CN106636397B

CN106636397B - 用于鉴定三种药用蛇的引物组合及其应用

Info

Publication number: CN106636397B
Application number: CN201611190219.8A
Authority: CN
Inventors: 袁媛; 蒋超; 黄璐琦; 赵玉洋
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: China Resources Sanjiu Modern Traditional Chinese Medicine Pharmaceutical Co ltd; Institute of Materia Medica of CAMS; Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital
Priority date: 2016-12-20
Filing date: 2016-12-20
Publication date: 2019-12-20
Anticipated expiration: 2036-12-20
Also published as: CN106636397A

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定三种药用蛇的引物组合及其应用。本发明的引物组合，由序列1至6所示的6条单链DNA分子组成。本发明还保护所述引物组合在鉴别蕲蛇、乌梢蛇和金钱白花蛇中的应用。本发明还保护鉴别蕲蛇、乌梢蛇和金钱白花蛇的方法。本发明通过单次PCR反应即可同时鉴别是否存在药用蛇类(蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇)，根据凝胶电泳条带大小可检测是否存在特定的药用蛇类物种。同时，本发明也可鉴别药用蛇类蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇的混合样品。

Description

用于鉴定三种药用蛇的引物组合及其应用

技术领域

本发明涉及一种用于鉴定三种药用蛇的引物组合及其应用。

背景技术

包括蛇肉、蛇胆、蛇蜕等在内的蛇类药材是我国传统医学的重要组成部分，往往具有祛风除湿、通络止痉、清凉明目、止咳化痰等作用，在中医临床上具有广泛应用，现行2015年版《中国药典》标准已收载了三种药用蛇类，即蕲蛇、乌梢蛇与金钱白花蛇。我国蛇类物种约有两百余种，其中有20余种为常见蛇类，包括蕲蛇Agkistrodon acutus、乌梢蛇Zaocysdhumnades、金钱白花蛇Bungarus multicinctus、金环蛇Bungarus fasciatus、滑鼠蛇Ptyas mucosus、圆斑蝰Daboia russelii、眼镜蛇Naja naja、中国水蛇Enhydrischinensis、铅色水蛇Enhydris plumbea、赤链蛇Lycodon rufozonatus、王锦蛇Elaphecarinata、红纹滞卵蛇Oocatochus rufodsata、灰鼠蛇Ptyas korros、短尾蝮蛇Gloydiusbrevicaudus、黑眉锦蛇Elaphe taeniura、平颏海蛇Pelamis platurus、三索锦蛇Elapheradiata、百花锦蛇Elaphe moellendorffi、赤链华游蛇Sinonatrix annularis、虎斑游蛇Rhabdophis tigrina等，其多数不具有临床药效。由于多种蛇类形态相似性，尤其是经过剥皮加工后，往往难以鉴别，常伪充药用蛇类出售，严重影响用药安全与临床疗效，需要建立准确度高，专属性好的鉴别方法。

目前蕲蛇与乌梢蛇施行聚合酶链式反应法鉴别，金钱白花蛇依靠传统性状鉴别。由于三种蛇类没有统一的鉴别方法，对药用蛇类进行鉴别时，需要同时进行性状检测，并且需要分别对蕲蛇、乌梢蛇使用各自特异性引物进行PCR扩增，并且这些方法测试时间较长，且均需要电泳检测才可完成，不利于现场快速鉴别的应用与推广。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于鉴定三种药用蛇的引物组合及其应用。

本发明提供了一种引物组合，由引物对I、引物对II和引物对III组成；

所述引物对I由引物F1和引物F2组成；

所述引物F1为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物F2为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；

