JP2003009878A - ステビア品種のｄｎａ鑑定による識別 - Google Patents
ステビア品種のｄｎａ鑑定による識別Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＲＡＰＤ法によるステビオサイドに対してレ
バウディオサイドＡの比率の高いステビア・レバウディ
アナ・ベルトニーの品種の識別方法、識別された植物体
またはその乾燥葉、その抽出物を含む甘味料およびその
製造方法を提供する。 【解決手段】 ステビオサイド１重量部に対してレバウ
デイオサイドＡ３重量部以上を含むステビア・レバウデ
ィアナ・ベルトニー品種の識別方法であって、配列番号
１および２に示される塩基配列を有するプライマーミッ
クスを用いるＲＡＰＤ法によって、ＤＮＡ鑑定により識
別を行うことを特徴とする方法、識別された植物体また
はその乾燥葉を抽出して得られる甘味料およびその製造
方法。
バウディオサイドＡの比率の高いステビア・レバウディ
アナ・ベルトニーの品種の識別方法、識別された植物体
またはその乾燥葉、その抽出物を含む甘味料およびその
製造方法を提供する。 【解決手段】 ステビオサイド１重量部に対してレバウ
デイオサイドＡ３重量部以上を含むステビア・レバウデ
ィアナ・ベルトニー品種の識別方法であって、配列番号
１および２に示される塩基配列を有するプライマーミッ
クスを用いるＲＡＰＤ法によって、ＤＮＡ鑑定により識
別を行うことを特徴とする方法、識別された植物体また
はその乾燥葉を抽出して得られる甘味料およびその製造
方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】ＲＡＰＤ法(Random Amplifie
d Polymorphic DNA method)によるステビオサイドに対
してレバウディオサイドＡの比率の高いステビア・レバ
ウディアナ・ベルトニーの品種の識別方法、識別された
植物体またはその乾燥葉、その抽出物を含む甘味料およ
びその製造方法に関する。
d Polymorphic DNA method)によるステビオサイドに対
してレバウディオサイドＡの比率の高いステビア・レバ
ウディアナ・ベルトニーの品種の識別方法、識別された
植物体またはその乾燥葉、その抽出物を含む甘味料およ
びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ステ
ビアは南米パラグアイを原産地とする菊科多年生植物
で、学名をステビア・レバウディアナ・ベルトニー(Ｓt
evia Ｒebaudiana Ｂertoni)という。ステビアは砂糖
の３００倍以上の甘味を持つ甘味成分を含むので、この
甘味成分を抽出して天然甘味料として用いる為に栽培さ
れている。
ビアは南米パラグアイを原産地とする菊科多年生植物
で、学名をステビア・レバウディアナ・ベルトニー(Ｓt
evia Ｒebaudiana Ｂertoni)という。ステビアは砂糖
の３００倍以上の甘味を持つ甘味成分を含むので、この
甘味成分を抽出して天然甘味料として用いる為に栽培さ
れている。
【０００３】ステビアの甘味成分としては、ステビオサ
イド(Ｃ３８Ｈ６０Ｏ１８、分子量８０４)、レバウディ
オサイドＡ(Ｃ４４Ｈ７０Ｏ２３、分子量９６６)、レバ
ウディオサイドＣ、Ｄ、Ｅ、ズルコサイドＡ等が知られ
ている。一般に栽培されているステビア品種では上記甘
味成分の内ステビオサイド(ＳＴ)が主成分でレバウディ
オサイドＡ(ＲＡ)の含有量はステビオサイドの１０分の
３〜４程度、レバウディオサイドＣの含量はそれよりや
や少ないが、品種によってはレバウディオサイドＡ、及
びＣを含まないもの、更にレバウディオサイドＣを主成
分とするものなど種々である。
イド(Ｃ３８Ｈ６０Ｏ１８、分子量８０４)、レバウディ
オサイドＡ(Ｃ４４Ｈ７０Ｏ２３、分子量９６６)、レバ
ウディオサイドＣ、Ｄ、Ｅ、ズルコサイドＡ等が知られ
ている。一般に栽培されているステビア品種では上記甘
味成分の内ステビオサイド(ＳＴ)が主成分でレバウディ
オサイドＡ(ＲＡ)の含有量はステビオサイドの１０分の
３〜４程度、レバウディオサイドＣの含量はそれよりや
や少ないが、品種によってはレバウディオサイドＡ、及
びＣを含まないもの、更にレバウディオサイドＣを主成
分とするものなど種々である。
【０００４】渋み、辛み等の舌で知覚される味の中でも
甘みの質は非常に微妙である。ステビオサイドは砂糖の
３００倍の甘味度を有するので天然甘味料として食品工
業界で用いられている。その甘味は比較的砂糖に似てい
るが、苦み等の不快味が後味に残るという欠点がある。
それゆえステビオサイドを多量に含むことは甘味料とし
て好ましいことではない。これに対して、レバウディオ
サイドＡは良質の甘味質とステビオサイドの１.３倍〜
１.５倍の甘味度を有する。
甘みの質は非常に微妙である。ステビオサイドは砂糖の
３００倍の甘味度を有するので天然甘味料として食品工
業界で用いられている。その甘味は比較的砂糖に似てい
るが、苦み等の不快味が後味に残るという欠点がある。
それゆえステビオサイドを多量に含むことは甘味料とし
て好ましいことではない。これに対して、レバウディオ
サイドＡは良質の甘味質とステビオサイドの１.３倍〜
１.５倍の甘味度を有する。
【０００５】生産コストの削減と安定した収穫量を保
ち、甘味料原料として甘味質の優れたレバウディオサイ
ドＡを高含有したステビア品種を開発し、同時に、それ
