RU2463780C2 - Способ производства подсластителя с высоким содержанием ребаудиозида-a - Google Patents

Способ производства подсластителя с высоким содержанием ребаудиозида-a Download PDF

Info

Publication number
RU2463780C2
RU2463780C2 RU2010140045/10A RU2010140045A RU2463780C2 RU 2463780 C2 RU2463780 C2 RU 2463780C2 RU 2010140045/10 A RU2010140045/10 A RU 2010140045/10A RU 2010140045 A RU2010140045 A RU 2010140045A RU 2463780 C2 RU2463780 C2 RU 2463780C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
rebaudioside
plant
sweetener
morita
stevioside
Prior art date
Application number
RU2010140045/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2010140045A (ru
Inventor
Тойошиге МОРИТА (JP)
Тойошиге МОРИТА
Коджи МОРИТА (JP)
Коджи МОРИТА
Коичиро КОМАИ (JP)
Коичиро КОМАИ
Original Assignee
Морита Кагаку Когио Со., Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Морита Кагаку Когио Со., Лтд. filed Critical Морита Кагаку Когио Со., Лтд.
Publication of RU2010140045A publication Critical patent/RU2010140045A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2463780C2 publication Critical patent/RU2463780C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/14—Asteraceae or Compositae, e.g. safflower, sunflower, artichoke or lettuce
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10—Seeds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/12—Leaves
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A23L27/10—Natural spices, flavouring agents or condiments; Extracts thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A23L27/30—Artificial sweetening agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A23L27/30—Artificial sweetening agents
    • A23L27/33—Artificial sweetening agents containing sugars or derivatives
    • A23L27/36—Terpene glycosides

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Seasonings (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ производства подсластителя из растения Stevia Rebaudiana, содержащего, по меньшей мере, 11,3:1 массового соотношения Ребаудиозида А к Стевиозиду, где указанное растение получено из семян, задепонированных в Международном Депозитарии под номером FERM ВР-10353 (IPOD) (Япония), или получено путем повторных скрещиваний или селекции растения, полученного из семян, задепонированных в Международном Депозитарии под номером FERM BP-10353 (IPOD) (Япония), или его сушеных листьев. Также предложен способ производства Ребаудиозида А путем экстракции из растения, полученного из семян, задепонированных в Международном Депозитарии под номером FERM BP-10353 (IPOD) (Япония), или его сушенных листьев. Настоящее изобретение может найти дальнейшее применение в области пищевой промышленности. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 4 пр., 11 табл., 2 ил.

