CN113136451B

CN113136451B - 鉴定五种山姜属植物的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN113136451B
Application number: CN202110613895.6A
Authority: CN
Inventors: 刘昶; 王立强; 杨合宇; 陈海梅
Original assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Priority date: 2021-06-02
Filing date: 2021-06-02
Publication date: 2022-08-09
Anticipated expiration: 2041-06-02
Also published as: CN113136451A

Abstract

本发明公开了鉴定五种山姜属植物的分子标记及其应用，属于植物分子鉴定技术领域。利用本发明分子标记及基于其设计的引物能够有效鉴定区分红豆蔻、海南山姜、黑果山姜、高良姜和益智，有利于山姜属物种分类、质体基因组进化研究以及山姜属物种衍生的药用产品判别。

Description

鉴定五种山姜属植物的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于植物分子鉴定技术领域，具体涉及鉴定五种山姜属植物的分子标记及其应用。

背景技术

姜科是姜目中最大的家族，包含约1587种和52属。山姜属是姜科中最大的、分布最广的，且分类学最复杂的属；其包括230种，遍布在整个热带和亚热带地区。许多山姜属物种被用于医药用途；其中，红豆蔻被用于治疗消化不良、发烧、尿失禁，口臭和嗓子声音嘶哑；海南山姜具有止吐和健胃作用；黑果山姜用于治疗支气管炎、胃溃疡、寄生性肠感染；高良姜用于缓解胃痛、治疗感冒、激活循环系统、减少肿胀；益智被广泛用于治疗消化不良、腹泻、腹痛、遗精、肾虚乏力、记忆差。上述物种通过形态学鉴定容易混淆，一旦误认会影响由此开发的药品的功效和安全性。

因此，如何有效鉴定上述五种山姜属植物是本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明公开了鉴定五种山姜属植物的分子标记，将其用于红豆蔻、海南山姜、黑果山姜、高良姜和益智的鉴定，成功率为100％。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

鉴定五种山姜属植物的分子标记，五种山姜属植物为红豆蔻、海南山姜、黑果山姜、高良姜和益智；

分子标记为Alpp和Alpr，

红豆蔻Alpp核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：

AGAACAGTTGGCCTTCGATTATTTTGGATCGATCGAAATACACACAGGTAAATGTAGCCAAAAAAAAGAATTGGGCTGCTATTTTGATGTACTATTTAGATATATATCTAATCTATGTACATACATATTGTATATTGATCTAGATATGGGCTTTTTTTTATAGGAAAAAGCCCATATCTAGATCAATATATAATACAACTCTCTATGAAAATAATGAATATGATAATATATACTATATAATAGTAGATAACTATACCATACTATCTAGGCTTAGATAGTACTATCTCAGATACTTATTATCTCAGATACTTATGATTCCAGCCAGATCATTTCTTTCGTTTAAGACTTAAAGTTTGACTTCAATCATTGATAAGAACTAATAATTCAAGTTTCAATCAAATTAGTCATTTTGACTGACTGTTTTTACGTAGATGATAAGTAAAAAAGCAGTAGGAACTAGAATGAACAGTGCAGT；

红豆蔻Alpr核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：

TAGGGAGGGTTCCGCTAAATCATAGCATAGAAAAGAAAGAAGATACTTAAATTAAATAAAAATAATAATTTAGTGGATTTAGGATAGGAACAATTGATAGTTAGAAAGAAATTGTATTTCTTAATTATTACTTCATAAAATTATTATTTTATTACTCTATATCTATATATCTATAAAATATCAAAGTAAAATTTTTACTTAATCTTAATTACATTAATTTTATTATCTTAATTACATTAATTAATTATTAATTAAGAATTTAATAAATAAATAAGAATTTAATGATAATGATAATTGCAACGAAATTTTTATAAAATTCTATTTCTAGTTAGTCACTTTTATTTAATTTATTTTTGTTTTCTTCTTCTTCAGCTCAGATCGAAAATATAAGAGTTAAGCCGATACAAAATGAAAAGGGGGTTTATGGCTAAGGGTAAG；