らを継続維持し、それらを基に優れた甘味料を製造する
必要がある。
ち、甘味料原料として甘味質の優れたレバウディオサイ
ドＡを高含有したステビア品種を開発し、同時に、それ
らを継続維持し、それらを基に優れた甘味料を製造する
必要がある。
【０００６】本発明者らは従来品種から交配選抜を繰り
返し品種改良を行い、ステビオサイド(ＳＴ)に対してレ
バウディオサイドＡ(ＲＡ)が高い含有比率を示すステビ
ア品種を得、これらの植物から甘味成分を抽出しステビ
オサイドに対してレバウディオサイドＡの含有比の高い
優れた甘味料を製造してきた(特開昭５９−０４５８４
８号、特開昭６０−１６０８２３号、特開昭６１−２０
２６６７号など)。
返し品種改良を行い、ステビオサイド(ＳＴ)に対してレ
バウディオサイドＡ(ＲＡ)が高い含有比率を示すステビ
ア品種を得、これらの植物から甘味成分を抽出しステビ
オサイドに対してレバウディオサイドＡの含有比の高い
優れた甘味料を製造してきた(特開昭５９−０４５８４
８号、特開昭６０−１６０８２３号、特開昭６１−２０
２６６７号など)。
【０００７】一方、ステビア植物を特定する問題点であ
る改良品種の識別方法として、草丈、葉形等による識別
が考えられるが、ステビアは自家不和合性であり雑種に
なりやすい。
る改良品種の識別方法として、草丈、葉形等による識別
が考えられるが、ステビアは自家不和合性であり雑種に
なりやすい。
【０００８】また、ステビア特有の病原菌による耐病性
による比較特定もあるが、ステビア特有に発現する枯
葉、黒斑点病はセプトリア菌、アルタナリア菌に起因し
て発生するが、それらの菌は土壌に生息する菌であり、
これらの症状のみによる品種の特定は日本のみならず世
界的に発生することからこれら特性のみで品種を特定す
るには不十分である。
による比較特定もあるが、ステビア特有に発現する枯
葉、黒斑点病はセプトリア菌、アルタナリア菌に起因し
て発生するが、それらの菌は土壌に生息する菌であり、
これらの症状のみによる品種の特定は日本のみならず世
界的に発生することからこれら特性のみで品種を特定す
るには不十分である。
【０００９】甘味成分の含有量が高くステビオサイドに
対してレバウディオサイドＡの含有比率の高い改良品種
にいたっては、生育期間の気象条件、収穫時期等により
甘味成分比率が変動するのは避けられないから、常に同
じというわけにはいかない。従って、甘味成分の含有量
および比率を測定する方法しかないが、識別の対象とな
る甘味成分は化学構造式が類似しているため不十分であ
った。
対してレバウディオサイドＡの含有比率の高い改良品種
にいたっては、生育期間の気象条件、収穫時期等により
甘味成分比率が変動するのは避けられないから、常に同
じというわけにはいかない。従って、甘味成分の含有量
および比率を測定する方法しかないが、識別の対象とな
る甘味成分は化学構造式が類似しているため不十分であ
った。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明の第１は、ステビ
オサイド１重量部に対してレバウデイオサイドＡ３重量
部以上を含むステビア・レバウディアナ・ベルトニー品
種の識別方法であって、配列番号１および２に示される
塩基配列を有するプライマーミックスを用いるＲＡＰＤ
法によって、ＤＮＡ鑑定により識別を行うことを特徴と
する方法である。
オサイド１重量部に対してレバウデイオサイドＡ３重量
部以上を含むステビア・レバウディアナ・ベルトニー品
種の識別方法であって、配列番号１および２に示される
塩基配列を有するプライマーミックスを用いるＲＡＰＤ
法によって、ＤＮＡ鑑定により識別を行うことを特徴と
する方法である。
【００１１】上記の方法によって、ステビオサイド１重
量部に対してレバウデイオサイドＡ３重量部以上を含む
ステビア・レバウディアナ・ベルトニー品種に属する植
物体またはその乾燥葉を識別することができる。
量部に対してレバウデイオサイドＡ３重量部以上を含む
ステビア・レバウディアナ・ベルトニー品種に属する植
物体またはその乾燥葉を識別することができる。
【００１２】本発明の第２は、本発明の方法によって識
別された植物体またはその乾燥葉を水、または含水溶媒
で抽出して得られるステビオサイド１重量部に対してレ
バウデイオサイドＡ３重量部以上を含む甘味料である。
別された植物体またはその乾燥葉を水、または含水溶媒
で抽出して得られるステビオサイド１重量部に対してレ
バウデイオサイドＡ３重量部以上を含む甘味料である。
【００１３】本発明の第３は、ステビオサイド１重量部
に対してレバウデイオサイドＡ３重量部以上を含む甘味
料の製造方法であって、本発明の植物体またはその乾燥
葉を水、または含水溶媒で抽出することを特徴とする方
法である。
に対してレバウデイオサイドＡ３重量部以上を含む甘味
料の製造方法であって、本発明の植物体またはその乾燥
葉を水、または含水溶媒で抽出することを特徴とする方
法である。
【００１４】本発明の識別に用いられるＲＡＰＤ法(Ran
dom Amplified Polymorphic DNA method)はＤＮＡの解
析手法の１つであり、複数のプライマーを用いてPCR(ポ
リメラーゼ連鎖反応)を行うと、用いたプライマーと同
一または類似の配列に挟まれたＤＮＡの領域が増幅さ
れ、その増幅されたＤＮＡのパターンを電気泳動で解析
する方法である。また、セチルトリメチルアンモニウム
