JP5140755B2 - ステビア甘味料 - Google Patents
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Description
本発明は、更に該甘味料から高純度レバウディオサイドAを製造する方法に関する。
ステビアの甘味成分としては、ステビオサイド(C38H60O18)、レバウディオサイドA(C44H70O23)、レバウディオサイドC、D、E、ズルコサイドA等が知られている。一般に栽培されているステビア品種では上記甘味成分の内ステビオサイド(ST)が主成分でレバウディオサイドA(RA)の含有量はステビオサイドの10分の3〜4程度、レバウディオサイドCの含量はそれよりやや少ないが、品種によってはレバウディオサイドCを主成分とするものなど種々である。
レバウディオサイドAの生産コストの削減と安定した乾燥葉の収穫量を保ち、甘味料原料として甘味質の優れたレバウディオサイドAを高含有したステビア品種を開発し、同時に、それらを継続維持し、それらを基に優れた甘味料を製造する必要がある。
一方、ステビア植物の品種改良においてステビア植物を特定する方法が問題となる。改良されたステビア植物の識別方法として、草丈、葉形等による識別が考えられるが、ステビアは自家不和合性であり雑種になりやすく、草丈、葉形等による識別のみでは不可能である。
甘味成分の含有量が高くステビオサイドに対してレバウディオサイドAの含有比率の高い改良品種においてはその含有比率による特定方法が考えられるが、生育期間の気象条件、収穫時期等により甘味成分比率が変動するのは避けられないから、この方法も現実性に乏しい。
本発明の第2は、ステビオサイド1重量部に対してレバウデイオサイドAを4重量部以上を含む甘味料の製造方法であり、前項の植物体またはその乾燥葉を水、または含水溶媒で抽出することを特徴とする。
交配と選別による品種改良においては、選別された品種の特定方法が重要な意味を持つ。本発明者らは、RAPD法によって、DNA鑑定による特定方法を検討した。
実際には、原料の植物体について、選択的に沈殿させたゲノムDNAを雛型とし、プライマーとして例えばA06(塩基配列;ACTGGCCGAGGG) とA48(塩基配列;CCGCAGGGACCA)のセットおよび rTaq(TAKARA)を用いて94度(30秒)、55度(30秒)、72度(120秒)で35サイクル反応を行った後、72度で10分間反応させる。その後、PCR増幅産物をアガロース電気泳動法によって確認し、特定のDNAバンドにより植物体が確認できる。
レバウディオサイドAを比較的高濃度で含有する品種の育種過程
実施例1
レバウディオサイドAを比較的高濃度に含有する品種のかけ合わせで得られた種子より、1995年にレバウディオサイドAを含有するSF−1、SF5−2品種(特開平10−271928号記載)を新見工場内ビニールハウス内で人工的にかけ合わせ、得られた種子を96年3月に新見工場内のビニールハウスに播種、発芽した苗を育苗ポットに移植し、5月上旬に苗丈8cm程度以上の苗600本を工場内圃場に10アール当たり窒素、燐、カリの肥料成分各20kgを施肥し2週間後に移植した。7月上旬に追肥として10アール当たり窒素、燐、カリの肥料成分各10kgを追肥した。
98年にTD-1品種を新見工場内ビニールハウス内で人工的にかけ合わせ、得られた種子を99年3月に新見工場内のビニールハウスに播種、発芽した苗を育苗ポットに移植し、5月上旬に苗丈7cm程度以上の苗300本を工場内圃場に10アール当たり窒素、燐、カリの肥料成分各20kgを施肥し2週間後に移植した。7月上旬に追肥として10アール当たり窒素、燐、カリの肥料成分各10kgを追肥した。
守田品種との他品種の比較のために、2003年4月中旬にレバウディオサイドAを主成分とするTD−1(TD)、ステビオサイドを主甘味成分とし、レバウデイオサイドAを副甘味成分とする一般的なステビア品種(SN)各40本も同様に挿し木し、同様に工場内圃場に植え付けた。
上記の5月上旬に圃場に移植した挿し木により増殖させた守田品種の苗200本と、TD品種、SN苗各40本のうち、6月上旬に任意に選んだ各品種10本中での発病の有無を調査した後、守田、TD、SNの各品種を地上から15cmで刈り取り後、葉部を分離し、乾燥後分析試料とした。