Description

Более ранние родственные заявки
Данная заявка является выделенной заявкой из российской заявки №2007131961, по которой испрашивается приоритет по WO2006093229, поданной 02.03.2006 и JP2005-060930, поданной 04.03.2005. Каждая включена здесь в качестве ссылки в полном объеме.
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к растению, принадлежащему виду Stevia Rebaudiana Bertoni с высокой долей Ребаудиозида-А по сравнению со Стевиозидом, и способу получения подсластителя, экстрагированного из указанного растения и/или его сушеных листьев. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения Ребаудиозида А высокой чистоты из указанного подсластителя.
Предпосылки к созданию изобретения
Stevia представляет собой многолетнее растение Compositae Asteraceae, первоначально произраставшее в Парагвае, Южной Америке, и его научное название - Stevia Rebaudiana Bertoni. Stevia содержит сладкие компоненты, сладость которых в 300 или более раз выше, чем у сахара, и его выращивают для использования в качестве натурального подсластителя, полученного путем экстракции компонентов, придающих сладость.
Стевиозид (C 38 H 60 O 18 ), Ребаудиозид А (С 44 Н 70 О 23 ), Ребаудиозид С, D и Е, Дулкозид А и т.д. уже известны в качестве подсластителей. У обычно сажаемых сортов, Стевиозид (ST) является основным компонентом среди упомянутых выше сладких компонентов с количественным содержанием Ребаудиозида A (RA), составляющим примерно от 3/10 до 4/10 содержания Стевиозида и содержания Ребаудиозида С, составляющим несколько меньше, но в зависимости от сортов, существует Stevia, основным компонентом которой является Ребаудиозид С. То есть существуют различные сорта.
Среди вкусовых ощущений, таких как горечь и терпкость, сладкий вкус является очень тонким. Поскольку степень сладости Стевиозида в 300 раз выше, чем у сахара, его использовали в качестве натурального подсластителя в пищевой промышленности. Его сладкий вкус относительно похож на вкус сахара, однако существует недостаток в том, что во рту остается неприятный вкус, такой как горечь. Следовательно, для подсластителя является нежелательным содержание большого количества Стевиозида. С другой стороны, сладкий вкус Ребаудиозида А хорошего качества и степень сладости в 1,3-1,5 раз выш,е чем стевиозида.
Следовательно, необходимо снизить стоимость получения Ребаудиозида А для поддержания стабильного выхода сушеных листьев, для выведения сорта Stevia, с высоким количественным содержанием Ребаудиозида А отличного качества подслащивания, в качестве сырья для подсластителя, и в то же время для сохранения его длительных запасов и для получения отличного подсластителя на его основе.
Авторы настоящего изобретения вывели растение путем повторных селективных перекрестных опылений обычных сортов, получая, таким образом, сорта Stevia с высокой долей содержания Ребаудиозида (RA) относительно Стевиозида (ST), и подсластители, превосходные по относительному содержанию Ребаудиозида А к Стевиозиду (ST), получали экстракцией компонента, придающего сладкий вкус, из этих растений (смотри патентные источники информации с 1-1 по 1-3, описанные далее), однако требовалось вывести стабильные сорта с более высоким и лучшим относительным содержанием Ребаудиозида А.
С другой стороны, при выведении растений Stevia, проблемой является способ идентификации растений Stevia. В качестве способа идентификации улучшенных растений Stevia можно думать об идентификациях по высоте растений, форме листьев, и т.д., однако, поскольку Stevia не является самоопыляемым растением и имеет тенденцию к образованию гибридов, классификацией только по высоте растений, форме листьев и т.д. этого нельзя достичь.
Кроме того, существует сравнительная идентификация на основе устойчивости к заболеваниям патогенами, специфичными для Stevia, однако, хотя увядшие листья и черные точки на листьях, которые имеют место только у Stevia, вызываются грибком Septoria и Alternaria, эти грибы живут в почве. Следовательно, поскольку эти симптомы встречаются не только в Японии, а также по всему миру, только этих характеристик недостаточно для идентификации сорта.
У улучшенного сорта с высоким содержанием сахаристого вещества и высоким относительным содержанием ребаудиозида А по сравнению со стевиозидом, можно подумать о способе идентификации по этому относительному содержанию, однако поскольку изменение относительного содержания сахаристого вещества может неизбежно изменяться в зависимости от погодных условий во время периода роста, времени сбора урожая и т.д., этому способу недостает практичности.
В последнее время был разработан способ, которым осуществляют идентификацию путем идентификации ДНК на основе метода RAPD, в котором используют смесь праймеров (смотри патентные ссылки 2, приведенные ниже), однако не ясно, возможно ли применять этот способ для идентификации растения в соответствии с настоящим изобретением.
Патентная ссылка 1: выложенная патентная публикация Sho. 59/1984-045848 Gazette.
Патентная ссылка 2: выложенная патентная публикация Sho. 60/1985-160823 Gazette.
Патентная ссылка 3: выложенная патентная публикация Sho. 61/1986-202667 Gazette.
Патентная ссылка 4: выложенная патентная публикация No. 2003-9878 Gazette.
Краткое изложение сущности изобретения
Сокращения: ST = Стевиозид; RA = Ребаудиозид А
Настоящее изобретение относится к созданию сортов, превосходных по количественному содержанию компонента, придающего сладкий вкус, и соотношения содержания компонентов, придающих сладкий вкус, для возможности различать их гены методом RAPD для сохранения их характеристик, тем самым различая их с растениями других сортов Stevia, и предоставлению подсластителей, превосходных по подслащивающему свойству, и к способу их получения.
Первый аспект настоящего изобретения относится к сорту Stevia Rebaudiana Bertoni, содержащему 4 части по массе или более Ребаудиозида А к одной части по массе Стевиозида. Для этого, как будет описано далее, путем повторных скрещиваний и селекции были созданы новые растения, принадлежащие виду Stevia Rebaudiana Bertoni, которые содержат по меньшей мере 4 части по массе Ребаудиозида А к одной части по массе Стевиозида.
Второй аспект настоящего изобретения относится к способу получения подсластителя, который содержит 4 части по массе или более Ребаудиозида А к одной части по массе Стевиодиза, указанный способ получения характеризуется проведением экстракции из растения, описанного в предыдущем параграфе или его сушеных листьев, водой или водосодержащим растворителем.
Третий аспект настоящего изобретения относится к способу получения подсластителя высокой чистоты, содержащего 40 частей по массе или более Ребаудиозида А к одной части Стевиозида; указанный способ получения подсластителя, содержащего 40 частей по массе или более Ребаудиозида А к одной части по массе Стевиозида, их содержание составляет 92% или более, характеризуется проведением перекристаллизации подсластителя, полученного в предыдущем параграфе.
При улучшении сорта путем скрещивания и селекции способ идентификации выбранного сорта имеет важное значение. Авторы настоящего изобретения изучили способы идентификации, основанные на идентификации ДНК, с помощью метода RAPD.
Настоящее изобретение относится к подсластителю превосходного подслащивающего качества и способу его получения.
Краткое описание чертежей
На Фиг.1 представлена электрофоретическая диаграмма последовательностей оснований ДНК сорта Morita, SS и SN. Характеристические последовательности оснований указаны стрелками. Символы на Фиг.1 представляют собой следующее.
a: Hind III маркер
b и е: сорт SN
с и f: сорт Morita
d и g: сорт SS
h: «лестничный» маркер ДНК 1 тыс. н.п.
На Фиг.2 представлена электрофоретическая диаграмма последовательности нуклеотидных оснований ДНК сорта Morita и SN. Характеристические последовательности оснований указаны стрелками. Символы на Фиг.2 означают следующее.
Mori: сорт Morita
SN: сорт SN
M: ДНК маркер (100 н.п. «лестничный»)
Описание вариантов осуществления изобретения
Метод RAPD (метод случайно амплифицированной полиморфной ДНК), используемый для идентификации в настоящем изобретении, представляет собой один из аналитических ДНК методов и представляет собой способ анализа с помощью электрофореза образца ДНК, амплифицированного в области ДНК, помещенной посередине между одной и той же или сходными последовательностями праймеров, используемых в ПЦР (полимеразно-цепной реакции), используя многочисленные праймеры. Кроме того, для цетилтриметил аммония бромида (СТАВ) существует четвертичная аммонийная соль, имеющая алкильную группу с длинной цепью, и она образует нерастворимый комплекс с полианионом, таким как нуклеиновая кислота, ее можно использовать для выделения нуклеиновой кислоты.
