KR101811539B1 - InDel 마커를 이용한 당귀 품종의 감별방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 당귀의 품종을 감별하는데 사용될 수 있는 InDel 마커를 증폭하기 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 당귀 품종의 감별방법에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머 세트 및 이를 이용한 감별 방법은 국내산 참당귀(Angelica gigas)를 일당귀(Angelica acutiloba) 및 중국당귀(Angelica sinensis)로부터 감별하는데 효과적으로 사용될 수 있으므로 국내에서 유통되는 당귀의 원산지를 식별하는데 유용하게 활용될 수 있다.

Description

InDel 마커를 이용한 당귀 품종의 감별방법{Method for discrimination of Angelica gigas using InDel marker}
본 발명은 당귀의 품종을 감별하는데 사용될 수 있는 InDel 마커를 증폭하기 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 당귀 품종의 감별방법에 관한 것이다.
당귀는 decursin, decursinol angelate, nodakenin, β-sitoster, polyacetylene계, Phthalide계, cumarin계, Adenosine, ligustilide, butylphthalide 등의 성분을 갖고 있으며, 자궁기능조절, 면역기능 활성화, 항염, 진통, 항균, 혈액순환개선, 항산화, 면역조정, 항종양 및 조혈 작용 증진, 생리불순, 무월경 등 여성혈관계 질환에 효능이 뛰어나며 대장의 건강에도 효능이 있다.
한약재로 사용되는 당귀는 한국에서는 “대한민국약전”에 등재된 참당귀(Angelica gigas)를 기원으로 하고, 일본에서는 왜당귀 또는 일당귀(Angelica acutiloba)를, 중국에서는 중국당귀(Angelica sinensis)를 기원으로 하며, 이들은 유사한 효능을 나타낸다. 그러나 최근 일당귀, 중국당귀 및 참당귀가 혼용된 당귀 재료가 국내 한약재 시장에 유통됨으로 인해 당귀의 원료 및 출처 식별에 어려움을 겪고 있다.
한편, 분자생물학 분야의 급진적인 발전과 더불어 식물의 속, 종간 또는 종내 품종간 분류에 분자생물학적인 방법들이 다양하게 사용되고 있으며, 이를 위하여 핵산(DNA) 수준에서 유전자원의 다양성(genetic diversity) 연구를 가능케 하는 핵산 지문 분석 방법 및 다양한 DNA 마커들이 개발되고 있다. 분자생물학 수준에서의 DNA 분석에 의한 변종의 감별은 그 변종의 양적 수준과 더불어 다수의 특성을 파악할 수 있으며 환경의 영향을 배제할 수 있는 장점이 있다. 그 중에서 RFLP(제한효소 단편 장다형, Restriction Fragment Length Polymorphism)는 일련의 DNA 사슬을 제한효소로 처리했을 때 생기는 DNA 단편들이 개체간의 유전적 조성의 차이, 즉 염기 서열상의 차이에 따라서 그 수나 길이가 서로 다르게 나타난다는 사실에 기초한 것으로써 다양하게 이용되고 있다. 하지만, RFLP는 순도가 높은 DNA가 다량으로 필요하며 시간과 노력과 비용이 많이 소요될 뿐 아니라 시험과정이 복잡하고 방사성 동위원소를 이용해야 하는 단점이 있다.
InDel (insertion/deletion) 마커는 생물의 DNA의 염기배열에서 일부 염기가 중간에 삽입되거나(insertion) 결실된(deletion) 변이를 총칭하는 용어로, 서로 다른 종 또는 품종간에 유전체 정보를 비교하여 염기가 삽입(insertion) 또는 결실(deletion)된 영역을 찾고, 그 정보를 바탕으로 프라이머를 제작한 뒤 PCR 기술을 이용하여 DNA를 증폭시키고 그 패턴을 분석함으로써 특정 품종을 식별할 수 있다.
한국등록특허 제10-1493978호
본 발명의 목적은 당귀의 품종을 감별해 낼 수 있는 InDel 마커의 증폭을 위한 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용한 당귀 품종 감별용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 당귀 품종을 감별하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 당귀 품종 감별용 InDel 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프라이머 세트는, 참당귀(Angelica gigas)를 일당귀(Angelica acutiloba) 및/또는 중국당귀(Angelica sinensis)로부터 감별하기 위한 용도로 사용될 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 당귀 감별용 InDel 프라이머 세트를 포함하는 당귀 품종 감별용 조성물을 제공한다.
다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 당귀 감별용 InDel 프라이머 세트를 포함하는 당귀 품종 감별용 키트를 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 당귀 감별용 InDel 프라이머 세트를 이용하여 당귀로부터 얻은 DNA 시료에 대해 PCR을 수행하는 단계를 포함하는, 당귀 품종의 감별 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 감별 방법은 상기 PCR을 통해 수득한 PCR 산물의 전기영동 패턴을 분석하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 감별 방법은, 참당귀(Angelica gigas)를 일당귀(Angelica acutiloba) 및 중국당귀(Angelica sinensis)로부터 감별하는 방법이다.