海南山姜Alpp核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示：

AGAACAGTTGGCCTTCGATTATTTTGGATCGATCGAAATACACACAGGTAAATGTAGCCAAAAAAAAGAATTGGGCTGCTATTTTGATGTACTATTTAGATATACATCTAATCTATGTACATATTGATCTAGATATGGGCTTTTTTTATAGGAAAAAGTCGATATCTAGATCAATATATAATACAACTCTCTATGAAAATAATGAATATGATAATATATACTATATAATAGTGGATAACTATACCATACTATCTAGGCTTAGATAGTACTATCTCAGATACTTATTATCTCAGATACTTATGATTCCAGCCAGATCATTTCTTTCGTTTAAGACTTGAAGTTTGAATCCCTTTCTTCAATCATTGATGAGAACTAATAATTAAAGTTTCAATCAAATTAGTCATTTTGACTGACTGTTTTTACGTAGATGATAAGTAAAAAAGCAGTAGGAACTAGAATGAACAGTGCAGT；

海南山姜Alpr核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示：

TAGGGAGGGTTCCGCTAAATCATAGCATAGAAAGAAGATACTTAAATTAAATAAAAATAATAATTTAGTGGATTTAGGATAGAAACAATTGATAGTTAGAAAGAAATTGTATTTCTTAATTATTACTTCATAAAATTATTATTTTATTACTCTATATCTATATATCTATAAAATATAAATATAAAAGTAAAATTTTTACTTAATCTTAATTACATTACATTTTTACTTAATCTTAATTACATTACATTAATATTCATTATTAATTTAATAAATATAAATAAGAATTTCATGATAATTGCAACGAAATTTTTAGAAAATTCTATTTCTAGTTAGTCACTTTTATTTAATTTATTTTTGTTTTCTTCTTCTTCAGCTCAGATCGAAAATATAAGAGTTAAGCCGATACAAAATTTAAAGGGGGTTTATGGCTAAGGGTAAG；

黑果山姜Alpp核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示：

AGAACAGTTGGCCTTCGATTATTTTGGATCGATCGAAATACACACAGGTAAATGTAGCCAAAAAAAAGAATTGGGCTGCTATTTTGATGTACTATTTAGATATATATCTAATCTATGTACATACATATTATATATTGATCTAGATATGGGCTTTTTTTTATAGGAAAAGCCCATATCTAGATCAATATATAATACAACTCTCCATGAAAATAATGAATATGATAATATATACTATATAATAGTAGATAACTATACCATACTATCTAGGCTTAGATAGTACTATCTAAGATACTTATTATCTCAGATACTTATTATTCCAGCCGGATCATTTCTTTCGTTTAAGACTTGAAGTCTTACTTCAATCATTGATAAGAACTAATAATTCAAGTTTCAATCAAATTAGTCATTTTGACTGACTGTTTTTACGTAGATGATAAGTAAAAAAGCAGTAGGAACTAGAATGAACAGTGCAGT；

黑果山姜Alpr核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示：

TAGGGAGGGTTCCGCTAAATCATAGCATAGAAAAGAAAGAAGATACTTAAATTAAATAAAAATAATAATTTAGTGGATTTAGGATAGGAACAATGGATAGTTAGAAAAAAACTGTATTTCTTAATTATTACTTCATAAAATTATTATTTTATTACTCTATATCTATATATCTATAAAATATAAAGGTAAAATTTTTACTCTAAATCTTAATCTATAAAATATAAAGGTAAAATTTTTACTTAATCTTAATTACATTACATTAATATTAATTATTAATTAAGAATTTAATAAATAAGAATTTAATGATAATTGCAACGAAATTTTTAGAAAATTATATTTCTAGTTAGTCACTTTTATTTAATTTATTTTTGTTTTCTTCTTCTTCAGCTCAGATCGAAAATATAAGAGTTAAGCCGATACAAAATAAAAAAAGGGGGTTTATGGCTAAGGGTAAG；

高良姜Alpp核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示：

AGAACAGTTGGCCTTCGATTATTTTGGATCGATCGAAATACACACAGGTAAATGTAGCCAAAAAAAAGAATTGGGCTGCTATTTTGATGTACTATTTAGATATACATCTAATCCATGTACATACATATTGTATATTGATCTAGATATGGGCTTTTTTATAGGAAAAAGTCTATATCTAGATCAATATATAATACAACTCTCTATGAAAATAATGAATATGATAATATATACTAGATAACTATACCATACTATCTAGGCTTAGATAGTACTATCTCAGATACTTATGATTCCAGCCAGATCATTTCTTTCGTTTAAGACTTGAAGTTTGAATCCCTTTCCTTTCTTCAATCATTGATAAGAACTAATAATTCAAGTTTCAATCAAATTAGTCATTTTGACTGACTGTTTTTACGTAGATGATAAGTAAAAAAGCAGTAGGAACTAGAATGAACAGTGCAGT；

