苗の葉をアグロバクテリウムを増殖させたプレー
トにのせ、注射針を用いて、葉を突き刺し、傷つける。
３日間共存培養した後、抗生物質として５００μｇ／ｍ
Ｌのカルベニシリンと１００μｇ／ｍＬのカナマイシン
を含み、ＩＡＡ（１×１０^-6Ｍ）とＢＡ（１×１０
^-5Ｍ）を含むＭＳ培地で培養した。この段階で、アグロ
バクテリウムを除菌するとともにｐＢＩＮＳＳＫが組み
込まれた形質転換カルスを形成させた。３〜４週間後、
形成されたカルスから出てきたシュートを切り取り、５
００μｇ／ｍＬのカルベニシリンと１００μｇ／ｍＬの
カナマイシンを含むＭＳ培地に移植した。移植後１〜２
週間後に、発根してきた植物を土に移植し、形質転換植
物を得た。

【００３９】（３）電気穿孔法による形質転換イネの作
製 ｐＢＥＳＳは、Tadaら（(1990) Theor Appl Genet 80:4
75-480））の方法に従って、イネ品種“キヌヒカリ”の
胚盤由来カルスから誘導したプロトプラストに電気穿孔
法で導入した。プロトプラスト培養後、ｐＢＥＳＳが組
み込まれた形質転換カルスをジェネティシンを用いて選
抜した。選抜した耐性カルスから植物体を再生させ、形
質転換イネ植物を得た。形質転換イネは閉鎖系のグロー
スチャンバー内で温度２４℃、湿度６０％、１４時間日
長（７００μｍｏｌ／ｍ２／ｓｅｃ）の環境条件で生育
させた。十分に成長した段階で、日長を８時間の短日条
件とし、自殖種子を形成させた。

【００４０】（４）アグロバクテリウム法による形質転
換イネの作製 ｐＢＩＮＳＳＫを保有するアグロバクテリウムは、Hiei
ら（(1994) Plant Journal 6:271-282））の方法に従
って、イネ品種“キヌヒカリ”の胚盤由来カルスに感染
させた。アグロバクテリウムを除菌後、ｐＢＩＮＳＳＫ
が組み込まれた形質転換カルスをジェネティシンを用い
て選抜した。選抜した耐性カルスから植物体を再生さ
せ、形質転換イネ植物を得た。形質転換イネは閉鎖系の
グロースチャンバー内で温度２４℃、湿度６０％、１４
時間日長（７００μｍｏｌ／ｍ２／ｓｅｃ）の環境条件
で生育させた。十分に成長した段階で、日長を８時間の
短日条件とし、自殖種子を形成させた。

【００４１】［実施例５］ （１）発現ベクターの構築 実施例２で単離したｐＺＭＩＮＶからＸｂａＩでインベ
ルターゼのｃＤＮＡを切り出し、実施例４で構築したｐ
Ｓａｔｏ２のＸｂａＩサイトに組み込み、ｐＢＥＩＮＶ
を得た。次に、ｐＢＥＩＮＶをＢｓｓＨＩＩで処理し、
切り出したインサートを平滑末端化した。これを、ｐＵ
Ｃ１９のＳｍａＩサイトにサブクローニングし、ｐＳＢ
ＥＩＮＶＳを得た。ｐＳＢＥＩＮＶＳからＳａｌＩを用
いてインサートを切り出した。一方、実施例４で構築し
たｐＢＩＮＳｍＥをＳａｌＩで開環させ、上記の切り出
したインサートと連結させ、て植物形質転換用バイナリ
ーベクターｐＢＩＮＢＥＩＮＶを構築した。構築した発
現ベクターｐＢＩＮＢＥＩＮＶはエレクトロポレーショ
ンによって、アグロバクテリウム（ＬＢＡ４４０４）に
導入した。

【００４２】（２）形質転換イネの作出 ｐＢＩＮＢＥＩＮＶを保有するアグロバクテリウムは、
Hieiら（(1994) PlantJournal 6:271-282））の方法に
従って、イネ胚盤由来カルスに感染させた。アグロバク
テリウムを除菌後、ｐＢＩＮＢＥＩＮＶが組み込まれた
形質転換カルスをジェネティシンを用いて選抜した。選
抜した耐性カルスから植物体を再生させ、形質転換イネ
植物を得た。形質転換イネは閉鎖系のグロースチャンバ
ー内で生育させた。

【００４３】［試験例１］実施例４で得た形質転換イネ
の後代を閉鎖系のグロースチャンバー内で温度２４℃、
湿度６０％、１４時間日長（７００μｍｏｌ／ｍ２／ｓ
ｅｃ）の環境条件で生育させた。十分に成長したところ
で、温度２４℃、湿度６０％、８時間日長（７００μｍ
ｏｌ／ｍ２／ｓｅｃ）の環境条件で、７日間短日処理を
行った。その後、温度を１９℃に下げて、４０日間生育
させた。対象として形質転換に用いた品種“キヌヒカ
リ”を同一条件で生育させた。穂を収穫後、稔実率を調
査した。対象品種のキヌヒカリでは低温障害によって稔
実率は２０％であった。これに対して、形質転換イネで
は低温障害が軽減され、稔実率は７０％であった。

【００４４】

【発明の効果】本発明により、ショ糖を分解する酵素の
遺伝子を用いた発現ベクター、該発現ベクターを組み込
んだ形質転換植物が提供され、さらに、形質転換植物で
ショ糖を分解する酵素を発現させることで、植物の耐冷
性を向上させることが出来る。

