CN104531868A - 一种用于鉴定西洋参的引物对及其应用 - Google Patents

一种用于鉴定西洋参的引物对及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴定西洋参的引物对及其应用。本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定西洋参的引物对，具体为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对。实验证明，采用本发明所提供的引物，通过快速PCR方法及荧光染色的方法实现了西洋参与人参、三七、竹节参、珠子参、羽叶三七的快速、准确鉴别，并引入了荧光染料法对真伪鉴别结果进行检测，为实现药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑。

Description

一种用于鉴定西洋参的引物对及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种用于鉴定西洋参的引物对及其应用。
背景技术
人参属植物药材的鉴定方法主要有形态鉴定、理化鉴定、细胞鉴定等，这些传统的鉴定手段由于易受环境条件的影响或植物本身的限制，人为干扰因素较多，无法直接体现种质的遗传特征，有时难以得到准确的结果(周延清.DNA分子标记技术在植物研究中的应用.北京:化学工业出版社,2005.)。
DNA分子标记技术是近二十年来兴起并不断发展和完善的新检测技术。近年来，DNA分子标记技术在人参属植物的许多研究中均有应用，如中药鉴定、遗传多样性与种质资源、物种进化与亲缘关系、野生类型与栽培品种的鉴别、道地性等。而就DNA分子标记技术在人参属植物鉴定中的应用而言，DNA分子标记则是从分子水平上客观地反映待测材料基因片段之间的差异，鉴别结果不受环境因素、样品形态和材料来源的影响，一般通过杂交或电泳等方式就能直观地体现出来，结果更为准确可靠。因此，中药鉴定也就成为DNA分子标记在人参属植物中应用最早且最多的领域。在DNA分子标记技术中应用最多的是随机扩增多态性(RAPD)技术。Shaw和But于1995年首先采用RAPD方法明显地区分开人参属的3种药材人参、西洋参、三七和桔梗、紫茉莉、栌兰Talinum paniculatum及商陆Phytolacca Acinosa 4种伪品(Shaw PC,But PP.Authentication of Panax species and their adulterants by random-primed polymerase chainreaction.Planta Med,1995,61(5):466.)。Kim等的研究表明RAPD标记可以方便有效地将韩国人参和其他人参属植物鉴别开(Kim HJ,Lim CJ,Cho JH,et al.Moleculardifferentiation of panax species by RAPD analysis.Arch Pharm Res,2003,26(8):601.)。除RAPD技术外，随机引物PCR(AP-PCR)、聚合酶链式反应(PCR)直接测序、rRNA和特征性片断扩增区域(SCAR)等技术也被应用在人参属植物药材的鉴定中。1994年，Cheung等首次将AP-PCR技术应用在人参与西洋参的药材鉴别中(Cheung KS,Kwan HS,But PP,el a1.Pharmacognostical identification of American and Oriental ginsengroots by genomic fingerprinting using arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR).Journal of Ethnopharmacology,1994,42(1):67.)。崔光红等利用多重等位基因特异PCR鉴别人参与西洋参(崔光红,唐晓晶,黄璐琦.利用多重等位基因特异PCR鉴别人参、西洋参，中国中药杂志，2006,31(23):1940)。詹鑫婕等依据人参和西洋参ITS2条形码的专属性鉴别位点，建立利用聚合酶链反应-单链构象多态性技术(PCR-SSCP)鉴别人参和西洋参的方法(詹鑫婕，田程，张媛，等.基于ITS2条形码SNPs的人参和西洋参PCR-SSCP分子鉴别研究，中国中药杂志，2012,37(24):3748)。
综上所述，不同研究学者分别采用RAPD法、AP-PCR法、PCR-SSCP法、多重PCR法等DNA分子标记技术对人参与人参属中其它药材进行鉴定研究，但这些方法测试时间较长，且均需要电泳检测才可完成，因此相比较荧光染色方法繁琐，不利于现场快速鉴别的应用与推广。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定西洋参的引物对。
本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定西洋参的引物对，具体为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对。