高良姜Alpr核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示：

TAGGGAGGGTTCCGCTAAATCATAGCATAGAAAGAAGATACTTAAATTAAATAAATAGTGGATTTAGGATAGGAACAATTGATAGTTAGAAATAAATTGTATTTCTTAATTATTACTTCATAAAATTATTATTTTATTACTCTATATCTATATATCTATAAAATATAAAAGTAAAATTTTTACTTAATCTTAATTTCTTAATTACATTACATTAATATTAATTAATAATTTAATAAATAAAAATAAGAATTTCATGATAATTGCAACGAAATTTTTAGAAAATTCTATTTCTAGTTAGTCACTTTTATTTCATTTATTTTTGTTTTCTTCTTCTTCAGCTCAGATCGAAAATATAAGAGTTAAGCCGATACAAAATTAAAAGGGGGTTTATGGCTAAGGGTAAG；

益智Alpp核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示：

益智Alpr核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示：

TAGGGAGGGTTCCGCTAAATCATAGCATAGAAAGAAGATACTTAAATTAAATAAATAGTGGATTTAGGATAGGAACAATTGATAGTTAGAAATAAATTGTATTTCTTAATTATTACTTCATAAAATTATTATTTTATTACTCTATATCTATATATCTATAAAATATAAAAGTAAAATTTTTACTTAATCTTAATTACATTACATTAATATTAATTATTAATTAATAATTTAATAAATAAAAATAAGAATTTCATGATAATTGCAACGAAATTTTTAGAAAATTCTATTTCTAGTTAGTCACTTTTATTTCATTTATTTTTGTTTTCTTCTTCTTCAGCTCAGATCGAAAATATAAGAGTTAAGCCGATACAAAATTTAAAGGGGGTTTATGGCTAAGGGTAAG。

基于上述鉴定五种山姜属植物的分子标记的引物，

分子标记Alpp的引物为：

上游引物：5’-AGAACAGTTGGCCTTCGATT-3’，SEQ ID NO：11；

下游引物：5’-ACTGCACTGTTCATTCTAGTTCC-3’，SEQ ID NO：12；

分子标记Alpr的引物为：

上游引物：5’-TAGGGAGGGTTCCGCTAAAT-3’，SEQ ID NO：13；

下游引物：5’-CTTACCCTTAGCCATAAACCCC-3’，SEQ ID NO：14。

上述分子标记或上述引物在鉴定红豆蔻、海南山姜、黑果山姜、高良姜和益智中的应用。

一种鉴定红豆蔻、海南山姜、黑果山姜、高良姜和益智的试剂盒，包括上述引物。

一种鉴定红豆蔻、海南山姜、黑果山姜、高良姜和益智的方法，包括如下步骤：

(1)取待检测样品，提取DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，使用上述引物进行PCR扩增；

(3)对步骤(2)扩增产物进行测序。

优选地，步骤(2)中扩增体系为：

2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，每种引物0.4μM，模板DNA2μL，加ddH2O至最终体积为25μL。

7.根据权利要求5所述的一种鉴定红豆蔻、海南山姜、黑果山姜、高良姜和益智的方法，其特征在于，

优选地，步骤(2)中扩增程序为：

94℃变性2min；

94℃30s，58℃30s，72℃60s，35个循环；

72℃2min。

综上所述，本发明分子标记及基于其设计的引物能够有效鉴定区分红豆蔻、海南山姜、黑果山姜、高良姜和益智，有利于山姜属物种分类、质体基因组进化研究以及山姜属物种衍生的药用产品判别。

附图说明

图1所示为红豆蔻质体基因组圈图；

图2所示为黑果山姜质体基因组圈图；

图3所示为高良姜质体基因组圈图；

图4所示为益智质体基因组圈图；

图5所示为红豆蔻、海南山姜、黑果山姜、高良姜和益智质体基因组间高可变IGS区域比较；X轴表示IGS区域，Y轴表示不同物种之间K2p距离的范围钻石型方块表示IGS区域平均K2p距离；

