JP2017148050A - ステビオシドからレバウジオシドaを製造する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】微生物由来酵素転換反応においてレバウジオシドAの低い生産率の限界を克服し、生産効率が高いレバウジオシドAの製造方法の提供。【解決手段】1)スクロースとヌクレオチドジホスフェートとをスクロース合成酵素の存在下で反応させ、ブドウ糖が結合されたヌクレオチドジホスフェートを製造するステップ;(2)前記ブドウ糖が結合されたヌクレオチドジホスフェートを糖転移酵素の存在下でステビオシドと反応させ、レバウジオシドAを製造するステップ;を含む、レバウジオシドAの製造方法。【選択図】図3
Description
本発明は、スクロースとステビオシドを原料とし、スクロース合成酵素及び糖転移酵素の反応によってレバウジオシドAを製造する方法に関する。
甘味度が砂糖の200倍以上である高甘味料ステビア(stevia)は、菊科植物であるステビア・レバウディアナ・ベルトニー(Stevia rebaudiana Bertoni)の熱水抽出から得られる。ステビア抽出物の甘味成分中の甘味質が砂糖と最も類似しており、苦味がなく、甘味度が砂糖の400倍と知られているレバウジオシドA(rebaudioside A)は、非改良植物体の場合、抽出物の約20%内外のみを占めており、抽出物中の最も高い含量を示す成分は、レバウジオシドAの前駆体であるステビオシドである。したがって、高純度のレバウジオシドAを生産するためには、レバウジオシドA高含量種子の改良、栽培、収獲、品種管理などの時間とコスト的な面で経済的な問題が伴ってきた。
このような問題を解決するために、ステビオシドをレバウジオシドAに転換しようとする努力が多角的になされてきたが、代表的な例として、土壌微生物由来のベータ―1,3―グルカナーゼを用いて酵素転換反応によってステビオシドにブドウ糖1分子を結合させることによってレバウジオシドAに転換する方法を挙げることができる(大韓民国特許出願公開第2004―0026747号及び米国特許登録第6469947号)。前記酵素転換反応に使用される糖供与基質としては、代表的にベータ―1,3―グルカンであるカードランを例として挙げることができるが、カードランは、溶解度の低い、高価な原料であって、産業化への適用が難しいという短所を有する。また、カビ発酵を通じてステビオシドをレバウジオシド配糖体に転換するという報告があるが、微生物の培養に半月ほど要し、レバウジオシドBなどその他のステビオール配糖体も生産され、最終的なレバウジオシドAへの転換率は40%ほどに留まるという短所がある。
本発明は、前記のように、微生物由来酵素転換反応においてレバウジオシドAの低い生産率の限界を克服し、生産効率が高いレバウジオシドAの製造方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、手順が簡単であり、コストが節減され、時間の消耗が少ないので、産業上の有用性が高いレバウジオシドAの製造方法を提供することを目的とする。
本発明の一様態において、
(1)スクロースとヌクレオチドジホスフェートとをスクロース合成酵素の存在下で反応させ、ブドウ糖が結合されたヌクレオチドジホスフェートを製造するステップ;
(2)前記ブドウ糖が結合されたヌクレオチドジホスフェートを糖転移酵素の存在下でステビオシドと反応させ、レバウジオシドAを製造するステップ;を含む、レバウジオシドAの製造方法が提供される。
(1)スクロースとヌクレオチドジホスフェートとをスクロース合成酵素の存在下で反応させ、ブドウ糖が結合されたヌクレオチドジホスフェートを製造するステップ;
(2)前記ブドウ糖が結合されたヌクレオチドジホスフェートを糖転移酵素の存在下でステビオシドと反応させ、レバウジオシドAを製造するステップ;を含む、レバウジオシドAの製造方法が提供される。
本発明の他の様態において、スクロース、ヌクレオチドジホスフェート、ステビオシド、スクロース合成酵素及び糖転移酵素を同一の反応系で反応させ、レバウジオシドAを製造するステップを含む、ステビオシドからレバウジオシドAを製造する方法が提供される。
本発明の更に他の様態において、本発明に係るレバウジオシドAを製造する方法によって製造されたレバウジオシドAが提供される。
本発明に係るレバウジオシドAの製造方法は、副産物がほとんどない高純度及び高収率のレバウジオシドAを提供する。