所述引物对II由引物F3和引物F4组成；

所述引物F3为如下(a5)或(a6)：

(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；

(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；

所述引物F4为如下(a7)或(a8)：

(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；

(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；

所述引物对III由引物F5和引物F6组成；

所述引物F5为如下(a9)或(a10)：

(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；

(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；

所述引物F6为如下(a11)或(a12)：

(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；

(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。

所述引物组合的用途为如下(b1)至(b6)中的任意一种：

(b1)鉴别蕲蛇、乌梢蛇和金钱白花蛇；

(b2)制备用于鉴别蕲蛇、乌梢蛇和金钱白花蛇的试剂盒；

(b3)鉴定待测蛇是否为蕲蛇、乌梢蛇或金钱白花蛇；

(b4)制备用于鉴定待测蛇是否为蕲蛇、乌梢蛇或金钱白花蛇的试剂盒；

(b5)鉴定待测样品中是否含有蕲蛇和/或乌梢蛇和/或金钱白花蛇；

(b6)制备用于鉴定待测样品中是否含有蕲蛇和/或乌梢蛇和/或金钱白花蛇的试剂盒。

本发明还保护所述引物组合的应用，如下(b1)至(b6)中的任意一种：

(b1)鉴别蕲蛇、乌梢蛇和金钱白花蛇；

(b2)制备用于鉴别蕲蛇、乌梢蛇和金钱白花蛇的试剂盒；

(b3)鉴定待测蛇是否为蕲蛇、乌梢蛇或金钱白花蛇；

本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)或(c3)：

(c1)鉴别蕲蛇、乌梢蛇和金钱白花蛇；

(c2)鉴定待测蛇是否为蕲蛇、乌梢蛇或金钱白花蛇；

(c3)鉴定待测样品中是否含有蕲蛇和/或乌梢蛇和/或金钱白花蛇。

本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。

本发明还保护鉴别蕲蛇、乌梢蛇和金钱白花蛇的方法，为方法I或方法II。

所述方法I包括如下步骤：提取待测蛇的基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，采用所述引物组合进行PCR扩增，如果扩增产物中含有339-359bp的DNA片段、待测蛇为蕲蛇，如果扩增产物中含有114-134bp的DNA片段、待测蛇为乌梢蛇，如果扩增产物中含有555-575bp的DNA片段、待测蛇为金钱白花蛇。

所述方法II包括如下步骤：检测待测蛇的基因组DNA中是否含有引物对I的靶序列、引物对II的靶序列或引物对III的靶序列；如果所述基因组DNA中含有引物对I的靶序列、待测蛇为蕲蛇，如果所述基因组DNA中含有引物对II的靶序列、待测蛇为乌梢蛇，如果所述基因组DNA中含有引物对III的靶序列、待测蛇为金钱白花蛇。本发明还保护鉴定待测蛇是否为蕲蛇、乌梢蛇或金钱白花蛇的方法，为方法III或方法IV或方法V。

本发明还保护鉴定待测蛇是否为蕲蛇、乌梢蛇或金钱白花蛇的方法，为方法III或方法IV或方法V。

所述方法III包括如下步骤：提取待测蛇的基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，采用所述引物组合进行PCR扩增，如果采用扩增产物中含有339-359bp的DNA片段、待测蛇为蕲蛇，如果扩增产物中含有114-134bp的DNA片段、待测蛇为乌梢蛇，如果扩增产中含有555-575bp的DNA片段、待测蛇为金钱白花蛇，如果扩增产物中不含有339-359bp的DNA片段、114-134bp的DNA片段或555-575bp的DNA片段、待测蛇为非蕲蛇且非乌梢蛇且非金钱白花蛇。

所述方法IV包括如下步骤：提取待测蛇的基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，采用所述引物组合进行PCR扩增；如果扩增产物加入SYBR Green I荧光染料后可以检测到绿色荧光、待测蛇为蕲蛇或乌梢蛇或金钱白花蛇，如果扩增产物加入SYBR Green I荧光染料后不可以检测到绿色荧光、待测蛇为非蕲蛇且非乌梢蛇且非金钱白花蛇。

所述方法V包括如下步骤：检测待测蛇的基因组DNA中是否含有引物对I的靶序列、引物对II的靶序列或引物对III的靶序列；如果所述基因组DNA中含有引物对I的靶序列、待测蛇为蕲蛇，如果所述基因组DNA中含有引物对II的靶序列、待测蛇为乌梢蛇，如果所述基因组DNA中含有引物对III的靶序列、待测蛇为金钱白花蛇，如果所述基因组DNA中不含有引物对I、引物对II或引物对III的靶序列、待测蛇为非蕲蛇且非乌梢蛇且非金钱白花蛇。

本发明还保护鉴定待测样品中是否含有蕲蛇和/或乌梢蛇和/或金钱白花蛇的方法，为方法VI或方法VII或方法VIII。

所述方法VI包括如下步骤：提取待测样品的基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，采用所述引物组合进行PCR扩增，如果扩增产物中含有339-359bp的DNA片段、待测样品中含有蕲蛇，如果扩增产物中含有114-134bp的DNA片段、待测样品中含有乌梢蛇，如果扩增产物中含有555-575bp的DNA片段、待测样品中含有金钱白花蛇，如果扩增产物中不含有339-359bp的DNA片段、114-134bp的DNA片段或555-575bp的DNA片段、待测样品中不含有蕲蛇且不含有乌梢蛇且不含有金钱白花蛇。