【００４５】

【配列表】

【００４６】 配列番号：１ 配列の長さ：２４９４ 配列の形：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ． 株名：品種“日本晴” 配列の特徴 配列： CCGGTACCTC TAGAAATTGA GTC ATG GCT GCC AAG CTA GCT CGC CTC CAC AGT 53 Met Ala Ala Lys Leu Ala Arg Leu His Ser 1 5 10 CTC CGC GAA CGC CTC GGT GCC ACC TTC TCG TCT CAT CCC AAT GAG TTG 101 Leu Arg Glu Arg Leu Gly Ala Thr Phe Ser Ser His Pro Asn Glu Leu 15 20 25 ATT GCA CTC TTC TCT AGG TAT GTT AAC CAG GGA AAG GGA ATG CTC CAG 149 Ile Ala Leu Phe Ser Arg Tyr Val Asn Gln Gly Lys Gly Met Leu Gln 30 35 40 CGT CAC CAG CTG CTT GCG GAG TTC GAT GCC TTG ATC GAA GCT GAC AAA 197 Arg His Gln Leu Leu Ala Glu Phe Asp Ala Leu Ile Glu Ala Asp Lys 45 50 55 GAG AAA TAT GCT CCC TTT GAA GAC ATT CTC CGG GCT GCT CAG GAA GCC 245 Glu Lys Tyr Ala Pro Phe Glu Asp Ile Leu Arg Ala Ala Gln Glu Ala 60 65 70 75 ATT GTG CTG CCG CCC TGG GTT GCA CTG GCC ATC AGG CCA AGG CCT GGT 293 Ile Val Leu Pro Pro Trp Val Ala Leu Ala Ile Arg Pro Arg Pro Gly 80 85 90 GTC TGG GAC TAC ATT CGG GTG AAT GTA AGT GAG TTG GCA GTG GAA GAG 341 Val Trp Asp Tyr Ile Arg Val Asn Val Ser Glu Leu Ala Val Glu Glu 95 100 105 CTG AGT GTT TCT GAG TAC TTG GCA TTC AAG GAA CAG CTT GTT GAT GGA 389 Leu Ser Val Ser Glu Tyr Leu Ala Phe Lys Glu Gln Leu Val Asp Gly 110 115 120 CAC ACC AAC AGC AAC TTT GTT CTT GAG CTT GAT TTT GAG CCC TTC AAT 437 His Thr Asn Ser Asn Phe Val Leu Glu Leu Asp Phe Glu Pro Phe Asn 125 130 135 GCC TCC TTC CCG CGC CCG TCC ATG TCC AAG TCC ATC GGA AAT GGG GTG 485 Ala Ser Phe Pro Arg Pro Ser Met Ser Lys Ser Ile Gly Asn Gly Val 140 145 150 155 CAG TTC CTT AAC CGT CAC CTG TCG TCC AAG TTG TTC CAG GAC AAG GAG 533 Gln Phe Leu Asn Arg His Leu Ser Ser Lys Leu Phe Gln Asp Lys Glu 160 165 170 AGC CTC TAC CCC TTG CTG AAC TTC CTG AAA GCC CAT AAC CAC AAG GGC 581 Ser Leu Tyr Pro Leu Leu Asn Phe Leu Lys Ala His Asn His Lys Gly 175 180 185 ACG ACA ATG ATG CTG AAT GAC AGA ATT CAG AGC CTT CGT GGG CTC CAA 629 Thr Thr Met Met Leu Asn Asp Arg Ile Gln Ser Leu Arg Gly Leu Gln 190 195 200 TCA TCC CTT AGA AAG GCA GAA GAA TAT CTG ATG GGC ATT CCT CAA GAC 677 Ser Ser Leu Arg Lys Ala Glu Glu Tyr Leu Met Gly Ile Pro Gln Asp 205 210 215 ACG CCC TAC TCG GAG TTC AAC CAC AGG TTC CAA GAG CTC GGT TTG GAG 725 Thr Pro Tyr Ser Glu Phe Asn His Arg Phe Gln Glu Leu Gly Leu Glu 220 225 230 235 AAG GGT TGG GGT GAC TGT GCA AAG CGT GTG CTT GAC ACC ATC CAC TTG 773 Lys Gly Trp Gly Asp Cys Ala Lys Arg Val Leu Asp Thr Ile His Leu 240 245 250 CTT CTT GAC CTT CTT GAG GCC CCT GAT CCG GCC AAC TTG GAG AAG TTC 821 Leu Leu Asp Leu Leu Glu Ala Pro Asp Pro Ala Asn Leu Glu Lys Phe 255 260 265 CTT GGA ACT ATT CCA ATG ATG TTC AAT GTT GTT ATC CTG TCT CCG CAT 869 Leu Gly Thr Ile Pro Met Met Phe Asn Val Val Ile Leu Ser Pro His 270 275 280 GGA TAC TTT GCC CAA TCC AAT GTG TTG GGA TAC CCT GAT ACT GGT GGT 917 Gly Tyr Phe Ala Gln Ser Asn Val Leu Gly Tyr Pro Asp Thr Gly Gly 285 290 295 CAG GTT GTG TAC ATT TTG GAC CAA GTC CGC GCT TTG GAG AAT GAG ATG 965 Gln Val Val Tyr Ile Leu Asp Gln Val Arg Ala Leu Glu Asn Glu Met 300 305 310 315 CTT TTG AGG ATC AAG CAG CAA GGC CTT GAT ATC ACA CCT AAG ATC CTC 1013 Leu Leu Arg Ile Lys Gln Gln Gly Leu Asp Ile Thr Pro Lys Ile Leu 320 325 330 ATT GTA ACC AGG CTG TTG CCT GAT GCT GTT GGT ACT ACA TGC GGC CAG 1061 Ile Val Thr Arg Leu Leu Pro Asp Ala Val Gly Thr Thr Cys Gly Gln 335 340 345 CGT GTG GAG AAG GTT ATT GGA ACT GAG CAC ACT GAC ATT CTT CGT GTT 1109 Arg Val Glu Lys Val Ile Gly Thr Glu His Thr Asp Ile Leu Arg Val 350 355 360 CCA TTC AGG AGT GAG AAT GGT ATC CTC CGC AAG TGG ATC TCC CGT TTT 157 Pro Phe Arg Ser Glu Asn Gly Ile Leu Arg Lys Trp Ile Ser Arg Phe 365 370 375 GAT GTC TGG CCA TTC CTG GAA ACA TAC ACT GAG GAT GTT GCA AAC GAA 1205 Asp Val Trp Pro Phe Leu Glu Thr Tyr Thr Glu Asp Val Ala Asn Glu 380 385 390 395 ATT ATG AGG GAA ATG CAA GCC AAA CCT GAT CTC ATC ATT GGC AAT TAC 