KR101936721B1 - 당귀의 종 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용하여 당귀의 종을 판별하는 방법 - Google Patents
당귀의 종 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용하여 당귀의 종을 판별하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 명세서에는 당귀의 종 판별을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용하여 당귀의 종을 판별하는 방법이 개시된다. 본 발명의 일 측면에 따른 당귀의 종 판별용 프라이머 세트는, 당귀의 종에 따라 당귀의 종을 구별하는데 최적화된 프라이머를 포함하여, 정확하게 당귀의 종을 판별할 수 있고, 당귀 혼합물에 극소량의 일당귀 및/또는 중국당귀가 포함되어 있더라도, 참당귀 외의 종의 당귀가 혼입되어 있는지 여부를 정확히 판단할 수 있다.
Description
본 명세서에는 당귀의 종 판별을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용하여 당귀의 종을 판별하는 방법이 개시된다.
당귀는 국내에서 널리 사용되는 대표적인 한약재로서 신체허약, 관절통, 두통, 변비, 타박상 등 다양한 증상에 처방되고 있다. 당귀의 기원식물은 한국, 중국, 일본에서 자생하고 있으며 국내에서는 정선, 홍천, 제천, 봉화, 산청 및 함양 등에서 약용 식물로 재배되고 있다.
대한민국약전에 생약 당귀는 참당귀 Angelica gigas 의 뿌리로 정의되어 있고, 일당귀(왜당귀)는 대한민국약전외한약 규격집에 Angelica acutiloba 또는 Angelica acutiloba var. sugiyamae를 기원식물로 정하고 있으며, 중국당귀는 Angelica sinensis를 기원으로 정립하고 있다. 일반적으로 국산 당귀라고 지칭되는 것은 참당귀를 의미한다. 또한, 대한한의학학회지에 의하면, 중국당귀와 일당귀가 상대적으로 유사한반면, 참당귀는 활성성분, 특정 약리 효과에 대한 메커니즘에서 차이가 있다. 즉, 각 당귀들은 활성성분에서 차이를 나타내어, 그 용도와 효과가 상이하므로 객관적인 감별을 통한 유통, 품질 관리가 필수적이다. 전통적으로 한약재의 감별은 주로 외형, 색, 맛, 냄새 등의 특징을 통해 감별하는방법 및 구성성분을 분석하고 비교하는 이화학적 감별 등에 의존하여 왔다. 그러나 당귀는 그 생육 환경에 따라 형태 및 대사물질에서 차이를 보일 수 있으나, 건조된 절편 및 가루 형태 유통품의 경우에는 형태학적 분석이 거의 불가능하고, 성분분석의 경우 생산지의 재배환경에 따라 약재성분이 영향을 받을 수 있다는 한계가 있었다. 최근에는 종래의 이러한 문제점을 해결하기 위해, RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA), SCAR(Sequence Characterized Amplified Regions), AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism) 등 유전자를 이용한 방법들이 사용되고 있다. 특히, 대한민국 공개특허 제2015-0104315호에는 각 단일염기 다형성에 맞는 마커를 사용하여 당귀의 종류를 판별하는 방법이 개시되어 있지만, 이러한 방법은, 동일한 프라이머를 사용하여 정확도가 떨어질 뿐만 아니라, 분석 장비와 형광마커 제조에 드는 비용이 고가이고, 조작이 복잡하다는 한계가 있다. 따라서, 경제적이면서도 조작이 쉽고, 단시간을 들이고도 높은 정확도로 당귀의 종을 판별할 수 있는 방법이 필요한 실정이다.
일 측면에서, 본 발명의 목적은, 간단하고 경제적으로 당귀의 종을 판별하는 것이다.
일 측면에서, 본 발명의 목적은, 다양한 종의 당귀의 혼합여부를 정확하게 판정하는 것이다.