ブロミド(ＣＴＡＢ：Cetyl Trimethyl Ammonium Bromid
e)は長鎖アルキル基をもつ第４級アンモニウム塩基であ
り、核酸のようなポリアニオンと不溶性の複合体を形成
するために核酸の単離に利用することができる。
dom Amplified Polymorphic DNA method)はＤＮＡの解
析手法の１つであり、複数のプライマーを用いてPCR(ポ
リメラーゼ連鎖反応)を行うと、用いたプライマーと同
一または類似の配列に挟まれたＤＮＡの領域が増幅さ
れ、その増幅されたＤＮＡのパターンを電気泳動で解析
する方法である。また、セチルトリメチルアンモニウム
ブロミド(ＣＴＡＢ：Cetyl Trimethyl Ammonium Bromid
e)は長鎖アルキル基をもつ第４級アンモニウム塩基であ
り、核酸のようなポリアニオンと不溶性の複合体を形成
するために核酸の単離に利用することができる。
【００１５】
【発明の実施の態様】本発明は甘味成分含量、甘味成分
含有比の優れた品種を創造し、その特徴を維持するため
にＲＡＰＤ法で遺伝子を識別することにより他系統、他
品種のステビア植物と区別し、それらより甘味質の優れ
た甘味料を得ることである。
含有比の優れた品種を創造し、その特徴を維持するため
にＲＡＰＤ法で遺伝子を識別することにより他系統、他
品種のステビア植物と区別し、それらより甘味質の優れ
た甘味料を得ることである。
【００１６】ＤＮＡ塩基配列を特定する手段はＣＴＡＢ
により植物体からゲノムＤＮＡを単離し、リボ核酸(Ｒ
ＮＡ)を除去し、プライマーミックスを用いてＰＣＲ法
により得られたＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳
動法によって得られるＤＮＡフィンガープリントの違い
により区別する。
により植物体からゲノムＤＮＡを単離し、リボ核酸(Ｒ
ＮＡ)を除去し、プライマーミックスを用いてＰＣＲ法
により得られたＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳
動法によって得られるＤＮＡフィンガープリントの違い
により区別する。
【００１７】選択的に沈殿させたゲノムＤＮＡを雛型と
し、プライマーとしてＡ０６(塩基配列；ＡＣＴＧＧＣ
ＣＧＡＧＧＧ) とＡ４８(塩基配列；ＣＣＧＣＡＧＧＧ
ＡＣＣＡ)のセットおよび rＴａｑ(ＴＡＫＡＲＡ)を用
いて９４度(３０秒)、５５度(３０秒)、７２度(６０秒)
で３５サイクル反応を行った後、７２度で１０分間反応
させる。その後、ＰＣＲ増幅産物をアガロース電気泳動
法によって確認し、特定のＤＮＡバンドを確認した植物
体、またはその乾燥葉から水、または含水有機溶媒にて
抽出し、次いで抽出液をそのまま濃縮するか、または必
要に応じて陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂でイオ
ン性不純物を除去し、吸着樹脂に甘味成分を吸着させ親
水性溶媒でして溶離液を濃縮、乾燥して甘味料が得られ
る。甘味料の製造方法はその他脱色等の慣用精製手段を
適宣施すことが出来る。得られた甘味料は他の甘味料、
希釈剤等を加える事が出来、さらに再結晶により高純度
レバウデイオサイドＡおよび酵素処理ステビア甘味料の
原料とすることも出来る。
し、プライマーとしてＡ０６(塩基配列；ＡＣＴＧＧＣ
ＣＧＡＧＧＧ) とＡ４８(塩基配列；ＣＣＧＣＡＧＧＧ
ＡＣＣＡ)のセットおよび rＴａｑ(ＴＡＫＡＲＡ)を用
いて９４度(３０秒)、５５度(３０秒)、７２度(６０秒)
で３５サイクル反応を行った後、７２度で１０分間反応
させる。その後、ＰＣＲ増幅産物をアガロース電気泳動
法によって確認し、特定のＤＮＡバンドを確認した植物
体、またはその乾燥葉から水、または含水有機溶媒にて
抽出し、次いで抽出液をそのまま濃縮するか、または必
要に応じて陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂でイオ
ン性不純物を除去し、吸着樹脂に甘味成分を吸着させ親
水性溶媒でして溶離液を濃縮、乾燥して甘味料が得られ
る。甘味料の製造方法はその他脱色等の慣用精製手段を
適宣施すことが出来る。得られた甘味料は他の甘味料、
希釈剤等を加える事が出来、さらに再結晶により高純度
レバウデイオサイドＡおよび酵素処理ステビア甘味料の
原料とすることも出来る。
【００１８】レバウディオサイドＡを比較的高含有する
品種の育種過程 育種はレバウディオサイドＡを比較的高含有する品種の
かけ合わせ選抜にて行い、まず、レバウディオサイドＡ
を高含有するＳＦ５−１、ＳＦ５−２(特願平９−１６
５３１号記載)を人工的に交配し、得られた種子の苗を
耐病性をも調査すべくセプトリア菌、アルタナリア菌の
発生が顕著な圃場に移植する。セプトリア菌、アルタナ
リア菌に抵抗性を有する品種を選抜し、その甘味成分を
分析し、ステビオサイドに対してレバウディオサイドＡ
を３倍以上含み、甘味含有量が高く、比較的耐病性に優
れた品種ＴＤ−１を選抜した。さらに、甘味成分含量、
甘味成分比率、生育状況を再度確認し、ＴＤ−１の遺伝
子を検索した。
品種の育種過程 育種はレバウディオサイドＡを比較的高含有する品種の
かけ合わせ選抜にて行い、まず、レバウディオサイドＡ
を高含有するＳＦ５−１、ＳＦ５−２(特願平９−１６
５３１号記載)を人工的に交配し、得られた種子の苗を
耐病性をも調査すべくセプトリア菌、アルタナリア菌の