1253 Ile Met Arg Glu Met Gln Ala Lys Pro Asp Leu Ile Ile Gly Asn Tyr 400 405 410 AGT GAT GGA AAC CTT GTT GCC ACT CTG CTG GCT CAC AAA TTA GGA GTT 1301 Ser Asp Gly Asn Leu Val Ala Thr Leu Leu Ala His Lys Leu Gly Val 415 420 425 ACC CAG TGT ACC ATT GCT CAT GCC TTG GAG AAA ACC AAA TAC CCC AAC 1349 Thr Gln Cys Thr Ile Ala His Ala Leu Glu Lys Thr Lys Tyr Pro Asn 430 435 440 TCA GAC ATA TAC TTG GAC AAG TTT GAC AGC CAG TAC CAC TTC TCA TGC 1397 Ser Asp Ile Tyr Leu Asp Lys Phe Asp Ser Gln Tyr His Phe Ser Cys 445 450 455 CAA TTC ACT GCT GAT CTT ATC GCC ATG AAT CAC ACT GAT TTC ATC ATC 1445 Gln Phe Thr Ala Asp Leu Ile Ala Met Asn His Thr Asp Phe Ile Ile 460 465 470 475 ACC AGT ACA TTC CAA GAA ATT GCT GGA AGC AAG GAC ACT GTG GGG CAG 1493 Thr Ser Thr Phe Gln Glu Ile Ala Gly Ser Lys Asp Thr Val Gly Gln 480 485 490 TAT GAA TCA CAC ATT GCA TTC ACC CTT CCT GGG CTT TAC CGA GTT GTG 1541 Tyr Glu Ser His Ile Ala Phe Thr Leu Pro Gly Leu Tyr Arg Val Val 495 500 505 CAT GGC ATA GAT GTT TTT GAT CCC AAG TTC AAC ATT GTC TCT CCT GGA 1589 His Gly Ile Asp Val Phe Asp Pro Lys Phe Asn Ile Val Ser Pro Gly 510 515 520 GCT GAC ATG AGT GTC TAC TTC CCG TAC ACC GAG GCT GAC AAG AGG CTC 1637 Ala Asp Met Ser Val Tyr Phe Pro Tyr Thr Glu Ala Asp Lys Arg Leu 525 530 535 ACT GCT TTC CAC CCT GAA ATT GAG GAG CTT CTC TAC AGT GAA GTC GAG 1685 Thr Ala Phe His Pro Glu Ile Glu Glu Leu Leu Tyr Ser Glu Val Glu 540 545 550 555 AAC GAT GAA CAC AAG TTT GTA TTG AAG GAC AAG AAC AAG CCA ATC ATC 1733 Asn Asp Glu His Lys Phe Val Leu Lys Asp Lys Asn Lys Pro Ile Ile 560 565 570 TTC TCC ATG GCT CGT CTT GAC CGA GTG AAG AAC ATG ACA GGT CTG GTT 1781 Phe Ser Met Ala Arg Leu Asp Arg Val Lys Asn Met Thr Gly Leu Val 575 580 585 GAG ATG TAT GGT AAG AAT GCA CAT CTC AGG GAT TTG GCA AAC CTT GTG 1829 Glu Met Tyr Gly Lys Asn Ala His Leu Arg Asp Leu Ala Asn Leu Val 590 595 600 ATT GTT TGT GGT GAC CAC GGC AAT CAG TCC AAG GAC AGG GAG GAG CAG 1877 Ile Val Cys Gly Asp His Gly Asn Gln Ser Lys Asp Arg Glu Glu Gln 605 610 615 GCT GAG TTC AAG AAG ATG TAC GGT CTC ATT GAC CAG TAC AAG TTG AAG 1925 Ala Glu Phe Lys Lys Met Tyr Gly Leu Ile Asp Gln Tyr Lys Leu Lys 620 625 630 635 GGG CAT ATC CGC TGG ATC TCA GCT CAG ATG AAC CGT GTT CGT AAC GGG 1973 Gly His Ile Arg Trp Ile Ser Ala Gln Met Asn Arg Val Arg Asn Gly 640 645 650 GAG TTG TAC CGA TAC ATT TGT GAC ACC AAG GGA GTC TTT GTC CAG CCT 2021 Glu Leu Tyr Arg Tyr Ile Cys Asp Thr Lys Gly Val Phe Val Gln Pro 655 660 665 GCA TTC TAT GAA GCG TTT GGT CTG ACT GTC ATC GAA GCC ATG ACA TGT 2069 Ala Phe Tyr Glu Ala Phe Gly Leu Thr Val Ile Glu Ala Met Thr Cys 670 675 680 GGT TTG CCA ACA ATC GCA ACA TGC CAT GGT GGC CCT GCT GAG ATT ATT 2117 Gly Leu Pro Thr Ile Ala Thr Cys His Gly Gly Pro Ala Glu Ile Ile 685 690 695 GTT GAT GGG GTG TCT GGT CTG CAC ATT GAT CCT TAC CAC AGT GAC AAG 2165 Val Asp Gly Val Ser Gly Leu His Ile Asp Pro Tyr His Ser Asp Lys 700 705 710 715 GCT GCT GAT ATC TTG GTC AAC TTC TTT GAG AAG TGC AAG CAG GAT TCA 2213 Ala Ala Asp Ile Leu Val Asn Phe Phe Glu Lys Cys Lys Gln Asp Ser 720 725 730 ACC TAC TGG GAC AAT ATT TCA CAG GGA GGT CTG CAG AGG ATT TAC GAG 2261 Thr Tyr Trp Asp Asn Ile Ser Gln Gly Gly Leu Gln Arg Ile Tyr Glu 735 740 745 AAG TAC ACC TGG AAG CTG TAC TCT GAG AGG CTG ATG ACC TTG ACT GGT 2309 Lys Tyr Thr Trp Lys Leu Tyr Ser Glu Arg Leu Met Thr Leu Thr Gly 750 755 760 GTA TAC GGA TTC TGG AAG TAC GTA AGC AAC CTT GAG AGG CGC GAG ACT 2357 Val Tyr Gly Phe Trp Lys Tyr Val Ser Asn Leu Glu Arg Arg Glu Thr 765 770 775 CGC CGT TAC ATT GAG ATG TTC TAT GCT CTG AAA TAC CGC AGC CTG GCC 2405 Arg Arg Tyr Ile Glu Met Phe Tyr Ala Leu Lys Tyr Arg Ser Leu Ala 780 785 790 795 AGC GCC GTC CCA TTG GCT GTC GAT GGA GAG AGC ACA TCC AAG 2447 Ser Ala Val Pro Leu Ala Val Asp Gly Glu Ser Thr Ser Lys 800 805 809 TAATGGAGGG GAAAATATGC ATCTTCAGCA GGAGAAGCCG TCAGCTG 2494