本発明に係るレバウジオシドAの製造方法は、安価な原料を用いるので経済的であり、手順が簡単で、時間の消耗が少ないので、レバウジオシドAの大量生産に適している。
本発明の一様態は、
(1)スクロースとヌクレオチドジホスフェートとをスクロース合成酵素の存在下で反応させ、ブドウ糖が結合されたヌクレオチドジホスフェートを製造するステップ;及び
(2)前記ブドウ糖が結合されたヌクレオチドジホスフェートを糖転移酵素の存在下でステビオシドと反応させ、レバウジオシドAを製造するステップ;を含む、レバウジオシドAの製造方法に関する。前記(1)ステップ及び前記(2)ステップは、順次行われてもよく、同一の反応系で連続的に行われてもよいが、同一の反応系で連続的に行われることが好ましい。
(1)スクロースとヌクレオチドジホスフェートとをスクロース合成酵素の存在下で反応させ、ブドウ糖が結合されたヌクレオチドジホスフェートを製造するステップ;及び
(2)前記ブドウ糖が結合されたヌクレオチドジホスフェートを糖転移酵素の存在下でステビオシドと反応させ、レバウジオシドAを製造するステップ;を含む、レバウジオシドAの製造方法に関する。前記(1)ステップ及び前記(2)ステップは、順次行われてもよく、同一の反応系で連続的に行われてもよいが、同一の反応系で連続的に行われることが好ましい。
本発明の他の様態は、スクロース、ヌクレオチドジホスフェート、ステビオシド、スクロース合成酵素及び糖転移酵素を反応させ、レバウジオシドAを製造するステップを含む、ステビオシドからレバウジオシドAを製造する方法に関する。前記スクロース、ヌクレオチドジホスフェート、ステビオシド、スクロース合成酵素及び糖転移酵素の反応は、同一の反応系での反応であってもよい。
本願において、「同一の反応系」という用語は、一つの反応系あるいは反応システムで反応が連続的に起こることを意味する。
スクロース合成酵素は、植物の糖代謝で可逆的に果糖にヌクレオチドジホスフェートが結合されたブドウ糖を転移し、スクロースを生産する役割を担当する。本発明では、5〜10のpH範囲でスクロースとヌクレオチドジホスフェートを反応し、ブドウ糖が結合されたヌクレオチドジホスフェート及び果糖に分離する活性を示す。
前記ブドウ糖が結合されたヌクレオチドジホスフェートは、糖転移酵素によってステビオシドと反応し、レバウジオシドAを生成することができる。
本発明において、前記化学式1及び2は、それぞれ別途の反応器で順次進めれられてもよいが、一つの反応器で連続反応によって進められることが好ましい。
本発明において、前記化学式1と2を一つの反応式で表現すると、下記の通りである。
本発明において、前記のような化学式3によってステビオシド13―O―グルコースのC―3'位置に特異的に一つのグルコースを結合させ、レバウジオシドAを高収率で合成する連続反応システムを提供する。
本発明において、スクロース合成酵素は、米、トウモロコシ、小麦、タケ、シロイヌナズナ、シバ、麦、キビまたはジャガイモに由来したスクロース合成酵素であってもよく、このうち、米、トウモロコシ、小麦、あるいは麦に由来したスクロース合成酵素であることが好ましく、米、特にオリザ・サティバ(Oryza sativa)に由来したスクロース合成酵素であることが特に好ましい。前記スクロース合成酵素は、スクロース合成酵素遺伝子を含有するベクターに形質転換された組換え大腸菌、バシラス、酵母、コリネバクテリウムまたはアグロバクテリウムから生産されたものであってもよい。前記スクロース合成酵素は、前記大腸菌などから生産された後、追加的に精製されたものであってもよい。前記スクロース合成酵素は、当業界に知られており、特別に制限されるものではないが、配列番号3の配列を含んでもよい。
本発明において、スクロースは、スクロース合成酵素の基質として作用し、ヌクレオチドジホスフェートにブドウ糖を提供できるものであれば制限されなく、例えば、原糖または砂糖であってもよい。
本発明において、前記ヌクレオチドジホスフェートとしては、プリンヌクレオチドまたはピリミジンヌクレオチドが使用されてもよく、このうち、ウリジンジホスフェートが使用されることが好ましい。