7月中旬に追肥を行い、9月上旬に各品種1区画20株を選択しセプトリア菌、アルタナリア菌の発病状況を調査した後、各品種を地上部から刈り取った後、葉部を分離し、乾燥後分析試料とした。
分析結果は次のとおりであった。
04年3月に守田品種から萌芽した穂先を200本挿し木し、4月下旬に圃場に移植し、5月末、6月末、7月末、8月末、9月末、開花後の10月末に地上部を刈り取り、葉のみを分離した後、乾燥し、甘味成分含量を測定した。
甘味成分の測定は高速液体クロマトグラフィーにより行った。
甘味成分含量、甘味成分比、収量から守田品種が最も優れていたことから、守田品種をPCR法により識別した。
乾熱滅菌した乳鉢に守田品種の葉を約0.2グラム入れ、液体窒素を加えて乳棒ですりつぶし、マイクロチューブにスパテュラで約0.05gづつ入れた。300μlの2%CTAB溶液(2%CTAB溶液(50ml):組成100mM、Tris−HCl(pH8.0)20mM、EDTA(pH8.0)、2% CTAB、1.4M NaCl)を加え、転倒混和した後、65℃に熱したヒートブロックにチューブを移し、30分間加温した。等量(300μl)のクロロホルム/イソアミルアルコール(24:1)を加え、5分間穏やかに攪拌する。14000rpmで15分遠心分離した後、2層に分かれた内容物の上層の水層を新しいチューブに移す。
上清を捨てて、400μlの1MCsClを加え、ピペッティングをして沈殿を完全に溶かす。900μlの100%エタノールを加え、転倒混和後、−20℃で20分以上静置し、14000rpmで15分間遠心分離を行なう。上清を捨て、沈殿に400μlの70%エタノールを加え14000rpmで15分間遠心分離を行い、この操作を繰り返した後に上清を捨て、沈殿を真空乾燥機で乾燥し、30μlの超純水に溶解する。溶液をアガロースゲル電気泳動し、DNAが単離されていることを確認した。
守田品種はおよそ2000bp下部に特徴的な塩基配列を有し、DNAをアガロースゲル電気泳動で検出することによって、他の品種と容易に区別することが出来る。
上記と異なるプライマーを使用して、守田品種およびSN品種の比較を行った。
<DNA抽出>
DNA抽出はCTAB法により行った。守田品種、SN品種それぞれの葉、約0.5gを乳鉢中で液体窒素により凍結し、乳棒にて粉砕した。粉砕したサンプルは50mlファルコンチューブ中で20mlの2%CTAB溶液(100mM Tris−HCl pH8.0、20mM EDTA pH8.0、2% CTAB、1.4M NaCl、1% PVP)と混和し、65℃で30分インキュベートした。等量のクロロホルム/イソアミルアルコール(24:1)を加え、10分間撹拌した後、3500rpmで15分遠心分離し、水層を別の50mlファルコンチューブに移した。
得られたDNAサンプルを鋳型として以下の反応液組成にてPCR反応を行った。PCRサイクルは96℃で30秒反応させた後、96℃10秒、42℃2分、72℃2分35サイクル、さらに72℃で4分反応させた。反応後、PCR産物は1.8%アガロースゲル電気泳動により分画し、EtBr染色後UV照射下にて撮影した。その結果、プライマーUBC−66において約2000bp付近に守田品種に特異的なバンドが確認できた。またプライマーUBC−72では約600bp付近に、UBC−106では約700bp付近にSN品種に特異的なバンドが確認された。この結果から守田品種とSN品種は遺伝的に異なる系統であり、RAPD分析により容易にその差異が検出できることが明らかとなった。
10 X PCR バファー 5μl
dNTP (2.0mM) 5μl
RAPD プライマー *(10 mer) 5μl(5μM)
ブレンド・タック(Blend Taq)(商標)(TOYOBO) 0.5μl(2.5U/μl)
ステビアDNA 1μl(30ng/μl)
滅菌水 33.5μl
*プライマーとしては下記のUBC−66、UBC−72またはUBC−106を用いた。
UBC−66: GAGGGCGTGA
UBC−72: GAGCACGGGA