【００４７】 配列番号：２ 配列の長さ：２１８７ 配列の形：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：Ｚｅａ ｍａｙｓ．Ｌ 株名：品種 “Ｐｅｔｅｒ ｃｏｒｎ” 配列の特徴 配列： AGCCTGGTGT TTCCGGAGGA GACAGAC ATG ATC CCT GCC GTT GCT GAT CCG 51 Met Ile Pro Ala Val Ala Asp Pro 1 5 ACG ACG CTG GAC GGC GGG GGC GCG CGC AGG CCG TTG CTC CCG GAG ACG 99 Thr Thr Leu Asp Gly Gly Gly Ala Arg Arg Pro Leu Leu Pro Glu Thr 10 15 20 GAC CCT CGG GGG CGT GCT GCC GCC GGC GCC GAG CAG AAG CGG CCG CCG 147 Asp Pro Arg Gly Arg Ala Ala Ala Gly Ala Glu Gln Lys Arg Pro Pro 25 30 35 40 GCT ACG CCG ACC GTT CTC ACC GCC GTC GTC TCC GCC GTG CTC CTG CTC 195 Ala Thr Pro Thr Val Leu Thr Ala Val Val Ser Ala Val Leu Leu Leu 45 50 55 GTC CTC GTG GCG GTC ACA GTC CTC GCG TCG CAG CAC GTC GAC GGG CAG 243 Val Leu Val Ala Val Thr Val Leu Ala Ser Gln His Val Asp Gly Gln 60 65 70 GCT GGG GGC GTT CCC GCG GGC GAA GAT GCC GTC GTC GTC GAG GTG GCC 291 Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Glu Asp Ala Val Val Val Glu Val Ala 75 80 85 GCC TCC CGT GGC GTG GCT GAG GGC GTG TCG GAG AAG TCC ACG GCC CCG 339 Ala Ser Arg Gly Val Ala Glu Gly Val Ser Glu Lys Ser Thr Ala Pro 90 95 100 CTC CTC GGC TCC GGC GCG CTC CAG GAC TTC TCC TGG ACC AAC GCG ATG 387 Leu Leu Gly Ser Gly Ala Leu Gln Asp Phe Ser Trp Thr Asn Ala Met 105 110 115 120 CTG GCG TGG CAG CGC ACG GCG TTC CAC TTC CAG CCC CCC AAG AAC TGG 435 Leu Ala Trp Gln Arg Thr Ala Phe His Phe Gln Pro Pro Lys Asn Trp 125 130 135 ATG AAC GAT CCG AAC GGT CCG CTG TAT CAC AAG GGC TGG TAC CAC CTC 483 Met Asn Asp Pro Asn Gly Pro Leu Tyr His Lys Gly Trp Tyr His Leu 140 145 150 TTC TAC CAG TGG AAC CCG GAC TCC GCG GTA TGG GGC AAC ATC ACC TGG 531 Phe Tyr Gln Trp Asn Pro Asp Ser Ala Val Trp Gly Asn Ile Thr Trp 155 160 165 GGC CAC GCC GTC TCG CGC GAC CTC CTC CAC TGG CTG CAC CTA CCG CTG 579 Gly His Ala Val Ser Arg Asp Leu Leu His Trp Leu His Leu Pro Leu 170 175 180 GCC ATG GTG CCC GAT CAC CCG TAC GAC GCC AAC GGC GTC TGG TCC GGG 627 Ala Met Val Pro Asp His Pro Tyr Asp Ala Asn Gly Val Trp Ser Gly 185 190 195 200 TCG GCG ACG CGC CTG CCC GAC GGC CGG ATC GTC ATG CTC TAC ACG GGC 675 Ser Ala Thr Arg Leu Pro Asp Gly Arg Ile Val Met Leu Tyr Thr Gly 205 210 215 TCC ACG GCG GAG TCG TCG GCG CAG GTG CAG AAC CTC GCG GAG CCG GCC 723 Ser Thr Ala Glu Ser Ser Ala Gln Val Gln Asn Leu Ala Glu Pro Ala 220 225 230 GAC GCG TCC GAC CCG CTG CTG CGG GAG TGG GTC AAG TCG GAC GCC AAC 771 Asp Ala Ser Asp Pro Leu Leu Arg Glu Trp Val Lys Ser Asp Ala Asn 235 240 245 CCG GTG CTG GTG CCG CCG CCG GGC ATC GGG CCG ACG GAC TTC CGC GAC 819 Pro Val Leu Val Pro Pro Pro Gly Ile Gly Pro Thr Asp Phe Arg Asp 250 255 260 CCG ACG ACG GCG TGT CGG ACG CCG GCC GGC AAC GAC ACG GCG TGG CGG 867 Pro Thr Thr Ala Cys Arg Thr Pro Ala Gly Asn Asp Thr Ala Trp Arg 265 270 275 280 GTC GCC ATC GGG TCC AAG GAC CGG GAC CAC GCG GGG CTG GCG CTG GTG 915 Val Ala Ile Gly Ser Lys Asp Arg Asp His Ala Gly Leu Ala Leu Val 285 290 295 TAC CGG ACG GAG GAC TTC GTG CGG TAC GAC CCG GCG CCG GCG CTG ATG 963 Tyr Arg Thr Glu Asp Phe Val Arg Tyr Asp Pro Ala Pro Ala Leu Met 300 305 310 CAC GCC GTG CCG GGC ACC GGC ATG TGG GAG TGC GTG GAC TTC TAC CCG 1011 His Ala Val Pro Gly Thr Gly Met Trp Glu Cys Val Asp Phe Tyr Pro 315 320 325 GTG GCC GCG GGA TCA GGC GCC GCG GCG GGC AGC GGG GAC GGG CTG GAG 1059 Val Ala Ala Gly Ser Gly Ala Ala Ala Gly Ser Gly Asp Gly Leu Glu 330 335 340 ACG TCC GCG GCG CCG GGA CCC GGG GTG AAG CAC GTG CTC AAG GCT AGC 1107 Thr Ser Ala Ala Pro Gly Pro Gly Val Lys His Val Leu Lys Ala Ser 345 350 355 360 CTC GAC GAC GAC AAG CAC GAC TAC TAC GCG ATC GGC ACC TAC GAC CCG 1155 Leu Asp Asp Asp Lys His Asp Tyr Tyr Ala Ile Gly Thr Tyr Asp Pro 365 370 375 GCG ACG GAC ACC TGG ACC CCC GAC AGC GCG GAG GAC GAC GTC GGG ATC 1203 Ala Thr Asp Thr Trp Thr Pro Asp Ser Ala Glu Asp Asp Val Gly Ile 380 385 390 GGC CTC CGG TAC GAC TAT GGC AAG TAC TAC GCG TCG AAG ACC TTC TAC 1253 Gly Leu Arg Tyr Asp Tyr Gly Lys Tyr Tyr Ala Ser Lys Thr Phe Tyr 395 400 405 GAC CCC GTC CTT CGC CGG CGG GTG CTC TGG GGG TGG GTC GGC GAG ACC 1301 Asp Pro Val Leu Arg Arg Arg Val Leu Trp Gly Trp Val Gly Glu Thr 410 415 420 GAC AGC GAG CGC GCG GAC ATC CTC AAG GGC TGG GCA TCC GTG CAG TCA 1349 Asp Ser Glu Arg Ala Asp Ile Leu Lys Gly Trp Ala Ser Val Gln Ser 425 430 435 440 ATC CCC AGG ACG GTC CTC CTG GAC ACG AAG ACG GGC AGC AAC CTG CTC 1397 Ile Pro Arg Thr Val Leu Leu Asp Thr Lys Thr Gly Ser Asn Leu Leu 445 450 455 CAG TGG CCG GTG GTG GAG GTG GAG AAC CTC CGG ATG AGC GGC AAG AGC 1445 Gln Trp Pro Val Val Glu Val Glu Asn Leu Arg Met Ser Gly Lys Ser 460 465 470 TTC GAC GGC GTC GCG CTG GAC CGC GGA TCC GTC GTG CCC CTC GAC GTC 1493 Phe Asp Gly Val Ala Leu Asp Arg Gly Ser Val Val Pro Leu Asp Val 475 480 485 GGC AAG GCG ACG CAG TTG GAC ATC GAG GCT GTG TTC GAG GTG GAC GCG 1539 Gly Lys Ala Thr Gln Leu Asp Ile Glu Ala Val Phe Glu Val Asp Ala 490 495 500 TCG GAC GCG GCG GGC GTC ACG GAG GCC GAC GTG ACG TTC AAC TGC AGC 1587 Ser Asp Ala Ala Gly Val Thr Glu Ala Asp Val Thr Phe Asn Cys Ser 505 510 515 520 ACC AGC GCA GGC GCG GCG GGC CGG GGC CTG CTC GGC CCG TTC GGC CTT 1635 Thr Ser Ala Gly Ala Ala Gly Arg Gly Leu Leu Gly Pro Phe Gly Leu 525 530 535 CTC GTG CTG GCG GAC GAC GAC TTG TCC GAG CAG ACC GCC GTG TAC TTC 1683 Leu Val Leu Ala Asp Asp Asp Leu Ser Glu Gln Thr Ala Val Tyr Phe 540 545 550 TAC CTG CTC AAG GGC ACG GAC GGC AGC CTC CAA ACT TTC TTC TGC CAA 1731 Tyr Leu Leu Lys Gly Thr Asp Gly Ser Leu Gln Thr Phe Phe Cys Gln 555 560 565 GAC GAG CTC AGG GCA TCC AAG GCG AAC GAT CTG GTT AAG AGA GTA TAC 1779 Asp Glu Leu Arg Ala Ser Lys Ala Asn Asp Leu Val Lys Arg Val Tyr 570 575 580 GGG AGC TTG GTC CCT GTG CTA GAT GGG GAG AAT CTC TCG GTC AGA ATA 1827 Gly Ser Leu Val Pro Val Leu Asp Gly Glu Asn Leu Ser Val Arg Ile 585 590 595 600 CTG GTT GAC CAC TCC ATC GTG GAG AGC TTT GCT CAA GGC GGG AGG ACG 1875 Leu Val Asp His Ser Ile Val Glu Ser Phe Ala Gln Gly Gly Arg Thr 605 610 615 TGC ATC ACG TCG CGA GTG TAC CCC ACA CGA GCC ATC TAC GAC TCC GCC 1923 Cys Ile Thr Ser Arg Val Tyr Pro Thr Arg Ala Ile Tyr Asp Ser Ala 620 625 630 CGC GTC TTC CTC TTC AAC AAC GCC ACA CAT GCT CAC GTC AAA GCA AAA 1971 Arg Val Phe Leu Phe Asn Asn Ala Thr His Ala His Val Lys Ala Lys 635 640 645 TCC GTC AAG ATC TGG CAG CTC AAC TCC GCC TAC ATC CGG CCA TAT CCG 2019 Ser Val Lys Ile Trp Gln Leu Asn Ser Ala Tyr Ile Arg Pro Tyr Pro 650 655 660 GCA ACG ACG ACT TCT CTA TGACTAAATT AAGTGACGGA CATCTAGACG 2067 Ala Thr Thr Thr Ser Leu 665 670

