BRPI0608458A2 - planta stevia rebaudiana, planta ou parte da mesma e método para a produção de um adoçante - Google Patents

Abstract

PLANTA Stevia rebaudiana, PLANTA OU PARTE DA MESMA E MéTODO PARA A PRODUçãO DE UM ADOçANTE. Expõe-se uma nova planta pertencente à variedade Stevia Rebaudiana Bertoni que contém pelo menos 4 partes, em peso, ou mais de Rebaudioside A com relação a uma parte, em peso, da Stevioside, e permite que um adoçante de boa qualidade seja facilmente produzido a partir da dita planta ou folhas secas da mesma.

Description

PLANTA Stevia rebaudlana, PLANTA OU PARTE DA MESMA E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM ADOÇANTE

Pedidos Relacionados Anteriores

0 presente pedido reivindica a prioridade de W02006/093229, depositado em 02/03/2006 e JP2 005-060930, depositado em 04/03/2005. Cada um fica incorporado por referência na sua totalidade.

Campo da Invenção

Refere-se a presente invenção a uma planta pertencente à variedade de Stevia Rebaudiana Bertoni que contém um alto teor de Rebaudioside-A em comparação com a Stevioside, e um método para a produção de um a-doçante extraido a partir da dita planta e/ou suas Folhas secas. Além disso, a presente invenção relaciona-se com um método para produzir Rebaudioside-A de alta pureza a partir do dito adoçante.

Antecedentes da Invenção

A Stevia é uma planta perene da Compositae Asteraceae originalmente desenvolvida no Paraguai, América do Sul, e o seu nome cientifico é Stevia Rebaudiana Bertoni. A Stevia contém componentes doces dotados de um dulçor de 300 vezes ou mais do que aquele do açúcar, e é plantada para o uso como um adoçante natural obtido pela extração destes componentes adoçantes.

Como componentes adoçantes, são conhecidos Stevioside (C38H6oOi8) / Rebaudioside A (C44H70O23) , Rebau-dioside C, D e E, Dulcoside A e outros. Com a varieda-de geralmente plantada, o Stevioside (ST) é o componente principal entre os componentes doces supramenciona-dos com um teor de conteúdo de Rebaudioside A (RA) situado entre cerca de 3/10 a 4/10 desse Stevioside e aquele de Rebaudioside C sendo levemente menor, mas dependendo das variedades, é Stevia com o Rebaudioside C constituindo-se no componente principal. Isto é, existem diversas variedades.

Entre os sabores tais como amargor e adstringência, o dulçor é muito delicado. Uma vez que o Stevioside tem um grau de dulçor de 300 vezes aquele do açúcar, ele tem sido usado como um adoçante natural na indústria de alimentos. O seu dulçor é relativamente semelhante àquele do açúcar, entretanto, existe um de-feito no qual um sabor desagradável, tal como amargor, permanece na boca. Conseqüentemente, não é de se jável para um adoçante conter uma grande quantidade de de Stevioside. Por outro lado, o Rebaudioside A tem um dulçor de boa qualidade e um grau de dulçor de 1,3 a 1,5 vezes aquele do Stevioside.

É necessário deste modo reduzir o custo de produção de Rebaudioside A, para manter estável o rendimento de folhas secas, para desenvolver uma variedade de Stevia que contenha uma quantidade de alto teor de Rebaudioside A dotado de excelente qualidade adoçante como um material bruto adoçante, e ao mesmo tempo, manter seu fornecimento continuo e produzir um adoçante excelente baseado em nas mesmas.Os inventores da presente invenção realizaram cultivo de plantas através da repetição de fertilizações cruzadas seletivas de variedades convencionais, obtendo desta forma variedades de Stevia com uma relação de alto teor de Rebaudioside (RA) para Stevio-side (ST); e foram produzidos adoçantes excelentes na relação de teor de Rebaudioside A para Stevioside (ST) pela extração do componente adoçante destas plantas (vide literatura de patentes 1-1 até 1-3 que serão descritas mais adiante); entretanto, é desejável o desenvolvimento de variedades de uma forma estável com uma relação de teor de Rebaudioside A que seja melhor e mais elevada.

Por outro lado, no cultivo de plantas da espécie Stevia plants, uma questão é um método de identificação das plantas Stevia. Como um método de identificação de plantas Stevia aperfeiçoado, pode-se pensar em identificações por alturas de plantas, formas de folhas, e assemelhadas; entretanto, uma vez que a Stevia é por ela mesma não compatível e tende a tornar-se hibrida, a classificação somente por alturas de plantas, formas de folhas e assemelhadas pode não permitir isto.

