JP2010158176A

JP2010158176A - プロポリスの起源植物の識別方法及びそれに用いられるｄｎａ増幅用のプライマーセット

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Publication number: JP2010158176A
Application number: JP2009000707A
Authority: JP
Inventors: Mamoru Kakino; 衛柿野; Shigemi Tazawa; 茂実田澤; Yoko Araki; 陽子荒木
Original assignee: API Co Ltd
Current assignee: API Co Ltd
Priority date: 2009-01-06
Filing date: 2009-01-06
Publication date: 2010-07-22
Anticipated expiration: 2029-01-06
Also published as: JP5113092B2

Abstract

【課題】プロポリスの起源植物としてバッカリス属が含まれるか否かの判定を正確に行うことができるプロポリスの起源植物の識別方法及びそれに用いられるＤＮＡ増幅用のプライマーセットを提供する。
【解決手段】プロポリスの起源植物の識別方法は、例えば（１）特定の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと他の特定の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対等の特定のプライマー対を用いてプロポリス由来のＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応を用い、ＰＣＲ産物の有無によりプロポリスの起源植物として、バッカリス属が含まれるか否かを判定する。
【選択図】なし

Description

本発明は、プロポリスの起源植物の識別方法及びそれに用いられるＤＮＡ増幅用のプライマーセットに係り、詳しくは特定の塩基配列からなるプライマー対を用いたプロポリスの起源植物の識別方法及びそれに用いられるＤＮＡ増幅用のプライマーセットに関する。

プロポリスは、巣の防御及び補強等を目的として、ミツバチが採取した植物の滲出液、新芽、及び樹脂等にミツロウを混ぜて作られる膠状ないしは蝋状の物質である。このプロポリスは、ミツバチが原料として巣箱周辺の種々の植物を採取して生産されるため、多種多様な成分を含有している。

プロポリス原塊は、紀元前４世紀に編纂されたアリストテレスの動物誌に「皮膚疾患、切り傷、感染症の治療薬」として記載されているように、抗菌効果や抗炎症効果を有していることが古くから知られている。また、プロポリスの主要な生理活性として、例えば抗酸化作用、免疫賦活作用、及び抗癌・抗腫瘍作用が知られている。そのため、プロポリスは、ヨーロッパにおいては医薬品或いは健康食品の素材として古くから用いられてきたが、１９８５年以降から日本においても健康食品や化粧品の素材の他、疾病の予防や治療等の多くの製品に使用されるようになった。

ところで、プロポリスの産地としては、中国、ブラジル、アルゼンチン、ウルグアイ等の南米諸国、ハンガリー、ブルガリア等のヨーロッパ、カナダ等の北米、オーストラリア、ニュージーランド等のオセアニアが産地となっている。近年、非特許文献１に開示されるように多くの研究者により産地別プロポリスの含有成分に関する研究が進められている。プロポリスは、通常ミツバチの巣箱を数日〜数ヶ月野外に放置することにより産生される。そのため、周辺植物の相違によりプロポリスを構成する植物起源は多種に及び、その産地によって含有成分も大いに異なることが考えられる。プロポリスの起源植物としては、例えばキク科、ナンヨウスギ科、ヤナギ科、カバノキ科、マツ科、マメ科、ウルシ科、フトモモ科等の植物が考えられている。ブラジル産のプロポリスは、特許文献１に開示されるように、例えばキク科バッカリス属の植物であるアレクレン（Baccharis dracunculifolia：バッカリス・ドラクンクリフォリア）と呼ばれる多年生の草木を主な起源植物として、複数の植物から採取された物質から生成されることが知られている。ブラジル産プロポリスは、主成分として、桂皮酸誘導体、例えばｐ−クマル酸、アルテピリンＣ、及びドゥルパニンが多く検出される。例えばアルテピリンＣは、アレクレンを起源植物とするブラジル産プロポリスに多く含有され、生体に対する副作用を生じさせることなく腫瘍細胞にアポトーシスを誘導するという有効な作用を有することが知られている。以上により、プロポリスは、起源植物材料の種類の相違によって、プロポリスの外観、性状、及び成分の相違、並びに期待される作用・機能も異なってくるものと考えられている。