【００４８】 配列番号：３ 配列の長さ：２３ 配列の形：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： AATGGCCAGA CATCAAAACG GGA 23

【００４９】 配列番号：４ 配列の長さ：２３ 配列の形：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： ATGATGCTGA ATGACAGAAT TCA 23

【００５０】 配列番号：５ 配列の長さ：８５７ 配列の形：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic 起源 生物名：Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ． 株名：品種“日本晴” 配列の特徴 配列： ATGATGCTGA ATGACAGAAT TCAGAGCCTT CGTGGGCTCC AATCATCCCT TAGAAAGGCA 60 GAAGAATATC TGATGGGCAT TCCTCAAGAC ACGCCCTACT CGGAGTTCAA CCACAGGTGA 120 TTACTTTATT ATTTCTCCTT ATCATATAGC CCATGTTATA CTACTGCAAA TGGAATAATT 180 CCTTACAATG TGATTCATGA TTTGAATACA GGTTCCAAGA GCTCGGTTTG GAGAAGGGTT 240 GGGGTGACTG TGCAAAGCGT GTGCTTGACA CCATCCACTT GCTTCTTGAC CTTCTTGAGG 300 CCCCTGATCC GGCCAACTTG GAGAAGTTCC TTGGAACTAT TCCAATGATG TTCAATGTTG 360 TTATCCTGTC TCCGCATGGA TACTTTGCCC AATCCAATGT GTTGGGATAC CCTGATACTG 420 GTGGTCAGGT AGAGCTTTTT AACAAATTTT CCCCTTATAT ACAGTACTTC AAATATTTCT 480 AGTTTTGACC TGTTATTCTG TTGTTTGCAG GTTGTGTACA TTTTGGACCA AGTCCGCGCT 540 TTGGAGAATG AGATGCTTTT GAGGATCAAG CAGCAAGGCC TTGATATCAC ACCTAAGATC 600 CTCATTGTAT GTTCAAGATG TTGGTCTTGA ATGTTTCAAG TTTTAAACAC TTCTCAGTGC 660 GAATTGTAGA GTAACGTGCG GACATGATTT TACTTGATGC AGGTAACCAG GCTGTTGCCT 720 GATGCTGTTG GTACTACATG CGGCCAGCGT GTGGAGAAGG TTATTGGAAC TGAGCACACT 780 GACATTCTTC GTGTTCCATT CAGGAGTGAG AATGGTATCC TCCGCAAGTG GATCTCCCGT 840 TTTGATGTCT GGCCATT 857