Além disso, existe uma identificação comparativa baseada na resistência de moléstias a patóge-nos específicos da Stevia; entretanto, muito embora as folhas mortas e pontos da folha negros que ocorrem especificamente à Stevia sejam causados pelo fungo Septo-ria e Alternaria, estes fungos vivem no solo. Conseqüentemente, uma vez que estes sintomas ocorrem não somente no Japão mas também no mundo inteiro, estas características sozinhas são insuficientes para a identificação de uma variedade.

Com uma variedade aperfeiçoada com um Alto teor de adoçante e uma relação de alto teor de Rebaudi-oside A em comparação com Stevioside, poderá pensar-se em um método de identificação por esta relação de teores; entretanto uma vez que uma variação na relação de teor de adoçante pode inevitavelmente variar na dependência de uma condição climática durante o período de crescimento, um tempo de colheita, e assemelhados, falta praticidade a este método.

Recentemente desenvolveu-se um método para o se promover a identificação através de identificação de DNA baseado no método RAPD que utiliza uma mistura de preparador (vide a Referência de Patente 2 adiante); entretanto não está claro se é possível ou não aplicar o mesmo à identificação de uma planta de acordo com a presente invenção.

Referência de Patente 1: Publicação de Patente Divulgada Sho. 59 /1984-045848 na Gazeta Oficial

Referência de Patente 2: Publicação de Patente Divulgada Sho. 60 /1985-160823 na Gazeta Oficial

Referência de Patente 3: Publicação de Patente Divulgada Sho. 61 /1986-202667 na Gazeta Oficial- 5 -

Referência de Patente 4: Publicação de Patente Divulgada No. 2003-9878 na Gazeta Oficial

Sumário da Invenção

Abreviaturas: ST = Stevioside; RA = Rebaudioside A

A presente invenção visa a criação de variedades excelentes na quantidade de teor de componente adoçante e relação de teor de componente adoçante, para permitir diferençar os seus genes pelo método de RAPD para manter as suas características, diferençando assim 10 as mesmas em relação em relação às plantas Stevia de outras variedades, e proporcionar adoçantes excelentes na propriedade de dulcificação e um método para a sua produção.

O primeiro aspecto da presente invenção refere-se a uma variedade Stevia Rebaudiana Bertoni que contém 4 partes, em peso, ou mais de Rebaudioside A com relação a uma parte, em peso, de Stevioside. Para isto, tal como será descrito mais adiante, pela repetição de cultivo cruzado e seleção, foram criadas novas plantas pertencentes à variedade Stevia Rebaudiana Bertoni que contêm pelo menos 4 partes, em peso, de Rebaudioside A com relação a uma parte, em peso, de Stevioside .

O segundo aspecto da presente invenção refere-se a um método para a produção de um adoçante que contém 4 partes, em peso, ou mais, de Rebaudioside A com relação a uma parte, em peso, de Stevioside, sendoo ditto método para a produção caracterizado pela realização da extração a partir da planta descrita no parágrafo anterior ou folhas secas da mesma com água ou um solvente que contém água.

0 terceiro aspecto da presente invenção refere-se a um método para a produção de um adoçante de alta pureza que contém 40 partes, em peso, ou mais, de Rebaudioside A com relação a uma parte, em peso, de Stevioside; o dito método para a produção de um adoçante que contém 40 partes, em peso, ou mais, de Rebaudioside A com relação a uma parte, em peso, de Stevioside sendo o seu conteúdo de 92% ou mais alto, sendo caracterizado pela re-cristalização do adoçante obtido no parágrafo anterior.

Em um aperfeiçoamento de uma variedade através de cultivo cruzado e seleção, o método de identificação de uma variedade selecionada tem um significado importante. Os inventores da presente invenção estudaram os métodos de identificação com base em identificação de DNA pelo método RAPD.

A presente invenção proporciona um adoçante excelente na qualidade de dulçor e um método para a sua produção.

Descrição Breve dos Desenhos

A Figura 1 é um diagrama de eletroforese das seqüências de base de DNA da variedade Morita, SS eSN. As seqüências de base características estão indicadas com setas. Os símbolos na Figura 1 são tais como expostos em seguida:

a: Marcador Hind III

b e e: variedade SN

c e f: Variedade Morita

d e g: variedade SS

h: marcador progressivo 1 kbp DNA

a Figura 2 é um diagrama de eletroforese da seqüência de nucleotideos de de base de DNA da variedade Morita e SN. As seqüências de base características estão indicadas com setas. Os símbolos na Figura 2 são os seguintes:

Mori : variedade Morita

SN: variedade SN

M: marcador de DNA (progressivo 100 bp)