所述方法VII包括如下步骤：提取待测样品的基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，采用所述引物组合进行PCR扩增；如果扩增产物加入SYBR Green I荧光染料后可以检测到绿色荧光、待测样品中含有蕲蛇或乌梢蛇或金钱白花蛇，如果扩增产物加入SYBR GreenI荧光染料后不可以检测到绿色荧光、待测样品中不含有蕲蛇且不含有乌梢蛇且不含有金钱白花蛇。

所述方法VIII包括如下步骤：检测待测样品的基因组DNA中是否含有引物对I的靶序列、引物对II的靶序列或引物对III的靶序列；如果所述基因组DNA中含有引物对I的靶序列、待测样品中含有蕲蛇，如果所述基因组DNA中含有引物对II的靶序列、待测样品中含有乌梢蛇，如果所述基因组DNA中含有引物对III的靶序列、待测样品中含有金钱白花蛇，如果所述基因组DNA中不含有引物对I、引物对II或引物对III的靶序列、待测样品中不含有蕲蛇且不含有乌梢蛇且不含有金钱白花蛇。

以上蛇的含义为生物个体蛇或蛇的任一组织。

本发明还保护所述引物对I或引物对II。

本发明还保护所述引物对I在制备试剂盒甲中的应用。

所述试剂盒甲的用途为如下(d1)或(d2)：

(d1)鉴定待测蛇是否为蕲蛇；

(d2)鉴定待测样品中是否含有蕲蛇。

本发明还保护所述引物对II在制备试剂盒乙中的应用。

所述试剂盒乙的用途为如下(d3)或(d4)：

(d3)鉴定待测蛇是否为乌梢蛇；

(d4)鉴定待测样品中是否含有乌梢蛇。

本发明还保护含有所述引物对I的试剂盒甲。

所述试剂盒甲的用途为如下(d1)或(d2)：

(d1)鉴定待测蛇是否为蕲蛇；

(d2)鉴定待测样品中是否含有蕲蛇。

本发明还保护含有所述引物对II的试剂盒乙。

所述试剂盒乙的用途为如下(d3)或(d4)：

(d3)鉴定待测蛇是否为乌梢蛇；

(d4)鉴定待测样品中是否含有乌梢蛇。

以上任一所述的PCR扩增退火温度为60℃。

以上任一所述PCR扩增的反应体系具体可为：2.5μL 10×buffer缓冲液，1.6μLdNTP(2.5mM)，0.4μL引物F1，0.4μL引物F2，0.4μL引物F3，0.4μL引物F4，0.4μL引物F5，0.4μL引物F6，0.2μL SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，2μL模板，16.3μL无菌双蒸水。

以上各条引物均以引物溶液形式加入至PCR反应体系中，各条引物在引物溶液中的初始浓度均为5μM。

以上任一所述PCR扩增的反应程序具体可为：预变性：95℃，1min；变性：95℃，10s，退火：60℃，10s，30个循环；4℃保存。

以上任一所述339-359bp的DNA片段具体可为349bp的DNA片段，更具体可为序列表的序列7所示的DNA分子。

以上任一所述114-134bp的DNA片段具体可为124bp的DNA片段，更具体可为序列表的序列8所示的DNA分子。

以上任一所述555-575bp的DNA片段具体可为565bp的DNA片段，更具体可为序列表的序列9所示的DNA分子。

以上任一所述待测样品具体可为蛇类药材样品。所述蛇类药材样品具体可为由蛇类任一组织制备的蛇类药材样品，例如蛇肉、蛇胆、蛇蜕制备的药材样品。

以上任一所述待测蛇具体可为如下任一种：乌梢蛇、金钱白花蛇、蕲蛇、眼镜蛇、孟加拉眼镜蛇、金环蛇、中国水蛇、铅色水蛇、赤链蛇、竹叶青、王锦蛇、红纹滞卵蛇、灰鼠蛇、短尾蝮蛇、蝮蛇、黑眉锦蛇、海蛇、三索锦蛇、百花锦蛇、赤链华游蛇、虎斑游蛇、山烙铁头蛇、滑鼠蛇。

本发明通过设计蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇的特异性引物，采用特异性PCR技术实现了药用蛇类及其混伪品的准确鉴别。通过单次PCR反应即可同时鉴别是否存在药用蛇类(蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇)，根据凝胶电泳条带大小可检测是否存在特定的药用蛇类物种。同时，本发明也可鉴别是药用蛇类蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇的混合样品。