特表２００７−５３０４３３号公報（段落［００２４］）

田澤茂実ら：Natural Medicines, ５４（６）, ３０６−３１３, ２０００

一般に、プロポリスの原料となる起源植物の正確な判定は、困難である場合が多い。例えば、プロポリスの原料となる起源植物を直接判定する方法としては、ミツバチが植物原料を採取する場面を撮影し、追跡する方法が挙げられる。しかしながら、かかる方法を用いて既に採取後のプロポリス原塊から起源植物を特定することはできない。従来より、プロポリス原塊から起源植物を特定する方法は、外観、例えば色及び性状、原料となる植物抽出エキスとプロポリスの抽出エキスの成分の比較、並びに顕微鏡を用いた植物構造マーカー（例えば腺毛、非腺毛、及び茎頂の表皮断片）の解析が知られている。しかしながら、かかる方法は起源植物材料を間接的に判定するものであり、また判定経験等も必要であるため正確且つ確実な判定結果が得られない場合があるという問題があった。

本発明は、例えばブラジル産プロポリスにおいて、プロポリスの起源植物としてバッカリス属が含まれるか否かの判定方法において、特定のプライマーを用いたＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法を使用して正確に行うことができることを発見したことに基づくものである。

本発明の目的とするところは、プロポリスの起源植物としてバッカリス属が含まれるか否かの判定を正確に行うことができるプロポリスの起源植物の識別方法及びそれに用いられるＤＮＡ増幅用のプライマーセットを提供することにある。

上記目的を達成するために、請求項１に記載の発明のプロポリスの起源植物の識別方法は、下記（１）〜（９）から選ばれる少なくとも一種のプライマー対を用いてプロポリス由来のＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応を用い、ＰＣＲ産物を検出することによりプロポリスの起源植物として、バッカリス属が含まれるか否かを判定することを特徴とする。（１）配列番号５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。（２）配列番号７に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号９に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。（３）配列番号１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。（４）配列番号２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。（５）配列番号１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号８に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。（６）配列番号３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。（７）配列番号４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号７に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。（８）配列番号４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号８に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。（９）配列番号１０に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。

請求項２に記載の発明は、請求項１に記載のプロポリスの起源植物の識別方法において、前記バッカリス属は、アレクレン（Baccharis dracunculifolia）であることを特徴とする。

請求項３に記載の発明は、請求項１又は請求項２に記載のプロポリスの起源植物の識別方法において、前記プライマー対は、前記（５）〜（９）から選ばれる少なくとも一種のプライマー対であることを特徴とする。

請求項４に記載の発明のＤＮＡ増幅用のプライマーセットは、プロポリス由来のＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応を用い、ＰＣＲ産物を検出することによりプロポリスの起源植物として、バッカリス属が含まれるか否かを判定するための下記（１）〜（９）から選ばれる少なくとも一種のプライマー対からなる。（１）配列番号５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。（２）配列番号７に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号９に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。（３）配列番号１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。（４）配列番号２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。（５）配列番号１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号８に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。（６）配列番号３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。（７）配列番号４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号７に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。（８）配列番号４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号８に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。（９）配列番号１０に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。

本発明によれば、プロポリスの起源植物としてバッカリス属が含まれるか否かの判定を正確に行うことができる。

１種類のプライマーを用いた場合のＰＣＲ産物の電気泳動写真を示す（尚、写真は明瞭化のため白黒反転処理を行っている）。各プライマー対を用いたＰＣＲ産物の電気泳動写真を示す（尚、写真は明瞭化のため白黒反転処理を行っている）。

以下、本発明のプロポリスの起源植物の識別方法を具体化した一実施形態を説明する。
本実施形態のプロポリスの起源植物の識別方法（以下、単に「識別方法」という）は、後述する（１）〜（９）から選ばれる少なくとも一種のプライマー対を用いてプロポリス由来のＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応を用い、ＰＣＲ産物を検出することによりバッカリス属が含まれるか否かを判定する工程からなる。