Descrição das Concretizações da Invenção

O método de RAPD (método de DNA polimórfi-co amplificado aleatório) usado para a identificação na presente invenção é um dos métodos analíticos de DNA, e é um método para a análise por eletrof orese de um padrão de DNA amplificado em uma região de DNA interposta entre a mesma ou seqüências similares como, ou para, os iniciadores usados em uma reação de PCR (reação de cadeira de polimerase) utilizando um número múltiplo de iniciadores. Além disso, para brometo de cetil trime-til amônio (CTAB) é um sal de amônio quaternário dotadode um grupo de alquila de cadeia longa, e forma um complexo insolúvel com um poli ânion, tal como ácido nu-cléico, ele pode ser utilizado para isolar um ácido nu-cléico.

No sentido de se classificar uma variedade baseada em diferenças em DNA, um DNA de genoma é isolado de uma forma individual a partir de uma planta por CTAB, ácido ribonucléico (RNA) é removido, e um produto amplificado PCR obtido por meio do método de PCR pelo uso de uma mistura de iniciadores é diferençado por meio das diferenças em impressão digital de DNA obtida pelo método de electroforese de gel de agarose. No caso da planta de acordo com a presente invenção, tal como será descrito mais adiante, confirmou-se que é mostrada uma seqüência de base característica na parte inferior de 2000 bp.

Na realidade, com o DNA de genoma precipitado seletivamente como um padrão com relação à planta de material bruto, é realizada uma reação de 35 ciclos a 94 graus (30 segundos), 55 graus (30 segundos), e 72 graus (120 segundos) pelo uso de um conjunto de, por exemplo, A06 (ACTGGCCGAGGG (SEQ ID NO: 1)) e A48 (CCGCAGGGACCA (SEQ ID NO: 2)) como iniciadores e rTaq (Takara), e depois disso, deixa-se que ocorra uma reação durante 10 minutos a 72 graus. Depois disto, o produto amplificado por PCR é confirmado pelo método de electroforese de gel agarose, e assim a planta pode ser confirmada por uma faixa de DNA específica.Para a produção de um adoçante, em seguida, a dita planta ou folhas secadas da mesma são submetidas a extração com água ou um solvente que contém á-gua, a solução de extrato é concentrada como está ou se for necessário impurezas iônicas são removidas com uma resina permutadora aniônica ou uma resina permutadora catiônica, ou carbono ativado, os componentes adoçantes são deixados ser adsorvidos em uma resina de adsorção, seguida pela eluição com um solvente hidrófilo, e o eluido é concentrado, e secado para produzir um adoçante. 0 método para a produção de um adoçante pode incluir neios de refinação usuais, tais como uma etapa de descoloração adicionalmente ao exposto anteriormente, tal como for apropriadamente requerido, e um método para se obter um Rebaudioside A de alta pureza pode in-cluir etapas usuais, tais como uma separação por membrana, extração com álcool, e cristalização, e assemelhados. Adicionalmente, no método de cristalização, é possivel utilizar apropriadamente o mesmo pela adição de água a um solvente orgânico, tal como etanol e metanol como um solvente de cristalização. É possivel adicionar outros adoçantes naturais ou artificiais, um a-gente de diluição e assemelhados, a este adoçante obtido desta forma.

Para o cultivo, variedades que contêm uma concentração relativamente elevada de Rebaudioside A são cruzadas e selecionadas. Primeiramente, SF5-1 e SF5-2 (descritos na Publicação de Patente Divulgada No.Hei 10 1998-271928 No. 271928 -1998 Gazeta) que contêm Rebaudioside A sob uma alta concentração são cruzadas artificialmente, seleciona-se TD-1 (descrita na Publicação de Patente Divulgada No. 2003 -9878 Gazeta) a partir das sementes assim obtidas, que são ainda cruzadas artificialmente, uma variedade que tem resistência a ao fungo Septoria e ao fungo Alternaria é selecionada a partir destas sementes, o seu componente adoçante é analisado, e é selecionada uma planta que contém 4 partes, em peso, ou mais de Rebaudioside A com relação a uma parte, em peso, de Stevioside, a qual é alta em conteúdo adoçante, e que é relativamente excelente na resistência a enfermidades. Além disso, a quantidade e teor dos componentes adoçantes, a proporção dos componentes adoçantes, e as condições de crescimento são repetidamente observadas, e esta é a chamada variedade Morita cujos genes foram pesquisados.