発生が顕著な圃場に移植する。セプトリア菌、アルタナ
リア菌に抵抗性を有する品種を選抜し、その甘味成分を
分析し、ステビオサイドに対してレバウディオサイドＡ
を３倍以上含み、甘味含有量が高く、比較的耐病性に優
れた品種ＴＤ−１を選抜した。さらに、甘味成分含量、
甘味成分比率、生育状況を再度確認し、ＴＤ−１の遺伝
子を検索した。
【００１９】
【実施例】以下に、育種過程およびその特性等を具体的
に記載する。本発明は本育種過程、栽培方法に限定され
るものでない。 実施例１ レバウディオサイドＡを比較的高含有する品種のかけ合
わせで得られた種子より、１９９５年にレバウディオサ
イドＡを含有するＳＦ−１、ＳＦ５−２品種(特願平９
−１６５３１号記載)を新見工場内ビニールハウス内で
人工的にかけ合わせ、得られた種子を９６年３月に新見
工場内のビニールハウスに播種、発芽した苗を育苗ポッ
トに移植し、５月上旬に苗丈８cm程度以上の苗６００本
を長年ステビア栽培を行いセプトリア菌、アルタナリア
菌の発生が顕著な工場内圃場に１０アール当たり窒素、
燐、カリの肥料成分各２０kgを施肥し２週間に移植し
た。７月上旬に追肥として１０アール当たり窒素、燐、
カリの肥料成分各１０kgを追肥した。
に記載する。本発明は本育種過程、栽培方法に限定され
るものでない。 実施例１ レバウディオサイドＡを比較的高含有する品種のかけ合
わせで得られた種子より、１９９５年にレバウディオサ
イドＡを含有するＳＦ−１、ＳＦ５−２品種(特願平９
−１６５３１号記載)を新見工場内ビニールハウス内で
人工的にかけ合わせ、得られた種子を９６年３月に新見
工場内のビニールハウスに播種、発芽した苗を育苗ポッ
トに移植し、５月上旬に苗丈８cm程度以上の苗６００本
を長年ステビア栽培を行いセプトリア菌、アルタナリア
菌の発生が顕著な工場内圃場に１０アール当たり窒素、
燐、カリの肥料成分各２０kgを施肥し２週間に移植し
た。７月上旬に追肥として１０アール当たり窒素、燐、
カリの肥料成分各１０kgを追肥した。
【００２０】上記の病原菌に対する抵抗性を目視により
９月上旬に調査し、生育が良く耐病性を有する株を選抜
し、その甘味成分を分析し、ステビオサイドに対してレ
バウディオサイドＡを３倍以上含み、その含有量が多い
株を選抜し、電照下で各５０本挿し木した。９７年４月
中旬にそれらより萌芽した芽を２００本挿し木した。５
月上旬に同様に工場内圃場に植え付け７月末に耐病性、
生育を再度調査し、甘味成分比、含量が優れている事を
確認しＴＤ−１品種とした。
９月上旬に調査し、生育が良く耐病性を有する株を選抜
し、その甘味成分を分析し、ステビオサイドに対してレ
バウディオサイドＡを３倍以上含み、その含有量が多い
株を選抜し、電照下で各５０本挿し木した。９７年４月
中旬にそれらより萌芽した芽を２００本挿し木した。５
月上旬に同様に工場内圃場に植え付け７月末に耐病性、
生育を再度調査し、甘味成分比、含量が優れている事を
確認しＴＤ−１品種とした。
【００２１】ＴＤ−１、ＳＴおよびＳＮの比較試験１
比較のために、９７年４月中旬にステビオサイドを主甘
味成分とするステビア品種(ＳＴ)、ステビオサイドを主
甘味成分とし、レバウデイオサイドＡを副甘味成分とす
るステビア品種(ＳＮ)各４０本も同様に挿し木し、同様
に工場内圃場に植え付けた。
味成分とするステビア品種(ＳＴ)、ステビオサイドを主
甘味成分とし、レバウデイオサイドＡを副甘味成分とす
るステビア品種(ＳＮ)各４０本も同様に挿し木し、同様
に工場内圃場に植え付けた。
【００２２】上記の５月上旬に圃場に移植した挿し木に
より増殖させた品種ＴＤ―１の苗２００本と、品種Ｓ
Ｔ、ＳＮ苗各４０本のうち、６月下旬に任意に選んだ各
品種１０本中での発病の有無を調査した後、ＴＤ−１を
地上から１５ｃｍで刈り取り、ＳＴ、ＳＮの各品種は２
０本を地上部から刈り取り後、葉部を分離し、乾燥後分
析試料とした。
より増殖させた品種ＴＤ―１の苗２００本と、品種Ｓ
Ｔ、ＳＮ苗各４０本のうち、６月下旬に任意に選んだ各
品種１０本中での発病の有無を調査した後、ＴＤ−１を
地上から１５ｃｍで刈り取り、ＳＴ、ＳＮの各品種は２
０本を地上部から刈り取り後、葉部を分離し、乾燥後分
析試料とした。
【００２３】分析結果は次のとおりであった。
【表１】
品種名 黄色、黒変葉の発現 ＳＴ(％) ＲＡ(％) ＲＡ／ＳＴ
ＴＤ−１ １株に黒斑点 ２.５ ９.５ ３.８
ＳＴ ３株に発生 ８.９ ０.８ ０.０１
ＳＮ ５株に発生 ７.５ ３.２ ０.４３
【００２４】ＴＤ−１、ＳＴおよびＳＮの比較試験２
７月上旬に追肥を行い、９月上旬に各品種１区画２０株
を選択しセプトリア菌、アルタナリア菌の発病状況を調
査した後、各品種を地上部から刈り取った後、葉部を分
離し、乾燥後分析試料とした。
を選択しセプトリア菌、アルタナリア菌の発病状況を調
査した後、各品種を地上部から刈り取った後、葉部を分
離し、乾燥後分析試料とした。
【００２５】分析結果次のとおりであった。
【表２】
品種名 病原の発現 ＳＴ(％) ＲＡ(％) 収量(平均) ＲＡ／ＳＴ
ＴＤ−１ ３株に下葉黒斑点 １.０ １１.９ １２.５ｇ／本 １１.９
ＳＴ １４株に下葉枯れ ９.１ ０.４ ７.８ｇ／本 ０.０４
ＳＮ ２０株に下葉枯れ ７.２ ３.４ ７.３ｇ／本 ０.４７
【００２６】品種ＴＤ−１は枯れ葉の発病割合は比較的
低く、甘味成分含量、乾燥葉収量も他品種より優れてい