图6所示为分子标记验证凝胶电泳结果；

图7所示为分子标记验证测序色谱图对比。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

1.植物材料和总DNA制备

从生长在中国广西药用植园(108°19'E，22°51'N，530023)的红豆蔻、黑果山姜、高良姜和益智的植株中采集幼嫩叶片；每个物种采集五个不同基因型的个体，将样品用二氧化硅干燥并储存在标本集中，标本集存放在中国医学科学院药用植物研究所(样品编号：Implad 201910413，Implad 201910414，Implad 20180327，和Implad 20180362)。

采用植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技，北京，有限公司)提取各样品总DNA；总DNA的纯度利用1.0％的琼脂糖凝胶进行评价；总DNA的浓度使用Nanodrop 2000(赛默飞，马萨诸塞州沃尔瑟姆，美国)分光光度计进行测量。

每个物种的五个不同基因型DNA混样后进行测序。

2.质体基因组的测序，组装和注释

使用TruSeq DNA样品制备试剂盒(Illumina公司，圣地亚哥，CA，USA)按照操作手册构建每个物种的总DNA测序文库，总DNA被剪切为大约500碱基长度的片段并构建双末端文库；该文库上机到Illumina的HiSeq 3000平台(Illumina的公司，圣地亚哥，CA，USA)进行测序；获得双端reads(2×250碱基)后，从GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/organelle/)下载质体基因组，使用BLASTn与测序得到的Illumina双端reads进行比对，设置E-value cutoff为1e-5；过滤得到的reads与质体基因组相关，可用于下游基因组组装。使用SPAdes(v。3.10.1)和CLC Genomics Workbench(v.7，QIAGEN，Aarhus，丹麦)从头组装质体基因组；构建contigs和参考基因组的点状图并可视化以评估装配质量；使用Lasergene(v.11.0，麦迪逊，威斯康星州)的Seqman模块进行contigs的组装，每个物种仅获得一个contig。

使用CpGAVAS 2网页服务器对四个物种的基因组进行注释，BLASTn和BLASTx的E-values设置为1e-10；在前过滤步骤之后，包括参考基因集里的用于注释的top hits的数目设置为10；手动校正以确定起始和终止密码子的位置和内含子/外显子的边界位置；使用自编的脚本进行密码子使用频率和GC含量(即，鸟嘌呤和胞嘧啶的相对含量)的计算。质体基因组的圈图通过cpgview网页服务器(http://www.herbalgenomics.org/cpgview/)进行绘制。

测序结果如表1及图1-4所示。

表1

4个物种质体基因组均为典型的环状结构，大小分别为160590个碱基(红豆蔻)，164294个碱基(黑果山姜)，162140个碱基(高良姜)，和161394个碱基(益智)。它们均包括一个大的单拷贝(LSC)区(87267–88970碱基)和小的单拷贝(SSC)区(15349-17,908碱基)，以上两个区域被两个反向重复(IR)区分开(27,490-29,951bp)。

3.高变区的确定

使用软件mVISTA(http://genome.lbl.gov/vista/mvista/submit.shtml)的Shuffle-LAGAN模式进行山姜属物种全质体基因组的比较基因组分析。将注释好的Z.spectabile质体基因组(NC_020363)用作参考。为了找出变异最大的区域，从测序获得的四个质体基因组以及海南山姜质体基因组(NC_048461)、益智质体基因组(NC_035895)、益智质体基因组(MK262729)中提取IGS区域的起点和终点。结果表明，红豆蔻、海南山姜、黑果山姜、高良姜和益智五个山姜属物种共有59个IGS区域；使用ClustalW2(v.2.0.12)并设置参数为“-type＝DNA-gapopen＝10-gapext＝2”提取序列并进行比对；使用EMBOSS软件包(6.3.1版)中distmat程序实现的K2p演化模型计算的高可变区域间的成对距离；结果如表2及图5所示，由山姜属物种中提取的59个IGS区域的平均K2p距离在0.00到6.793之间；其中，psbE-petL,petN-psbM,accD-psaI,petD-rpoA有最大K2p距离，分别为6.79、6.32、5.51和5.27。