В способах, которыми классифицируют сорт, исходя из различий в ДНК, ДНК геном отдельно выделяют из растения с помощью СТАВ, удаляют рибонуклеиновую кислоту (РНК) и ПЦР амплифицированный продукт, полученный методом ПЦР с использованием смеси праймеров, выделяют по различиям в отпечатках ДНК, полученных электрофорезом в агарозном геле. В случае растения по настоящему изобретению, как будет описано далее, было подтверждено, что характеристическая последовательность оснований показана на уровне 2000 пар оснований нижней части.
Фактически, с ДНК геномом, селективно преципитированным как образец растительного сырья, проводят 35 циклов реакции при 94 градусах (30 сек), 55 градусах (30 сек) и 72 градусах (120 сек), используя в качестве праймеров, например, набор А06 (ACTGGCCGAGGG (SEQ ID NO:1)) и А48 (CCGCAGGGACCA (SEQ ID NO:2)) и rTaq (Takara), и после этого реакция продолжается в течение 10 мин при 72 градусах. После этого ПЦР амплифицированный продукт подтверждается электрофорезом в агарозном геле, и, таким образом, это растение может быть подтверждено специфической полосой ДНК.
Для получения подсластителя, далее, указанное растение или его высушенные листья экстрагируют водой или растворителем, содержащим воду, экстракционный раствор концентрируют как есть или удаляют ионные примеси с использованием анионообменной смолы или катионообменной смолы, или активированным углем, компоненты, придающие сладкий вкус, оставляют для абсорбции в абсорбционную смолу, с последующей элюцией гидрофильным растворителем, и элюат концентрируют и сушат с получением подсластителя. Способ получения подсластителя может включать в себя обычные средства очистки, такие как стадии обесцвечивания, в дополнение к приведенным выше, как требуется соответствующим образом, и способ, которым получают Ребаудиозид А высокой чистоты, может включать обычные стадии, такие как мембранная сепарация, спиртовая экстракция и кристаллизация и т.д. Кроме того, в способе кристаллизации его можно соответствующим образом использовать путем добавления воды к органическому растворителю, такому как этанол или метанол, в качестве кристаллизующего растворителя. К полученному таким образом подсластителю можно добавлять другие природные или искусственные подсластители, разбавитель и т.д.
Для селекции сорта, содержащие относительно высокую концентрацию Ребаудиозида А, скрещивают и производят отбор. Сначала, SF5-1 и SF5-2 (описанные в выложенной патентной публикации № Hei 10/1998-271928 №271928-1998 Gazette) с содержанием Ребаудиозида А в высокой концентрации, искусственно скрещивают, TD-1 (описанный в выложенной патентной публикации №2003-9878 Gazette) отбирают из полученных таким образом семян, которые в дальнейшем искусственно скрещивают, сорт, устойчивый к грибку Septoria и грибку Alternaria отбирают из этих семян, анализируют содержание в нем компонента, придающего сладкий вкус, и проводят отбор растения, которое содержит 4 части по массе или более Ребаудиозида А к одной части Стевиозида, имеет высокое содержание подслащивающего компонента, и в общем и целом превосходное по устойчивости к заболеваниям. Кроме того, количество содержащихся компонентов, придающих сладкий вкус, соотношение подслащивающих компонентов и условия выращивания получали путем неоднократных исследований и сорт назвали Morita, гены которого исследовали.
Кроме того, в настоящее время заявитель завершил международное депонирование сорта Morita по этому изобретению (международный депозитарий патентуемых организмов (IPOD) (Япония) (входящий № FERM ВР-10353). Следовательно, можно легко получить растение по изобретению из семян сорта Morita этого депозитария. Stevia не является самоопыляемым растением, и хотя это не обязательно, что целевое растение всегда может быть получено из указанных семян, целевое растение может быть легко выбрано путем идентификации ДНК, описанной в этой заявке. И если необходимо, если оно скрещено с другим высококачественным сортом Stevia (например, TD-1) и отбор проводят в соответствии с осуществлением Примера 1, описанного далее, растение, которое содержит Ребаудиозид А в высокой концентрации, может быть легко получено. Эти растения все охватываются растениями, которые могут быть получены из семян сорта Morita, депонированного на международном уровне, т.е. сорта Morita.
Далее будет конкретно описан процесс скрещивания, его характеристики и т.д. Однако настоящее изобретение не ограничивается этими процессами скрещивания и способами культивирования.
Пример 1: Скрещивание и тестирования
Из семян, полученных скрещиванием сортов, содержащих Ребаудиозид А в относительно высокой концентрации, семена, полученные искусственным скрещиванием SF-1 и SF 5-2 (описанных в выложенной патентной публикации № Hei 10/1998-271928), содержащие Ребаудиозид А, сеяли в виниловой теплице в фермерском хозяйстве Nimi, проросшую рассаду пересаживали в горшочки для выращивания рассады, и 600 сеянцев высотой около 8 см или выше пересаживали на сельскохозяйственные угодья фермерского хозяйства в начале мая, на каждый ар земли вносили около 20 кг азотистых, фосфорных и калийных удобрений. В начале июля в качестве дополнительных удобрений в землю дополнительно вносили по 10 кг азотистого, фосфорного и калийного удобрения.
В начале сентября анализировали компоненты, придающие сладкий вкус, и отбирали сырье, сорт TD-1 (описан в выложенной патентной публикации № 2003-9878), содержащее в 3 раза больше Ребаудиозида А по сравнению со Стевиозидом.
В 1998 сорт TD-1 был выведен искусственным скрещиванием в виниловой теплице в фермерском хозяйстве Nimi, полученные семена сеяли в виниловой теплице в фермерском хозяйстве Nimi в марте 1999, проросшую рассаду пересаживали в горшочки для выращивания рассады и 300 сеянцев высотой около 7 см или выше пересаживали на сельскохозяйственные угодья фермерского хозяйства в начале мая, на каждый ар земли вносили около 20 кг азотистых, фосфорных и калийных удобрений. В начале июля в качестве дополнительных удобрений в землю дополнительно вносили по 10 кг азотистого, фосфорного и калийного удобрения.
В начале сентября анализировали компоненты, придающие сладкий вкус, и отбирали сырье, содержащее 4 части по массе или более, Ребаудиозида А по сравнению со Стевиозидом, и более устойчивое к заболеваниям, и обладающее лучшими ростовыми качествами, чем сорт TD-1. В середине апреля 2000, 100 побегов, проросших из них, срезали и сажали. В начале мая их высаживали подобным образом на сельскохозяйственные угодья фермерского хозяйства и в конце июля снова изучали их устойчивость к болезням и развитие и выверяли те, у которых были наилучшие соотношения компонентов, придающих сладкий вкус и количественное содержание. Кроме того, в течение 3 лет с 2001 было подтверждено, что устойчивость к болезням, соотношения компонентов, придающих сладкий вкус, количественное содержание компонента, придающего сладкий вкус, и выход сушеных листьев были лучше и больше, и не было изменений характеристик роста и компонентов, и это растение было названо сортом Morita.
Для сравнения сорта Morita и других сортов было сделано 40 срезов каждого растения TD-1 (TD), основным компонентом которых был Ребаудиозид А, и другого основного сорта Stevia (SN), основным компонентом, придающим сладкий вкус, которого был Стевиозид, второстепенным подслащивающим компонентом которого был Ребаудиозид А, и их высаживали аналогичным образом на сельскохозяйственных угодьях фермерского хозяйства.
Наличие или отсутствие вспышек какого-либо заболевания исследовали в каждых 10 вариантах, произвольно отобранных в начале июня из 200 саженцев сорта Morita, размноженных вышеупомянутыми черенками, пересаженными на сельскохозяйственные угодья в начале мая, и по 40 саженцев сорта TD и SN, и после этого, каждый саженец Morita, TD и SN срезали на высоте 15 см от земли, отделяли листья, и после высушивания, их использовали в качестве образцов для анализа.
Результаты анализа представляют собой следующее.
Таблица 1
Сравнительный тест 1 сортов Morita, TD и SN