Além disso, nesta data, a requerente completou o depósito internacional da variedade Morita referente a esta invenção (Organismo Depositário de Patentes Internacional (IPOD)(Japan) (Recebimento No. FERM BP-10353) . Conseqüentemente, é possível obter-se facilmente a planta da referida invenção a partir de sementes da variedade Morita do depositário. A Stevia é auto-incompativel e muito embora não seja necessariamente verdade que a planta visada pode ser sempre obtida a partir das ditas sementes, a planta visada pode ser facilmente selecionada pela identificação de DNAdescrita neste pedido de patente. E se necessário for, na eventualidade de seu cruzamento com outra variedade de Stevia de alta qualidade (por exemplo, TD-1) e a seleção for realizada de acordo com o Exemplo Concretizado 1 que será descrito adiante, uma planta que contém Rebaudioside A sob uma alta concentração pode ser facilmente obtida. Estas plantas estão todas cobertas nas plantas que podem ser obtidas a partir das sementes da variedade Morita depositada internacionalmente, isto é, a variedade Morita.

Em seguida serão descritos especificamente o processo de cultivo, as suas características, e outros assemelhados. Entretanto, a presente invenção não fica limitada a estes processos de cultivo e aos métodos de plantio.

EXEMPLO 1: CULTIVO E TESTES

A partir de sementes obtidas pelo cruzamento de variedades que continham Rebaudioside A sob uma concentração relativamente alta, as sementes obtidas pelo cruzamento de SF-1 e SF 5-2 (descrita na Publicação de Patentes Divulgadas No. Hei 10/1998-271928) que contém Rebaudioside A em um alojamento de vinilo em plantação Nimi foram mostradas, as plantas novas germinadas foram replantadas em vasos de crescimento de plantas novas; e 600 plantas novas de uma altura de cerca de 8 cm ou mais altas foram transplantadas em um campo agrícola na plantação no começo de maio, enquantocerca de 20 kg de cada por are de compostos fertilizantes de nitrogênio, fósforo e potássio foram aplicados à terra. No começo de julho, como fertilizantes adicionais, 10 kg de cada um de componentes fertilizantes de nitrogênio, fósforo e potássio por are foram aplicados adicionalmente à terra.

No começo de setembro, os componentes adoçantes foram analisados, e caule, variedade TD-1 (descrito na Publicação de Patente Divulgada No. 2003-9878) 10 foi selecionado o qual continha 3 vezes mais Rebaudio-side A com relação a Stevioside.

Em 1998, a variedade TD-1 foi cruzada artificialmente no alojamento de vinilo na plantação Ni-mi, as sementes obtidas foram mostradas em um alojamento de vinilo na plantação Nimi em março de 1999, as plantas novas germinadas foram replantadas em vasos de crescimento de plantas novas, e 300 plantas novas de uma altura de cerca de 7 cm ou mais altas foram transplantadas em uma terra de agricultura na plantação em inicio de maio, enquanto cerca de 20 kg de cada por are de compostos fertilizantes de nitrogênio, fósforo e potássio foram aplicados à terra. No começo de julho, como fertilizantes adicionais, 10 kg de cada um de componentes fertilizantes de nitrogênio, fósforo e potássio por are foram aplicados adicionalmente à terra.

No inicio de setembro, os componentes de adoçante foram analisados, e caule, o qual continha 4 partes, em peso, ou mais vezes mais Rebaudioside A comrelação a Stevioside, e é muito superior em resistência a doenças e cresceu melhor do que a variedade TD-1 e foram selecionados. Em meados de abril de 2000, os 100 brotos germinados a partir dos mesmos foram cortados e plantados. No inicio de maio foram os mesmos plantados similarmente na terra agricola da plantação, e no final de julho, a sua resistência a doenças e crescimento foram novamente avaliados, e foi confirmado que as relações e quantidades de componente adoçante foram superiores. Além disso, durante 3 anos a partir de 2001, foi confirmado que a resistência a doenças, relações de componente adoçante, quantidades de componente adoçante e o rendimento das folhas secas foram superiores e que não houve alteração no crescimento e componentes, e esta foi chamada de variedade Morita.

A fim de se comparar a variedade Morita e outras variedades, prepararam-se mudas de 40 de cada um de TD-1 (TD), cujo componente principal foi Rebaudiosi-de A, e uma outra variedade Stevia geral (SN), cujo componente adoçante principal foi Stevioside e cujo componente adoçante secundário foi Rebaudioside A e e-las foram plantadas similarmente em terra agricola na plantação.

A presença ou ausência de afloramento de qualquer doença foi investigada em cada 10 variedade arbitrariamente selecionadas em inicio de julho a partir das 200 plantas novas da variedade Morita multiplicadas a partir das mudas mencionadas anteriormentetransplantadas na terra agrícola no início de maio, e 40 plantas novas cada uma da variedade TD e SN, e depois disso, as plantas novas da Morita, plantas novas TD e SN foram cada uma cortadas na altura de 15 cm acima do solo, as folhas foram separadas e depois de secagem elas foram usadas como amostras para análise.