本発明において、前記(1)ステップまたは化学式1では、反応温度が20℃〜60℃で、反応pHが5〜10の範囲であってもよく、反応温度が30℃〜55℃で、反応pHが6〜9の範囲であることが好ましく、反応温度が35℃〜50℃で、反応pHが7〜8の範囲であることが特に好ましい。本発明において、前記(1)ステップまたは化学式1では、反応時間が30分〜48時間の範囲であって、反応時間が1時間〜36時間の範囲であることが好ましく、反応時間が1時間〜24時間の範囲であることが特に好ましいが、特別な制限はない。
本発明において、糖転移酵素は、オリザ・サティバ(Oryza sativa)、ステビア・レバウディアナ・ベルトニー(Stevia rebaudiana Bertoni)、バンブサ・オルダミイ(Bambusa oldhamii)、ブラキポディウム(Brachypodium distachyon)、ホルデウム・ウルガレ(Hordeum vulgare)、ソルガム・バイカラー(Sorghum bicolor)、ジー・メイズ(Zea mays)、アラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)由来の糖転移酵素であってもよい。前記糖転移酵素は、オリザ・サティバ(Oryza sativa)、ステビア・レバウディアナ・ベルトニー(Stevia rebaudiana Bertoni)、バンブサ・オルダミイ(Bambusa oldhamii)由来の糖転移酵素であることが好ましく、ステビア・レバウディアナ・ベルトニー(Stevia rebaudiana Bertoni)由来の糖転移酵素であることが特に好ましい。前記糖転移酵素は、糖転移酵素遺伝子を含有するベクターに形質転換された組換え大腸菌、バシラス、酵母、コリネバクテリウムまたはアグロバクテリウムから生産されたものであってもよい。前記糖転移酵素は、前記大腸菌などから生産された後、追加的に精製されたものであってもよい。前記糖転移酵素は、当業界に知られており、特別に制限されるものではないが、配列番号4の配列を含むものであってもよい。
本発明において、ステビオシドは、ステビア・リバウンディアナ熱水あるいはエタノール水溶液抽出物またはその精製物、または抽出物のレバウジオシドA生産後の副産物であって、ステビオシドの含量は、全体のステビオール配糖体の重量を基準にして10重量%以上であって、50重量%以上であることが好ましく、70重量%以上であることが特に好ましく、80重量%以上であることがさらに好ましい。
本発明において、前記(2)ステップまたは化学式2では、反応温度が20℃〜60℃で、反応pHが5〜10の範囲であってもよく、反応温度が30℃〜55℃で、反応pHが6〜9の範囲であることが好ましく、反応温度が35℃〜50℃で、反応pHが7〜8の範囲であることが特に好ましい。本発明において、前記(2)ステップまたは化学式2では、反応時間が30分〜48時間の範囲であって、反応時間が1時間〜36時間の範囲であることが好ましく、反応時間が1時間〜24時間の範囲であることが特に好ましいが、特別な制限はない。
本発明において、前記スクロース、ヌクレオチドジホスフェート、ステビオシド、スクロース合成酵素及び糖転移酵素を同一の反応系で反応させ、レバウジオシドAを製造するステップでは、反応温度が20℃〜60℃で、反応pHが5〜10の範囲であってもよく、反応時間が30℃〜55℃で、反応pHが6〜9の範囲であることが好ましく、反応時間が35℃〜50℃で、反応pHが7〜8の範囲であることが特に好ましい。
本発明において、前記ヌクレオチドジホスフェートとしては、プリンヌクレオチドまたはピリミジンヌクレオチドが使用されてもよく、ウリジンジホスフェートが使用されることが好ましい。
本発明の更に他の様態において、本願に記載の製造方法によって製造されたレバウジオシドAが提供される。
本発明に係るレバウジオシドAは、ステビオール配糖体に存在するステビオシドの全量を原料として生産されるという特徴を有する。このような特徴は、配糖体内のステビオシドの含量を5重量%以内に、好ましくは3重量%以内に、特に好ましくは1重量%以内にし、精製工程でステビオシドとレバウジオシドAとの分離過程を省略可能にするので、コストを節減するという効果を期待することができる。また、本発明のように、原料にステビオール配糖体としてステビオシド以外の少量のレバウジオシドAのみが存在する場合、酵素転換反応を通じてステビオール配糖体中のレバウジオシドAの含量が99%以上である高純度の製品を生産できるという長所を保有する。また、本反応において、糖供与体として使用されるスクロースは、既存の各発明の原料であるカードランに比べて少なくとも50分の1水準の価格で購入が可能であり、結果的に、高純度のレバウジオシドAを既存に比べて低コスト/高効率で生産可能である。