附图说明

图1为实施例3部分待测样本PCR鉴别电泳检测结果。其中，泳道1-2为乌梢蛇(表1中的编号为编号为1和2)；泳道3-4为蕲蛇(表1中的编号为编号为7和8)；泳道5-6为金钱白花蛇(表1中的编号为编号为5和6)；泳道9-23分别为眼镜蛇(表1中的编号为编号为12)；孟加拉眼镜蛇(表1中的编号为13)；中国水蛇(表1中的编号为15)；铅色水蛇(表1中的编号为16)；赤链蛇(表1中的编号为18)；竹叶青(表1中的编号为19)；王锦蛇(表1中的编号为20)；红纹滞卵蛇(表1中的编号为23)；灰鼠蛇(表1中的编号为25)；短尾蝮蛇(表1中的编号为26)；蝮蛇(表1中的编号为27)；黑眉锦蛇(表1中的编号为28)；海蛇(表1中的编号为30)；三索锦蛇(表1中的编号为31)；百花锦蛇(表1中的编号为32)；；泳道24为以水做模板的空白对照；泳道M为DNA分子量标准：从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。

图2为实施例3部分待测样本PCR鉴别荧光检测结果。其中，A1、A2为乌梢蛇(表1中的编号为1和2)；A3、A4为蕲蛇(表1中的编号为7和8)；A5、A6为金钱白花蛇(表1中的编号为5和6)；A7：眼镜蛇(表1中的编号为12)；A8：孟加拉眼镜蛇(表1中的编号为13)；B1：中国水蛇(表1中的编号为15)；B2：铅色水蛇(表1中的编号为16)；B3：铅色水蛇(表1中的编号为17)；B4：赤链蛇(表1中的编号为18)；B5：竹叶青(表1中的编号为19)；B6：王锦蛇(表1中的编号为20)；B7：王锦蛇(表1中的编号为21)；B8：王锦蛇(表1中的编号为22)；C1：红纹滞卵蛇(表1中的编号为23)；C2：红纹滞卵蛇(表1中的编号为24)；C3：灰鼠蛇(表1中的编号为25)；C4：短尾蝮蛇(表1中的编号为26)；C5：蝮蛇(表1中的编号为27)；C6：黑眉锦蛇(表1中的编号为28)；C7：黑眉锦蛇(表1中的编号为29)；C8：海蛇(表1中的编号为30)；D1：三索锦蛇(表1中的编号为31)；D2：百花锦蛇(表1中的编号为32)；D3：赤链华游蛇(表1中的编号为33)；D4：虎斑游蛇(表1中的编号为34)；D5：虎斑游蛇(表1中的编号为35)；D6：山烙铁头蛇(表1中的编号为36)；D7：滑鼠蛇(表1中的编号为37)；D8：以水做模板的空白对照。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下实施例中，各条引物均以引物溶液形式加入至PCR反应体系中，各条引物在引物溶液中的初始浓度均为5μM。

10×buffer缓冲液：Takara公司，产品目录号：A1101E。

SpeedStar HS Taq DNA聚合酶：Takara公司，5U/μL，产品目录号：RR070A。

100×SYBR Green I：Invitrogen公司，产品目录号：1135054。

表1中蛇类样品均已在文献“陈康，蒋超，袁媛，等.快速PCR方法在蛇类药材真伪鉴别中的应用[J].中国中药杂志，2014，39(19)：3673-3677.”和“黄勇，张月云，赵成坚，等.DNA条形码技术在常见中药材蛇类鉴别中的应用[J].中国中药杂志，2015，40(5)：868-874.”中公开，公众可以从中国中医科学院中药研究所获得。

实施例1、引物设计

对各种蛇类物种的基因组进行大量序列分析，获得了用于鉴定蕲蛇、乌梢蛇和金钱白花蛇的若干引物。将各个引物进行预实验，比较灵敏度、特异性等性能，最终得到用于鉴定蕲蛇、乌梢蛇和金钱白花蛇的三套引物对。

用于鉴定蕲蛇的引物对(引物对I)由引物F1和引物F2组成(5’→3’)：

F1(序列表的序列1)：CTATACCTAATATTCGGCGCT；

F2(序列表的序列2)：CGGAGAGAGGTGGATAGACG；

用于鉴定乌梢蛇的引物对(引物对II)由引物F3和引物F4组成(5’→3’)：

F3(序列表的序列3)：CAGACATAGCCTTCCCACGC；

F4(序列表的序列4)：GGGGGGTATACTGTTCACCCA；

用于鉴定金钱白花蛇的引物对(引物对III)由引物F5和引物F6组成(5’→3’)：

F5(序列表的序列5)：GAAATTTCGGCTCAATGCTTATAACCTGTCTTT；

F6(序列表的序列6)：GGAATTTTATCGATATCTGAATTAGTA。

引物对I、引物对II和引物对III组成引物组合。

实施例2、鉴定方法建立

一、琼脂糖凝胶电泳法

1、提取待测样本的基因组DNA。

2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用实施例1制备的引物组合中的引物对I、引物对II和引物对III分别进行PCR扩增，得到扩增产物。