プロポリスは、巣の防御及び補強等を目的として、セイヨウミツバチ等のミツバチが採取した植物の滲出液、新芽及び樹脂等に唾液を混ぜて作られる膠状ないしは蝋状の物質である。したがって、プロポリスには採取された植物に由来するＤＮＡが含有される。本実施形態の識別方法に用いられるプロポリスは、ＤＮＡが含有される形態であれば特に限定されず、好ましくは巣箱から採取したプロポリス原塊が用いられ、プロポリス由来のＤＮＡを含有する限り、プロポリス原塊から水、有機溶媒等の抽出溶媒を用いて得られる抽出液を被検体として用いてもよい。本実施形態において使用されるプロポリスの産地は、特に限定されないが陽性の判定を期待する場合、ブラジル産又は主要起源植物がキク科バッカリス属である可能性があると判断されるプロポリスが用いられることが好ましい。キク科バッカリス属は好ましくは、アレクレン（Baccharis dracunculifolia ：バッカリス・ドラクンクリフォリア）が挙げられる。アレクレンを起源植物とするプロポリスには、抗腫瘍作用を有するアルテピリンＣが多く含有される。例えばブラジル産プロポリスは、アレクレンを主な起源植物として、複数の植物から採取された物質から生成されることが知られている。

本実施形態の識別方法は、まずプロポリス原塊等の被検体からプロポリス由来のゲノムＤＮＡを抽出する工程が行われることが好ましい。被検体からのゲノムＤＮＡの抽出方法は、分子生物学の分野で公知の方法を用いることができ、必要に応じて精製処理してもよい。ゲノムＤＮＡの抽出方法としては、例えばシリカベーズレジンタイプキット法（Promega Wizard DNA Clean-Up System）、シリカゲル膜タイプキット法（QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit 改定法、NIPPON GENE GM quicker）、及びＣＴＡＢ法が挙げられる。市販品としては、Invitrogen 社製のTRIzol Reagent が挙げられる。

次に、被検体から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応を用い、ＤＮＡの増幅を行う。本ＰＣＲ反応に用いられるプライマー対は、下記（１）〜（９）から選ばれる少なくとも一種のプライマー対が用いられる。（１）プライマー対は、配列番号５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせである。この（１）プライマー対により、配列番号１２の３０９ｂｐのＤＮＡが増幅される。（２）プライマー対は、配列番号７に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号９に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせである。この（２）プライマー対により、配列番号１３の２６３ｂｐのＤＮＡが増幅される。（３）プライマー対は、配列番号１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせである。この（３）プライマー対により、配列番号１４の２４０ｂｐのＤＮＡが増幅される。（４）プライマー対は、配列番号２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせである。この（４）プライマー対により、配列番号１５の塩基配列を含む約９００ｂｐのＤＮＡが増幅される。（５）プライマー対は、配列番号１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号８に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせである。この（５）プライマー対により、配列番号１６の２４９ｂｐのＤＮＡが増幅される。（６）プライマー対は、配列番号３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせである。この（６）プライマー対により、配列番号１７の２３８ｂｐのＤＮＡが増幅される。（７）プライマー対は、配列番号４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号７に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせである。この（７）プライマー対により、配列番号１８の２７８ｂｐのＤＮＡが増幅される。（８）プライマー対は、配列番号４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号８に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせである。この（８）プライマー対により、配列番号１９の塩基配列を含む約９００ｂｐのＤＮＡが増幅される。（９）プライマー対は、配列番号１０に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせである。この（９）プライマー対により、配列番号２０の２６７ｂｐのＤＮＡが増幅される。

上記（１）〜（９）の各プライマー対は、各プライマー対を構成する配列番号１〜１１の塩基配列自体を用いることができる。また、上記（１）〜（９）の各プライマー対は、各配列番号１〜１１を含むさらに長い塩基配列、例えば各塩基配列に続く塩基をさらに５〜２０塩基程度（さらに長く構成することも可能）付加することにより構成されるＳＴＳ（Sequence tagged-site）化プライマー等であってもよい。また、各塩基配列に続く塩基のうち各塩基配列を含めない２０〜３０塩基により構成されるＳＴＳ化プライマーを構成することも将来的には可能である。ＳＴＳ化は、各プライマー対によって増幅される配列番号１２〜２０の塩基配列から決定することができる。ＳＴＳ化することにより、より正確に（特異的に）バッカリス属の植物を識別することができる。例えば、各プライマー対によって増幅される配列番号１２〜２０の両端において、配列番号１〜１１の各塩基配列（又はその配列に相補的な塩基配列）と該塩基配列に続く配列領域（５〜２０塩基）から構成されるプライマー、又は該塩基配列に続く配列領域（２０〜３０塩基）から構成されるプライマーが挙げられる。