た。品種ＳＴはセプトリア菌により下葉の４節までの部
分で既に葉の１／２程度がセプトリア菌により発病した
葉が多数あり黄色く変色しており、最下部の葉は枯葉に
なっていた。品種ＳＮはセプトリア菌により下葉の３節
までの部分で既に葉の１／２程度がセプトリア菌による
黄変が見られ、地上より１節の葉は枯れ葉となってい
た。
低く、甘味成分含量、乾燥葉収量も他品種より優れてい
た。品種ＳＴはセプトリア菌により下葉の４節までの部
分で既に葉の１／２程度がセプトリア菌により発病した
葉が多数あり黄色く変色しており、最下部の葉は枯葉に
なっていた。品種ＳＮはセプトリア菌により下葉の３節
までの部分で既に葉の１／２程度がセプトリア菌による
黄変が見られ、地上より１節の葉は枯れ葉となってい
た。
【００２７】９８年３月にＴＤ−１から萌芽した穂先を
２００本挿し木し、４月下旬に圃場に移植し、５月末、
６月末、７月末、８月末、９月末、１０月末に地上部を
刈り取り、葉のみを分離した後、乾燥し、甘味成分含量
を測定した。甘味成分の測定は高速液体クロマトグラフ
ィ−により行った。
２００本挿し木し、４月下旬に圃場に移植し、５月末、
６月末、７月末、８月末、９月末、１０月末に地上部を
刈り取り、葉のみを分離した後、乾燥し、甘味成分含量
を測定した。甘味成分の測定は高速液体クロマトグラフ
ィ−により行った。
【００２８】
【表３】
刈取り時期 ＳＴ(％) ＲＡ(％) ＲＡ／ＳＴ
５月末 ２.８ ８.４ ３.０
６月末 ２.１ ９.３ ４.４
７月末 １.９ １０.８ ５.７
８月末 １.９ １１.５ ６.０
９月末 １.０ １１.６ １１.６
１０月末 ０.９ １０.４ １１.６
【００２９】ＴＤ一１は生育期間により甘味成分含量、
甘味成分比が異なり、生育期間が長くなるにつれて甘味
成分含量が増え、一方、ステビオサイド含量が減少する
傾向が見られた。開花時期の１０月末には甘味成分含量
の減少がみられる。
甘味成分比が異なり、生育期間が長くなるにつれて甘味
成分含量が増え、一方、ステビオサイド含量が減少する
傾向が見られた。開花時期の１０月末には甘味成分含量
の減少がみられる。
【００３０】遺伝子塩基配列の特定
甘味成分含量、甘味成分比、収量からＴＤ−１が最も優
れていたことから、ＴＤ−１を識別すべくそのＤＮＡ塩
基配列を決定した。
れていたことから、ＴＤ−１を識別すべくそのＤＮＡ塩
基配列を決定した。
【００３１】乾熱滅菌した乳鉢にＴＤ−１の葉を約１グ
ラム入れ、液体窒素を加えて完全にすりつぶし、１５ｍ
ｌのチューブに粉砕した植物組織を移した。５ｍｌの２
％ＣＴＡＢ溶液(２％ＣＴＡＢ溶液(５０ｍｌ)：組成１
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ２.５ｍｌ、０.５Ｍ ＥＤＴＡ
１.０ｍｌ、２％ ＣＴＡＢ ０.５ｇ、４Ｍ ＮａＣ
ｌ ４.１ｇ)を加え、転倒混和した後、３０分間６５℃
でウォターバスにて加温し、５ｍｌのクロロホルム／イ
ソアミルアルコール(２４:１)を加え、５分間穏やかに
攪拌する。８０００ｒｐｍで３０分遠心した後、２層に
分かれた内容物の上層の水層を新しいチューブに移す。
ラム入れ、液体窒素を加えて完全にすりつぶし、１５ｍ
ｌのチューブに粉砕した植物組織を移した。５ｍｌの２
％ＣＴＡＢ溶液(２％ＣＴＡＢ溶液(５０ｍｌ)：組成１
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ２.５ｍｌ、０.５Ｍ ＥＤＴＡ
１.０ｍｌ、２％ ＣＴＡＢ ０.５ｇ、４Ｍ ＮａＣ
ｌ ４.１ｇ)を加え、転倒混和した後、３０分間６５℃
でウォターバスにて加温し、５ｍｌのクロロホルム／イ
ソアミルアルコール(２４:１)を加え、５分間穏やかに
攪拌する。８０００ｒｐｍで３０分遠心した後、２層に
分かれた内容物の上層の水層を新しいチューブに移す。
【００３２】加温後の上記操作をもう一度繰り返し、水
層を新しいチューブに移す。７ｍｌの１％ＣＴＡＢ溶液
(１％ＣＴＡＢ溶液(５０ｍｌ)：組成１Ｍ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ ２.５ｍｌ、０.５Ｍ ＥＤＴＡ １.０ｍｌ、
１％ ＣＴＡＢ ０.５ｇ)を加え、転倒混和後、１時間
室温で静置し、８０００ｒｐｍで１５分間遠心を行う。
層を新しいチューブに移す。７ｍｌの１％ＣＴＡＢ溶液
(１％ＣＴＡＢ溶液(５０ｍｌ)：組成１Ｍ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ ２.５ｍｌ、０.５Ｍ ＥＤＴＡ １.０ｍｌ、
１％ ＣＴＡＢ ０.５ｇ)を加え、転倒混和後、１時間
室温で静置し、８０００ｒｐｍで１５分間遠心を行う。
【００３３】上清を捨てて、１ｍｌの１ＭＣｓＣＬ(１
Ｍ ＣｓＣｌ溶液(５０ｍｌ)：組成ＣｓＣｌ ８.４ｇ)
を加え、沈殿を完全に溶かす。２.５倍量の１００％エ
タノールを加え、転倒混和後、−２０℃で２０分以上静
置し、エタノール沈殿を行う。上清を捨て、沈殿を真空
乾燥機で風乾し、１００ｍｌの超純水に溶解する。溶液
をアガロースゲル電気泳動でＤＮＡが単離されているこ
とを確認した。
Ｍ ＣｓＣｌ溶液(５０ｍｌ)：組成ＣｓＣｌ ８.４ｇ)
を加え、沈殿を完全に溶かす。２.５倍量の１００％エ
タノールを加え、転倒混和後、−２０℃で２０分以上静
置し、エタノール沈殿を行う。上清を捨て、沈殿を真空
乾燥機で風乾し、１００ｍｌの超純水に溶解する。溶液