表2

表中Alga：红豆蔻；Alka：海南山姜；Alni：黑果山姜；Alof：高良姜；Alox：益智。

4.鉴定和验证用于物种区分的分子标记

使用可变的基因间区域来作为开发区分5种药用山姜属物种分子标记的模板，筛选的分子标记为Alpp和Alpr，

红豆蔻Alpp核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

红豆蔻Alpr核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

海南山姜Alpp核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

海南山姜Alpr核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

黑果山姜Alpp核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

黑果山姜Alpr核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；

高良姜Alpp核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；

高良姜Alpr核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；

益智Alpp核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；

益智Alpr核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。

分别于广东、广西采集红豆蔻、海南山姜、黑果山姜、高良姜和益智不同基因型的个体，详见表3。

表3

使用表3样品对分子标记Alpp和Alpr进行验证：

(1)取待检测样品幼嫩叶片，提取DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，进行PCR扩增；

分子标记Alpp的引物为：

上游引物：5’-AGAACAGTTGGCCTTCGATT-3’，SEQ ID NO：11；

下游引物：5’-ACTGCACTGTTCATTCTAGTTCC-3’，SEQ ID NO：12；

分子标记Alpr的引物为：

上游引物：5’-TAGGGAGGGTTCCGCTAAAT-3’，SEQ ID NO：13；

下游引物：5’-CTTACCCTTAGCCATAAACCCC-3’，SEQ ID NO：14；

扩增体系为：

2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，每种引物0.4μM，模板DNA2μL，加10.1μL ddH₂O至最终体积为25μL。

所有的扩增均在Pro-Flex PCR system(Applied Biosystems，Waltham，MA，USA)仪器上进行，扩增程序为：

94℃变性2min；

94℃30s，58℃30s，72℃60s，35个循环；

72℃2min。

PCR扩增产物通过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测；均能扩增出相应条带，部分结果如图6所示；

(3)在ABI 3730X仪器(Applied Biosystems，USA)上使用相同的一组用于PCR扩增引物进行Sanger测序，结果如图7所示。

其中，红豆蔻(Alga:A.galanga)Alpp如SEQ ID NO：1，Alpr如SEQ ID NO：2；

海南山姜(Alha:A.hainanensis)Alpp如SEQ ID NO：3，Alpr如SEQ ID NO：4；

黑果山姜(Alni:A.nigra)Alpp如SEQ ID NO：5，Alpr如SEQ ID NO：6；

高良姜(Alof:Alpinia officinarum)Alpp如SEQ ID NO：7，Alpr如SEQ ID NO：8；

益智(Alox:A.oxyphylla)Alpp如SEQ ID NO：9，Alpr如SEQ ID NO：10。

从IGS区域petN-psbM中开发的标记Alpp，有两个特定的SNP位点A、B和一个Indel基因座C；这3个可变位点可以用来区分5个山姜属物种中除高良姜和益智以外的3个物种。从IGS区域psaJ-rpl33中开发的标记Alpr具有两个SNP位点D、E和一个Indel位点F。当使用来自两个Alpp和Alpr两个标记的SNP和IndeI位点时，五个物种均可以被成功地区分开。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 中国医学科学院药用植物研究所

<120> 鉴定五种山姜属植物的分子标记及其应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 475

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

agaacagttg gccttcgatt attttggatc gatcgaaata cacacaggta aatgtagcca 60

aaaaaaagaa ttgggctgct attttgatgt actatttaga tatatatcta atctatgtac 120

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gatcaatata taatacaact ctctatgaaa ataatgaata tgataatata tactatataa 240

tagtagataa ctataccata ctatctaggc ttagatagta ctatctcaga tacttattat 300

ctcagatact tatgattcca gccagatcat ttctttcgtt taagacttaa agtttgactt 360

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tttttacgta gatgataagt aaaaaagcag taggaactag aatgaacagt gcagt 475

<210> 2

<211> 438

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 2

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aataataatt tagtggattt aggataggaa caattgatag ttagaaagaa attgtatttc 120

ttaattatta cttcataaaa ttattatttt attactctat atctatatat ctataaaata 180

tcaaagtaaa atttttactt aatcttaatt acattaattt tattatctta attacattaa 240

ttaattatta attaagaatt taataaataa ataagaattt aatgataatg ataattgcaa 300

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<210> 3

<211> 471

<212> DNA

<213> Artificial

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<210> 4

<211> 439

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 4

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<210> 5

<211> 474

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 5

agaacagttg gccttcgatt attttggatc gatcgaaata cacacaggta aatgtagcca 60

aaaaaaagaa ttgggctgct attttgatgt actatttaga tatatatcta atctatgtac 120

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<400> 6

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<210> 7

<211> 460

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 7

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taagtaaaaa agcagtagga actagaatga acagtgcagt 460