【００５１】 配列番号６ 配列の長さ：２３６０ｂｐ 配列の形：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ． 株名：品種“日本晴” 配列の特徴 配列： AAG GGA ATG CTC CAG CGT CAC CAG CTG CTT GCG GAG TTC GAT GCC TTG 48 Lys Gly Met Leu Gln Arg His Gln Leu Leu Ala Glu Phe Asp Ala Leu 1 5 10 15 ATC GAA GCT GAC AAA GAG AAA TAT GCT CCC TTT GAA GAC ATT CTC CGG 96 Ile Glu Ala Asp Lys Glu Lys Tyr Ala Pro Phe Glu Asp Ile Leu Arg 20 25 30 GCT GCT CAG GAA GCC ATT GTG CTG CCG CCC TGG GTT GCA CTG GCC ATC 144 Ala Ala Gln Glu Ala Ile Val Leu Pro Pro Trp Val Ala Leu Ala Ile 35 40 45 AGG CCA AGG CCT GGT GTC TGG GAC TAC ATT CGG GTG AAT GTA AGT GAG 192 Arg Pro Arg Pro Gly Val Trp Asp Tyr Ile Arg Val Asn Val Ser Glu 50 55 60 TTG GCA GTG GAA GAG CTG AGT GTT TCT GAG TAC TTG GCA TTC AAG GAA 240 Leu Ala Val Glu Glu Leu Ser Val Ser Glu Tyr Leu Ala Phe Lys Glu 65 70 75 80 CAG CTT GTT GAT GGA CAC ACC AAC AGC AAC TTT GTT CTT GAG CTT GAT 288 Gln Leu Val Asp Gly His Thr Asn Ser Asn Phe Val Leu Glu Leu Asp 85 90 95 TTT GAG CCC TTC AAT GCC TCC TTC CCG CGC CCG TCC ATG TCC AAG TCC 336 Phe Glu Pro Phe Asn Ala Ser Phe Pro Arg Pro Ser Met Ser Lys Ser 100 105 110 ATC GGA AAT GGG GTG CAG TTC CTT AAC CGT CAC CTG TCG TCC AAG TTG 384 Ile Gly Asn Gly Val Gln Phe Leu Asn Arg His Leu Ser Ser Lys Leu 115 120 125 TTC CAG GAC AAG GAG AGC CTC TAC CCC TTG CTG AAC TTC CTG AAA GCC 432 Phe Gln Asp Lys Glu Ser Leu Tyr Pro Leu Leu Asn Phe Leu Lys Ala 130 135 140 CAT AAC CAC AAG GGC ACG ACA ATG ATG CTG AAT GAC AGA ATT CAG AGC 480 His Asn His Lys Gly Thr Thr Met Met Leu Asn Asp Arg Ile Gln Ser 145 150 155 160 CTT CGT GGG CTC CAA TCA TCC CTT AGA AAG GCA GAA GAA TAT CTG ATG 528 Leu Arg Gly Leu Gln Ser Ser Leu Arg Lys Ala Glu Glu Tyr Leu Met 165 170 175 GGC ATT CCT CAA GAC ACG CCC TAC TCG GAG TTC AAC CAC AGG TTC CAA 576 Gly Ile Pro Gln Asp Thr Pro Tyr Ser Glu Phe Asn His Arg Phe Gln 180 185 190 GAG CTC GGT TTG GAG AAG GGT TGG GGT GAC TGT GCA AAG CGT GTG CTT 624 Glu Leu Gly Leu Glu Lys Gly Trp Gly Asp Cys Ala Lys Arg Val Leu 195 200 205 GAC ACC ATC CAC TTG CTT CTT GAC CTT CTT GAG GCC CCT GAT CCG GCC 672 Asp Thr Ile His Leu Leu Leu Asp Leu Leu Glu Ala Pro Asp Pro Ala 210 215 220 AAC TTG GAG AAG TTC CTT GGA ACT ATT CCA ATG ATG TTC AAT GTT GTT 720 Asn Leu Glu Lys Phe Leu Gly Thr Ile Pro Met Met Phe Asn Val Val 225 230 235 240 ATC CTG TCT CCG CAT GGA TAC TTT GCC CAA TCC AAT GTG TTG GGA TAC 768 Ile Leu Ser Pro His Gly Tyr Phe Ala Gln Ser Asn Val Leu Gly Tyr 245 250 255 CCT GAT ACT GGT GGT CAG GTT GTG TAC ATT TTG GAC CAA GTC CGC GCT 816 Pro Asp Thr Gly Gly Gln Val Val Tyr Ile Leu Asp Gln Val Arg Ala 260 265 270 TTG GAG AAT GAG ATG CTT TTG AGG ATC AAG CAG CAA GGC CTT GAT ATC 864 Leu Glu Asn Glu Met Leu Leu Arg Ile Lys Gln Gln Gly Leu Asp Ile 275 280 285 ACA CCT AAG ATC CTC ATT GTA ACC AGG CTG TTG CCT GAT GCT GTT GGT 912 Thr Pro Lys Ile Leu Ile Val Thr Arg Leu Leu Pro Asp Ala Val Gly 290 295 300 ACT ACA TGC GGC CAG CGT GTG GAG AAG GTT ATT GGA ACT GAG CAC ACT 960 Thr Thr Cys Gly Gln Arg Val Glu Lys Val Ile Gly Thr Glu His Thr 305 310 315 320 GAC ATT CTT CGT GTT CCA TTC AGG AGT GAG AAT GGT ATC CTC CGC AAG 1008 Asp Ile Leu Arg Val Pro Phe Arg Ser Glu Asn Gly Ile Leu Arg Lys 325 330 335 TGG ATC TCC CGT TTT GAT GTC TGG CCA TTC CTG GAA ACA TAC ACT GAG 1056 Trp Ile Ser Arg Phe Asp Val Trp Pro Phe Leu Glu Thr Tyr Thr Glu 340 345 350 GAT GTT GCA AAC GAA ATT ATG AGG GAA ATG CAA GCC AAA CCT GAT CTC 1104 Asp Val Ala Asn Glu Ile Met Arg Glu Met Gln Ala Lys Pro Asp Leu 355 360 365 ATC ATT GGC AAT TAC AGT GAT GGA AAC CTT GTT GCC ACT CTG CTG GCT 1152 Ile Ile Gly Asn Tyr Ser Asp Gly Asn Leu Val Ala Thr Leu Leu Ala 370 375 380 CAC AAA TTA GGA GTT ACC CAG TGT ACC ATT GCT CAT GCC TTG GAG AAA 1200 His Lys Leu Gly Val Thr Gln Cys Thr Ile Ala His Ala Leu Glu Lys 385 390 395 400 ACC AAA TAC CCC AAC TCA GAC ATA TAC TTG GAC AAG TTT GAC AGC CAG 1248 Thr Lys Tyr Pro Asn Ser Asp Ile Tyr Leu Asp Lys Phe Asp Ser Gln 405 410 415 TAC CAC TTC TCA TGC CAA TTC ACT GCT GAT CTT ATC GCC ATG AAT CAC 1296 Tyr His Phe Ser Cys Gln Phe Thr Ala Asp Leu Ile Ala Met Asn His 420 425 430 ACT GAT TTC ATC ATC ACC AGT ACA TTC CAA GAA ATT GCT GGA AGC AAG 1344 Thr Asp Phe Ile Ile Thr Ser Thr Phe Gln Glu Ile Ala Gly Ser Lys 435 440 445 GAC ACT GTG GGG CAG TAT GAA TCA CAC ATT GCA TTC ACC CTT CCT GGG 1392 Asp Thr Val Gly Gln Tyr Glu Ser His Ile Ala Phe Thr Leu Pro Gly 450 455 460 CTT TAC CGA GTT GTG CAT GGC ATA GAT GTT TTT GAT CCC AAG TTC AAC 1440 Leu Tyr Arg Val Val His Gly Ile Asp Val Phe Asp Pro Lys Phe Asn 465 470 475 480 ATT GTC TCT CCT GGA GCT GAC ATG AGT GTC TAC TTC CCG TAC ACC GAG 1488 Ile Val Ser Pro Gly Ala Asp Met Ser Val Tyr Phe Pro Tyr Thr Glu 485 490 495 GCT GAC AAG AGG CTC ACT GCT TTC CAC CCT GAA ATT GAG GAG CTT CTC 1536 Ala Asp Lys Arg Leu Thr Ala Phe His Pro Glu Ile Glu Glu Leu Leu 500 505 510 TAC AGT GAA GTC GAG AAC GAT GAA CAC AAG TTT GTA TTG AAG GAC AAG 1584 Tyr Ser Glu Val Glu Asn Asp Glu His Lys Phe Val Leu Lys Asp Lys 515 520 525 AAC AAG CCA ATC ATC TTC TCC ATG GCT CGT CTT GAC CGA GTG AAG AAC 1632 Asn Lys Pro Ile Ile Phe Ser Met Ala Arg Leu Asp Arg Val Lys Asn 530 535 540 ATG ACA GGT CTG GTT GAG ATG TAT GGT AAG AAT GCA CAT CTC AGG GAT 1680 Met Thr Gly Leu Val Glu Met Tyr Gly Lys Asn Ala His Leu Arg Asp 545 550 555 560 TTG GCA AAC CTT GTG ATT GTT TGT GGT GAC CAC GGC AAT CAG TCC AAG 1728 Leu Ala Asn Leu Val Ile Val Cys Gly Asp His Gly Asn Gln Ser Lys 565 570 575 GAC AGG GAG GAG CAG GCT GAG TTC AAG AAG ATG TAC GGT CTC ATT GAC 1776 Asp Arg Glu Glu Gln Ala Glu Phe Lys Lys Met Tyr Gly Leu Ile Asp 580 585 590 CAG TAC AAG TTG AAG GGG CAT ATC CGC TGG ATC TCA GCT CAG ATG AAC 1824 Gln Tyr Lys Leu Lys Gly His Ile Arg Trp Ile Ser Ala Gln Met Asn 595 600 605 CGT GTT CGT AAC GGG GAG TTG TAC CGA TAC ATT TGT GAC ACC AAG GGA 1872 Arg Val Arg Asn Gly Glu Leu Tyr Arg Tyr Ile Cys Asp Thr Lys Gly 610 615 620 GTC TTT GTC CAG CCT GCA TTC TAT GAA GCG TTT GGT CTG ACT GTC ATC 1920 Val Phe Val Gln Pro Ala Phe Tyr Glu Ala Phe Gly Leu Thr Val Ile 625 630 635 640 GAA GCC ATG ACA TGT GGT TTG CCA ACA ATC GCA ACA TGC CAT GGT GGC 1968 Glu Ala Met Thr Cys Gly Leu Pro Thr Ile Ala Thr Cys His Gly Gly 645 650 655 CCT GCT GAG ATT ATT GTT GAT GGG GTG TCT GGT CTG CAC ATT GAT CCT 2016 Pro Ala Glu Ile Ile Val Asp Gly Val Ser Gly Leu His Ile Asp Pro 660 665 670 TAC CAC AGT GAC AAG GCT GCT GAT ATC TTG GTC AAC TTC TTT GAG AAG 2064 Tyr His Ser Asp Lys Ala Ala Asp Ile Leu Val Asn Phe Phe Glu Lys 675 680 685 TGC AAG CAG GAT TCA ACC TAC TGG GAC AAT ATT TCA CAG GGA GGT CTG 2112 Cys Lys Gln Asp Ser Thr Tyr Trp Asp Asn Ile Ser Gln Gly Gly Leu 690 695 700 CAG AGG ATT TAC GAG AAG TAC ACC TGG AAG CTG TAC TCT GAG AGG CTG 2160 Gln Arg Ile Tyr Glu Lys Tyr Thr Trp Lys Leu Tyr Ser Glu Arg Leu 705 710 715 720 ATG ACC TTG ACT GGT GTA TAC GGA TTC TGG AAG TAC GTA AGC AAC CTT 2208 Met Thr Leu Thr Gly Val Tyr Gly Phe Trp Lys Tyr Val Ser Asn Leu 725 730 735 GAG AGG CGC GAG ACT CGC CGT TAC ATT GAG ATG TTC TAT GCT CTG AAA 2256 Glu Arg Arg Glu Thr Arg Arg Tyr Ile Glu Met Phe Tyr Ala Leu Lys 740 745 750 TAC CGC AGC CTG GCC AGC GCC GTC CCA TTG GCT GTC GAT GGA GAG AGC 2304 Tyr Arg Ser Leu Ala Ser Ala Val Pro Leu Ala Val Asp Gly Glu Ser 755 760 765 ACA TCC AAG TAATGGAGGG GAAAATATGC ATCTTCAGCA GGAGAAGCCG TCAGCTG 2360 Thr Ser Lys 770