所述引物对中，两条单链DNA分子既可以分别单独包装，也可以按照摩尔比为1:1的比例混合后包装在一起。
本发明的第二个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定西洋参的试剂盒。
本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定西洋参的试剂盒，具体可含有所述引物对、dNTP和DNA聚合酶。
根据需要，所述试剂盒中还可含有荧光染料SYBR Green I。
制备所述引物对的方法也属于本发明的保护范围。
制备所述引物对的方法，具体可包括将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装的步骤。
制备所述试剂盒的方法也属于本发明的保护范围。
制备所述试剂盒的方法，具体可包括如下A)或B)的步骤：
A)将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装后，与分别单独包装的dNTP和DNA聚合酶包装于同一个试剂盒内：
B)将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装后，与分别单独包装的dNTP、DNA聚合酶和SYBR Green I包装于同一个试剂盒内。
所述引物对，或所述试剂盒，在鉴定或辅助鉴定西洋参中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的第三个目的是提供一种利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定待测样品中是否含有西洋参的方法。
本发明所提供的利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定待测样品中是否含有西洋参的方法，具体可包括如下步骤：
(a)从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用所述引物对(序列1和序列2)进行PCR扩增；
(b)为如下(b1)或(b2)：
(b1)根据步骤(a)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定待测样品中是否含有西洋参：若PCR产物中含有大小为100-500bp(如240-260bp)的DNA片段，则所述待测样品中含有或候选含有西洋参；若PCR产物中不含有大小为100-500bp(如240-260bp)的DNA片段，则所述待测样品中不含有或候选不含有西洋参；
所述100-500bp(如240-260bp)的DNA片段具体为大小约为250bp的DNA片段(在琼脂糖凝胶电泳图谱上与DNA分子量标准位于250bp处的条带处于同一水平线上)。
(b2)向步骤(a)扩增后的反应体系中加入荧光染料SYBR Green I，得到含有荧光染料的体系，按照如下方法确定待测样品中是否含有西洋参：若观察到所述含有荧光染料的体系产生绿色荧光，则所述待测样品中含有或候选含有西洋参；若观察不到所述含有荧光染料的体系产生绿色荧光，则所述待测样品不含有或候选不含有西洋参。
在所述方法的步骤(a)中，进行所述PCR扩增时采用的退火温度可为59℃。
在本发明中，进行所述PCR扩增时采用的具体反应条件如下：90℃1min；90℃15s、59℃20s，29个循环。
在所述方法的步骤(a)中，在进行所述PCR扩增的反应体系中，所述引物对中每条单链DNA分子的终浓度均为125nM。
在本发明中，进行所述PCR扩增时采用的具体反应体系如下：2.0μL 10×buffer缓冲液，1.6μL浓度为2.5mM的dNTP，0.5μL浓度为5μM的序列1所示的引物F1，0.5μL浓度为5μM的序列2所示的引物F2，0.2μL rTaq DNA聚合酶(Takara公司，5U/μL)，0.5μL模板DNA，无菌双蒸水补足至20μL。
在实际应用中，判断所述PCR产物中是否含有大小为100-500bp(如240-260bp)的DNA片段，可通过将所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳进行检测，若电泳结果显示有大小为100-500bp(如240-260bp)目的条带，则所述PCR产物中含有大小为100-500bp(如240-260bp)的DNA片段；反之，则不含有大小为100-500bp(如240-260bp)的DNA片段。当然也通过测序的方法判定所述PCR产物中是否含有大小为100-500bp(如240-260bp)的DNA片段。
在所述方法的步骤(b2)中，向所述反应体系中加入荧光染料SYBR Green I时，所述荧光染料SYBR Green I的加入量为：每20μL所述反应体系中加入1μL 100×SYBR Green I(Invitrogen公司，其产品目录号为1135054)。
在所述方法的步骤(b2)中，确定所述含有荧光染料的体系是否产生绿色荧光具体是在365nm紫外波长下进行检测的。
在上述方法中，所述西洋参可为基原植物，也可为药材西洋参。相应的，所述待测样品可为植株，也可为单一或混合的中药材成品。