일 측면에서, 본 발명의 목적은 중국당귀(Angelica sinensis) 및/또는 일당귀(Angelica acutiloba)가 혼입되지 않은 순수한 참당귀(Angelica gigas) 원료를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열, 및 서열번호 서열번호 2의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열을 포함하는 제1 프라이머 세트; 서열번호 3의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열, 서열번호 4의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열을 포함하는 제2 프라이머 세트; 및 서열번호 5의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열, 서열번호 6의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열을 포함하는 제3 프라이머 세트 중 하나 이상을 포함하는, 당귀의 종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 당귀로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 DNA를 주형으로 하고, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 당귀의 종 판별용 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하는 단계; 상기 PCR의 증폭 산물을 전기영동하는 단계; 및 상기 전기영동된 증폭 산물의 크기를 측정하여 당귀의 종을 판별하는 단계를 포함하는, 당귀의 종 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 일 측면인 당귀의 종 판별용 프라이머 세트는, 당귀의 종에 따라 당귀의 종을 구별하는데 최적화된 프라이머를 포함하여, 정확하게 당귀의 종을 판별할 수 있고, 나아가 당귀의 혼합물에 극소량의 일당귀 및/또는 중국당귀가 포함되어 있더라도, 참당귀 외의 종의 당귀가 혼합되어 있는지 여부를 정확히 판단할 수 있다.
도 1은, 본 발명에 따른 종 특이 프라이머의 위치를 보여주는 도이다.
도 2는, 각 당귀의 다중 PCR 결과를 보이는 도이다.
도 3은, 각 당귀의 종에 따른 검출 한계 결과를 보이는 도이다.
도 2는, 각 당귀의 다중 PCR 결과를 보이는 도이다.
도 3은, 각 당귀의 종에 따른 검출 한계 결과를 보이는 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
일 측면에서, 본 발명은, 서열번호 1의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열, 및 서열번호 서열번호 2의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열을 포함하는 제1 프라이머 세트; 서열번호 3의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열, 서열번호 4의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열을 포함하는 제2 프라이머 세트; 및 서열번호 5의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열, 서열번호 6의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열을 포함하는 제3 프라이머 세트 중 하나 이상을 포함하는, 당귀의 종 판별용 프라이머 세트이다.
본 명세서에서 '프라이머 세트'는 예컨대, 포워드 프라이머(forward primer) 및 리버스 프라이머(reverse primer)로 구성될 수 있으며, 프라이머는 검출하고자 하는 유전자를 포함하는 유전자 시료의 증폭에 통상적으로 사용되는 일반적인 시발체를 의미한다.
본 명세서에서 '상보적인 서열(complementary sequence)'란, 특정 서열과 서로 염기쌍을 이루어 이중가닥 구조를 형성할 수 있는 염기배열을 의미한다.
일 구현예에서, 상기 당귀의 종 판별용 프라이머 세트는, 참당귀(Angelica gigas), 중국당귀(Angelica sinensis) 및 일당귀(Angelica acutiloba)를 판별하는 것을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 제1 프라이머 세트는 참당귀 판별용일 수 있고, 상기 제2 프라이머 세트는 중국당귀 판별용일 수 있으며, 상기 제3 프라이머 세트는 일당귀 판별용일 수 있다.
예컨대, 상기 프라이머 세트는 당귀의 종이 참당귀, 중국당귀 또는 일당귀인지 여부를 판단하는데 사용될 수 있고, 상기 상이한 종의 당귀가 2종 이상 혼합된 혼합물에서, 어떠한 종의 당귀가 혼합되어 있는지 여부를 확인하는 데에도 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 당귀의 종 판별용 프라이머 세트는, 서열번호 1의 서열 및 서열번호 2의 서열로 구성된 제1 프라이머 세트; 서열번호 3의 서열 및 서열번호 4의 서열로 구성된 제2 프라이머 세트; 및 서열번호 5의 서열 및 서열번호 6의 서열로 구성된 제3 프라이머 세트로 구성될 수 있다.
상기 서열번호 1 내지 6의 서열은 아래 표 1에 기재된 바와 같다.
| 프라이머 명칭 | 서열 | 유전자 | |
| 참당귀 (A. gigas) |
AG-F | TCTGTGGGCAATAC | ITS |
| AG-R | AATTGTACGTCCGT | ||
| 중국당귀 (A. sinensis) |
AS-F | CAGTACAGCTCCACG | ITS |
| AS-R | TGTCACGCATCATCT | ||
| 일당귀 (A. acutiloba) |
Aa-F5 | CCTTTATATACATAATATACATATACT | trnC-petN |
| Aa-R5 | TTTTATCTTTATATAAGTTTATATAAG |
일 구현예에서, 상기 제1 프라이머 세트 및 제2 프라이머 세트의 서열들은 각각 당귀의 ITS(Internal Transcribed Spacer) 영역으로부터 유래한 것일 수 있다.