【００５２】 配列番号：７ 配列の長さ：３２ 配列の形：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： CCGGTACCTC TAGAAATTGA GTCATGGCTG CC 32

【００５３】 配列番号８ 配列の長さ：２２ 配列の形：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： AAGGCTCTGA ATTCTGTCAT TC 22

【００５４】 配列番号９ 配列の長さ：６１７ 配列の形：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ． 株名：品種“日本晴” 配列の特徴 配列： CCGGTACCTC TAGAAATTGA GTC ATG GCT GCC AAG CTA GCT CGC CTC CAC AGT 53 Met Ala Ala Lys Leu Ala Arg Leu His Ser 1 5 10 CTC CGC GAA CGC CTC GGT GCC ACC TTC TCG TCT CAT CCC AAT GAG TTG 101 Leu Arg Glu Arg Leu Gly Ala Thr Phe Ser Ser His Pro Asn Glu Leu 15 20 25 ATT GCA CTC TTC TCT AGG TAT GTT AAC CAG GGA AAG GGA ATG CTC CAG 149 Ile Ala Leu Phe Ser Arg Tyr Val Asn Gln Gly Lys Gly Met Leu Gln 30 35 40 CGT CAC CAG CTG CTT GCG GAG TTC GAT GCC TTG ATC GAA GCT GAC AAA 197 Arg His Gln Leu Leu Ala Glu Phe Asp Ala Leu Ile Glu Ala Asp Lys 45 50 55 GAG AAA TAT GCT CCC TTT GAA GAC ATT CTC CGG GCT GCT CAG GAA GCC 245 Glu Lys Tyr Ala Pro Phe Glu Asp Ile Leu Arg Ala Ala Gln Glu Ala 60 65 70 ATT GTG CTG CCG CCC TGG GTT GCA CTG GCC ATC AGG CCA AGG CCT GGT 293 Ile Val Leu Pro Pro Trp Val Ala Leu Ala Ile Arg Pro Arg Pro Gly 75 80 85 90 GTC TGG GAC TAC ATT CGG GTG AAT GTA AGT GAG TTG GCA GTG GAA GAG 341 Val Trp Asp Tyr Ile Arg Val Asn Val Ser Glu Leu Ala Val Glu Glu 95 100 105 CTG AGT GTT TCT GAG TAC TTG GCA TTC AAG GAA CAG CTT GTT GAT GGA 389 Leu Ser Val Ser Glu Tyr Leu Ala Phe Lys Glu Gln Leu Val Asp Gly 110 115 120 CAC ACC AAC AGC AAC TTT GTT CTT GAG CTT GAT TTT GAG CCC TTC AAT 437 His Thr Asn Ser Asn Phe Val Leu Glu Leu Asp Phe Glu Pro Phe Asn 125 130 135 GCC TCC TTC CCG CGC CCG TCC ATG TCC AAG TCC ATC GGA AAT GGG GTG 485 Ala Ser Phe Pro Arg Pro Ser Met Ser Lys Ser Ile Gly Asn Gly Val 140 145 150 CAG TTC CTT AAC CGT CAC CTG TCG TCC AAG TTG TTC CAG GAC AAG GAG 533 Gln Phe Leu Asn Arg His Leu Ser Ser Lys Leu Phe Gln Asp Lys Glu 155 160 165 170 AGC CTC TAC CCC TTG CTG AAC TTC CTG AAA GCC CAT AAC CAC AAG GGC 581 Ser Leu Tyr Pro Leu Leu Asn Phe Leu Lys Ala His Asn His Lys Gly 175 180 185 ACG ACA ATG ATG CTG AAT GAC AGA ATT CAG AGC CTT 617 Thr Thr Met Met Leu Asn Asp Arg Ile Gln Ser Leu 190 195

【００５５】 配列番号１０ 配列の長さ：２３ 配列の形：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： CTGTCTAGAT GTCCGTCACT TAA 23

【００５６】 配列番号１１ 配列の長さ：２３ 配列の形：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： AGCCTGGTGT TTCCGGAGGA GAC 23

【００５７】 配列番号１２ 配列の長さ：２２ 配列の形：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： ACGCAAATAC ATTTCAAGTG GC 22

【００５８】 配列番号１３ 配列の長さ：２１ 配列の形：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： GGCGACTCCC ATTTCCACAG C 21