UBC−106: CGTCTGCCCG
9月末に得られた守田品種の乾燥葉20gを20倍量の水で甘味が感じられなくなるまで数回抽出し、抽出液を陽イオン交換樹脂(アンバーライトIR−120B)20mlを充填したカラムおよび陰イオン交換樹脂(デュオライトA−4)20ml、粒状活性炭5mlを充填したカラムに通液し、通過液を吸着樹脂(ダイヤイオンHP−20)100mlを充填したカラムに通して甘味成分を吸着させ、十分水洗後エタノール300mlで溶離する。溶離液を減圧下に濃縮し、乾燥して淡黄白色の粉末を得た。比較のためにTD、SNからも同様の処理をして甘味成分を得、これを分析した。
分析方法 高速液体クロマトグラフィー法
使用カラム Hibar Licrosorb NH2 5μ 4mm(直径)×250mm
流速 1.5ml/分
展開溶媒 アセトニトリル:水=82:18
測定波長 210nm
実施例2で得られた守田、SNの淡黄色の粉末の各0.1%溶液を調製し、ステビア甘味料の味質に精通したパネラ−10人により苦み、渋み、甘味質を比較した。
実施例2で得られた守田、TDの淡黄色の粉末の各0.1%溶液を調製し、ステビア甘味料の味質に精通したパネラ−10人により苦み、渋み、甘味質を比較した。
実施例2で得られた抽出精製物(守田品種)2gを10倍量の95%メタノールに加熱溶解した後に、4℃に6日間冷却放置し、得られた結晶を分離し、冷メタノールで洗浄後、減圧乾燥し、白色の結晶1.2gを得た。比較のためにTD、SNからも同様の処理をしてそれぞれ白色の結晶0.9gおよび0.6gを得、これを分析した。
分析方法 高速液体クロマトグラフィー法
使用カラム Hibar licrosorb NH2 5μ 4mm(直径)×250mm
流速 1.5ml/分
展開溶媒 アセトニトリル:水=82:18
測定波長 210nm
実施例3で得られたSN白色の粉末の各0.1%溶液を調製し、ステビア甘味料の味質に精通したパネラ−10人により苦み、渋み、甘味質を比較した。
実施例4 高純度レバウディオサイドA甘味料の製造
実施例2で得られた抽出精製物(守田品種)の2gを5倍量の75%メタノールに加熱溶解した後に、4℃に7日間冷却放置し、得られた結晶を分離し、冷メタノールで洗浄後、減圧乾燥し、白色の結晶0.9gを得て、分析した。
a:Hind IIIマーカー
b、e:SN品種
c、f:守田品種
d、g:SS品種
h:1kbp DNA ラダーマーカー
図2における記号は以下の通りである。
守:守田品種
SN:SN品種
M:DNAマーカー(100bp ラダー)
Claims (6)
- ステビオサイド1重量部に対してレバウディオサイドAを少なくとも4重量部以上含むステビア・レバウディアナ・ベルトーニ品種であって、国際寄託の種子(受託番号FERM BP−10353)より得られる植物体またはその植物体の挿し木により得られる植物体。
- 以下の2種のプライマーA06およびA48:
A06:ACTGGCCGAGGGおよびA48:CCGCAGGGACCA
の混合物を用いるPCRを実施し、得られたPCR増幅物中にアガロース電気泳動で2000bp下部に特異的なバンドを有することを特徴とする、請求項1の植物体。 - 以下のプライマー:UBC−66
UBC-66:GAGGGCGTGA
を用いるPCRを実施し、得られたPCR増幅物中にアガロース電気泳動で2000bp付近に特徴的なバンドを有することを特徴とする、請求項1または2の植物体。 - 請求項1〜3のいずれかに記載の植物体またはその乾燥葉を水または含水溶媒で抽出することを特徴とする、甘味料の製造方法。
- 請求項4の方法により得られる甘味料から、ステビオサイド1重量部に対してレバウディオサイドAを少なくとも40重量部以上含み、かつ純度92%以上のレバウディオサイドAを得る方法。
- ステビオサイド1重量部に対してレバウディオサイドAを少なくとも4重量部以上含むステビア・レバウディアナ・ベルトーニ品種の種子であって、そのサンプルが国際寄託(受託番号FERM BP−10353)されている種子。
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