以下、本発明のために各実施例を挙げて詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本願発明の一例示に過ぎなく、発明の内容がこれに限定されると解釈してはならない。
遺伝子の確保及び組換えタンパク質の生産
1)スクロース合成酵素遺伝子組換え大腸菌の製造
PCRに使用されたプライマーの配列は、スクロース合成酵素遺伝子の両側末端の一部の配列と、それぞれNdeIとHindIIIの制限酵素の認識配列とを含む。
(FORWARD)5'―CATATGGCTGCCAAGCTAGCTCG―3'
(BACKWARD)5'―AAGCTTTTACTTGGATGTGCTCTCTC―3'
遺伝子の増幅のために、94℃で30秒間、60℃で30秒間、72℃で2分間の恒温処理過程を30回繰り返し、約2.5kbのPCR産物を得ることができた。
獲得したcDNA切片をpET―28a(+)ベクターに挿入した後、大腸菌BL21(DE3)に形質転換させた。形質転換された大腸菌は、カナマイシン(kanamycin)が含まれた平板培地で塗抹し、カナマイシンに対する耐性がある菌株を1次的に選別した。1次的に選別された各菌株をそれぞれ液体培養した後、DNAを精製してNdeIとHindIIIに二重切断したとき、約2.5kbのDNA断片が確認された菌株を最終的に選別した。自動塩基配列分析機を用いて塩基配列を分析した結果、報告されたスクロース合成酵素遺伝子塩基配列と本研究で得られたスクロース合成酵素遺伝子の塩基配列(配列番号1)とは同一であり、次のように確認された。
TGCCAACAATCGCAACATGCCATGGTGGCCCTGCTGAGATTATTGTTGATGGGGTGTCTGGTCTGCACATTGATCCTTACCACAGTGACAAGGCTGCTGATATCTTGGTCAACTTCTTTGAGAAGTGCAAGCAGGATTCAACCTACTGGGACAATATTTCACAGGGAGGTCTGCAGAGGATTTACGAGAAGTACACCTGGAAGCTGTACTCTGAGAGGCTGATGACCTTGACTGGTGTATACGGATTCTGGAAGTACGTAAGCAACCTTGAGAGGCGCGAGACTCGCCGTTACATTGAGATGTTCTATGCTCTGAAATACCGCAGCCTGGCCAGCGCCGTCCCATTGGCTGTCGATGGAGAGAGCACATCCAAGTAA
2)糖転移酵素遺伝子組換え大腸菌の製造
PCRに使用されたプライマーの配列は、ステビア・リバウンディアナ由来の糖転移酵素遺伝子の両側末端の一部の配列と、それぞれNdeIとHindIIIの制限酵素の認識配列とを含む。
(FORWARD)5'―CATATGGAAAATAAAACGGA―3'
(BACKWARD)5'―AAGCTTTTACAACGATGAAATGT―3'
遺伝子の増幅のために、94℃で30秒間、60℃で30秒間、72℃で2分間の恒温処理過程を30回繰り返し、約1.4kbのPCR産物を得ることができた。獲得したcDNA切片をpET―28a(+)ベクターに挿入した後、大腸菌BL21(DE3)に形質転換させた。形質転換された大腸菌は、カナマイシンが含まれた平板培地で塗抹し、カナマイシンに対する耐性がある菌株を1次的に選別した。1次的に選別された各菌株をそれぞれ液体培養した後、DNAを精製してNdeIとHindIIIに二重切断したとき、約1.4kbのDNA断片が確認された菌株を最終的に選別した。自動塩基配列分析機を用いて塩基配列を分析した結果、報告された糖転移酵素遺伝子塩基配列と本研究で得られた糖転移酵素遺伝子の塩基配列(配列番号2)は同一であり、次の通りである。
AGAAGTGCTAGCTCATGGAGCAATAGGCGCATTCTGGACTCATAGCGGATGGAACTCTACGTTGGAAAGCGTTTGTGAAGGTGTTCCTATGATTTTCTCGGATTTTGGGCTCGATCAACCGTTGAATGCTAGATACATGAGTGATGTTTTGAAGGTAGGGGTGTATTTGGAAAATGGGTGGGAAAGAGGAGAGATAGCAAATGCAATAAGAAGAGTTATGGTGGATGAAGAAGGAGAATACATTAGACAGAATGCAAGAGTTTTGAAACAAAAGGCAGATGTTTCTTTGATGAAGGGTGGTTCGTCTTACGAATCATTAGAGTCTCTAGTTTCTTACATTTCATCGTTGTAA