Os resultados da análise são os seguintes:

Tabela 1: Teste de comparação 1 da variedade Morita, TD e SN

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Em meados de julho, aplicaram-se fertilizantes adicionais, e depois de se selecionarem 20 cau-10 les a partir de cada variedade por uma seção e investigando-se as condições de começo das doenças decorrentes de fungo Septoria e Alternaria, cada variedade foi cortada das seções acima do solo, as folhas foram separadas e depois de secagem, elas foram usadas como amostras analíticas.

Os resultados da análise foram os seguintes :

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Com a variedade Morita, a proporção da o-corrência de pontos negros nas folhas inferiores foi relativamente baixa, e foi superior em outras variedades no teor de componente adoçante, e rendimento de folhas secas. Com a variedade TD, em comparação com a variedade Morita, observou-se um grande número de pontos negros das folhas inferiores devidos ao fungo Sep-toria, as folhas já começaram a ficar amareladas devido ao fungo Septoria. A variedade SN mostrou aparência amarela das folhas até o 3o nodo das folhas inferiores devido ao fungo Septoria, e as folhas no terceiro nodo murcharam.

Em março de 2004, 200 mudas das pontas das espigas brotadas a partir da variedade Morita foram plantadas, no final de abril, as mesmas foram replanta-das em terra agrícola, as seções acima do solo foram colhidas no final de maio, no final de junho, no final de julho e no final de agosto, no final de setembro e no final de outubro depois do florescimento, somente as folhas foram separadas, e secadas, e a quantidade de teor do componente adoçante foi medida.

Os componentes adoçantes foram medidos porcromatografia de liquido de alto desempenho.

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A variedade Morita exibiu quantidade de teor de componente adoçante e relações de componentes adoçantes diferentes, na dependência do periodo de crescimento; observou-se uma tendência na qual na medida em que o periodo de crescimento se tornou mais longo, a quantidade de teor de componente adoçante aumentou, e por outro lado, a quantidade de teor de Stevioside diminuiu. No final de outubro, que é a época do florescimento, a quantidade do teor de componente adoçante diminuiu,

Em termos da quantidade de teor do componente adoçante, da relação de componente adoçante e rendimento, uma vez que a variedade Morita foi a melhor , a variedade Morita foi identificada pelo método PCR.Um almofariz esterilizado por secagem e aquecimento foi carregado com cerca de 0,2 g das folhas da variedade Morita, às quais foi adicionado nitrogênio, elas foram esmagadas por um pilão, e cerca de 0,05 g de uma vez foi colocado em micro tubo(s) por uma espátula. Adicionaram-se 300 ul de solução de CTAB a 2% (solução de CTAB 2% (50 ml) : composição 100 mM, tris-HC1 (pH 8,0) 20 mM, EDTA (pH 8,0), CTAB a 2%, 1,4 M Na-Cl) , e depois de volteamento e mistura, o tubo foi movido para um bloco quente aquecido a 65°C, e foi aquecido durante 30 min. Uma quantidade igual (300 ul) de clorofórmio / álcool de isoamil (24:1) foi adicionada ao mesmo, seguida por agitação gradualmente. Depois de centrifugação e separação do mesmo a 14000 rpm, durante 15 min, a camada aquosa, que era a camada superior do conteúdo separado em 2 camadas, foi movida para um Novo tubo.

As operações depois clorofórmio / álcool de isoamil anteriormente mencionados foram repetidas uma vez mais, e a camada aquosa foi deslocada para um novo tubo. Adicionaram-se ao mesmo 400 ul de solução de CTAB a 1% (solução de CTAB a 1% (50 ml) : composição 1 M, tris-HCl 2,5 mM, EDTA 1,0 ml, 1% CTAB 0,5 g) , e depois de volteamento e mistura durante 15 min, deixou-se assentar sob temperatura ambiente durante 1 hora, seguida por separação centrifuga a 14.000 rpm durante 15 minutos.

O sobrenadante foi descartado, seguido póradição de 400 ul de 1M CSC1, e o precipitado foi completamente dissolvido mediante pipetamento. Adicionaram-se 900 ul de etanol 100%, e depois de volteamento e mistura, foi deixado assentar durante a noite sob teraperatura de -20°C durante 20 min, seguido por separação centrifuga a 14.000 rpm durante 15 min. O sobrenadante foi descartado, seguido por adição de 400 ul de etanol a 70% ao precipitado, foi submetido a separação centrifuga a 14.000 rpm durante 15 min, e depois de repetição desta operação, o sobrenadante foi descartado, o precipitado foi secado em um secador a vácuo, e foi então dissolvido em 30 ul de água extra pura. A solução foi submetida a eletroforese de gel de agarose, confirmando assim que o DNA foi separado sozinho.