Сорт Появление пожелтевших или почерневших листьев ST (%) RA (%) RA/ST
Morita Черные точки у 0 черенков 2,3 9,3 4,04
TD Черные точки у 1 черенка 2,5 9,1 3,64
SN Появились у 7 черенков 6,9 2,8 2,46
В середине июля вносили дополнительные удобрения и после отбора 20 черенков из каждого сорта на одну секцию и изучения условий появления заболеваний, вызванных грибами Septoria и Alternaria, каждый сорт срезали наземные части, листья отделяли и после высушивания использовали в качестве образцов для анализа.
Результаты анализа представляют собой следующее.
Таблица 2
Сравнительный тест 2 сортов Morita, TD и SN
Сорт Появление пожелтевших или почерневших листьев ST (%) RA (%) RA/ST Выход/растение (г)
Morita Черные точки на нижних листьях у 3 черенков 1,1 13,1 11,9 12,9
TD Черные точки на нижних листьях у 5 черенков 1,1 11,1 10,0 11,7
SN Увядание нижних листьев у 12 черенков 9,8 3,9 0,39 9,3
У сорта Morita соотношение появления черных точек на нижних листьях было относительно меньше и он превосходил другие сорта по содержанию компонента, придающего сладкий вкус, и выходу высушенных листьев. У сорта TD, по сравнению с сортом Morita, наблюдалось большое количество черных точек, вызванных грибком Septoria, листья уже начинали желтеть из-за грибка Septoria. У сорта SN проявилось пожелтение листьев вплоть до 3-го узла нижних листьев из-за грибка Septoria, а листья первого узла увядали.
В марте 2004 сажали 200 срезов верхушек побегов, проросших из сорта Morita, в конце апреля их пересаживали на сельскохозяйственные угодья, собирали наземную часть растения в конце мая, в конце июня, в конце июля, в конце августа, в конце сентября и в конце октября после цветения, отделяли только листья и сушили, измеряли количественное содержание компонента, придающего сладкий вкус.
Компоненты со сладким вкусом определяли с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения.
Таблица 3
Сезонная продукция стевиозида и ребаудиозида А
Время сбора урожая ST (%) RA (%) RA/ST
Конец мая 2,2 9,1 4,1
Конец июня 2,3 9,6 4,2
Конец июля 1,9 12,6 6,6
Конец августа 1,5 12,8 8,5
Конец сентября 1,0 13,2 13,2
Конец октября 1,0 10,1 10,1
У сорта Morita было показано различное количественное содержание компонентов, придающих сладкий вкус, и соотношения компонентов, придающих сладкий вкус, в зависимости от периода роста, наблюдалась тенденция увеличения количественного содержания компонента, придающего сладкий вкус, с удлинением периода роста, и с другой стороны, снижалось количественное содержание стевиозида. В конце октября, в период цветения, количественное содержание компонента, придающего сладкий вкус, снижалось.
Что касается количественного содержания компонента, придающего сладкий вкус, соотношения компонентов, придающих сладкий вкус, и выхода, поскольку сорт Morita был лучшим, сорт Morita идентифицировали методом ПЦР.
В ступку, стерилизованную высушиванием и нагреванием, помещали около 0,2 г листьев сорта Morita, к которым добавляли жидкий азот, размельчали пестиком и около 0,05 г за один раз помещали шпателем в микропробирки. Туда добавляли 300 мкл 2% раствора СТАВ (2% раствор СТАВ (50 мл1): состав 100 мМ, трис-HCl (рН 8,0) 20 мМ, EDTA (рН 8,0), 2% СТАВ, 1,4 М NaCl) и после переворачивания и перемешивания пробирки перемещали в жаровой шкаф, нагретый до 65°С, и нагревали в течение 30 мин. Туда добавляли равное количество хлороформа (300 мкл)/изоамилового спирта (24:1) с последующим постепенным перемешиванием. После центрифугирования и разделения при 14000 об/мин в течение 15 мин водный слой, который был верхним слоем разделенного на 2 слоя содержимого, переносили в новую пробирку.
Действия после вышеупомянутой стадии обработки хлороформом/изоамиловым спиртом повторяли еще один раз, и водный слой переносили в новую пробирку. Туда добавляли 400 мкл 1% раствора СТАВ (1% раствор СТАВ (50 мл): состав 1 М, трис-HCl 2,5 мМ, EDTA 1,0 мл, 1% СТАВ 0,5 г) и после переворачивания и перемешивания в течение 15 мин оставляли неподвижно стоять при комнатной температуре в течение 1 часа с последующим разделением центрифугированием при 14000 об/мин в течение 15 мин.
Супернатант отбрасывали, после чего добавляли 400 мкл 1М C s Cl, и осадок полностью растворяли пипетированием. Туда добавляли 900 мкл 100% этанола и после переворачивания и перемешивания оставляли неподвижно стоять при температуре -20°С в течение 20 мин, с последующим разделением центрифугированием при 14000 об/мин в течение 15 мин. Супернатант отбрасывали, затем к осадку добавляли 400 мкл 70% этанола, подвергали разделению центрифугированием при 14000 об/мин в течение 15 мин и после повторения этого действия супернатант отбрасывали, осадок сушили в вакуумной сушилке и растворяли в 30 мкл особо чистой воды. Раствор подвергали электрофорезу в агарозном геле, тем самым подтверждая, что была отделена только лишь ДНК.
Для удаления РНК проводили реакцию в 500 мкл растворе РНКазы (состав: 100 мкл раствора вышеуказанной выделенной ДНК и 5 мкл РНКазы (5 г/мл) при 37°С в течение 1 часа и в реакционный раствор добавляли равное количество раствора PCI (состав: раствор, полученный центрифугированием при 13000 об/мин в течение 5 мин и отделением водного слоя после примешивания фенола:хлороформа:изоамилового спирта (25:24:1) постепенно). После остановки реакции и постепенного перемешивая смесь центрифугировали при 13000 об/мин в течение 5 мин.
Водный слой (верхний слой) переносили в новую микропробирку, в которую добавляли равное количество раствора CIA (состав: хлороформ:изоамиловый спирт, объемное соотношение 24:1), хранившегося при комнатной температуре, и после постепенного перемешивания его центрифугировали при 15000 об/мин в течение 3 мин, водный слой переносили в новую пробирку с последующей обработкой раствором CIA еще раз, туда добавляли 3 М ацетата натрия в количестве 1/10 количества полученного супернатанта и 100% этанола в избытке в 2,5 раза, с последующим тщательным перемешиванием и охлаждением при -20°С в течение 20 мин или дольше, а затем центрифугировали при 15000 об/мин в течение 15 мин, тем самым осаждая ДНК, супернатант отбрасывали и после добавления к осадку 1 мл охлажденного 70% этанола центрифугировали при 15000 об/мин в течение 15 мин, супернатант отбрасывали и остаток сушили в течение 5 мин, используя сушильный шкаф, под пониженным давлением.
С полученной таким образом геномной ДНК в качестве матрицы, используя состав для ПЦР (Таблица 4), проводили 35 циклов реакции при 94°С (30 сек), 55°С (30 сек) и 72°С (120 сек), а затем подвергали реакции при 72°С в течение 10 мин. После реакции ее держали при 4°С и получали ПЦР амплифицированный продукт. Когда полоса ДНК в ПЦР амплифицированном продукте подтвердилась электрофорезом в 1% агарозном геле, характеристический фрагмент ДНК выверяли в положении, которое примерно на 2000 пар нуклеотидов ниже, как показано у Morita на Фиг.1.
Таблица 4а
ПЦР реакция (20 мкл)
Матричная ДНК (1 нг/мкл) 5 мкл
Смесь праймеров (16 пмоль/мкл каждого) 0,5 мкл каждого
A06*(SEQ ID NO:1: ACTGGCCGAGGG)  
А48*(SEQ ID NO:2: CCGCAGGGACCA)  
dNTP (2,5 мМ каждый) 1,6 мкл
10 х буфер 2 мкл
Дистиллированная вода 7,9 мкл
rTaq (Takara) 0,5 мкл
MgCl 2 2 мкл
*Праймеры A06 и А48 изготовлены ВЕХ Corp.
Подобным образом полосы ДНК, полученные путем обработки, аналогичной приведенной выше, показаны на Фиг.1 для сорта SN (SN) и сорта SS (SS), основным компонентом которых является стевиозид и второстепенным компонентом ребаудиозид А.
Сорт Morita имеет характеристическую последовательность оснований в положении, которая примерно на 2000 пар нуклеотидов ниже, и, следовательно, ее легко отличить от других сортов путем детектирования ДНК с помощью агарозного электрофореза.
Используя праймеры, отличные от приведенных выше, сравнивали сорт Morita и сорт SN.
Экстракцию ДНК проводили с помощью СТАВ метода. Примерно по 0,5 г листьев сорта Morita и сорта SN замораживали жидким азотом в ступке, листья размалывали пестиком. Каждый размолотый образец смешивали с 20 мл 2% раствора СТАВ (100 мМ трис-HCl (рН 8,0) 20 мМ, EDTA (рН 8,0), 2% СТАВ, 1,4 М NaCl, 1% PVP) в пробирке Фалкона, объемом 50 мл, с последующей инкубацией при 65°С в течение 30 мин. Туда добавляли равное количество хлороформа:изоамилового спирта (24:1), с последующим перемешиванием в течение 10 мин, а затем подвергали разделению центрифугированием при 3500 об/мин в течение 15 мин и водный слой отбирали в другую 50 мл пробирку Фалкона.