PCR扩增体系(25μL)：2.5μL 10×buffer缓冲液，1.6μL dNTP(2.5mM)，0.4μL引物F1，0.4μL引物F2，0.4μL引物F3，0.4μL引物F4，0.4μL引物F5，0.4μL引物F6，0.2μLSpeedStar HS Taq DNA聚合酶，2μL模板，16.3μL无菌双蒸水。

PCR反应程序：预变性：95℃，1min；变性：95℃，10s，退火：60℃，10s，30个循环；4℃保存。

3、将步骤2得到的扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，根据结果进行如下判断：

如果扩增产物中含有349bp的DNA片段，则待测样本中含有蕲蛇，如果扩增产物中不含有349bp的DNA片段，则待测样本中不含有蕲蛇；

如果扩增产物中含有124bp的DNA片段，则待测样本中含有乌梢蛇，如果扩增产物中不含有124bp的DNA片段，则待测样本中不含有乌梢蛇；

如果扩增产物中含有565bp的DNA片段，则待测样本中含有金钱白花蛇，如果扩增产物中不含有565bp的DNA片段，则待测样本中不含有金钱白花蛇。

二、荧光染色法

1、提取待测样本的基因组DNA。

3、向步骤2得到的PCR扩增产物中加入1μL 100×SYBR Green I，于362nm紫外波长下检测荧光，根据结果进行如下判断：

如果扩增产物加入1μL 100×SYBR Green I后进行检测可以产生绿色荧光，则待测样本中含有蕲蛇或乌梢蛇或金钱白花蛇，如果扩增产物加入1μL 100×SYBR Green I后进行检测不能产生绿色荧光，则待测样本中不含有蕲蛇且不含有乌梢蛇且不含有金钱白花蛇。

实施例3、鉴定方法验证

待测样品：表1所示的37个来自不同采集地的已知物种的蛇类药材样品。表中的中药材样品均符合中国药典(2015年版)一部正文各药材项下的有关规定。通过鉴定，各味药材实物与名称相符，质量符合标准。

分别采用实施例2建立的琼脂糖凝胶电泳法和荧光染色法对待测样品进行鉴定，PCR反应体系中，模板的DNA含量均为20ng。

表1样品来源表

部分采用琼脂糖凝胶电泳法进行鉴定的结果见图1。将图1中泳道1和泳道2的124bp的目的条带测序，测序结果均如序列7所示。将图1中泳道3和泳道4的349bp的目的条带测序，测序结果均如序列8所示。将图1中泳道5和泳道6的565bp的目的条带测序，测序结果均如序列9所示。其他样品均未得到条带。结果表明，采用琼脂糖凝胶电泳法进行鉴定的结果均与实际情况相符，检测准确率高达100％。