A fim de se remover o RNA a mesma foi sub-metida a uma reação em 500 ul de uma solução de RNase (composição: 100 ul da solução de DNA mencionado anteriormente e 5 ul de RNase (5 g/ ml) a 37°C durante 1 hr, e uma quantidade igual da solução de PCI (composição: uma solução obtida por centrifugação a 13.000 rpm durante 5 min e por separação de uma camada aquosa depois de se misturar fenol: clorofórmio:álcool de isoa-mil (25:24:1) gradualmente) foi adicionado à solução de reação. Depois de se colocar uma tampa e de se misturar gradualmente, foi centrifugada a 13.000 rpm durante 5 minutos.

A camada aquosa (camada superior) foi transferida para um novo tubo, ao qual se adicionou umaquantidade igual da solução CIA (composição: clorofór-miorálcool de isoamil, relação em volume 24:1) preservada sob temperatura ambiente e depois de misturada gradualmente, foi centrifugada a 15.000 rpm durante 3 min, a camada aquosa foi transferida para um novo micro tubo, seguida pelo tratamento CIA uma vez mais, acetato de sódio 3 M de uma quantidade de 1/ 10 vezes aquela do sobrenadante obtido e adicionou-se etanol a 100% em quantidade de 2,5 vezes, misturando-se então muito bem, e refrigerando-se a -20°C durante 20 min ou mais baixa, e então foi centrifugada a 15.000 rpm durante 15 min, pelotizando-se assim o DNA, o sobrenadante foi descartado, e depois de se adicionar às péletes 1 ml de etanol a 70% o qual tinha sido refrigerado, ela foi centrifugada a 15000 rpm durante 15 min, o sobrenadante foi descartado, e depois de adição de 1 ml de etanol a 70% que tinha sido refrigerado, ela foi centrifugada a 15.000 rpm durante 15 min, o sobrenadante foi descartado, e ela foi secada durante 5 min pelo uso de um dis-secador sob uma pressão reduzida.

Com o DNA de genoma assim obtido como um gabarito, utilizando-se composição de PCR (Tabela 4), realizou-se uma reação de 35 ciclos a 94°C (30 segundos), 55°C (30 segundos), e 72°C (120 segundos), e depois disso, deixou-se ser submetido a uma reação a 72°C durante 10 min. Depois da reação, ela foi mantida a 4°C e obteve-se um produto amplificado por PCR. Quando a faixa de DNA no produto amplificado por PCR foi con-firmada pela eletroforese de gel de agarose a 1%, um fragmento de DNA característico foi confirmado em uma posição que é cerca de 2000 bp mais baixa, conforme exposta na Morita da Figura 1.

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• Os iniciadores A06 e A48 são preparados pela BEX Corp.

De forma assemelhada, faixas de DNA obtidas mediante tratamento de forma semelhante ao anterior estão ilustrados na Figura 1 para a variedade SN (SN) e a variedade SS (SS) tendo Stevioside como o componente principal e Rebaudioside A como um componente secundário .

A variedade Morita tem a seqüência de casecaracteristica em uma posição que é cerca de 2000 bp mais baixa e assim pode ser facilmente diferençada das outras variedades pela detecção de DNA pela eletrofore-se de agarose.

Pelo uso de iniciadores que são diferentes daqueles expostos anteriormente, a variedade Morita e a variedade SN foram comparadas.

A extração de DNA foi executada pelo método CTAB. Cerca de 0,5 g de cada uma das folhas proveio nientes da variedade Morita e da variedade SN foram congeladas com nitrogênio liquido em um pilão, as folhas foram esmagadas por meio de um pilão. Cada amostra esmagada foi misturada com 20 ml de uma solução de CTAB a 2% (100 mM tris-HCl (pH 8,0) 20 mM, EDTA (pH 15 8,0), CTAB a 2%, 1,4 M NaCl, PVP a 1%) em um tubo Fal-con de 50 ml, seguida por incubação a 65°C durante 30 min. Adicionou-se uma quantidade igual de clorofór-mio:álcool de isoamil (24:1), seguida por agitação durante 10 min, e então foi submetida a separação por 20 centrifugação a 3.500 rpm durante 15 min, e a camada aquosa foi recolhida em um outro tubo Falcon de 50 ml.