Кроме того, туда добавляли равное количество 100% изопропанола с последующим разделением центрифугированием при 3500 об/мин в течение 15 мин, преципитат, собранный крючком, переносили в 1,5 мл микропробирку. После промывания преципитата 75% этанолом его сушили, а затем растворяли в 600 мкл ТЕ буфера. После добавления 1 мкл раствора РНКазы (1 мг/мл) и инкубирования при 37°С в течение 1 часа туда добавляли равное количество фенола, насыщенного ТЕ, с последующим перемешиванием и разделением центрифугированием при 15000 об/мин в течение 30 мин. Водный слой переносили в другую пробирку с последующим добавлением 3М ацетата натрия в количестве 1/10 и равное количество изопропанола и перемешиванием, а затем подвергали разделению центрифугированием при 15000 об/мин в течение 30 мин. После промывки полученного таким образом преципитата 75% этанолом дважды его сушили, растворяли в 50 мкл ТЕ буфера для получения образца ДНК.
С полученным таким образом образцом ДНК в качестве матрицы проводили ПЦР реакцию со следующим составом реакционной смеси. Что касается цикла ПЦР, после проведения реакции при 96°С в течение 30 сек, проводили 35 циклов при 96°С в течение 10 сек, при 42°С в течение 2 мин и 72°С в течение 2 мин, а затем реакцию снова проводили при 72°С в течение 4 мин. После проведения реакции ПЦР продукт фракционировали электрофорезом на 1,8% агарозном геле, и после его окрашивания с использованием EtBr, изображение получали под УФ излучением. В результате специфическая полоса сорта Morita могла быть подтверждена в окрестностях примерно 2000 пар нуклеотидов с праймером UBC-66. Кроме того, специфические полосы сорта SN были подтверждены в окрестностях примерно 600 пар нуклеотидов с праймером UBC-72 и в окрестностях примерно 700 пар нуклеотидов с UBC-106. В результате стало ясно, что сорт Morita и сорт SN являются генетически различными и это различие легко определяется с помощью RAPD анализа.
Таблица 4b
ПЦР реакция (50 мкл)
10 х ПЦР буфер 5 мкл
dNTP (2,0 мМ) 5 µ1
RAPD праймер * (10 mer) 5 мкл (5 мкМ)
UBC-66: (SEQ ID NO:3 GAGGGCGTGA)  
UBC-72: (SEQ ID NO:4 GAGCACGGGA)  
UBC-106: (SEQ ID NO:5 CGTCTGCCCG)  
Blend Taq (торговое название) (Toyobo) 0,5 мкл1 (2,5 Ед/мкл)
ДНК Stevia 1 мкл1 (30 нг/мкл)
Стерильная вода 33,5 мкл
Пример 2: Получение подсластителя
Двадцать г сушеных листьев сорта Morita, полученных в конце сентября, экстрагирвали водой в 20-кратном избытке несколько раз, пока не переставал чувствоваться сладкий вкус, раствор пропускали через колонку, наполненную 20 мл катионобменной смолы (Amberlite IR-120B), и колонку, наполненную 20 мл анионообменной смолы (Duolite A-4) и 5 мл гранулированного активированного угля, раствор, который прошел через эту колонку, пропускали через колонку, заполненную 100 мл адсорбционной смолы (Diaion HP-20), адсорбируя, таким образом, компоненты, придающие сладкий вкус, и после достаточного промывания водой, растворяли в 300 мл этанола. Полученный таким образом элюент концентрировали под пониженным давлением и сушили, получая, таким образом, порошок светлого желтовато-белого цвета. Для сравнения, компоненты, придающие сладкий вкус, получали из TD и SN путем аналогичной обработки и анализировали.
Способ анализа Жидкостная хроматография высокого разрешения
Используемая колонка Hibar Licrosorb NH 2 5 мк 4 мм (диа) × 250 мм
Скорость потока 1,5 мл/мин
Движущий растворитель ацетонитрил:вода = 82:18
Длина волны измерения 210 нм
Результаты анализа экстрагированных и очищенных продуктов приведены в таблице.
Таблица 5
Сравнительный тест 3 сорта Morita, TD и SN
Сорт ST (%) RA (%) RA/ST Выход
Morita 5,7 75,9 13,3 3,52 г
TD 6,1 71,2 11,6 3,25 г
SN 53,2 21,0 0,39 2,20 г
Сенсорный анализ 1: каждый 0,1% раствор Morita и SN, полученные в примере 2, и 0,1% раствор желтого порошка готовили по отдельности и отбирали группу 10 участников, хорошо знакомых со вкусом подсластителей Stevia. И сравнивали горечь, терпкость и качество сладкого вкуса.
Таблица 6
Сенсорный анализ 1
Горечь No. Утверждение, что Morita имеет горький вкус. No. Утверждение, что SN имеет горький вкус
0 10
терпкость No. Утверждение, что Morita имеет терпкий вкус. No. Утверждение, что SN имеет терпкий вкус
0 10
сладость No. Утверждение, что Morita имеет превосходный сладкий вкус No. Утверждение, что SN имеет превосходный сладкий вкус
10 0
В каждом из образцов сорт Morita был улучшен по горечи и терпкости по сравнению с другими образцами, а его сладкий вкус был превосходным.
Сенсорный анализ 2: каждый 0,1% раствор Morita и TD, полученные в примере 2, представляющие собой желтый порошок, готовили по отдельности и отбирали группу 10 участников, хорошо знакомых со вкусом подсластителей Stevia. И сравнивали горечь, терпкость и качество сладкого вкуса.
Таблица 7
Сенсорный анализ 2
Горечь No. Утверждение, что Morita имеет горький вкус. No. Утверждение, что TD имеет горький вкус
2 8
терпкость No. Утверждение, что Morita имеет терпкий вкус No. Утверждение, что TD имеет терпкий вкус
3 7
сладость No. Утверждение, что Morita имеет превосходный сладкий вкус No. Утверждение, что TD имеет превосходный сладкий вкус
9 1
В каждом образце сорт Morita был улучшен по горечи и терпкости по сравнению с другими образцами, а его сладкий вкус был превосходным.
Пример 3: Получение ребаудиозида а
После нагревания и растворения 2 г экстрагированного и очищенного продукта (сорт Morita), полученного в Примере 2, в 95% метаноле в 10-кратном объеме, его оставляли стоять при 4°С в течение 6 дней, охлаждая его. Полученный таким образом кристалл отделяли, и после его промывания холодным метанолом сушили под пониженным давлением и получали 1,2 г белого кристалла. Для сравнения аналогичной обработкой из TD и SN получали 0,9 г белого кристалла и 0,6 г белого кристалла соответственно и анализировали их.
Способ анализа Жидкостная хроматография высокого разрешения
Используемая колонка Hibar Licrosorb NH 2 5 мк 4 мм (диа) × 250 мм
Скорость потока 1,5 мл/мин
Движущий растворитель ацетонитрил:вода = 82:18
Длина волны измерения 210 нм
Результаты анализа экстрагированных и очищенных продуктов приведены в Таблице 8.
Таблица 8
Сравнительный тест 4 сорта Morita, TD и SN
Сорт ST (%) RA (%) RA/ST Выход
Morita 2,3 92,1 40,0 1,2 г
TD 3,7 87,9 23,7 0,9 г
SN 94,2 2,0 0,02 0,6 г
Сенсорный анализ 3: готовили каждый 0,1% раствор белого порошка SN, полученного в Примере 3, и отбирали группу 10 участников, хорошо знакомых со вкусом подсластителей Stevia. Сравнивали горечь, терпкость и качество сладкого вкуса.
Таблица 9
Сенсорный анализ 3
Горечь No. Утверждение, что Morita имеет горький вкус. No. Утверждение, что SN имеет горький вкус
0 10
терпкость No. Утверждение, что Morita имеет терпкий вкус. No. Утверждение, что SN имеет терпкий вкус
0 10
сладость No. Утверждение, что Morita имеет превосходный сладкий вкус No. Утверждение, что SN имеет превосходный сладкий вкус
10 0
В каждом из образцов, сорт Morita был улучшен по горечи и терпкости по сравнению с другими образцами, а его сладкий вкус был превосходным. Степень извлечения из него продукта высокой чистоты была выше, чем у других.
Сенсорный анализ 4: готовили по 0,1% раствору белого порошка TD, полученного в Примере 3, и отбирали группу 10 участников, хорошо знакомых со вкусом подсластителей Stevia. Сравнивали горечь, терпкость и качество сладкого вкуса.
Таблица 10
Сенсорный анализ 4
Горечь No. Утверждение, что Morita имеет горький вкус No. Утверждение, что TD имеет горький вкус
2 8
терпкость No. Утверждение, что Morita имеет терпкий вкус No. Утверждение, что TD имеет терпкий вкус
2 8
сладость No. Утверждение, что Morita имеет превосходный сладкий вкус No. Утверждение, что TD имеет превосходный сладкий вкус
10 0
В каждом из образцов сорт Morita был улучшен по горечи и терпкости по сравнению с другими образцами, а его сладкий вкус был превосходным. Степень извлечения из него продукта высокой чистоты была выше, чем у других.
Пример 4: Очистка ребаудиозида А
После нагревания и растворения 2 г экстрагированного и очищенного продукта (сорт Morita), полученного в Примере 2, в 75% метаноле в 5-кратном объеме, его оставляли стоять при 4°С в течение 7 дней, охлаждая его. Полученный таким образом кристалл отделяли и после его промывания холодным метанолом сушили под пониженным давлением и получали 0,9 г белого кристалла и анализировали.
Таблица 11
Очистка RA
Сорт ST (%) RA (%) RA/ST Выход
Morita 0,1 97,2 972 0,9 г