实验证明，采用本发明所提供的引物，通过快速PCR方法及荧光染色的方法实现了西洋参与人参、三七、竹节参、珠子参、羽叶三七的快速、准确鉴别，并引入了荧光染料法对真伪鉴别结果进行检测，为实现药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑。
附图说明
图1为西洋参与人参、三七、竹节参、珠子参、羽叶三七PCR鉴别结果。其中，泳道1为阴性对照；泳道2、3为西洋参(河北石家庄)；泳道4-6为西洋参(吉林长春)；泳道7-9为西洋参(北京怀柔)；泳道10为人参(吉林省白山市)；泳道11为三七(云南文山州)；泳道12为竹节参(湖北省宣恩县)；泳道13为珠子参(湖北省恩施市)；泳道14为羽叶三七(云南昭通市)；泳道M为DNA分子量标准：从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用材料如表1所示：
表1样品来源表
编号 样品名称 来源(个数)
1 西洋参(Panax quinquefolium) 河北石家庄(2)；吉林长春(3)；北京怀柔(3)
2 人参(Panax ginseng) 吉林集安市(6)；吉林省白山市(6)
3 三七(Panax notoginseng) 云南文山州(2)
4 竹节参(Panax japonicus) 湖北省宣恩县(2)
5 珠子参(Panax japonicus C.A.Mey.var.major) 湖北省恩施市(2)
6 羽叶三七(Panax japonicus C.A.Mey.var.bipinnatifidus) 云南昭通市(2)
表中各样品均符合中国药典(2010年版)一部正文各药材项下的有关规定。通过鉴定，各味药材实物与名称相符，质量符合标准。
实施例1、用于鉴定西洋参的试剂盒的制备及使用方法
一、用于鉴定西洋参的引物对的设计与合成
本实施例选择通用引物matK(3F：5’-CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG-3’1R：5’-ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC-3’)对西洋参与人参、三七、竹节参、珠子参、羽叶三七样品进行扩增，测序，然后对所得序列进行同源比对，根据其变异区设计一对特异引物F1、F2，作为用于鉴定西洋参的特异性引物对。序列为下：
引物F1：5’-GGAAAATGCGGGTTATGACAGA-3’(序列1)；
引物F2：5’-TTATGAGATTTGACTATCCCTTTGCTT-3’(序列2)。
二、用于鉴定西洋参的试剂盒的组装
将步骤一设计合成的引物F1和F2分别单独包装后，与分别单独包装的dNTP、DNA聚合酶、10×buffer缓冲液、荧光染料SYBR Green I等包装于同一个试剂盒内，即得到本发明用于鉴定西洋参的试剂盒。
三、鉴定待测样品中是否含有西洋参的方法
采用步骤二的试剂盒按照包括如下步骤的方法鉴定待测样品中是否含有西洋参：
1、PCR扩增
从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用步骤一设计合成的引物F1和F2(序列1和序列2)按照如下进行PCR扩增：
PCR反应在200μL PCR反应管中进行，反应总体积20μL，包括以下试剂：2.0μL10×buffer缓冲液(Takara公司，其产品目录号为A1101E)，1.6μL浓度为2.5mM的dNTP，0.5μL浓度为5μM的引物F1，0.5μL浓度为5μM的引物F2，0.2μL rTaq DNA聚合酶(Takara公司，Extaq 5U/μL)，0.5μL模板DNA，14.7μL无菌双蒸水。
PCR反应液配制完后，轻轻震荡混匀，将PCR管放入PCR仪中，采用两步法进行PCR扩增，具体进行如下反应：预变性温度90℃，时间1min；变性温度90℃，时间15s，退火温度59℃，时间20s，29个循环；4℃保存，获得扩增产物。
2、PCR产物检测
可以采用两种方法检测PCR产物：
(1)琼脂糖凝胶电泳法
取3μL扩增产物，采用1％的琼脂糖凝胶，在电压100-150V下电泳15分钟，凝胶成像系统下观察并拍照。根据目的条带的大小，按照如下方法确定待测样品中是否含有西洋参：若获得大小约为250bp的目的条带，则所述待测样品中含有西洋参；若没有获得大小约为250bp的目的条带，则所述待测样品中不含有西洋参。
(2)荧光染色法
在PCR扩增产物(20μL)中加入1μL 100×SYBR Green I(Invitrogen公司，其产品目录号为1135054)于365nm紫外波长下检测荧光，按照如下方法确定待测样品中是否含有西洋参：若观察到所述反应体系产生绿色荧光，则所述待测样品中含有西洋参；若观察不到所述反应体系产生绿色荧光，则所述待测样品不含有西洋参。
实施例2、采用实施例1制备的试剂盒鉴定西洋参
待测样品：表1中所示的6种中药材样品，西洋参与人参、三七、竹节参、珠子参、羽叶三七。
一、从待测样品中提取基因组DNA