これらのプライマー対は、品種間の塩基配列の多型を検出する方法として用いられるＲＡＰＤ（ランダム増幅多型ＤＮＡ：Random amplified polymorphic DNA）法（Williams. et. al. Nucleic Acids Research. 第１８巻、第６５３１頁、１９９０年）により決定されたものである。より具体的には、ランダムプライマーの存在下でＰＣＲによってＤＮＡを増幅した時、増幅されるゲノムＤＮＡの大きさや数等の差によって、品種間を識別することができるプライマー又はプライマー対を決定することができる。本実施形態においてランダムプライマーは、ＤＮＡ合成機を用いて合成してもよく、市販品として例えばＢＥＸ社製コモンプライマー（Ａ〜Ｄ、Ｆ、Ｚセット）を用いてもよい。ＲＡＰＤ法により決定された（１）〜（９）の各プライマー対は、プロポリスを構成する起源植物であるバッカリス属の識別に適するよう設計されている。これらの中で、（５）〜（９）から選ばれる少なくとも一種のプライマー対が、より確実に特異的にバッカリス属を識別することができるため好ましい。

ＰＣＲを用いたゲノムＤＮＡの増幅は、公知の方法を適宜採用することができる。（１）〜（９）の各プライマー対を用いたＰＣＲ反応は、常法に従い、鋳型ＤＮＡの解離工程、プライマーと鋳型ＤＮＡとのアニーリング工程、及びプライマーを開始点としたＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成工程からなるＤＮＡの複製サイクルを繰り返すことにより行われる。ＰＣＲの反応液は、例えば、鋳型ＤＮＡとしてプロポリス由来のＤＮＡ、（１）〜（９）のいずれかのプライマー対、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｇポリメラーゼ）、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、及び反応用緩衝液等から調製される。鋳型ＤＮＡの解離工程は、好ましくは９０〜１００℃で数秒から数分程度行われ、プライマーと鋳型ＤＮＡとのアニーリング工程は、好ましくは３８〜５０℃で３０秒から３分程度行われ、ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成工程は、好ましくは７０〜７３℃で３０秒〜６分程度行われる。ＤＮＡの複製サイクルの繰り返し回数は、特に限定されないが、好ましくは３０〜６０回、より好ましくは４０〜５０回行われる。尚、ＤＮＡの複製サイクルは、市販のＰＣＲ装置を用いて行うことができる。

上記複製サイクルを繰り返すことにより、目的とするＰＣＲ産物（増幅ゲノムＤＮＡ）を得ることができる。ＰＣＲ産物の検出は、ＤＮＡの分離工程及びＤＮＡの検出工程により行われる。ＤＮＡの分離工程は、例えばアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等を用いて行うことができる。ＤＮＡの検出工程は、例えば、エチジウムブロマイド等のフェナントリジン系の色素を用い検出することができる。例えばエチジウムブロマイドは、核酸に結合して紫外線照射によりＤＮＡ量に比例した蛍光を発する。また、プライマー分子を予め標識分子（例えば、蛍光分子、色素分子、及び放射性同位元素等）を用いて合成又はそれらの標識分子を付加し、公知の方法を用いて検出してもよい。

プロポリスの起源植物として、バッカリス属が含まれるか否かを判定は、上記複製サイクルにより生成したＰＣＲ産物の分離及び検出の各工程を経ることに得られる分画パターンに基づいて判断される。ＰＣＲ産物の分画パターンの比較解析は、増幅ゲノムＤＮＡの有無、分子量（塩基数）、量、及び塩基配列等に基づいて行われる。それらは、ＰＣＲ産物を電気泳動したときのバンドの有無、移動距離、濃淡、及び塩基配列の解析等により決定することができる。

プロポリス中にバッカリス属由来の植物が含有されるか否かの判断をより正確に行うために、２回以上ＰＣＲ反応を繰り返すことが好ましく、また２種以上のプライマー対を用いてＰＣＲ反応を行いＰＣＲ産物を検出することがより好ましい。

本実施形態のプロポリスの起源植物の識別方法によれば、以下のような効果を得ることができる。
・本実施形態のプロポリスの起源植物の識別方法は、上述した（１）〜（９）から選ばれる少なくとも一種のプライマー対を用いてプロポリス由来のＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応を用い、ＰＣＲ産物を検出することによりプロポリスの起源植物として、バッカリス属が含まれるか否かを判定する。したがって、プロポリスの起源植物としてバッカリス属が含まれるか否かの判定を正確に行うことができる。