본 명세서에서, 본 명세서에서, ITS 영역은, ITS 영역의 일부 또는 전부를 포함하고 rDNA(18S, 5.8S 및 28S)의 전부 또는 일부 서열을 포함하는 gDNA 상의 지역을 의미할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 제3 프라이머 세트의 각 서열은 당귀의 trnC - petN 스페이서에서 유래한 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 서열번호 1의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열, 상기 서열번호 3의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열 및 상기 서열번호 5의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열은, 정방향 프라이머이며, 상기 서열번호 2의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열, 상기 서열번호 4의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열 및 상기 서열번호 6의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열은, 역방향 프라이머일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 당귀의 종 판별용 키트이다.
일 측면에서, 본 발명은, 당귀로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 DNA를 주형으로 하고, 상기 당귀의 종 판별용 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하는 단계; 상기 PCR의 증폭 산물을 전기영동하는 단계; 및 상기 전기영동된 증폭 산물의 크기를 측정하여 당귀의 종을 판별하는 단계를 포함하는, 당귀의 종 판별 방법이다.
일 구현예에서, 상기 방법은, 하기의 검출 한계를 포함할 수 있다: 참당귀, 일당귀 및 중국당귀 중 하나 이상을 포함하는 혼합물에, 혼합물 총 중량을 기준으로, 5 중량%의 참당귀, 5 중량%의 일당귀, 및 2 중량%의 중국당귀.
본 명세서에서 검출 한계란, 특정 종의 당귀를 검출 또는 판별할 수 있는 최소 당귀의 양을 의미한다. 따라서, 본 발명의 당귀의 종 판별 방법은, 특정 혼합물에 혼합물의 총 중량을 기준으로, 5% 이상의 참당귀에 대해서 참당귀의 존재를 판별할 수 있고, 5%의 일당귀에 대해서 일당귀의 존재를 판별할 수 있으며, 2%의 중국당귀에 대해서 중국당귀의 존재를 판별할 수 있다.
상기와 같은 측면에서, 상기 방법의 당귀의 종을 판별하는 단계는, PCR의 증폭 산물의 크기가 225~235 bp(base pair)인 경우 참당귀, 48~58 bp인 경우 중국당귀, 165~175bp인 경우 일당귀로 판단하는 것을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 PCR의 증폭 산물의 크기가 229bp인 경우 참당귀, 53bp인 경우 중국당귀, 170bp인 경우 일당귀로 판단할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 PCR은, 하기 중 하나 이상의 조건을 포함할 수 있다:
90~100℃에서 3~7분 동안 초기 변성(initial denaturation); 90~100℃에서 25~35초간 변성(denaturation); 30~40℃에서 8~12초간 결합(annealing); 70~75℃에서 25~35초간 신장(extension); 및 70~75℃에서 3~7분간 최종신장(elongation).
상기 초기 변성은 바람직하게는, 93~97℃, 더욱 바람직하게는, 94~96℃에서 4~6분 수행될 수 있고, 1회 수행될 수 있다. 또한, 상기 변성은, 바람직하게는 93~98℃, 더욱 바람직하게는, 94~96℃에서 수행될 수 있고, 수행 시간은, 바람직하게는, 27~33초간, 더욱 바람직하게는, 29~31초일 수 있다. 또한, 상기 결합은, 바람직하게는, 33~38℃, 더욱 바람직하게는 34~36℃에서 수행될 수 있고, 수행 시간은 바람직하게는 9~11초일 수 있다. 또한, 상기 신장은, 바람직하게는 70~74℃, 더욱 바람직하게는 71~73℃에서 수행될 수 있고, 수행 시간은 바람직하게는27~33초, 더욱 바람직하게는 29~31초일 수 있다. 또한, 상기 최종신장은, 바람직하게는 70~74℃, 더욱 바람직하게는 71~73℃에서 수행될 수 있고, 수행 시간은 바람직하게는 4~6분일 수 있다. 상기 변성, 결합 및 신장은 바람직하게는 20~40회, 더욱 바람직하게는 28~32회 반복될 수 있고, 일 구현예에서 30회 반복될 수 있다. 또한, 일 구현예에서 상기 최종신장 후 3~5℃에서 PCR 산물이 보존될 수 있다. 상기 PCR 조건은, 참당귀, 중국당귀 및/또는 일당귀를 판별을 위한 검출 한계를 높이기 위하여 최적화된 것이며, 특히, 상기 결합 온도는 각각의 프라이머 염기서열 및 multiplex-PCR에 최적화된 것으로써, 상기 온도범위보다 낮은 온도에서 결합이 일어나면, 낮은 온도로 인해 비특이적 밴드가 발생하여, 당귀의 종 판별 정확도가 크게 떨어질 수 있다.