3)組換えタンパク質の生産
冷凍保管された組換え大腸菌BL21(DE3)菌株をLB培地5mlが入っている試験管(test tube)に接種し、600nmで吸光度が2.0になるまで37℃の培養器で種菌培養を実施した。種菌培養された培養液をLB培地500mlが入っている2000mlのフラスコに添加し、本培養を実施した。また、600nmでの吸光度が0.4になるとき、0.1mM IPTG(イソプロピルβ―D―1―チオガラクトチオピラノシド)を添加し、スクロース合成酵素(sucrose synthase)及び糖転移酵素(glycosyltransferase)の大量発現をそれぞれ誘導した。前記過程中の撹拌速度は180rpmに、培養温度は37℃に維持されるように調節し、IPTGを添加した後、撹拌速度は120rpm、培養温度は16℃にして培養した。前記形質転換された菌株の培養液を6,000×gで4℃で20分間遠心分離し、50mMトリス―塩酸緩衝溶液で2回洗浄した後、50mMトリス―塩酸緩衝溶液(50mM Tris―HCl、pH7.5)を添加し、前記細胞溶液を超音波破砕機(sonicator)で破砕した。また、細胞破砕物は、再び13,000×gで4℃で20分間遠心分離し、細胞上澄液のみを酵素液として分離した。各酵素の特性を正確に把握するために、Ni―NTA superflowカラムを用いてそれぞれ精製した。精製した酵素の分子量をSDS―PAGEで測定した結果、米(Oryza sativa)由来のスクロース合成酵素は92kDa(配列番号3)で、ステビア(Stevia rebaudiana)由来の糖転移酵素(UDP―glucosyltransferase)は57kDa(配列番号4)であることを確認した。
HPLCを用いた各酵素活性の測定
1)スクロース合成酵素の活性測定
米(Oryza sativa)由来のスクロース合成酵素(sucrose synthase)の活性は、HPLCを用いて測定した。米(Oryza sativa)由来のスクロース合成酵素(sucrose synthase)の活性測定のためのHPLC分析条件は、次の通りである。
HPLC分析条件
検出器の波長(Detector Wavelength):260nm
流量(Flow rate):1ml/min
試料注入量(Sample injection vol.):10μl
カラム(Column):C18 4.6×250mm(5μm pore size)
溶媒(Solvent):A:100mMのリン酸カリウム内の8mMの過硫酸テトラブチルアンモニウム(8mM Tetrabutylammonium persulfate in 100mM potassium phosphate)[pH5.3]
B:70%のA溶媒+30%のメタノール
A溶媒100%から始めて、分析15分にB溶媒の濃度を20%まで上昇した後、17分にA溶媒100%に転換し、全ての分析所要時間は30分に設定する。
米(Oryza sativa)由来のスクロース合成酵素(sucrose synthase)の活性に対しては、原糖あるいは砂糖(スクロース)とウリジンジホスフェート(Uridine diphosphate)を反応し、ブドウ糖が結合されたウリジンジホスフェート(Uridine diphosphate)が生成されるか否かを酵素反応で確認した。酵素反応条件は、次の通りである。
50mMリン酸緩衝溶液(pH6.5)に溶解されたスクロース100mM、ウリジンジホスフェート10mM及び実施例1―3で製造された0.1mg/mlのスクロース合成酵素に対して1時間にわたって温度37℃で酵素反応を行った。100℃で5分間加熱しながら反応を停止させた後、HPLC分析を実施し、ブドウ糖が結合されたウリジンジホスフェートの生産量を測定した。分析の結果、ウリジンジホスフェート(Uridine diphosphate)からブドウ糖が結合されたウリジンジホスフェート(Uridine diphosphate)に、初期のモル濃度に比べて90%転換されたことを確認した(図1)。図1において、(a)は、反応0時間であるときにウリジンジホスフェート(1)のみが存在することを示し、(b)は、反応1時間後、スクロース合成酵素によってブドウ糖が結合されたウリジンジホスフェート(2)が生成されることを示す。
