CN102505045A - 人参和西洋参快速鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人参和西洋参鉴定方法，其包括如下步骤：1)以待测样品DNA为模板，扩增含有SEQ ID No.1所示的序列；2)对扩增产物进行测序，分析SEQ ID No.1所示的序列，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第32位为C和/或第43位为T，则鉴定为人参，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第32位为T和/或第43位为C，则鉴定为西洋参。本发明能够实现人参、西洋参原植物、药材、生饮片和粉未的快速、准确鉴定。

Description

人参和西洋参快速鉴定方法
技术领域
本发明术语中药材来源品种鉴定技术领域，具体涉及用特异的SNP鉴定人参和西洋参的方法。
背景技术
人参(Panax ginseng)和西洋参(Panax quinquefolius)分别为五加科人参属植物和干燥根，皆系名贵中药材，因补虚治病效果显著，临床应用日趋广泛。二者的性状非常相似，颜色基本一致，用传统方法很难将其区别。但两者在药性和功效上有很大差别，人参具补气、固脱、生津、益智、安神的功效。西洋参具有补气养阴，益胃生津，清热除烦之功效。这就需要寻找到一种稳定可靠的方法将人参和西洋参药材、饮片和粉未加以鉴定区分。
发明内容
本发明第一个目的在于提供人参和西洋参鉴定用SNP。
本发明第二个目的在于提供人参和西洋参鉴定用SNP在人参和西洋参鉴定用的应用。
本发明第三个目的在于提供人参和西洋参鉴定方法
本发明提供的人参和西洋参鉴定用SNP，其核苷酸序列如SEQID No.1所示，其中，自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第32位为C或T和/或第43位为T或C。
本发明提供的SNP可用于鉴定人参和西洋参，如果自SEQ IDNo.1所示序列的5’端起第32位为C和/或第43位为T，则鉴定为人参，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第32位为T和/或第43位为C，则鉴定为西洋参。
本发明提供的人参和西洋参鉴定方法，其包括如下步骤：
1)以待测样品DNA为模板，扩增含有SEQ ID No.1所示序列的片段；
2)对扩增产物进行测序，拼接后去除序列两端5.8S和26S基因区，获得完整ITS2基因间隔区，通过分析SEQ ID No.1所示的序列，确定自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第32位和/或第43位的碱基。
其中，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第32位为C和/或第43位为T，则鉴定为人参，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第32位为T和/或第43位为C，则鉴定为西洋参。
本发明发明人通过大量的引物设计和筛选，意外地发现一对特异性好，扩增效率高的引物，其序列为：
ITS2-F：AACCATCGAGTCTTTGAACGC；
ITS2-R：CCTTGTAAGTTTCTTTTCCTCC。
上述引物用于扩增人参或西洋参的ITS2序列。
本发明还提供含有上述引物的人参和西洋参鉴定试剂盒。
本发明方法适用性更广，能检测所有能提取出DNA的人参和西洋参任何样品。因此，能够实现人参、西洋参原植物、药材、生饮片和粉未的快速、准确鉴定。
附图说明
图1所示为ITS2序列的扩增结果。
图2所示为人参和西洋参ITS2序列的比对结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
1)从不同产地收集的39份人参和17份西洋参样品，分别取20mg药材，在MM400球磨仪(德国Retsch)上进行研磨，用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA试剂盒提取总DNA。
表1人参和西洋参样品
Figure BDA0000107248230000031
Figure BDA0000107248230000041
2)PCR扩增
引物序列为ITS2-F：AACCATCGAGTCTTTGAACGC；ITS2-R：CCTTGTAAGTTTCTTTTCCTCC，由生工生物工程公司有限公司(北京)合成。引物用无菌去离子溶解并稀释至2μmol/μL。
25μL反应体系：PCR Buffer(10×)2.5μL，Mg2+2μL(25mmol/L)，dNTPs混合物2μL(2.5mmol/L)，引物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNA 1μL(～30ng)，Taq DNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25μL，进行PCR扩增。
PCR反应程序：在PCR仪上按照以下程序进行扩增反应：
Figure BDA0000107248230000051
分别取5μL的PCR扩增产物上样，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后在凝胶成像仪上检测结果。(图1)。
3)测序
PCR产物直接送中国农业科学院重大工程实验室测序。测序引物同PCR引物。为确保DNA条形码序列的可靠性，需要进行正反向测序或重复测序，然后将正反向测序结果进行拼接获得DNA条形码序列。
4)序列拼接
本实施例采用应用软件CodonCode Aligner 2.06(CodonCode Co.，Germany)进行序列拼接及校对。首先，进行测序质量评估及预处理，即去除测序结果两端的低质量部分，并对剩余部分进行质量评估，如果满足质量要求，方可用于序列拼接，具体方法是：以20bp的窗口分别从序列5’端和3’端进行滑动，如果窗口内有多于2个碱基的Q值小于20，则删除一个碱基，窗口继续滑动，如果窗口内碱基Q值小于20的数目小于或等于2个，窗口停止滑动。测序结果的剩余部分需大于150bp，且平均Q值大于等于30(Chen et al.2010)。最后进行序列拼接，根据Hidden Markov Model(HMM)模型，去除序列两端5.8S和26S基因区，获得完整的人参和西洋参ITS2基因间隔区序列。
5)序列比对
用DNAman软件对测序并拼接后的各个样品的ITS2基因间隔区序列进行比对，结果如图2所示。从图2中可以看出，共获得两个SNP位点，所有人参样品的ITS2基因间隔区序列(SEQ ID No.1)的第32位为C，第43位为T，而所有西洋参样品的ITS2基因间隔基因区序列的第32位为T，第43位为C，表明这两个SNP位点可特异性地用于鉴定人参和西洋参。
实施例2
基本同实施例1，所不同的是将实施例1中的人参根和西洋参根制备成饮片，以该饮片为样品，提取DNA，进行鉴定，结果也能特异性地检测到上述的两个SNP位点。
实施例3
基本同实施例1，所不同的是将实施例1中的人参根和西洋参根制备成粉末，以该粉末为样品，提取DNA，进行鉴定，结果也能特异性地检测到上述的两个SNP位点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Figure IDA0000107248310000011

Claims (6)

1.人参和西洋参鉴定用SNP标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其中，自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第32位为C或T和/或第43位为T或C。
2.权利要求1所述的SNP在鉴定人参和西洋参中的应用，其特征在于，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第32位为C和/或第43位为T，则鉴定为人参，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第32位为T和/或第43位为C，则鉴定为西洋参。
3.人参和西洋参鉴定方法，其包括如下步骤：
1)以待测样品DNA为模板，扩增含有SEQ ID No.1所示序列的片段；
2)对扩增产物进行测序，拼接后去除序列两端5.8S和26S基因区，获得完整ITS2基因间隔区，通过分析SEQ ID No.1所示的序列，确定自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第32位和/或第43位的碱基。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第32位为C和/或第43位为T，则鉴定为人参，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第32位为T和/或第43位为C，则鉴定为西洋参。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，用于扩增含有SEQ ID No.1所示序列的片段的引物为：
ITS2-F：AACCATCGAGTCTTTGAACGC；
ITS2-R：CCTTGTAAGTTTCTTTTCCTCC。
6.含有权利要求5中所述的引物的人参和西洋参鉴定试剂盒。
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