또한, 일 구현예에서, PCR에 사용된 반응액의 조성은 하기와 같을 수 있다.
| 성분 | 농도 |
| DNA polymerase | 0.8~1.2U |
| dNTPs | 230~270μM |
| 프라이머 | 참당귀/일당귀 : 각 1.8~2.2 μM 중국당귀: 각 0.8~1.2 μM |
| 주형 DNA | 48~52ng |
| 멸균 증류수 | 잔량 |
| 총 합 | 20㎕ |
일 구현예에서, 상기 PCR에 사용되는 용액의 조성은, 용액 총 20㎕ 당 DNA 폴리머라아제 1.0U, dNTPs 각 250μM, 참당귀 및 일당귀의 프라이머 각 2.0 μM, 중국당귀의 프라이머 각 1.0 μM, 주형 DNA 50ng, 및 잔량의 멸균 증류수를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 PCR은 다중 PCR(multiplex PCR)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 PCR 조건은, 다중 PCR을 통해 당귀의 종이 참당귀, 중국당귀 또는 일당귀인지 여부를 판별하는데 최적화된 것이다.
이하, 실시예 및 시험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1] 당귀 유전자의 추출 및 순도 확인
[실시예 1-1] 당귀 유전자의 추출
DNA는 DNeasy plant mini 키트(QIAGEN) 등을 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 아래와 같이 추출하였다:
a. 시료(약 0.1 g)에 AP1 완충액 400 ㎕ 및 RNase A (100 ㎎/㎖) 4㎕를 넣어 혼합 후 65℃에서 10분간 반응시켰다(반응 중 샘플을 2~3회 혼합).
b. 반응액에 AP2 완충액 130 ㎕를 넣고 혼합하여 얼음에 5분간 방치 후 원심분리(14,000 x g, 5분)하였다.
c. 상층액을 QIAshredder mini spin 컬럼에 옮긴 후 원심분리(14,000 x g, 2분)하였다.
d. AP3/E 완충액을 용출액 1.5배에 해당되게 혼합 후 DNeasy Mini spin 컬럼에 넣고 원심분리(8,000 x g, 1분) 하였다.
e. AW 완충액 500 ㎕로 DNeasy Mini spin 컬럼을 2회 세척하였다.
f. AE 완충액 100 ㎕를 컬럼에 넣고 5분간 방치 후 원심 분리하여 (8,000 x g, 1분) 최종 용출하였다.
[실시예 1-2] 당귀 유전자의 순도 확인
DNA 원액의 농도는 멸균증류수(또는 TE(Tris-EDTA) 완충용액, pH 8.0)로 적절히 희석한 후 분광광도계를 사용하여 260 nm에서 흡광도(Absorbance, A)를 측정하고, 그 값이 1일 때 DNA 농도가 50 ng/㎕인 것으로 하여 계산하였다. 한편, 추출된 DNA의 순도를 확인하기 위하여 230, 260, 280 nm에서 흡광도를 각각 측정하였다. A260/A280과 A260/A230이 1.7~2.0일 경우 PCR에 적합한 DNA로 판단하였다.