【００５９】 配列番号：１４ 配列の長さ：１１６０ 配列の形：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic 起源 生物名：Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ． 株名：品種“日本晴” 配列の特徴 配列： ACGCAAATAC ATTTCAAGTG GCTACTTTTT ATCAAGAAGA CAATAAATTT CAAGCAGATT 60 AAAGTTGAAG AGGAAAATAA ATATGCAGTT CTTTTCTTAT CTTTTCTTCA AGGTTTCATC 120 CAGATGTCCT TGAATCCTTT TTTTTTTTCT TTTTGACAAG AAAACATATG CCTTTGTGCC 180 GGGAATTAAT GGAAAAAGAA CCTTAGTTAA GCTGATCACG CGACAGATTT GGCACAATCA 240 CGTTGTGCTA CATAACACGC ATACAAAGTG ATTATCCTCC TAGGATGCTA TGAGTCACCA 300 AAAGCAACTG ATAACAAGAC GTGAGAGTAG GCCTGTTTAG ATGGGACTAA AACTTTTAAG 360 TCCCTATCAC ATCGGATGTT TGAAAATTAA TTATAAATAT TAAACGTAGA CTATTAATAA 420 AACCCATCCA TAATCTTGGA CTAATTTGCG AGACGAATCT AATGAGCCTA ATTAATCCAT 480 GATTAGCCTA TGTGATGCTA CAGTAAACAT TCTCTAATTA TAGATTAATT AGGCTTAAAA 540 AATTTGTCTC GTGAATTAGC TTTTATTTAT GTAATTAGTT TTGTAAGTAG TCTATATTTA 600 ATACTCTAAA TTAGTGTCTA AAGACAGGGA CTAAAGTTAA GTCCCTGGAT CTAAACACCA 660 CCAAGCTGAT CGAGCAACAA ATACGTTTTA TTCCCCCACT GCTTTAGCTA TCAAAAAGGC 720 CACATAATTA CACATTTTGA CAGAAATCAA AGCTGCTTTT ACCTTGTATG CATTTGCTTT 780 ACTGACAGCT AACAGCAGCA AGCAACCTCA TTTGGATGAA ACAAGCAACA GTGTCAGCAT 840 AGAAATCTCA TTACCTTTCG CTTTTGTCTT GTATTATGAT TTACAGGAAT TCGGTTTGTA 900 TTTATTTGCG TCTGGAAAAA GAAAAGGAAG GAGAGACACG TGAAGGCCCA TGGCAATTGG 960 CCAAAGGCTC CTGGGCACCT CCTGGCCGTC CACGTGGCAG GTGTCCACGT CAGCACTTTG 1020 GCTTTGTTTT CTCCTTTTTT TTTCTCCCAA TTTTCACTCC ACTGCTGCAC AAGCTTTTCC 1080 GTGCTTCCTC GCCGCCTCCG GCCTCCGCTC CGGCGCTATA AATCGCCGCC GATTTCGAA 1140 CTGTGGAAAT GGGAGTCGCC 1160

【００６０】 配列番号１５ 配列の長さ：２２ 配列の形：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： GCTCCTTGAA GAGCCTGAGA TC 22

【００６１】 配列番号１６ 配列の長さ：２１ 配列の形：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： CATGAATAGT ACTTTATACA TGAC 24

【００６２】 配列番号：１７ 配列の長さ：７１４ 配列の形：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic 起源 生物名：Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ． 株名：品種“日本晴” 配列の特徴 配列： GCTCCTTGAA GAGCCTGAGA TCTACATATG GAGTGATTAA TTAATATAGC AGTATATGGA 60 TGAGAGACGA ATGAACCAGT GGTTTGTTTG TTGTAGTGAA TTTGTAGCTA TAGCCAATTA 120 TATAGGCTAA TAAGTTTGAT GTTGTACTCT TCTGGGTGTG CTTAAGTATC TTATCGGACC 180 CTGAATTTAT GTGTGTGGCT TATTGCCAAT AATATTAAGT AATAAAGGGT TTATTATATT 240 ATTATATATG TTATATTATA CTTCCCCTGT TCCATATTAT ACCATGCCAT TTTTGTTTTA 300 TGCCAAGTCA AACTTTTTAT ATTTAACCAA ATTTATAAAA ATAAATATAG CAACATTTGT 360 AATACTGAAC TATTTTTTTG TTAGACAGAC TGTCAAAACT TAAATTATAG GTACTATATT 420 TGTCTCAAAA TATAATAACT TTTAGTTATG TATCTGGGTA TGTGTCTGTC TATATGTGTA 480 GCTAAAAGTT GTTTTGTGTC AAAAAAAATG TTATTATATT TTTTTTATAA ATTTATTTAA 540 GTTTGAAGGA GCAGTAGTTT GACTCAGGAT AAGATGTAAA ATAATTTATA ATATACTCTC 600 TCGTCCCATT TTAAATGCAA CCAAAACTTT GATCGTTTAT CTTATTTATT TTTTTATAAT 660 TAATACTTTT ATTGTTATGA GATAATAAAA CATGAATAGT ACTTTATACA TGAC 714

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD04 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 CD13 CD17 CD21 HA01 4B024 AA08 BA10 BA12 CA04 DA05 EA05 FA02 GA11 HA20 4B065 AA11X AA89X AA89Y AC03 AC20 BA02 CA29 CA31 CA53

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ショ糖を分解する酵素をコードする遺伝
   子を、植物の体内で発現可能なプロモーターの下流に連
   結させたＤＮＡを有する発現ベクターを植物に導入し、
   ショ糖を分解する酵素を植物体内で発現させることによ
   って、植物の耐冷性を向上させる方法。
2. 【請求項２】 植物がイネであることを特徴とする請求
   項１記載の方法。
3. 【請求項３】 ショ糖を分解する酵素がスクロースシン
   ターゼであることを特徴とする請求項１又は２に記載の
   方法。
4. 【請求項４】 スクロースシンターゼのアミノ酸配列が
   配列表の配列番号１で示される事を特徴とする請求項３
   に記載の方法。
5. 【請求項５】 スクロースシンターゼをコードする遺伝
   子の塩基配列が配列表の配列番号１で示される事を特徴
   とする請求項３に記載の方法。
6. 【請求項６】 ショ糖を分解する酵素がインベルターゼ
   であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
7. 【請求項７】 インベルターゼのアミノ酸配列が配列表
   の配列番号２で示される事を特徴とする請求項６に記載
   の方法。
8. 【請求項８】 インベルターゼをコードする遺伝子の塩
   基配列が配列表の配列番号２で示される事を特徴とする
   請求項６に記載の方法。
9. 【請求項９】 植物体内で発現可能なプロモーターが植
   物の葯で発現する事を特徴とする請求項１〜８の何れか
   一項に記載の方法。
10. 【請求項１０】 植物体内で発現可能なプロモーターが
    植物の葯で特異的に発現する事を特徴とする請求項９に
    記載の方法。
11. 【請求項１１】 植物の葯で発現するプロモーターの塩
    基配列が配列表の配列番号１４で示される事を特徴とす
    る請求項９に記載の方法。
12. 【請求項１２】 請求項１〜１１の何れか１項に記載の
    方法に使用される発現ベクター。
13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の発現ベクターを保
    持する形質転換植物。
14. 【請求項１４】 請求項１２に記載の発現ベクターを保
    持する形質転換イネ。