Claims (11)

1. Способ производства подсластителя, согласно которому: проводят экстракцию из растения Stevia rebaudiana или его сушеных листьев водосодержащим растворителем, при этом указанное растение содержит, по меньшей мере, 11,3:1 массового соотношения Ребаудиозида А к Стевиозиду и имеет полосу 2000 пар нуклеотидов при анализе методом случайно амплифицированной полиморфной ДНК (RAPD) с использованием праймеров SEQ ID NO:3 (GAGGGCGTGA), указанное растение получено из семян, задепонированных в Международном Депозитарии под номером FERM BP-10353 (IPOD) (Япония) или получено путем повторных скрещиваний или селекции растения, полученного из семян, задепонированных в Международном депозитарии под номером FERM BP-10353 (IPOD) (Япония).
2. Способ по п.1, в котором указанное растение принадлежит к виду Stevia Rebaudiana Bertoni.
3. Способ по п.1, в котором указанный подсластитель далее перекристаллизуют и представляет собой, по меньшей мере, 92% Ребаудиозида А.
4. Способ по п.1, в котором указанный подсластитель далее перекристаллизуют и представляет собой, по меньшей мере, 97% Ребаудиозида А.
5. Способ по п.1, в котором указанный подсластитель представляет собой, по меньшей мере, 92% Ребаудиозида А.
6. Способ по п.1, в котором указанный подсластитель представляет собой, по меньшей мере, 97% Ребаудиозида А.
7. Способ производства Ребаудиозида А, согласно которому проводят экстракцию из растения Stevia rebaudiana или его сушеных листьев растворителем Ребаудиозида А, удаляют указанный растворитель Ребаудиозида А и отделяют Ребаудиозид А, при этом указанное растение получено из семян, задепонированных в Международном Депозитарии под номером FERM BP-10353 (IPOD) (Япония).
8. Способ по п.7, в котором указанный Ребаудиозид А далее перекристаллизуют и имеет чистоту, по меньшей мере, 92%.
9. Способ по п.7, в котором указанный Ребаудиозид А далее перекристаллизуют и имеет чистоту, по меньшей мере, 97%.
10. Способ по п.7, далее содержащий перекристаллизацию Ребаудиозида А из 95% метанола для получения, по меньшей мере, 40 частей Ребаудиозида А к одной части Стевиозида, и указанный Ребаудиозид А имеет чистоту, по меньшей мере, 92,1%.
11. Способ по п.7, далее содержащий перекристаллизацию Ребаудиозида А из 75% метанола для получения, по меньшей мере, 972 частей Ребаудиозида А к одной части Стевиозида, и указанный Ребаудиозид А имеет чистоту, по меньшей мере, 97,2%.
RU2010140045/10A 2003-03-04 2010-09-30 Способ производства подсластителя с высоким содержанием ребаудиозида-a RU2463780C2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005-060930 2005-03-04
JP2005060930 2005-03-04