选取无霉变的干燥药材约0.03g，置于粉碎机中研磨粉碎，过40目筛。将粉末转移到2.0mL的微量离心管中，加入900μL已灭菌的CTAB提取液(配方：2％(2g/100ml)CTAB，100mmol/L Tris-HCl pH＝8.0，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl)、0.02g PVP 40000、10μLβ-巯基乙醇充分振荡混匀，65℃水浴1.5h-2h，期间轻摇2-3次。结束后取出冷却至室温，加入900μL氯仿-异戊醇(体积比24：1)，充分振荡混匀，12000g离心10min。取上清，加入等体积氯仿-异戊醇(体积比24：1)，充分振荡混匀，12000g离心10min。取上清，加入2/3体积预冷的异丙醇溶液，-20℃放置0.5h以上。取出，12000g离心10min，弃上清，沉淀用70％(体积分数)乙醇洗涤两次，37℃挥干乙醇，用适量灭菌水溶解，-20℃保存。
二、PCR扩增
以步骤一从待测样品中提取的基因组DNA为模板，采用实施例1步骤一设计的引物对(引物F1和引物F2)进行PCR扩增。具体的反应体系和反应条件同实施例1步骤三1。实验同时设置以双蒸水为模板作为阴性对照。实验重复三次。
反应结束后，一方面，按照实施例1中步骤三2(1)的方法对待测样品进行鉴定。另一方面，按照实施例1中步骤三2(2)的方法对待测样品进行鉴定。
结果如图1所示，从图中可以看出，利用本发明的引物对(引物F1和引物F2)对6种待测样品进行检测，只有西洋参能够扩增出片段大小约为250bp的目的条带。而人参、三七、竹节参、珠子参及羽叶三七则均未扩增出目的条带。这表明该反应体系能将西洋参与同属的人参、三七、竹节参、珠子参及羽叶三七准确的鉴别出来。另外，荧光检测结果表明，西洋参显示出明亮绿色荧光，而人参、三七、竹节参、珠子参及羽叶三七均不发绿色荧光。可见，采用本发明的引物对(引物F1和引物F2)鉴定西洋参，可通过荧光染色的方法对结果进行直接判定，操作简便，结果准确可靠。

Claims (10)

1.用于鉴定或辅助鉴定西洋参的引物对，其特征在于：所述引物对为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对。
2.用于鉴定或辅助鉴定西洋参的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1所述的引物对、dNTP和DNA聚合酶。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有荧光染料SYBR Green I。
4.制备权利要求1所述引物对的方法，包括将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装的步骤。
5.制备权利要求2或3所述试剂盒的方法，包括如下A)或B)的步骤：
A)将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装后，与分别单独包装的dNTP和DNA聚合酶包装于同一个试剂盒内：
B)将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装后，与分别单独包装的dNTP、DNA聚合酶和SYBR Green I包装于同一个试剂盒内。
6.权利要求1所述的引物对，或权利要求2或3所述的试剂盒，在鉴定或辅助鉴定西洋参中的应用。
7.利用权利要求1所述的引物对，或权利要求2或3所述的试剂盒，鉴定或辅助鉴定待测样品中是否含有西洋参的方法，包括如下步骤：
(a)从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增；
(b)为如下(b1)或(b2)：
(b1)根据步骤(a)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定待测样品中是否含有西洋参：若PCR产物中含有大小为100-500bp的DNA片段，则所述待测样品中含有或候选含有西洋参；若PCR产物中不含有大小为100-500bp的DNA片段，则所述待测样品中不含有或候选不含有西洋参；
(b2)向步骤(a)扩增后的反应体系中加入荧光染料SYBR Green I，得到含有荧光染料的体系，按照如下方法确定待测样品中是否含有西洋参：若观察到所述含有荧光染料的体系产生绿色荧光，则所述待测样品中含有或候选含有西洋参；若观察不到所述含有荧光染料的体系产生绿色荧光，则所述待测样品不含有或候选不含有西洋参。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：在步骤(a)中，进行所述PCR扩增时采用的退火温度为59℃。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：进行所述PCR扩增时采用的扩增程序为：90℃1min；90℃15s、59℃20s，29个循环。
10.根据权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于：在步骤(b2)中，确定所述含有荧光染料的体系是否产生绿色荧光是在365nm紫外波长下进行检测的。
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