[실시예 2] 종 특이 프라이머의 설계
각각의 염기서열은 염기서열 비교프로그램(BioEdit Sequence Alignment Editor)을 이용하여 종간 상이한 염기서열 부위를 선택하였고, Primer-Blast(NCBI)에서 Tm 값 및 self-complementarity 여부 등과 다른 종의 유전자와의 결합유무를 확인한 후 결과를 토대로 프라이머를 제작하였다. 본 발명에서 개발한 종 특이 프라이머 위치는 도 1과 같고, 그 정보는 상기 표 1과 같다.
[실시예 3] 다중 PCR을 통한 유전자 증폭 및 결과 확인
[실시예 3-1] PCR 수행
AccuPower Gold Multiplex PCR Premix (BIONEER, Korea)을 사용하여 PCR을 수행하였으며, 유전자 증폭 반응액 조성(표3)과 최적화된 반응조건(표4)은 아래와 같다.
| 성분 | 농도 |
| DNA polymerase | 1.0U |
| dNTPs | 250μM |
| 프라이머 | 참당귀/일당귀 : 각 2.0 μM 중국당귀: 각 1 μM |
| 주형 DNA | 50ng |
| 멸균 증류수 | 잔량 |
| 총 합 | 20㎕ |
| 구분 | 온도 | 시간 | 반복 수 |
| 초기변성(Initial denaturation) | 95℃ | 5분 | 1회 |
| 변성(denaturation) 결합(annealing) 신장(extension) |
95℃ 35℃ 72℃ |
30초 10초 30초 |
30회 |
| 최종신장(elongation) | 72℃ | 5분 | 1회 |
| 보존 | 4℃ | - | - |
[실시예 3-2] PCR 결과 확인
유전자 증폭(PCR) 후에 결과 확인은 전기영동(아가로스 또는 폴리아크릴아마이드 젤)을 통하여 확인 할 수 있으며, 본 발명에서는 최종 농도 1.5~2%의 아가로스를 칭량하여 전기영동 TAE (Tris-acetate/EDTA) 완충액을 넣고 가열함으로서 아가로스를 녹여 사용하였다.
전기영동의 경우 PCR 증폭산물에 염색액(gel loading buffer)을 혼합 후 겔의 각 홈에 시료를 넣으며, 양끝의 각 홈에는 PCR 증폭 산물의 크기를 식별하기에 적당한 표식 DNA (Marker DNA)을 넣고, 전압 100 V로 25~30분 진행 후 전기영동을 멈추고 화상분석기 등을 이용하여 전기영동 결과를 확인하였다.
본 발명에서 개발한 당귀속(Angelica sp.：참당귀, 중국당귀, 일당귀)의 혼합 종 특이 프라이머를 이용하여 다중유전자 증폭(Multiplex-PCR)을 시행한 결과, 참당귀에서 특이적으로 229bp, 중국당귀에서 53bp, 일당귀에서 170bp 크기의 증폭 산물을 확인 할 수 있었다. 그리고 참당귀, 중국당귀 및 일당귀의 유전자가 혼합된 시료의 경우 각각의 크기에 맞는 3개의 증폭산물을 확인할 수 있었다(도 2).
[실시예 4] 검출 한계 확인
참당귀, 중국당귀 또는 일당귀의 혼합물에서의 각 당귀의 검출 한계를 확인하기 위하여, 혼합 종 특이 프라이머를 이용하여 Multiplex-PCR 을 진행하였다.
본 실험에서는 참당귀 표준시료에 중국당귀 및 일당귀 표준시료를 건조원물 수준에서 질량 대비 1%, 2%, 5%, 10%, 25%로 혼합하여 유전자를 추출하여 시료로 사용하였다.
참당귀, 중국당귀 그리고 일당귀의 혼합 종 특이 프라이머를 이용하여 유전자 증폭을 한 결과 도 3에서 볼 수 있듯이, 전체 함량 대비 참당귀는 5%, 중국당귀는 2%, 일당귀는 5%까지 혼합된 경우에 각 당귀의 존재여부를 확인 할 수 있었다.