部分采用荧光染色法进行鉴定的结果见图2。结果表明，采用荧光染色法进行鉴定的结果均与实际情况相符，检测准确率高达100％。

综上所述，采用实施例2建立的琼脂糖凝胶电泳法和荧光染色法均能够成功鉴定乌梢蛇、金钱白花蛇、蕲蛇三种药用蛇样品。

实施例4、灵敏度

待测样品为：表1中编号为1的乌梢蛇样品(样品1)、编号为5的金钱白花蛇样品(样品2)、编号为7的蕲蛇样品(样品3)。

1、提取待测样品的基因组DNA，得到DNA溶液；

2、用ddH₂O稀释步骤1得到的DNA溶液，得到各稀释液；

3、取步骤2到的各稀释液作为模板，采用实施例1制备的引物组合分别按照实施例2中的琼脂糖凝胶电泳法和荧光染色法进行鉴定；

由于采用的稀释液的稀释度不同，形成如下不同的反应体系：

反应体系1中，待测样品DNA初始含量为：100ng；

反应体系2中，待测样品DNA初始含量为：20ng；

反应体系3中，待测样品DNA初始含量为：4ng；

反应体系4中，待测样品DNA初始含量为：0.8ng；

反应体系5中，待测样品DNA初始含量为：0.16ng。

结果显示，模板DNA含量最低为0.16ng时，采用实施例2建立的琼脂糖凝胶电泳法和荧光染色法均能够成功鉴定乌梢蛇、金钱白花蛇、蕲蛇三种药用蛇样品。

4、采用引物组合II替代实施例1制备的引物组合按照步骤1-3进行操作；

引物组合II由引物对IV、引物对V和引物对III组成；

引物对IV由引物F7和引物F8组成(5’→3’)：

F7：GGCAATTCACTACACAGCCAACATCAAC；

F8：CCATAGTCAGGTGGTTAGTGATAC；

引物对V由引物F9和引物F10组成(5’→3’)：

F9：GCGAAAGCTCGACCTAGCAAGGGGACCACA；

F10：CAGGCTCCTCTAGGTTGTTATGGGGTACCG。

结果显示，单独检测样品1、样品2和样品3时，使用引物组合II进行检测的最低检测限为20ng。

5、制备DNA混合溶液，所述混合溶液中样品1基因组DNA的含量为0.16ng、样品2基因组DNA的含量为0.16ng、样品3基因组DNA的含量为0.16ng。

6、以步骤5制备的DNA混合溶液为模板，分别采用实施例1制备的引物组合和步骤4制备的引物组合II按照实施例2中的琼脂糖凝胶电泳法进行鉴定。

结果显示，采用实施例1制备的引物组合对DNA混合溶液进行鉴定时，能够得到125bp、350bp、560bp三条目的条件，很好的鉴别出三种药用蛇类样品，而采用引物组合II对DNA混合溶液进行鉴定时，由于模板DNA含量未达到检测限，没有得到目的条带。

7、制备DNA混合溶液II，所述混合溶液中样品1基因组DNA的含量为20ng、样品2基因组DNA的含量为20ng、样品3基因组DNA的含量为20ng。

8、以步骤7制备的DNA混合溶液II为模板，分别采用实施例1制备的引物组合和步骤4制备的引物组合II按照实施例2中的琼脂糖凝胶电泳法进行鉴定。

结果显示，采用实施例1制备的引物组合对DNA混合溶液进行鉴定时，能够得到124bp、349bp、565bp三条目的条件，很好的鉴别出三种药用蛇类样品，而采用引物组合II对DNA混合溶液进行鉴定时，由于引物对IV和引物对V的扩增产物片段大小相近无法区分，不能得到准确的检测结果。