Além disso, adicionou-se ao mesmo uma quantidade igual de isopropanol a 100%, seguida por separação centrifuga a 3500 rpm durante 15 min, o preci-25 pitado foi coletado por um gancho, que foi transferido para um micro tubo de 1,5 ml. Depois de enxágüe do precipitado com etanol a 75%, ele foi secado e então dissolvido em 600 ul de amortecedor de TE. Depois deadição de 1 ul de uma solução de RNase (1 mg/ml) e in-cubação a 37°C durante 1 hr, adicionou-se ao mesmo uma quantidade igual de fenol saturado com TE, seguido por mistura e separação centrifuga a 15000 rpm durante 30 min. A camada aquosa foi removida para um outro micro tubo, seguida por adição de acetato de sódio 3M em quantidade de 1/10 e uma quantidade igual de isopropa-nol, e mistura, e então foi submetida a separação Centrifuga a 15000 rpm durante 30 min. Depois de enxágüe do precipitado assim obtido com etanol a 75% duas vezes, ele foi secado, que foi dissolvido em 50 ul do a-mortecedor de TE para produzir uma amostra de DNA.

Com a amostra de DNA assim obtida como um gabarito, deixou-se ocorrer a reação de PCR com a seguinte composição de reação. Quando ao ciclo de PCR, depois de se permitir que a reação ocorresse a 96°C durante 30 sec, permitiu-se a ocorrência de 35 ciclos a 96°C durante 10 sec, a 42°C durante 2 min, e 72°C durante 2 min, e então fez-se reagir novamente a 72°C durante 4 min. Depois da reação, o produto de PCR foi fracionado pela eletroforese de gel de agarose a 1,8% e depois de manchar o mesmo com EtBr, a imagem foi obtida sob irradiação de UV. Como um resultado, a faixa especifica da variedade Morita pôde ser confirmada nas proximidades de cerca de 2000 bp com o iniciador-UBC-66. Adicionalmente, faixas especificas da variedade de SN foram confirmadas na proximidade de cerca de 600 bp com o iniciador UBC-72, e na proximidade de cerca de 700 bpcom UBC-106. Como um resultado, tornou-se evidente que a variedade Morita e a variedade SN são geneticamente diferentes e a diferença pode ser facilmente detectada pela análise de RAPD.

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EXEMPLO 2 PRODUÇÃO DE UM ADOÇANTE

Vinte gramas de folhas secas da variedade Morita obtidas no final de setembro foram extraídas com água de 20 vezes em quantidade várias vezes até que nenhum dulçor pôde ser sentido, a solução foi deixada fluir através de uma coluna acondicionada com 20 ml de uma resina permutadora de cátions (Amberlite IR-120B) , e uma coluna acondicionada com 2 0 ml de uma resina permut adora de ânions (Duolite A-4) e 5 ml de carbono ativado granular; a solução que tinha passado através da coluna foi deixada fluir através de uma coluna acondicionada com 100 ml ode uma resina de adsorção (DiaionHP-20), adsorvendo deste modo os componentes adoçantes, e depois de lavagem suficientemente com água, foi dissolvida em 300 ml de etanol. O eluente assim obtido foi concentrado sob uma pressão reduzida, e secado, ob-tendo-se desta maneira pó de cor branco amarelado claro. Para o efeito de comparação, componentes adoçantes foram obtidos a partir de TD e de SN por meio de tratamentos semelhantes, e analisados.

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Os resultados de análise dos produtos extraídos e refinados estão expostos na

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Teste sensório 1: Cada solução a 0,1% da Morita e SN obtidas no Exemplo 2 e uma solução a 0,1% do pó amarelo foram preparadas separadamente, e sele-de participantes que estavam muito facom o sabor dos adoçantes de Stevia. E amargor, adstringência e qualidade de cionou-se um miliarizados compararam-se dulçor.

<table>table see original document page 26</column></row><table>

Em cada uma das amostras, a variedade Morita tinha sido aperfeiçoada no amargor e na adstringência em comparação com outras amostras e o seu dulçor é superior.

Teste sensório 2: Cada solução a 0,1% da Morita e TD obtida no Exemplo 2 que são o pó amarelo claro foi preparada separadamente, e selecionou-se um painel de 10 participantes que estavam muito familiarizados com o sabor dos adoçantes de Stevia. Compararam-se amargor, adstringência e qualidade de dulçor.

Tabela 7: Teste sensório 2<table>table see original document page 27</column></row><table>

Em cada uma das amostras, a variedade Morita tinha sido aperfeiçoada em amargor e adstringência em comparação com outras amostras, e o seu dulçor é superior .