<110> KOLMAR KOREA
<120> PRIMER FOR DETERMINING SPECIES OF ANGELICA AND METHOD FOR
DETERMINIG SPECIES OF ANGELICA USING THE SAME
<130> PF160282
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for A.gigas(Forward)
<400> 1
tctgtgggca atac 14
<210> 2
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for A.gigas(Reverse)
<400> 2
aattgtacgt ccgt 14
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for A.sinensis(Forward)
<400> 3
cagtacagct ccacg 15
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for A.sinensis(Reverse)
<400> 4
tgtcacgcat catct 15
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for A.acutiloba(Forward)
<400> 5
cctttatata cataatatac atatact 27
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for A.acutiloba(Reverse)
<400> 6
ttttatcttt atataagttt atataag 27
Claims (14)
- 서열번호 1의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열, 및 서열번호 서열번호 2의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열을 포함하는 제1 프라이머 세트;
서열번호 3의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열, 서열번호 4의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열을 포함하는 제2 프라이머 세트; 및
서열번호 5의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열, 서열번호 6의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열을 포함하는 제3 프라이머 세트를 포함하고,
상기 프라이머 세트는,
참당귀(Angelica gigas), 중국당귀(Angelica sinensis) 및 일당귀(Angelica acutiloba)를 판별하는 것을 포함하는, 당귀의 종 판별용 프라이머 세트. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 제1 프라이머 세트는, 참당귀 판별용인, 당귀의 종 판별용 프라이머 세트. - 제1항에 있어서,
상기 제2 프라이머 세트는, 중국당귀 판별용인, 당귀의 종 판별용 프라이머 세트. - 제1항에 있어서,
상기 제3 프라이머 세트는, 일당귀 판별용인, 당귀의 종 판별용 프라이머 세트. - 제1항에 있어서,
상기 제1프라이머 세트 및 제2 프라이머 세트의 서열은, 당귀의 ITS 영역에서 유래한 것이고,
상기 제3 프라이머 세트의 서열은, 당귀의 trnC - petN 스페이서에서 유래한 것인, 당귀의 종 판별용 프라이머 세트. - 제1항에 있어서,
상기 서열번호 1의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열, 상기 서열번호 3의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열 및 상기 서열번호 5의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열은, 정방향 프라이머이며,
상기 서열번호 2의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열, 상기 서열번호 4의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열 및 상기 서열번호 6의 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열은, 역방향 프라이머인, 당귀의 종 판별용 프라이머 세트. - 제1항, 및 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는, 당귀의 종 판별용 키트.
- 당귀의 종 판별 방법으로서,
상기 방법은, 당귀로부터 DNA를 추출하는 단계;
상기 추출된 DNA를 주형으로 하고, 제1항, 및 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 당귀의 종 판별용 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하는 단계;
상기 PCR의 증폭 산물을 전기영동하는 단계; 및
상기 전기영동된 증폭 산물의 크기를 측정하여 당귀의 종을 판별하는 단계를 포함하는, 당귀의 종 판별 방법. - 제9항에 있어서,
상기 방법은, 하기의 검출 한계를 포함하는, 당귀의 종 판별 방법:
참당귀, 일당귀 및 중국당귀 중 하나 이상을 포함하는 혼합물에, 혼합물 총 중량을 기준으로,
5 중량%의 참당귀, 5 중량%의 일당귀, 및 2 중량%의 중국당귀. - 제9항에 있어서,
상기 당귀의 종을 판별하는 단계는,
PCR의 증폭 산물의 크기가 225~235 bp인 경우 참당귀, 48~58 bp인 경우 중국당귀, 165~175bp인 경우 일당귀로 판단하는 것을 포함하는, 당귀의 종 판별 방법. - 제11항에 있어서,
상기 당귀의 종을 판별하는 단계는,
PCR의 증폭 산물의 크기가 229bp인 경우 참당귀, 53bp인 경우 중국당귀, 170bp인 경우 일당귀로 판단하는 것을 포함하는, 당귀의 종 판별 방법. - 제9항에 있어서,
상기 PCR은 하기 중 하나 이상의 조건을 포함하는, 당귀의 종 판별 방법:
90~100℃에서 3~7분 동안 초기 변성(initial denaturation);
90~100℃에서 25~35초간 변성(denaturation);
30~40℃에서 8~12초간 결합(annealing);
70~75℃에서 25~35초간 신장(extension); 및
70~75℃에서 3~7분간 최종신장(elongation). - 제9항에 있어서,
상기 PCR은 다중 PCR(multiplex PCR)을 포함하는, 당귀의 종 판별 방법.
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