・本実施形態のプロポリスの起源植物の識別方法により、キク科バッカリス属の植物と他のプロポリスの起源植物として知られているナンヨウスギ科、ヤナギ科、カバノキ科、マツ科、マメ科、ウルシ科、フトモモ科等の植物と区別することができる。

・本実施形態の識別方法により、主要起源植物がキク科バッカリス属であるブラジル産プロポリスと他のプロポリスの産地として知られている中国、アルゼンチン、ウルグアイ等の南米諸国、ハンガリー、ブルガリア等のヨーロッパ、カナダ等の北米、オーストラリア、ニュージーランド等のオセアニア等の産地とを区別することができる。

・本実施形態のプロポリスの起源植物の識別方法は、アレクレン（Baccharis dracunculifolia）の識別により好ましく適用することができる。
・例えば、アレクレンを多く含有するブラジル産プロポリスは、プロポリス原塊が少し緑がかっているのでグリーンプロポリスと呼ばれている。本実施形態のプロポリスの起源植物の識別方法により、グリーンプロポリスを外観のみの官能的な識別判定のみならず、直接的で正確な識別判定を行うことができる。

・本実施形態のプロポリスの起源植物の識別方法において、好ましくは上記（５）〜（９）から選ばれる少なくとも一種のプライマー対が用いられる。したがって、より正確且つ確実にプロポリスの起源植物としてバッカリス属が含まれるか否かの判定を行うことができる。

・本実施形態のプロポリスの起源植物の識別方法は、ＰＣＲ法、電気泳動法等の公知の分子生物学的手法を適用することにより実施することができる。よって、容易に実施することができ、且つ容易に結果を判断することができる。

なお、上記実施形態は以下のように変更してもよい。
・上記実施形態は、プロポリス由来のＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応を用い、ＰＣＲ産物を検出することによりプロポリスの起源植物として、バッカリス属が含まれるか否かを判定するための上記（１）〜（９）から選ばれる少なくとも一種のプライマー対からなるＤＮＡ増幅用のプライマーセットとして構成してもよい。

・上記ＤＮＡ増幅用のプライマーセットは、さらに、核酸増幅用試薬、例えばＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ混合液、及び核酸増幅反応バッファ、並びにゲノムＤＮＡ抽出用試薬等を含んでなるプロポリス起源植物識別用キットとして構成してもよい。

・本実施形態において、ＰＣＲ産物を電気泳動したときの検出バンドの濃淡、又はその相対値の比較により、プロポリス中におけるバッカリス属植物の有無のみならず、全体に占める含有率、含有量等を算出してもよい。

以下に実施例を挙げ、前記実施形態をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜試験例１：グリーンプロポリスにバッカリス属のＤＮＡが含有されているかの検討＞
（試験試料）
周辺植物が主にアレクレンから構成される巣箱より採取されたプロポリス（ブラジル産グリーンプロポリス：Ａ，Ｂの２社使用）を試験試料として使用した。陽性対照としてアレクレン（バッカリス）、陰性対照としてアレクレン以外の周辺植物である（１）シプレスティ、（２）パラナマツ、（３）ポロロッカ、及び（４）アロエイラの各生葉、並びに蜂としてアフリカ蜂化ミツバチ（ブラジル産）由来のＤＮＡを使用した。

（ＤＮＡの抽出）
プロポリス、植物の生葉、及び蜂からのＤＮＡ抽出は、TRIzol Reagent（Invitrogen社製）を用いて行った。植物組織を５０ｍｇ〜１００ｎｇ、２ｍＬエッペンチューブに秤量した。１ｍＬのTRIzol Reagentを添加して混合した。３００μＬのクロロホルムを添加し、１５秒ほどしっかりと転倒混和させ、常温で２〜３分放置した。これらを５０００〜５５００ｒｐｍで１５分低温遠心し、上層を捨てた。４５０μＬのエタノールを添加し、転倒混和させ、常温で２〜３分放置した。２５００ｒｐｍで５分低温遠心し、上層（フェノール−エタノール層）を捨てた。これに１ｍＬの０．１Ｍクエン酸ナトリウム−１０％エタノールを添加し、常温で３０分転倒混和した。２５００ｒｐｍで５分低温遠心し、上層を捨てた。１．５〜２．０ｍＬの７５％エタノールを添加し、常温で３０分転倒混和した。２５００ｒｐｍで５分低温遠心し、上層を捨てた。エッペンチューブを、１５〜３０分程度風乾させ、３００〜６００μＬの８ｍＭ−ＮａＯＨで希釈する。ＴＥに２０倍希釈して全体を３０μＬから６００μＬにした。紫外線吸光度測定（２３０〜３２０ｎｍ）によって、スペクトルを測定し、２５７ｎｍ近辺にピークがあることを確認した。