<110> 中国中医科学院中药研究所

<120> 用于鉴定三种药用蛇的引物组合及其应用

<130> GNCYXMN162250

<160> 9

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

ctatacctaa tattcggcgc t 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

cggagagagg tggatagacg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

cagacatagc cttcccacgc 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

ggggggtata ctgttcaccc a 21

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

gaaatttcgg ctcaatgctt ataacctgtc ttt 33

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

ggaattttat cgatatctga attagta 27

<210> 7

<211> 349

<212> DNA

<213> 蕲蛇

<400> 7

ctatacctaa tattcggcgc ttggtccggc cttgtaggag cctgcttaag tattctaatg 60

cgcatagaac tgacgcagcc cggaacattg ttcggtagtg accaaatctt taatgtccta 120

gtaaccgccc acgcattcat cataatcttc tttatagtaa tacctattat aatcggagga 180

ttcggaaact gactaattcc tctaataatc ggaacccccg atatagcttt cccccgtata 240

aacaacataa gcttctgact actgccccca gcattactcc tattactatc ctcctcctac 300

atcgaagcag gcgcaggaac aggttgaacc gtctatccac ctctctccg 349

<210> 8

<211> 124

<212> DNA

<213> 乌梢蛇

<400> 8

cagacatagc cttcccacgc ataaacaaca tgagcttctg gttgctacca ccagcactac 60

tcctacttct atcctcctct tatgttgaag ccggagccgg cactgggtga acagtatacc 120

cccc 124

<210> 9

<211> 565

<212> DNA

<213> 金钱白花蛇

<400> 9

gaaattttgg ctctatgtta ataacctgtc ttttactaca aattataaca ggctttttcc 60

tagcgatcca ctatacagct aatattaact tagctttctc atcagtagtg catattatac 120

gcgatgtgcc ctacgggtga accatacaaa atattcatgc aattggcgca tctttattct 180

ttatttgtat ttacgcccat attgcacgag gactctacta tggcttgtac ctcaataaag 240

aggtctgatt atcaggaacc gccctattaa ttactctaat agcaacagcc ttctttggct 300

atgtccttcc atgagggcaa atatcattct gggcagcaac agtaattaca aacttactta 360

ccgcaatccc atacctagga aacacactaa caacctgact ttgaggaggt ttctctatta 420

atgacccaac cctcacccga tttttcgctt tacacttcat cctcccattc gctattatct 480

ccttatcctc aatccacatt ctcctccttc atgtcgaagg atcaaacaac ccacttggta 540

ctaattcaga tatcgataaa attcc 565

Claims

1.引物组合，由引物对Ⅰ、引物对Ⅱ和引物对Ⅲ组成；

所述引物对Ⅰ由引物F1和引物F2组成；

所述引物F1为序列表的序列1所示的单链DNA分子；

所述引物F2为序列表的序列2所示的单链DNA分子；

所述引物对Ⅱ由引物F3和引物F4组成；

所述引物F3为序列表的序列3所示的单链DNA分子；

所述引物F4为序列表的序列4所示的单链DNA分子；

所述引物对Ⅲ由引物F5和引物F6组成；

所述引物F5为序列表的序列5所示的单链DNA分子；

所述引物F6为序列表的序列6所示的单链DNA分子。

2.权利要求1所述引物组合的应用，为如下（b1）至（b6）中的任意一种：

（b1）鉴别蕲蛇、乌梢蛇和金钱白花蛇；

（b2）制备用于鉴别蕲蛇、乌梢蛇和金钱白花蛇的试剂盒；

（b3）鉴定待测蛇是否为蕲蛇、乌梢蛇或金钱白花蛇；

（b4）制备用于鉴定待测蛇是否为蕲蛇、乌梢蛇或金钱白花蛇的试剂盒；

（b5）鉴定待测样品中是否含有蕲蛇和/或乌梢蛇和/或金钱白花蛇；

（b6）制备用于鉴定待测样品中是否含有蕲蛇和/或乌梢蛇和/或金钱白花蛇的试剂盒。

3.含有权利要求1所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下（c1）或（c2）或（c3）：

（c1）鉴别蕲蛇、乌梢蛇和金钱白花蛇；

（c2）鉴定待测蛇是否为蕲蛇、乌梢蛇或金钱白花蛇；

（c3）鉴定待测样品中是否含有蕲蛇和/或乌梢蛇和/或金钱白花蛇。

4.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。

5.鉴别蕲蛇、乌梢蛇和金钱白花蛇的方法，为如下方法Ⅰ或方法Ⅱ；

所述方法Ⅰ包括如下步骤：提取待测蛇基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的引物组合进行PCR扩增，如果扩增产物中含有349bp的DNA片段、待测蛇为蕲蛇，如果扩增产物中含有124bp的DNA片段、待测蛇为乌梢蛇，如果扩增产物中含有565bp的DNA片段、待测蛇为金钱白花蛇；

所述方法Ⅱ包括如下步骤：检测待测蛇的基因组DNA中是否含有权利要求1所述的引物组合中的引物对Ⅰ的靶序列、引物对Ⅱ的靶序列或引物对Ⅲ的靶序列；如果所述基因组DNA中含有引物对Ⅰ的靶序列、待测蛇为蕲蛇，如果所述基因组DNA中含有引物对Ⅱ的靶序列、待测蛇为乌梢蛇，如果所述基因组DNA中含有引物对Ⅲ的靶序列、待测蛇为金钱白花蛇；

所述引物对Ⅰ由引物F1和引物F2组成；

所述引物F1为序列表的序列1所示的单链DNA分子；

所述引物F2为序列表的序列2所示的单链DNA分子；

所述引物对Ⅱ由引物F3和引物F4组成；

所述引物F3为序列表的序列3所示的单链DNA分子；

所述引物F4为序列表的序列4所示的单链DNA分子；

所述引物对Ⅲ由引物F5和引物F6组成；

所述引物F5为序列表的序列5所示的单链DNA分子；

所述引物F6为序列表的序列6所示的单链DNA分子；

所述引物对Ⅰ的靶序列为序列表的序列7所示的单链DNA分子；

所述引物对Ⅱ的靶序列为序列表的序列8所示的单链DNA分子；

所述引物对Ⅲ的靶序列为序列表的序列9所示的单链DNA分子。

6.鉴定待测蛇是否为蕲蛇、乌梢蛇或金钱白花蛇的方法，为如下方法Ⅲ或方法Ⅳ或方法Ⅴ；

所述方法Ⅲ包括如下步骤：提取待测蛇的基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的引物组合进行PCR扩增，如果采用扩增产物中含有349bp的DNA片段、待测蛇为蕲蛇，如果扩增产物中含有124bp的DNA片段、待测蛇为乌梢蛇，如果扩增产中含有565bp的DNA片段、待测蛇为金钱白花蛇，如果扩增产物中不含有349bp的DNA片段、124bp的DNA片段或565bp的DNA片段、待测蛇为非蕲蛇且非乌梢蛇且非金钱白花蛇；

所述方法Ⅳ包括如下步骤：提取待测蛇的基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的引物组合进行PCR扩增；如果扩增产物加入SYBR Green I荧光染料后可以检测到绿色荧光、待测蛇为蕲蛇或乌梢蛇或金钱白花蛇，如果扩增产物加入SYBR Green I荧光染料后不可以检测到绿色荧光、待测蛇为非蕲蛇且非乌梢蛇且非金钱白花蛇；