본 발명의 프라이머 세트 및 이를 이용한 당귀의 감별 방법은 국내산 참당귀(Angelica gigas)를 일당귀(Angelica acutiloba) 및 중국당귀(Angelica sinensis)로부터 감별하는데 효과적으로 사용될 수 있으므로 국내에서 유통되는 당귀의 원산지를 식별하는데 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 서열번호 1 및 2로 이루어진 본 발명의 프라이머 세트(AG InDel 1 프라이머 세트)를 이용하여 당귀를 감별한 결과를 나타낸 전기영동 이미지이다.
도 2는 서열번호 3 및 4로 이루어진 본 발명의 프라이머 세트(AG InDel 2 프라이머 세트)를 이용하여 당귀를 감별한 결과를 나타낸 전기영동 이미지이다.
제 1 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 당귀 감별용 InDel 프라이머 세트를 제공할 수 있다.
상기 당귀는 한국, 일본, 중국에서 주로 약제로 사용되는데, 원산지에 따라 그 품종이 상이하다. 즉, 중국산 당귀(중국당귀) 품종은 안젤리카 시넨시스(Angelica sinensis), 일본산 당귀(왜당귀 또는 일당귀) 품종은 안젤리카 아큐틸로바(A. acutiloba), 한국산 당귀(참당귀) 품종은 안젤리카 기가스(A. gigas)로 알려져 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트 및/또는 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트는 참당귀, 일당귀 및 중국당귀로 이루어진 군에서 참당귀를 감별하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 ‘프라이머'는 그 서열과 상보적인 염기서열을 갖는 주형과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 본 발명의 프라이머 세트는 InDel 마커의 증폭을 위하여 각각 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머로 구성되어 있다.
제 2 양태로서, 본 발명은 상기 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 당귀 감별용 조성물을 제공할 수 있다.
제 3 양태로서, 본 발명은 상기 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 당귀 감별용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 당귀 감별용 키트는 상기 프라이머 세트 외에도 PCR 반응에 필요한 반응완충용액, 중합효소, dNTP를 더 포함할 수 있으며, 그 외에도 안정화제 및 모든 생물학적 또는 화학적 시약, 사용설명서 등을 포함할 수 있다. 이러한 키트의 다른 구성은 당업자에 의하여 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물 또는 키트는 참당귀, 일당귀 및 중국당귀로 이루어진 군에서 참당귀를 감별하는데 사용될 수 있다.
제 4 양태로서, 본 발명은 상기 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여, 감별하고자 하는 대상 당귀로부터 얻은 DNA 시료에 대해 PCR을 수행하는 단계를 포함하는, 당귀 품종의 감별 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 감별 방법은 PCR을 통해 수득한 PCR 산물의 전기영동 패턴을 분석하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 PCR은 당업계에 알려진 통상적인 방법에 따라 수행될 수 있다. 예컨대 상기 PCR은 90 내지 100℃에서 1분 내지 5분간 preheating을 거친 후, 90 내지 100℃에서 1분 내지 5분(denaturation), 45 내지 60℃에서 10초 내지 50초(annealing), 72℃에서 30초 내지 2분(extension)간의 반응을 30 내지 40회 실시하고, 최종 extension 과정으로 72℃에서 1 내지 10분간 하는 과정을 30 내지 40 cycle 반복하여 반응시키는 과정을 통해 이루어질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 PCR 수행을 통해 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 하나의 구체적 예로서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사선을 발하는 물질일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 표지 물질은 에티디움브로마이드(Ethidium Bromide: EtBr), Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭 시 프라이머의 5′-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사선 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCT 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사선이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사선으로 표지될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 증폭된 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사선 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5′-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사선 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사선 측정기구, 예를 들면, 가이어 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사선을 측정할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 감별 방법은 참당귀, 일당귀 및 중국당귀로 이루어진 군에서 참당귀를 감별하는데 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본원발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본원발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본원발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 참당귀, 일당귀 및 중국당귀로부터의 DNA 추출
참당귀(Angelica gigas), 일당귀(Angelica acutiloba) 및 중국당귀(Angelica sinensis)를 각각 5개체씩 준비하였다. 일당귀 및 중국당귀의 경우 국내 온라인 쇼핑몰(다농, 아람씨앗, 성우종묘, 아시아종묘, 민속씨앗, 세계종묘에서 구매하여 유식물을 키워 무작위로 5개체를 선택하여 DNA를 추출하여 실험에 사용하였음)에 거래되는 종묘회사의 종자를 구입하여 파종 후 유식물을 사용하였으며, 참당귀 5개체는 충북대학교 약초실습 포장의 5개체에서 잎을 채취하여 발명의 시료(재료)로 이용하였다.