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2007131961/10A Division RU2409937C2 (ru) 2005-03-04 2006-03-02 Растение с высоким содержанием ребаудиозида а

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2010140045A RU2010140045A (ru) 2012-04-10
RU2463780C2 true RU2463780C2 (ru) 2012-10-20

Family

ID=36941258

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2007131961/10A RU2409937C2 (ru) 2005-03-04 2006-03-02 Растение с высоким содержанием ребаудиозида а
RU2010140045/10A RU2463780C2 (ru) 2003-03-04 2010-09-30 Способ производства подсластителя с высоким содержанием ребаудиозида-a

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2007131961/10A RU2409937C2 (ru) 2005-03-04 2006-03-02 Растение с высоким содержанием ребаудиозида а

Country Status (11)

Country Link
US (1) US7884265B2 (ru)
EP (1) EP1856967A4 (ru)
JP (2) JPWO2006093229A1 (ru)
KR (1) KR20070120943A (ru)
CN (1) CN101146440B (ru)
AU (1) AU2006219311B2 (ru)
BR (1) BRPI0608458A2 (ru)
CA (1) CA2598109C (ru)
MX (1) MX2007010819A (ru)
RU (2) RU2409937C2 (ru)
WO (1) WO2006093229A1 (ru)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9101160B2 (en) 2005-11-23 2015-08-11 The Coca-Cola Company Condiments with high-potency sweetener
US8017168B2 (en) 2006-11-02 2011-09-13 The Coca-Cola Company High-potency sweetener composition with rubisco protein, rubiscolin, rubiscolin derivatives, ace inhibitory peptides, and combinations thereof, and compositions sweetened therewith
KR20100106509A (ko) * 2008-01-22 2010-10-01 모리타 가가쿠 고교 가부시키가이샤 신규 스테비아종 및 감미료의 제조 방법
EP3101023B1 (en) * 2008-10-03 2023-08-30 Morita Kagaku Kogyo Co., Ltd. New steviol glycosides
EP2482676B1 (en) 2009-06-16 2014-10-22 EPC (Beijing) Natural Products Co., Ltd. Reducing or eliminating aftertaste in a sweetener using rebaudioside d
US9578895B2 (en) 2010-08-23 2017-02-28 Epc (Beijing) Natural Products Co., Ltd. Rebaudioside A and stevioside compositions
US20160338396A1 (en) * 2010-12-31 2016-11-24 Glg Life Tech Corporation High Rebaudioside-A Plant and Methods of Producing the Same and Uses Thereof
WO2012088612A1 (en) * 2010-12-31 2012-07-05 Glg Life Tech Corporation High rebaudioside-a plant and methods of producing the same and uses thereof
US8962698B2 (en) 2011-01-28 2015-02-24 Tate & Lyle Ingredients Americas Llc Rebaudioside-mogroside V blends
AR083480A1 (es) 2011-01-28 2013-02-27 Tate & Lyle Ingredients Mezclas de stevia que contienen rebaudiosida b
US9795156B2 (en) 2011-03-17 2017-10-24 E.P.C (Beijing) Plant Pharmaceutical Technology Co., Ltd Rebaudioside B and derivatives
FR2984743B1 (fr) 2011-12-23 2014-08-22 Oreal Utilisation cosmetique du steviol, d'un derive glycoside du steviol, ou un de leurs isomeres pour stimuler, restaurer ou reguler le metabolisme des cellules de la peau et des semi-muqueuses.
FR2984742A1 (fr) 2011-12-23 2013-06-28 Oreal Utilisation de steviol, d'un derive glycoside du steviol, ou d'un de leurs isomeres, pour prevenir, reduire et/ou traiter une alteration du teint de la peau.
GB201217700D0 (en) 2012-08-01 2012-11-14 Tate & Lyle Ingredients Sweetener compositions containing rebaudioside B
KR101404728B1 (ko) * 2013-02-28 2014-06-09 씨제이제일제당 (주) 스테비오사이드로부터 리바우디오사이드 a를 제조하는 방법
US10264811B2 (en) 2014-05-19 2019-04-23 Epc Natural Products Co., Ltd. Stevia sweetener with improved solubility
GB2526383B (en) 2014-05-20 2018-01-31 Tate & Lyle Ingredients Americas Llc Improved sweetener
US10357052B2 (en) 2014-06-16 2019-07-23 Sweet Green Fields USA LLC Rebaudioside A and stevioside with improved solubilities
US10485256B2 (en) 2014-06-20 2019-11-26 Sweet Green Fields International Co., Limited Stevia sweetener with improved solubility with a cyclodextrin
NZ730943A (en) 2014-09-30 2017-12-22 Suntory Beverage & Food Ltd Carbonated beverage, syrup used for preparing carbonated beverage, method for manufacturing carbonated beverage, and method for suppressing foaming in carbonated beverage
USPP27937P3 (en) 2014-11-30 2017-04-25 S&W Seed Company Stevia plant named ‘SW 107’
USPP27815P3 (en) 2014-12-08 2017-03-28 S&W Seed Company Stevia plant named ‘SW 201’
JP6858116B2 (ja) 2015-03-11 2021-04-14 守田化学工業株式会社 甘味料組成物、およびそれを含む食品
USPP28373P3 (en) 2015-11-17 2017-09-12 S&W Seed Company Stevia plant named ‘SW 129’
JP6109353B1 (ja) 2016-01-05 2017-04-05 サントリー食品インターナショナル株式会社 飲料、飲料の製造方法、及び飲料の泡立ちを抑制する方法
USPP28977P3 (en) 2016-03-31 2018-02-20 S&W Seed Company Stevia plant named ‘SW 227’
WO2017172401A1 (en) * 2016-03-31 2017-10-05 S&W Seed Company Stevia plant named 'sw 227'
PE20212081A1 (es) * 2019-04-11 2021-10-28 Suntory Holdings Ltd Planta de stevia con baja formacion de polen
KR102546737B1 (ko) 2020-11-25 2023-06-22 씨제이제일제당 주식회사 포도당 전이 스테비아를 포함하는 감미질이 개선된 조성물