所述方法Ⅴ包括如下步骤：检测待测蛇的基因组DNA中是否含有权利要求1所述的引物组合中的引物对Ⅰ的靶序列、引物对Ⅱ的靶序列或引物对Ⅲ的靶序列；如果所述基因组DNA中含有引物对Ⅰ的靶序列、待测蛇为蕲蛇，如果所述基因组DNA中含有引物对Ⅱ的靶序列、待测蛇为乌梢蛇，如果所述基因组DNA中含有引物对Ⅲ的靶序列、待测蛇为金钱白花蛇，如果所述基因组DNA中不含有引物对Ⅰ、引物对Ⅱ或引物对Ⅲ的靶序列、待测蛇为非蕲蛇且非乌梢蛇且非金钱白花蛇；

所述引物对Ⅰ的靶序列为序列表的序列7所示的单链DNA分子；

所述引物对Ⅱ的靶序列为序列表的序列8所示的单链DNA分子；

所述引物对Ⅲ的靶序列为序列表的序列9所示的单链DNA分子；

所述引物对Ⅰ由引物F1和引物F2组成；

所述引物F1为序列表的序列1所示的单链DNA分子；所述引物F2为序列表的序列2所示的单链DNA分子；

所述引物对Ⅱ由引物F3和引物F4组成；

所述引物F3为序列表的序列3所示的单链DNA分子；

所述引物F4为序列表的序列4所示的单链DNA分子；

所述引物对Ⅲ由引物F5和引物F6组成；

所述引物F5为序列表的序列5所示的单链DNA分子；

所述引物F6为序列表的序列6所示的单链DNA分子。

7.鉴定待测样品中是否含有蕲蛇和/或乌梢蛇和/或金钱白花蛇的方法，为如下方法Ⅵ或方法Ⅶ或方法Ⅷ；

所述方法Ⅵ包括如下步骤：提取待测样品的基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的引物组合进行PCR扩增，如果扩增产物中含有349bp的DNA片段、待测样品中含有蕲蛇，如果扩增产物中含有124bp的DNA片段、待测样品中含有乌梢蛇，如果扩增产物中含有565bp的DNA片段、待测样品中含有金钱白花蛇，如果扩增产物中不含有349bp的DNA片段、124bp的DNA片段或565bp的DNA片段、待测样品中不含有蕲蛇且不含有乌梢蛇且不含有金钱白花蛇；

所述方法Ⅶ包括如下步骤：提取待测样品的基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的引物组合进行PCR扩增；如果扩增产物加入SYBR Green I荧光染料后可以检测到绿色荧光、待测样品中含有蕲蛇或乌梢蛇或金钱白花蛇，如果扩增产物加入SYBRGreen I荧光染料后不可以检测到绿色荧光、待测样品中不含有蕲蛇且不含有乌梢蛇且不含有金钱白花蛇；

所述方法Ⅷ包括如下步骤：检测待测样品的基因组DNA中是否含有权利要求1所述的引物组合中的引物对Ⅰ的靶序列、引物对Ⅱ的靶序列或引物对Ⅲ的靶序列；如果所述基因组DNA中含有引物对Ⅰ的靶序列、待测样品中含有蕲蛇，如果所述基因组DNA中含有引物对Ⅱ的靶序列、待测样品中含有乌梢蛇，如果所述基因组DNA中含有引物对Ⅲ的靶序列、待测样品中含有金钱白花蛇，如果所述基因组DNA中不含有引物对Ⅰ、引物对Ⅱ或引物对Ⅲ的靶序列、待测样品中不含有蕲蛇且不含有乌梢蛇且不含有金钱白花蛇；所述引物对Ⅰ由引物F1和引物F2组成；

所述引物对Ⅰ的靶序列为序列表的序列7所示的单链DNA分子；

所述引物对Ⅱ的靶序列为序列表的序列8所示的单链DNA分子；

所述引物对Ⅲ的靶序列为序列表的序列9所示的单链DNA分子；

所述引物F1为序列表的序列1所示的单链DNA分子；

所述引物F2为序列表的序列2所示的单链DNA分子；

所述引物对Ⅱ由引物F3和引物F4组成；

所述引物F3为序列表的序列3所示的单链DNA分子；

所述引物F4为序列表的序列4所示的单链DNA分子；

所述引物对Ⅲ由引物F5和引物F6组成；

所述引物F5为序列表的序列5所示的单链DNA分子；

所述引物F6为序列表的序列6所示的单链DNA分子。