2)糖転移酵素の活性測定
ステビア(Stevia rebaudiana)由来の糖転移酵素(UDP―glycosyltransferase)の活性測定のためのHPLC分析条件は、次の通りである。
HPLC分析条件
検出器の波長(Detector Wavelength):210nm
流量(Flow rate):1ml/min
試料注入量(Sample injection vol.):10μl
カラム(Column):C18 4.6×250mm(5μmの細孔径 (pore size))
溶媒(Solvent):アセトニトリル(Acetonitrile):10mMのリン酸ナトリウム(10mM sodium phosphate)[pH2.6]=32:68
ステビア(Stevia rebaudiana)由来の糖転移酵素(UDP―glycosyltransferase)の活性に対しては、ステビオシドにブドウ糖1分子を結合させ、レバウジオシドAに転換されるか否かを酵素転換反応で確認した。酵素反応条件は、次の通りである。50mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)に溶解されたステビオシド(>96%)2mM、ウリジンジホスフェートグルコース10mM及び実施例1―3で製造された0.1mg/mlステビア由来の糖転移酵素に対して1時間にわたって温度37℃で酵素反応を行った。ここで、酵素反応の基質として使用したステビオシドは、純粋なステビオシド96%以上であり、レバウジオシドAが約3%ほど含有された混合試料を用いることによって、HPLC分析時の反応前後の標準物質として活用した。100℃で5分間加熱しながら反応を停止させた後、HPLCを実施し、レバウジオシドAの生産量を測定した。分析の結果、ステビオシドからレバウジオシドAに、モル濃度に比べて100%転換されたことを確認した(図2)。図2は、糖転移酵素によってステビオシドがレバウジオシドAに転換されることを示すHPLC分析結果である。図2において、(a)は、反応0時間であるときにステビオシド(1)のみが存在することを示し、(b)は、反応0.5時間後、ステビオシド(1)とレバウジオシドA(2)が全て存在することを示し、(c)は、反応1時間後、ステビオシド(1)がレバウジオシドA(2)に全て転換されたことを示す。
スクロース合成酵素と糖転移酵素の同一の反応系反応によるステビオシドからレバウジオシドAへの転換率の測定
スクロース合成酵素(Sucrose synthase)と糖転移酵素(UDP―glycosyltransferase)の同一の反応系反応によってステビオシドからレバウジオシドAへの転換率を確認した。酵素反応条件は、次の通りである。スクロース1M、ウリジンジホスフェート20mM、ステビオシド100mM〜250mM及び実施例1―3で製造された0.1mg/mlのスクロース合成酵素と実施例1―3で製造された0.1mg/mlの糖転移酵素が含まれた50mMリン酸緩衝溶液(pH6.5)に対して24時間にわたって温度45℃で酵素反応を行った。本反応に使用された基質は、実施例2に明記された混合物としてのステビオシドである。反応完了後、100℃で5分間加熱しながら反応を停止させた後、HPLC分析を実施し、ステビオシドの濃度によるレバウジオシドAの発生濃度を測定した。ステビオシドからレバウジオシドAへの転換率は、使用されたステビオシドのモル濃度に対して生産されたレバウジオシドAのモル濃度で計算された(図3及び表1(反応24時間後の転換率))。
図3は、前記スクロース合成酵素と糖転移酵素によってステビオシド(1)からレバウジオシドA(2)が生成されることを示すHPLC分析結果である。図3において、(a)は、ステビオシド基質濃度を100mMとし、反応0時間であるときにステビオシド(1)のみが存在することを示し、(b)は、ステビオシド基質濃度を100mMとし、反応24時間後にはレバウジオシドA(2)のみが存在することを示し、(c)は、ステビオシド基質濃度を250mMとし、反応24時間後にはステビオシド(1)とレバウジオシドA(2)が全て存在することを示す。
スクロース合成酵素と糖転移酵素の同一の反応系反応のpH安定性
・