<210> 8

<211> 404

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 8

tagggagggt tccgctaaat catagcatag aaagaagata cttaaattaa ataaatagtg 60

gatttaggat aggaacaatt gatagttaga aataaattgt atttcttaat tattacttca 120

taaaattatt attttattac tctatatcta tatatctata aaatataaaa gtaaaatttt 180

tacttaatct taatttctta attacattac attaatatta attaataatt taataaataa 240

aaataagaat ttcatgataa ttgcaacgaa atttttagaa aattctattt ctagttagtc 300

acttttattt catttatttt tgttttcttc ttcttcagct cagatcgaaa atataagagt 360

taagccgata caaaattaaa agggggttta tggctaaggg taag 404

<210> 9

<211> 460

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 9

agaacagttg gccttcgatt attttggatc gatcgaaata cacacaggta aatgtagcca 60

aaaaaaagaa ttgggctgct attttgatgt actatttaga tatacatcta atccatgtac 120

atacatattg tatattgatc tagatatggg cttttttata ggaaaaagtc tatatctaga 180

tcaatatata atacaactct ctatgaaaat aatgaatatg ataatatata ctagataact 240

ataccatact atctaggctt agatagtact atctcagata cttatgattc cagccagatc 300

atttctttcg tttaagactt gaagtttgaa tccctttcct ttcttcaatc attgataaga 360

actaataatt caagtttcaa tcaaattagt cattttgact gactgttttt acgtagatga 420

taagtaaaaa agcagtagga actagaatga acagtgcagt 460

<210> 10

<211> 403

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 10

tagggagggt tccgctaaat catagcatag aaagaagata cttaaattaa ataaatagtg 60

gatttaggat aggaacaatt gatagttaga aataaattgt atttcttaat tattacttca 120

taaaattatt attttattac tctatatcta tatatctata aaatataaaa gtaaaatttt 180

tacttaatct taattacatt acattaatat taattattaa ttaataattt aataaataaa 240

aataagaatt tcatgataat tgcaacgaaa tttttagaaa attctatttc tagttagtca 300

cttttatttc atttattttt gttttcttct tcttcagctc agatcgaaaa tataagagtt 360

aagccgatac aaaatttaaa gggggtttat ggctaagggt aag 403

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 11

agaacagttg gccttcgatt 20

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 12

actgcactgt tcattctagt tcc 23

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 13

tagggagggt tccgctaaat 20

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 14

cttaccctta gccataaacc cc 22

Claims

1.鉴定五种山姜属植物的分子标记，其特征在于，

所述五种山姜属植物为红豆蔻、海南山姜、黑果山姜、高良姜和益智；

所述分子标记为Alpp和Alpr，

红豆蔻Alpp核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：

红豆蔻Alpr核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：

海南山姜Alpp核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示：

海南山姜Alpr核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示：

黑果山姜Alpp核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示：

黑果山姜Alpr核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示：

高良姜Alpp核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示：

高良姜Alpr核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示：

益智Alpp核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示：

益智Alpr核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示：

2.基于权利要求1所述鉴定五种山姜属植物的分子标记的引物，其特征在于，分子标记Alpp的引物为：

上游引物：5’-AGAACAGTTGGCCTTCGATT-3’，SEQ ID NO：11；

下游引物：5’-ACTGCACTGTTCATTCTAGTTCC-3’，SEQ ID NO：12；

分子标记Alpr的引物为：

上游引物：5’-TAGGGAGGGTTCCGCTAAAT-3’，SEQ ID NO：13；

下游引物：5’-CTTACCCTTAGCCATAAACCCC-3’，SEQ ID NO：14。

3.权利要求1所述分子标记或权利要求2所述引物在鉴定红豆蔻、海南山姜、黑果山姜、高良姜和益智中的应用。

4.一种鉴定红豆蔻、海南山姜、黑果山姜、高良姜和益智的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述引物。

5.一种鉴定红豆蔻、海南山姜、黑果山姜、高良姜和益智的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取待检测样品，提取DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，使用权利要求2所述引物进行PCR扩增；

(3)对步骤(2)扩增产物进行测序。

6.根据权利要求5所述的一种鉴定红豆蔻、海南山姜、黑果山姜、高良姜和益智的方法，其特征在于，

步骤(2)中扩增体系为：

2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，每种引物0.4μM，模板DNA2μL，加ddH₂O至最终体积为25μL。

步骤(2)中扩增程序为：

94℃变性2min；

94℃30s，58℃30s，72℃60s，35个循环；

72℃2min。