（ＲＡＰＤマーカーを用いたＰＣＲ増幅及びＰＣＲ産物の検出）
ＲＡＰＤ（ランダム増幅多型ＤＮＡ：Random amplified polymorphic DNA）法により、ランダムプライマーを用いて増幅されるバンドの起源植物間多型を検出し、その中から明瞭且つ再現性のある多型を選択する。

各試験試料から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＲＡＰＤ法用のランダムプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。ランダムプライマーとしては、ＢＥＸコモンプライマーＡセット（１００種類）をシングルプライマーとして使用した。

ＰＣＲ反応液の組成は、２．５μＬの１０×ＰＣＲバッファー、２．０μＬの２．５ｍＭｄＮＴＰ混合液、１．６μＬの７．８μＭランダムプライマー、０．２μＬの５Ｕ／μＬｒＴａｑポリメラーゼ（TAKARA社製）、１．０μＬの５ｎｇ／μＬ鋳型ゲノムＤＮＡ、滅菌水１７．７μＬを含む総量２５．０μＬとした。ＰＣＲは、サーマルサイクラー（PERKIN ELMER CETUS社製Gene Amp PCR System）で９８℃で５分の後に、９８℃で１０秒、４０℃で１分、７２℃で１分を４５サイクル繰り返し、７２℃５分で保温した後に、４℃で保持した。

反応後、ＰＣＲ産物を０．５×ＴＢＥバッファー中、２．０％アガロースゲル上で電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した後、ＵＶ光下でバンドを検出した。検出されたバンドのうち、明瞭かつ再現性のある多型を示すバンド（ＲＡＰＤマーカー）を選択した。結果を図１に示す（図１は１種類のプライマーの結果のみ示す）。

図１に示されるように、ＢＥＸコモンプライマーＡセットを用いることにより、グリーンプロポリスにおいてバッカリス属の植物と同一レベルのバンドが検出された。尚、その他の周辺植物及び蜂由来の遺伝子からは、同一レベルのバンドは検出されなかった。ＢＥＸコモンプライマーＡセットのうち配列番号１〜１１に示される１１種類のシングルプライマーについて同等の結果が得られた。グリーンプロポリスにバッカリス属のＤＮＡが含有されていることが確認された。

＜試験例２：プライマー対の検討＞
試験試料として、プロポリス原料となる植物としてアレクレン（バッカリス）、シプレスティ、パラナマツ、ポロロッカ、及びアロエイラの各生葉、並びに蜂としてアフリカ蜂化ミツバチ（ブラジル産）及び西洋ミツバチ（中国産）を使用した。プライマーとしては、試験例１でグリーンプロポリスにおいてバッカリス属の植物と同一レベルのバンドが検出された配列番号１〜１１に示される１１種類のプライマーから２種類ずつを選定してダブルプライマー（プライマー対：全５５対について検討）として使用した。尚、ＤＮＡの抽出、ＰＣＲ、及び電気泳動によるバンドの検出方法は、上記試験例１に記載の方法を適用した。また、ＰＣＲにより増幅した断片について下記の方法に従い塩基配列を決定した。ＰＣＲ後の電気泳動の結果を図２に示す。

（増幅断片の塩基配列の決定）
各プライマー対から増幅されたＤＮＡ断片のうち、バッカリスの判別に良好なＤＮＡ断片を選定した。それらのＤＮＡ断片を、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN社製）を用いて精製した。精製した増幅ＤＮＡは、シグマアルドリッチジャパン社に委託して塩基配列決定を行った。