をアガロースゲル電気泳動でＤＮＡが単離されているこ
とを確認した。
【００３４】ＲＮＡを除去する為にＲＮａｓｅ溶液５０
０μｌ(組成：上記ＤＮＡ単離溶液１００μl、ＲＮａｓ
ｅ(５ｇ／ｍｌ) ５μｌ)で３７℃にて１時間反応さ
せ、反応液にＰＣＩ溶液(組成：フェノール／クロロホ
ルム／イソアミルアルコール、２５：２４：１を穏やか
に混合した後、１５０００ｒｐｍで５分間遠心し、水層
を分離した溶液)を等量加える。蓋をして穏やかに混合
した後、１５０００ｒｐｍで５分間遠心した。
０μｌ(組成：上記ＤＮＡ単離溶液１００μl、ＲＮａｓ
ｅ(５ｇ／ｍｌ) ５μｌ)で３７℃にて１時間反応さ
せ、反応液にＰＣＩ溶液(組成：フェノール／クロロホ
ルム／イソアミルアルコール、２５：２４：１を穏やか
に混合した後、１５０００ｒｐｍで５分間遠心し、水層
を分離した溶液)を等量加える。蓋をして穏やかに混合
した後、１５０００ｒｐｍで５分間遠心した。
【００３５】水層(上層)を新しいマイクロチューブに移
し、室温で保存していたＣＩＡ溶液(組成：クロロホル
ム／イソアミルアルコール、容量比２４：１)を等量加
え、穏やかに混合した後、１５０００ｒｐｍで３分間遠
心し、水層を新しいマイクロチューブに移し、もう一度
ＣＩＡ処理を行い、得られた上清の１／１０倍量の３Ｍ
酢酸ナトリウムと２.５倍量の１００％エタノールを加
え、よく混ぜた後、−２０゜Ｃで３０分間冷却し、１５
０００ｒｐｍで２０分間遠心し、ＤＮＡをペレットに
し、上清を捨て、ペレットに冷却しておいた７０％エタ
ノールを１ｍｌを加えた後、１５０００ｒｐｍで１０分
間遠心し、上清を捨て、もう一度冷却した７０％エタノ
ールを１ｍｌ加えた後、１５０００ｒｐｍで１０分間遠
心し、上清を捨て、減圧デシケーターを用いて５分間乾
燥させた。
し、室温で保存していたＣＩＡ溶液(組成：クロロホル
ム／イソアミルアルコール、容量比２４：１)を等量加
え、穏やかに混合した後、１５０００ｒｐｍで３分間遠
心し、水層を新しいマイクロチューブに移し、もう一度
ＣＩＡ処理を行い、得られた上清の１／１０倍量の３Ｍ
酢酸ナトリウムと２.５倍量の１００％エタノールを加
え、よく混ぜた後、−２０゜Ｃで３０分間冷却し、１５
０００ｒｐｍで２０分間遠心し、ＤＮＡをペレットに
し、上清を捨て、ペレットに冷却しておいた７０％エタ
ノールを１ｍｌを加えた後、１５０００ｒｐｍで１０分
間遠心し、上清を捨て、もう一度冷却した７０％エタノ
ールを１ｍｌ加えた後、１５０００ｒｐｍで１０分間遠
心し、上清を捨て、減圧デシケーターを用いて５分間乾
燥させた。
【００３６】得られたゲノムＤＮＡをテンプレートとし
てＰＣＲ用組成物(表４)にて、９４℃３０秒、５５℃３
０秒、７２℃６０秒を３５サイクル反応を行った後、７
２℃で１０分間反応させる。反応後、４℃に保ちＰＣＲ
増幅産物を得た。ＰＣＲ増幅産物を１％アガロースゲル
電気でＤＮＡバンドを確認すると、図１のが示すよう
に、およそ２３００および９００ｂｐに特徴的なＤＮＡ
断片が確認できた。
てＰＣＲ用組成物(表４)にて、９４℃３０秒、５５℃３
０秒、７２℃６０秒を３５サイクル反応を行った後、７
２℃で１０分間反応させる。反応後、４℃に保ちＰＣＲ
増幅産物を得た。ＰＣＲ増幅産物を１％アガロースゲル
電気でＤＮＡバンドを確認すると、図１のが示すよう
に、およそ２３００および９００ｂｐに特徴的なＤＮＡ
断片が確認できた。
【００３７】
【表４】
ＰＣＲ用組成物(２０μｌ)
テンプレートＤＮＡ(１nｇ／μｌ) ５μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ ＭＩＸ(各１６ｐｍｏｌ／μｌ) １μｌ
Ａ０６*(配列番号１：ＡＣＴＧＧＣＣＧＡＧＧＧ)
Ａ４８*(配列番号２：ＣＣＧＣＡＧＧＧＡＣＣＡ)
ｄＮＴＰ(各２.５ｍＭ) １.６μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ ２μｌ
ｄＨ2Ｏ ９.９μｌ
rＴａｑ(ＴＡＫＡＲＡ) ０.５μｌ
*：A０６およびA４８プライマーはBEX社製
【００３８】比較遺伝子塩基配列の特定
同様にステビオサイドを主成分とする品種(ＳＴ)、ステ
ビオサイドを主成分としレバウディオサイドＡを副成分
とする品種(ＳＮ)を上記と同様に処理したＤＮＡバンド
を図１の、に示す。
ビオサイドを主成分としレバウディオサイドＡを副成分
とする品種(ＳＮ)を上記と同様に処理したＤＮＡバンド
を図１の、に示す。
【００３９】ＴＤ―１はおよそ２３００、および９００
ｂｐに特徴的な塩基配列を有するＤＮＡをアガロースゲ
ル電気泳動で検出することによって、他の品種と容易に
区別することが出来る。
ｂｐに特徴的な塩基配列を有するＤＮＡをアガロースゲ
ル電気泳動で検出することによって、他の品種と容易に
区別することが出来る。
【００４０】実施例２
甘味料の製造
９月末にＴＤ−１の乾燥葉２０ｇを２０倍量の水で甘味
が感じられなくなるまで数回抽出し、抽出液を陽イオン
交換樹脂(アンバーライトＩＲ−１２０Ｂ)２０mlを充填
したカラムおよび陰イオン交換樹脂(デュオライトＡ−
４)２０mlを充填したカラムに通液し、通過液を吸着樹
脂(ダイヤイオンＨＰ−２０)１００mlを充填したカラム
に通して甘味成分を吸着させ、十分水洗後メタノール３
００mlで溶離する。溶離液を減圧下に濃縮し、乾燥して
淡黄白色の粉末を得た。比較のためにＳＮからも同様の