米(Oryza sativa)由来のスクロース合成酵素(sucrose synthase)によって生産されたブドウ糖が結合されたウリジンジホスフェート(Uridine diphosphate)は、糖転移酵素によってステビオシドと反応してレバウジオシドAに転換され、ウリジンジホスフェート(Uridine diphosphate)を解離することができる。前記2種の酵素が一つの反応器に存在し、レバウジオシドAが生産されるときの最適なpHを確認した。最適なpHを確認するためのHPLC分析条件は、次の通りである。
・
米(Oryza sativa)由来のスクロース合成酵素(sucrose synthase)によって生産されたブドウ糖が結合されたウリジンジホスフェート(Uridine diphosphate)は、糖転移酵素によってステビオシドと反応してレバウジオシドAに転換され、ウリジンジホスフェート(Uridine diphosphate)を解離することができる。前記2種の酵素が一つの反応器に存在し、レバウジオシドAが生産されるときの最適なpHを確認した。最適なpHを確認するためのHPLC分析条件は、次の通りである。
HPLC分析条件
検出器の波長(Detector Wavelength):210nm
流量(Flow rate):1ml/min
試料注入量(Sample injection vol.):10μl
カラム(Column):C18 4.6×250mm(5μmの細孔径 (pore size))
溶媒(Solvent):アセトニトリル(Acetonitrile):10mMのリン酸ナトリウム(10mM sodium phosphate)[pH2.6]=32:68
スクロース合成酵素(Sucrose synthase)と糖転移酵素(UDP―glycosyltransferase)との複合反応によって最適なpHを確認した。酵素反応条件は、次の通りである。スクロース1M、ウリジンジホスフェート20mM、ステビオシド40mM、及び実施例1―3で製造された0.1mg/mlのスクロース合成酵素と実施例1―3で製造された0.1mg/mlの糖転移酵素が含まれた50mMリン酸緩衝溶液(pH6.5)に対して1時間にわたって温度45℃で酵素反応を行った。ここで、pH2.5〜12.0バッファーとしては、汎用バッファー(Universal buffer)を用いた。100℃で5分間加熱しながら反応を停止させた後、HPLC分析を実施し、レバウジオシドAの生成率を測定した。レバウジオシドAの生成量を互いに比較し、最大値を示す反応系の反応pHがこの複合反応の最適なpHとして求められる。スクロース合成酵素と糖転移酵素の複合反応の最適なpHは、温度45℃、60分間の反応で約pH7.5付近と確認された(図4及び表2)。
スクロース合成酵素と糖転移酵素の同一の反応系反応の温度安定性
米(Oryza sativa)由来のスクロース合成酵素(sucrose synthase)によって生産されたブドウ糖が結合されたウリジンジホスフェート(Uridine diphosphate)は、糖転移酵素によってステビオシドと反応してレバウジオシドAに転換され、ウリジンジホスフェート(Uridine diphosphate)を解離することができる。前記2種の酵素が一つの反応器に存在し、レバウジオシドAが生産されるときの最適な温度を確認した。最適な温度を確認するためのHPLC分析条件は、次の通りである。
HPLC分析条件
検出器の波長(Detector Wavelength):210nm
流量(Flow rate):1ml/min
試料注入量(Sample injection vol.):10μl
カラム(Column):C18 4.6×250mm(5μmの細孔径(pore size))
溶媒(Solvent):アセトニトリル(Acetonitrile):10mMのリン酸ナトリウム(10mM sodium phosphate)[pH2.6]=32:68
スクロース合成酵素(Sucrose synthase)と糖転移酵素(UDP―glycosyltransferase)との複合反応によって最適な温度を確認した。酵素反応条件は、次の通りである。スクロース1M、ウリジンジホスフェート20mM、ステビオシド40mM及び0.1mg/mlのスクロース合成酵素と0.1mg/mlの糖転移酵素が含まれた50mMリン酸緩衝溶液(pH6.5)に対して、1時間にわたって4℃、20℃、30℃、37℃、45℃、60℃、70℃、80℃の温度で酵素反応を行った。100℃で5分間加熱しながら反応を停止させた後、HPLC分析を実施し、レバウジオシドAの生成量を互いに比較し、最大値を示した反応系の反応温度がこの複合反応の最適な温度として求められる。