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2111969C1 (ru) * 1995-11-08 1998-05-27 Республиканская научно-исследовательская лаборатория по биологически активным веществам Способ получения стевиозида
US5972120A (en) * 1997-07-19 1999-10-26 National Research Council Of Canada Extraction of sweet compounds from Stevia rebaudiana Bertoni
JP2003009878A (ja) * 2001-07-02 2003-01-14 Morita Kagaku Kogyo Kk ステビア品種のｄｎａ鑑定による識別

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5945848A (ja) 1982-09-09 1984-03-14 Morita Kagaku Kogyo Kk 新天然甘味料の製造方法
JP3102865B2 (ja) * 1983-12-29 2000-10-23 中里 隆憲 ステビア新品種に属する植物
JPS61202667A (ja) 1985-03-04 1986-09-08 Morita Kagaku Kogyo Kk 新天然甘味料
JPS6296025A (ja) * 1985-10-14 1987-05-02 中里　隆憲 乾燥葉
USPP10564P (en) * 1996-05-29 1998-08-18 Royal-Sweet International Technologies Ltd. Stevia plant named `RSIT 94-751`
US5962678A (en) 1996-09-13 1999-10-05 Alberta Research Council Method of extracting selected sweet glycosides from the Stevia rebaudiana plant
JP2002262822A (ja) * 1997-01-30 2002-09-17 Morita Kagaku Kogyo Kk 種子栽培可能なステビア品種の植物体から得られる甘味料
JPH10271928A (ja) 1997-01-30 1998-10-13 Morita Kagaku Kogyo Kk ステビア・レバウディアナ・ベルトニーに属する新植物
CN1212827A (zh) 1997-09-29 1999-04-07 胡广志 高瑞保替甙含量的甜菊杂交制种方法
US6255557B1 (en) * 1998-03-31 2001-07-03 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Ministerof Agriculture And Agri-Food Canada Stevia rebaudiana with altered steviol glycoside composition
JP2000032859A (ja) 1998-07-22 2000-02-02 Morita Kagaku Kogyo Kk ステビア植物の新品種
CN1102141C (zh) * 2000-05-18 2003-02-26 泰兴市化工七厂 3.5－二甲基苯甲酸提纯方法
CN1129354C (zh) 2001-07-11 2003-12-03 青岛创升生物科技有限公司 甜叶菊杂交种子的培育方法
CN1547893A (zh) 2003-05-18 2004-11-24 杨有钊 一种甜叶菊单株育成新品种改良工艺
CN101213935A (zh) 2008-01-08 2008-07-09 江苏省中国科学院植物研究所 双无性系优良f1代甜菊制种方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2111969C1 (ru) * 1995-11-08 1998-05-27 Республиканская научно-исследовательская лаборатория по биологически активным веществам Способ получения стевиозида
US5972120A (en) * 1997-07-19 1999-10-26 National Research Council Of Canada Extraction of sweet compounds from Stevia rebaudiana Bertoni
JP2003009878A (ja) * 2001-07-02 2003-01-14 Morita Kagaku Kogyo Kk ステビア品種のｄｎａ鑑定による識別

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRANDLE J.E. et al., "Stevia rebaudiana: Its agricultural, biological, and chemical properties" Can. J. Plant Sci. (1998), 78: 527-536. *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2006093229A1 (ja) 2006-09-08
RU2007131961A (ru) 2009-04-10
CA2598109A1 (en) 2006-09-08
AU2006219311B2 (en) 2012-02-02
EP1856967A4 (en) 2008-12-10
CN101146440A (zh) 2008-03-19
CN101146440B (zh) 2012-01-11
RU2409937C2 (ru) 2011-01-27
KR20070120943A (ko) 2007-12-26
JP2012090629A (ja) 2012-05-17
EP1856967A1 (en) 2007-11-21
CA2598109C (en) 2014-03-25
MX2007010819A (es) 2008-01-14
RU2010140045A (ru) 2012-04-10
AU2006219311A1 (en) 2006-09-08
US7884265B2 (en) 2011-02-08
BRPI0608458A2 (pt) 2010-01-05
JPWO2006093229A1 (ja) 2008-08-07
JP5140755B2 (ja) 2013-02-13
US20090214753A1 (en) 2009-08-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2463780C2 (ru) Способ производства подсластителя с высоким содержанием ребаудиозида-a
JP7091021B2 (ja) 増大したレバウジオシドｄ含量を有するステビア属植物
US20130347140A1 (en) High Rebaudioside-A Plant and Methods of Producing the Same and Uses Thereof
US20170290285A1 (en) High rebaudioside-c plant varietal and compositions extracted therefrom with high rebaudioside-c and total steviol glycoside content
US20110023192A1 (en) Novel stevia variety and method of producing sweetener
KR20200041360A (ko) Cgmmv 저항성 시트룰루스 식물
AU2020320849A1 (en) Novel steviol glycoside, method for producing same, and sweetener composition containing same
US20180042280A1 (en) High rebaudioside-a plant varietal, methods of extraction and purification therefrom, of compositions with enhanced rebaudioside-a content and uses of said composition
JP4776107B2 (ja) ステビア品種のｄｎａ鑑定による識別
Ahmad Sarhadi et al. Characterization of aroma and agronomic traits in Afghan native rice cultivars
JP2002034502A (ja) 新規ステビア作出方法及び新規ステビア甘味料
Puthiyaparambil et al. Rapid papaya crop improvement through accelerated in vitro breeding and molecular diagnostics
KR102618294B1 (ko) 환경 스트레스에 대한 저항성 및 항산화 물질 함량이 증가된 자포니카 벼 신품종 '세복' 및 이의 육종 방법
Verma et al. Grape improvement
KR101887123B1 (ko) 신품종 딸기 핑크향 및 이의 육종 방법
CA2551921A1 (en) Melon plants producing fruits with high acid and sugar content
Kurganskaya et al. Future directions in tomato breeding
Zone HUR 917 (Malviya Sugandh Dhan 917: IET 21838): A New Aromatic 2 Short Grain High Yielding Rice Variety Released For Cultivation of 3 Indo-Gangetic Plain Zone of Uttar Pradesh 4

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20170303