EXEMPLO 3 PRODUÇÃO DE REBAUDIOSIDE A

Depois de aquecimento e dissolução de 2 g do produto extraido e refinado (variedade Morita) obtido no Exemplo 2 em metanol a 95% de um volume de 10 vezes, deixou-se o mesmo assentar a 4°C durante 6 dias enquanto se refrigerava o mesmo. O cristal assim obtido foi separado, e depois de lavagem do mesmo com metanol frio, ele foi secado sob uma pressão reduzida, e obtiveram-se 1,2 g de um cristal branco. Para fins de comparação, a partir de TD e SN, obtiveram-se 0,9 g de um cristal branco e 0,6 g de um cristal branco mediante tratamento semelhante, respectivamente e os mesmos Foram analisados.

Método de Análise

Cromatografia de líquido de alto desempenho<table>table see original document page 28</column></row><table>

Os resultados de análise dos produtos extraídos e refinados estão expostos na Tabela 8.

Tabela 8: Teste de Comparação 4 da Variedade Morita, TD e SN <table>table see original document page 28</column></row><table> Teste sensório 3: Cada solução a 0,1% do pó branco de SN obtido no Exemplo 3 foi preparada, e 5 selecionou-se um painel de 10 participantes que estavam muito familiarizados com o sabor dos adoçantes de Ste-via. Compararam-se amargor, adstringência e qualidade de dulçor.

Tabela 9: Teste sensório 3

<table>table see original document page 28</column></row><table>Em cada uma das amostras, a variedade Mo-rita tinha sido aperfeiçoada no amargor e adstringência em comparação com outras amostras, e seu dulçor é superior . A taxa de recuperação de um produto de alta pureza do mesmo foi superior.

Teste sensório 4: Preparou-se cada uma de solução a 0.1% do pó branco de TD obtida no Exemplo 3, e selecionou-se um painel de 10 participantes que estavam muito familiarizados com o sabor dos adoçantes de Stevia. Compararam-se amargor, adstringência e qualidade de dulçor.

Tabela 10: Teste sensório 4

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Em cada uma das amostras, a variedade Morita foi aperfeiçoada em amargor e adstringência em comparação com outras amostras, seu dulçor é superior e a taxa de recuperação de um produto de alta pureza também foi superior.EXEMPLO 4 PURIFICAÇÃO DE RERAUDIOSIDE A

Depois de aquecimento e dissolução obtiveram- se 2 g do produto extraido e refinado (variedade Morita) obtido no Exemplo 2 em metanol a 7 5% de um volume de 5 vezes, deixou-se assentar a 4°C durante 7 dias enquanto se refrigerava o mesmo. 0 cristal assim obtido foi separado, e depois de lavagem do mesmo com metanol frio, foi secado sob uma pressão reduzida, e obteve-se 0,9 g de um cristal branco que foi analisado.

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Claims (9)

1. - Planta Stevia rebaudiana, caracterizada pelo fato de que contém pelo menos uma relação em peso de 11,3:1 de Rebaudioside A para Stevioside e que contém uma faixa de 2 000 bp quando analisada por DNA Polimórfico Amplificado Aleatório (RAPD) utilizando-se os iniciadores da SEQ ID NO: 1 e da SEQ ID NO: 2.

2. - Planta Stevia rebaudiana de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende a variedade Stevia rebaudiana bertoni.

3. - Planta Stevia rebaudiana de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que é desenvolvida a partir de sementes do International Patent Organism Depositary (IPOD)(Japan) (Receipt No. FERM BP-10353).

4. - Planta Stevia rebaudiana plant de a-cordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é desenvolvida por cruzamento com uma planta derivada de sementes do International Patent Organism Depositary (IPOD)(Japan) (Receipt No. FERM BP-10353).

5. - Planta ou parte da mesma, caracterizada pelo fato de que pode ser obtida a partir de sementes do International Patent Organism Depositary (I-POD)(Japan) (Receipt No. FERM BP-10353).

6. - Método para a produção de um adoçante, caracterizado pelo fato de que a planta descrita na reivindicação 1 ou folhas secas da mesma é extraida com um solvente que compreende água.

7. - Método para produzir um adoçante, caracterizado pelo fato de que compreende extrair uma planta ou parte da mesma que pode ser obtida a partir de sementes do International Depôsitory (Receipt No. FERM BP-10353) com um solvente de Rebaudioside A, remover o dito solvente de Rebaudioside A e deixando a Re-baudioside-A.

8. - Método de acordo com a reivindicação 7 caracterizado pelo fato de que a dita Rebaudioside-A é pelo menos 92% pura.

9. - Método de acordo com a reivindicação 8 caracterizado pelo fato de que a dita Rebaudioside-A é pelo menos 97% pura.