処理をして甘味成分を得、これを分析した。
が感じられなくなるまで数回抽出し、抽出液を陽イオン
交換樹脂(アンバーライトＩＲ−１２０Ｂ)２０mlを充填
したカラムおよび陰イオン交換樹脂(デュオライトＡ−
４)２０mlを充填したカラムに通液し、通過液を吸着樹
脂(ダイヤイオンＨＰ−２０)１００mlを充填したカラム
に通して甘味成分を吸着させ、十分水洗後メタノール３
００mlで溶離する。溶離液を減圧下に濃縮し、乾燥して
淡黄白色の粉末を得た。比較のためにＳＮからも同様の
処理をして甘味成分を得、これを分析した。
【００４１】
分析方法 高速液体クロマトグラフィー法
使用カラム リクロソルブＮＨ２ ５μ ４mm(直径)×２５０mm
流速 １.５ml／分
展開溶媒 アセトニトリル：水＝８２：１８
測定波長 ２１０ｎｍ
【００４２】表５に抽出精製物の分析結果を示す。表中
のＳＴはステビオサイド、ＲＡはレバウディオサイドＡ
である。
のＳＴはステビオサイド、ＲＡはレバウディオサイドＡ
である。
【表５】
品種名 ＳＴ(％) ＲＡ(％) ＲＡ／ＳＴ 収量
ＴＤ−１ ７.１ ６９.８ ９.８ ３.２５ｇ
ＳＮ ５３.２ ２５.０ ０.４７ ２.６０ｇ
【００４３】官能試験
実施例２で得られた淡黄色の粉末の各０.１％溶液を調
製し、ステビア甘味料の味質に精通したパネラ−１０人
により苦み、渋み、甘味質を比較した。 苦み ＴＤ−１＜ＳＮ 渋み ＴＤ−１＜ＳＮ 甘味質 ＴＤ−１＞ＳＮ 各試料においてＴＤ−１は苦み、渋みが他の試料より改
善されており、甘味質において優れていた。
製し、ステビア甘味料の味質に精通したパネラ−１０人
により苦み、渋み、甘味質を比較した。 苦み ＴＤ−１＜ＳＮ 渋み ＴＤ−１＜ＳＮ 甘味質 ＴＤ−１＞ＳＮ 各試料においてＴＤ−１は苦み、渋みが他の試料より改
善されており、甘味質において優れていた。
【００４４】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> 守田化学工業株式会社(MORITA KAGAKU KOGYO KABUSHIKI KAISYA)
<120> ステビア品種のＤＮＡ鑑定による識別
<130> １７８５４２
<160> ２
<210> SEQ ID NO: 1
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A０６プライマー(BEX社製)
<400> 1
ＡＣＴＧＧＣＣＧＡＧＧＧ
<210> SEQ ID NO: 2
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A４８プライマー(BEX社製)
<400> 2
ＣＣＧＣＡＧＧＧＡＣＣＡ
【図１】 ＴＤ−１、ＳＴおよびＳＮのＤＮＡ塩基配列
の電気泳動図である。
の電気泳動図である。
【符号の説明】
・・１００bpＤＮＡLadderマーカー ・・ＳＴ品種
・・ＳＮ品種 ・・ＴＤ−１品種 ・・λ−Ｈind III digestマー
カー
・・ＳＮ品種 ・・ＴＤ−１品種 ・・λ−Ｈind III digestマー
カー
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 細野 文夫
大阪府大阪市城東区今福南１丁目２番24号
守田化学工業株式会社内
(72)発明者 駒井 功一郎
京都府京都市北区大宮薬師山東町38
(72)発明者 松田 一彦
奈良県奈良市中登美ヶ丘４−１ ローレル
スクエア登美ヶ丘５−502
Ｆターム(参考） 2B030 AD05 AD08 CA01
4B024 AA03 AA05 AA11 CA01 HA11
4B047 LB03 LB08 LG37 LP01 LP12
4B063 QA13 QA18 QQ04 QQ42 QR32
QR62 QS16 QS25 QX01
Claims (3)
- 【請求項１】 ステビオサイド１重量部に対してレバウ
デイオサイドＡ３重量部以上を含むステビア・レバウデ
ィアナ・ベルトニー品種の識別方法であって、配列番号
１および２に示される塩基配列を有するプライマーミッ
クスを用いるＲＡＰＤ法によって、ＤＮＡ鑑定により識
別を行うことを特徴とする方法。 - 【請求項２】 請求項１に記載の方法によって識別され
た、ステビオサイド１重量部に対してレバウデイオサイ
ドＡ３重量部以上を含むステビア・レバウディアナ・ベ
ルトニー品種に属する植物体またはその乾燥葉を水、ま
たは含水溶媒で抽出して得られるステビオサイド１重量
部に対してレバウデイオサイドＡ３重量部以上を含む甘
味料。 - 【請求項３】 ステビオサイド１重量部に対してレバウ
デイオサイドＡ３重量部以上を含む甘味料の製造方法で
あって、請求項１に記載の方法によって識別された、ス
テビオサイド１重量部に対してレバウデイオサイドＡ３
重量部以上を含むステビア・レバウディアナ・ベルトニ
ー品種に属する植物体またはその乾燥葉を水、または含
水溶媒で抽出することを特徴とする方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001200944A JP4776107B2 (ja) | 2001-07-02 | 2001-07-02 | ステビア品種のｄｎａ鑑定による識別 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001200944A JP4776107B2 (ja) | 2001-07-02 | 2001-07-02 | ステビア品種のｄｎａ鑑定による識別 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003009878A true JP2003009878A (ja) | 2003-01-14 |