상기 준비된 참당귀, 일당귀 및 중국당귀 샘플을 액체질소를 이용하여 얼린 뒤 막자사발로 분쇄하여 1g을 준비한 후 CTAB 방법을 이용하여 추출하였고, TE 버퍼에 용출시켜 각각의 DNA를 5 ng으로 정량하였다. 보다 구체적으로, CTAB 과정으로는 마이크로 튜브에 분쇄하여 준비한 참당귀, 일당귀 및 중국당귀 각각의 파우더 샘플 1g과 0.2% 2-머캅토에탄올(Mercaptoethanol)이 첨가된 CTAB 용액 700㎕를 넣고 혼합한 뒤 항온수조 65℃에서 30분간 배양하였다. 배양 후 클로로폼(chloroform)과 이소-아밀알콜(iso-amylalchol)을 24:1 비율로 700㎕를 첨가하여 10분간 12000rpm으로 16℃에서 원심분리하고 상등액을 수득하였다. 수득한 상등액은 이소프로파놀(isopropanol)을 1:1 비율로 동일하게 첨가한 후 inverting하여 DNA 확인 후 5분간 12000rpm으로 4℃에서 원심분리하여 생성된 펠렛에 70% 에탄올 200㎕를 넣어준 뒤, 12000rpm, 4℃, 5분의 조건으로 원심분리하고 상온에서 10분 방치하여 에탄올을 휘발시킨 후 1X TE buffer 200㎕ 첨가하여 녹인 후 RNase(10mg/ml)를 1㎕, 37℃, 30분 처리하여 DNA 농도를 확인하였다.
실시예 2. PCR을 이용한 DNA 증폭 및 당귀 품종의 감별
상기 실시예 1에서 CTAB 방법을 이용하여 추출한 참당귀, 일당귀 및 중국당귀의 DNA를 10 pmol로 희석하여 DNA 10ng, 및 하기 표 1에 정리된 서열번호 1 내지 4의 InDel 프라이머 세트 10 ng을 넣어 20 ㎕의 PCR 반응 혼합물을 만들었다.
본 발명의 프라이머 세트
프라이머 명칭 서열 (5’→3’) 프라이머 명칭 서열 (5’→3’)
AG InDel 1F
(서열번호 1)		 CCCTTTTTTGTTTCCCTCT AG InDel 1R
(서열번호 2)		 CTATGGTCACTTCTTCGTAT
AG InDel 2F
(서열번호 3) 		GATGCCGCTAATGCTTTTT AG InDel 2R
(서열번호 4)		 ACTTCGTGTCGATCAATCT
PCR은 preheating 95℃ 180초, denaturation 95℃ 60초, annealing 51℃ 30초, extension 72℃ 60초, post extension 72℃ 300초, 35 cycle을 반복하여 수행하였다.
증폭된 DNA 단편을 확인하기 위해 4.0% 아가로스젤에 10㎕씩 로딩하여 전기영동을 실시하고, Molecular imagerⓡ Gel DocTM XR+ imaging system (Bio-Rad, USA)을 이용하여 참당귀, 일당귀 및 중국당귀의 특이 밴드를 확인하고, 그 결과를 도 1 및 2에 나타내었다.
도 1 및 2에 나타난 바와 같이, AG InDel 1 프라이머 세트 (서열번호 1 및 2) 또는 AG InDel 2 프라이머 세트(서열번호 3 및 4)를 사용하여, 참당귀, 일본당귀 및 중국당귀 중에서 참당귀인 시료를 구분할 수 있음을 확인하였다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다. 본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Method for discrimination of Angelica gigas using InDel marker <130> PN1608-305 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AG InDel 1F <400> 1 cccttttttg tttccctct 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AG InDel 1R <400> 2 ctatggtcac ttcttcgtat 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AG InDel 2F <400> 3 gatgccgcta atgcttttt 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AG InDel 2R <400> 4 acttcgtgtc gatcaatct 19

Claims (8)

  1. 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 당귀 품종 감별용 InDel 프라이머 세트로서,
    상기 감별은, 중국당귀(Angelica sinensis)로부터 참당귀(Angelica gigas)를 구별하는 것인, 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 당귀 품종 감별용 조성물.
  4. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 당귀 품종 감별용 키트.
  5. 삭제
  6. 제1항의 프라이머를 이용하여 중국당귀(Angelica sinensis) 및 참당귀(Angelica gigas)로부터 얻은 각각의 DNA 시료에 대해 PCR을 수행하는 단계를 포함하는, 중국당귀(Angelica sinensis) 및 참당귀(Angelica gigas) 사이의 품종 감별 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 방법은 PCR 산물의 전기영동 패턴을 분석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 삭제
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