図２に示されるように、上記（１）〜（９）のプライマー対を用いた場合に、バッカリス属のアレクレン特異的なバンドが検出された。（１）プライマー対により、配列番号１２の塩基配列からなる３０９ｂｐのＰＣＲ産物が得られる。（２）プライマー対により、配列番号１３の塩基配列からなる２６３ｂｐのＰＣＲ産物が得られる。（３）プライマー対により、配列番号１４の塩基配列からなる２４０ｂｐのＰＣＲ産物が得られる。（４）プライマー対により、配列番号１５の塩基配列を含む約９００ｂｐのＰＣＲ産物が得られる。尚、この（４）プライマー対により得られる約９００ｂｐのＰＣＲ産物は、配列が長いため全配列のうち中央部分のみ塩基配列を決定している。決定された塩基配列を配列番号１５に示す。（５）プライマー対により、配列番号１６の塩基配列からなる２４９ｂｐのＰＣＲ産物が得られる。（６）プライマー対により、配列番号１７の塩基配列からなる２３８ｂｐのＰＣＲ産物が得られる。アフリカ蜂化ミツバチ及び西洋ミツバチにおいて近いバンドが検出されるが、識別性に問題はない。また、確実性が高い。（７）プライマー対により、配列番号１８の塩基配列からなる２７８ｂｐのＰＣＲ産物が得られる。アフリカ蜂化ミツバチにおいて近いバンドが検出されるが識別性に問題はない。（８）プライマー対により、配列番号１９の塩基配列を含む約９００ｂｐのＰＣＲ産物が得られる。尚、この（８）プライマー対により得られる約９００ｂｐのＰＣＲ産物は、配列が長いため全配列のうち中央部分のみ塩基配列を決定している。決定された塩基配列を配列番号１９に示す。（９）プライマー対により、配列番号２０の塩基配列からなる２６７ｂｐのＰＣＲ産物が得られる。アロエイラにおいて近いバンドが検出されるが識別性に問題はない。また、確実性が高い。

これらのプライマー対の中で再現性が特に良好なものは、（５）〜（９）のプライマー対であった。識別性の容易性も考慮に入れると、（５）及び（８）のプライマー対がより好ましい。

以上により、特定のプライマー対を使用することにより、プロポリス中の遺伝子産物からバッカリス属由来の遺伝子が含まれるか否かを検出することにより、該プロポリスの起源植物を直接判定することが可能となった。

次に、上記実施形態及び別例から把握できる技術的思想について、それらの効果とともに以下に追記する。
（ａ）前記プライマーセットに、さらに核酸増幅用試薬としてＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ混合液、及び核酸増幅反応バッファ、並びにゲノムＤＮＡ抽出用試薬を含んでなるプロポリス起源植物識別用キット。

（ｂ）前記ＰＣＲ産物を電気泳動したときの検出バンドの濃淡、又はその相対値の比較により、プロポリス中におけるバッカリス属植物の全体に占める含有率又は含有量を算出することを特徴とする前記プロポリスの起源植物の識別方法。

Claims

下記（１）〜（９）から選ばれる少なくとも一種のプライマー対を用いてプロポリス由来のＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応を用い、ＰＣＲ産物を検出することによりプロポリスの起源植物として、バッカリス属が含まれるか否かを判定することを特徴とするプロポリスの起源植物の識別方法。
（１）配列番号５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。
（２）配列番号７に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号９に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。
（３）配列番号１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。
（４）配列番号２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。
（５）配列番号１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号８に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。
（６）配列番号３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。
（７）配列番号４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号７に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。
（８）配列番号４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号８に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。
（９）配列番号１０に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。
前記バッカリス属は、アレクレン（Baccharis dracunculifolia）であることを特徴とする請求項１に記載のプロポリスの起源植物の識別方法。
前記プライマー対は、前記（５）〜（９）から選ばれる少なくとも一種のプライマー対であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のプロポリスの起源植物の識別方法。
プロポリス由来のＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応を用い、ＰＣＲ産物を検出することによりプロポリスの起源植物として、バッカリス属が含まれるか否かを判定するための下記（１）〜（９）から選ばれる少なくとも一種のプライマー対からなるＤＮＡ増幅用のプライマーセット。
（１）配列番号５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。
（２）配列番号７に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号９に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。
（３）配列番号１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。
（４）配列番号２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。
（５）配列番号１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号８に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。
（６）配列番号３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。
（７）配列番号４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号７に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。
（８）配列番号４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号８に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。
（９）配列番号１０に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであるプライマー対。