スクロース合成酵素と糖転移酵素との複合反応の最適な温度は、pH6.5、60分間の反応で約45℃付近と確認された。酵素相対活性を図5及び表3に示した。
Claims (14)
- (1)スクロースとヌクレオチドジホスフェートとをスクロース合成酵素の存在下で反応させ、ブドウ糖が結合されたヌクレオチドジホスフェートを製造するステップ;
(2)前記ブドウ糖が結合されたヌクレオチドジホスフェートを糖転移酵素の存在下でステビオシドと反応させ、レバウジオシドAを製造するステップ;を含む、レバウジオシドAの製造方法。 - 前記スクロース合成酵素は、米、トウモロコシ、小麦、タケ、シロイヌナズナ、シバ、麦、キビまたはジャガイモに由来したスクロース合成酵素である、請求項1に記載の製造方法。
- 前記スクロース合成酵素は、スクロース合成酵素遺伝子を含有するベクターに形質転換された組換え大腸菌、バシラス、酵母、コリネバクテリウムまたはアグロバクテリウムから生産されたものである、請求項1または2に記載の製造方法。
- 前記スクロース合成酵素が配列番号3の配列を有する、請求項3に記載の製造方法。
- 前記糖転移酵素は、オリザ・サティバ(Oryza sativa)、ステビア・レバウディアナ・ベルトニー(Stevia rebaudiana Bertoni)、バンブサ・オルダミイ(Bambusa oldhamii)、ブラキポディウム(Brachypodium distachyon)、ホルデウム・ウルガレ(Hordeum vulgare)、ソルガム・バイカラー(Sorghum bicolor)、ジー・メイズ(Zea mays)、またはアラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana) 由来の糖転移酵素である、請求項1から4のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記糖転移酵素は、糖転移酵素遺伝子を含有するベクターに形質転換された組換え大腸菌、バシラス、酵母、コリネバクテリウムまたはアグロバクテリウムから生産されたものである、請求項1から5のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記糖転移酵素が配列番号4の配列を有する、請求項1から6のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記(1)ステップ及び前記(2)ステップが同一の反応系で連続的に行われる、請求項1から7のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記同一の反応系では、反応温度が20℃〜60℃で、反応pHが5〜10の範囲である、請求項8に記載の製造方法。
- スクロース、ヌクレオチドジホスフェート、ステビオシド、スクロース合成酵素及び糖転移酵素を同一の反応系で反応させ、レバウジオシドAを製造するステップを含む、ステビオシドからレバウジオシドAを製造する方法。
- 前記反応温度が20℃〜60℃で、反応pHが5〜10の範囲である、請求項10に記載の方法。
- 前記スクロース合成酵素は、米、トウモロコシ、小麦、タケ、シロイヌナズナ、シバ、麦、キビまたはジャガイモに由来したスクロース合成酵素である、請求項10または11に記載の方法。
- 前記糖転移酵素は、オリザ・サティバ(Oryza sativa)、ステビア・レバウディアナ・ベルトニー(Stevia rebaudiana Bertoni)、バンブサ・オルダミイ(Bambusa oldhamii)、ブラキポディウム(Brachypodium distachyon)、ホルデウム・ウルガレ(Hordeum vulgare)、ソルガム・バイカラー(Sorghum bicolor)、ジー・メイズ(Zea mays)、またはアラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)由来の糖転移酵素である、請求項10から12のいずれか1項に記載の製造方法。
- 請求項1から13のいずれか1項による製造方法によって製造されたレバウジオシドA。
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