| JP4776107B2 JP4776107B2 (ja) | 2011-09-21 |
Family
ID=19037982
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001200944A Expired - Lifetime JP4776107B2 (ja) | 2001-07-02 | 2001-07-02 | ステビア品種のｄｎａ鑑定による識別 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4776107B2 (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006093229A1 (ja) * | 2005-03-04 | 2006-09-08 | Morita Kagaku Kogyo Co., Ltd. | ステビア甘味料 |
| WO2009093610A1 (ja) * | 2008-01-22 | 2009-07-30 | Morita Kagaku Kogyo Co., Ltd. | 新規ステビア種および甘味料製造方法 |
| WO2010038911A1 (en) | 2008-10-03 | 2010-04-08 | Morita Kagaku Kogyo Co., Ltd. | New steviol glycoside |
| JP2010158176A (ja) * | 2009-01-06 | 2010-07-22 | Api Co Ltd | プロポリスの起源植物の識別方法及びそれに用いられるｄｎａ増幅用のプライマーセット |
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-
2001
- 2001-07-02 JP JP2001200944A patent/JP4776107B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| AU2006219311B2 (en) * | 2005-03-04 | 2012-02-02 | Morita Kagaku Kogyo Co., Ltd. | Stevia sweetener |
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| WO2009093610A1 (ja) * | 2008-01-22 | 2009-07-30 | Morita Kagaku Kogyo Co., Ltd. | 新規ステビア種および甘味料製造方法 |
| JPWO2009093610A1 (ja) * | 2008-01-22 | 2011-05-26 | 守田化学工業株式会社 | 新規ステビア種および甘味料製造方法 |
| KR20110066962A (ko) | 2008-10-03 | 2011-06-17 | 모리타 가가쿠 고교 가부시키가이샤 | 신규 스테비올 배당체 |
| EP3101023A1 (en) | 2008-10-03 | 2016-12-07 | Morita Kagaku Kogyo Co., Ltd. | New steviol glycosides |
| JP2014207899A (ja) * | 2008-10-03 | 2014-11-06 | 守田化学工業株式会社 | 新規ステビオール配糖体 |
| WO2010038911A1 (en) | 2008-10-03 | 2010-04-08 | Morita Kagaku Kogyo Co., Ltd. | New steviol glycoside |
| US20160058050A1 (en) * | 2008-10-03 | 2016-03-03 | Morita Kagaku Kogyo Co., Ltd. | Steviol glycoside |
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| EP2350110B1 (en) | 2008-10-03 | 2016-06-15 | Morita Kagaku Kogyo Co., Ltd. | New steviol glycosides |
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| KR20170018982A (ko) | 2008-10-03 | 2017-02-20 | 모리타 가가쿠 고교 가부시키가이샤 | 신규 스테비올 배당체 |
| KR20170018983A (ko) | 2008-10-03 | 2017-02-20 | 모리타 가가쿠 고교 가부시키가이샤 | 신규 스테비올 배당체 |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4776107B2 (ja) | 2011-09-21 |
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