CN114480678B - 基于CpG-InDel/STR标记的精液来源鉴定及个人识别试剂盒 - Google Patents

基于CpG-InDel/STR标记的精液来源鉴定及个人识别试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN114480678B
CN114480678B CN202210308280.7A CN202210308280A CN114480678B CN 114480678 B CN114480678 B CN 114480678B CN 202210308280 A CN202210308280 A CN 202210308280A CN 114480678 B CN114480678 B CN 114480678B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
pcr primers
specific
specific pcr
semen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210308280.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114480678A (zh
Inventor
李泽琴
李一丹
张更谦
严江伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanxi Medical University
Original Assignee
Shanxi Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanxi Medical University filed Critical Shanxi Medical University
Priority to CN202210308280.7A priority Critical patent/CN114480678B/zh
Publication of CN114480678A publication Critical patent/CN114480678A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114480678B publication Critical patent/CN114480678B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于CpG‑InDel/STR标记的精液来源鉴定及个人识别试剂盒，包括有SEQ NO.1～34所示核苷酸序列的17对特异性PCR引物，分别对应用于特异性检测17个精液特异性CpG位点联合一个或多个InDel/STR的连锁标记。本发明通过扩增、比对17个精液特异性CpG‑InDel/STR标记及其他体液的特异性CpG指示标记，检测混合样本中的体液来源及个人识别、确认精液供者个体分型，可应用于含有精液混合斑的法医学鉴定。

Description

基于CpG-InDel/STR标记的精液来源鉴定及个人识别试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，涉及体液来源的鉴定及个人识别，特别是涉及基于组织特异性差异甲基化相关的体液特异性CpG位点联合一个或多个InDel/STR的连锁标记同时进行体液来源鉴定和个人识别的检测方法。
背景技术
混合斑是法医实践中常见的生物检材，在性侵犯案件中经常收集到的是由精液和阴道分泌物组成的混合斑。对于混合斑的解释主要是对DNA分型进行反卷积，从而实现个人识别，目前主要包括有以下三种方案。
首先，是基于短串联重复序列(STR)各基因座的峰高(PH)、混合比和stutter峰等一系列法医学参数对DNA分型进行反卷积。为了提高其性能，STRmix，DNAmixtures和TureAllele等一些计算软件应运而生，但由于不同软件计算的LRs值一致性差，且计算复杂，在法庭讨论中具有争议性。因此对于混合斑的解释，分析软件仅能提供一些拆分混合斑分型的可能性，而且还需要依靠法医鉴定人员的分析经验。
其次，Y染色体STR(Y-STR)分型可以直接作用于混合斑中的男性成分。Y-STR以单倍体的形态存在，因此不需要进行复杂的计算，仅通过条带数即可确定男性供者的数量；并且Y-STR具有群体特异性，能够锁定嫌疑人的群体来源。但是Y-STR的多态性差，在个人识别中只具有排除意义。
同时，近几年开发出很多连锁的遗传标记，可以分析不平衡比例混合斑，比如插入/缺失多态性联合STR标记(DIP-STR)，插入/缺失联合单核苷酸多态性标记(DIP-SNP)，插入/缺失联合微单倍型标记(DIP-microhaplotypes)等。这些联合标记的最大优点是以高灵敏度对混合斑中的微量成分进行分型，其次，一些联合标记也可以分析降解检材。然而，这些联合标记依然有各自的缺点，比如说这些联合标记均需要嫌疑人的样本进行参考，且个人识别能力低。
无论是STR、Y-STR或新型遗传标记，仅能实现个人识别。但仅对混合斑进行个人识别，可能会产生“联想谬误”，因此对于体液/组织的来源识别具有至关重要的作用。
最近对体液/组织的来源鉴定主要集中在表观遗传标记的使用。DNA甲基化是最常见的表观遗传学修饰之一，在转录调控中起着至关重要的作用。
DNA甲基化通常发生在胞嘧啶的5号碳原子位。根据先前研究表明，大量的CpG位点被证明在人体组织/体液之间显示出不同的甲基化模式，且甲基化状态较为稳定。因此，CpG渐渐被用来在法医领域中推断组织/体液来源。
然而，DNA甲基化标记仅能被用于推断体液来源，而法医学实践的最终目标是对体液进行人体识别。因此，为了同时识别体液来源和个体识别，考虑将组织特异性CpG位点与InDel/STR长度遗传标记连锁分析，企图通过组织特异性甲基化位点的特异性扩增，准确地识别精液及其供者。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于CpG-InDel/STR标记的精液来源鉴定及个人识别试剂盒，以组织特异性差异甲基化相关的精液特异性CpG位点联合一个或多个InDel/STR作为连锁标记，同时进行精液的来源鉴定和个人识别。
为实现上述目的，本发明提供了一种基于CpG-InDel/STR标记的精液来源鉴定及个人识别试剂盒，在所述试剂盒中首先包含了17对特异性PCR引物，所述17对特异性PCR引物的核苷酸序列如SEQ NO.1～34所示，其分别对应用于特异性检测本发明筛选出的17个精液特异性CpG-InDel/STR标记。
特别地，本发明所述的17个精液特异性CpG-InDel/STR标记具体是以下17个精液特异性CpG位点按照下述方式联合一个或多个InDel/STR的连锁标记。
cg21382890-rs57941264。
cg03070236-rs57326989。
cg05696706-rs5895792。
cg08066035-rs35021759。
cg07865607-rs200660007。
cg13885748-rs527349730。
cg15780398-rs138945785-rs572771462。
cg13488570-rs35471620。
cg00115178-rs199589728-rs143958455。
cg19640166-rs66606338。
cg14133945-rs72410937。
cg08716982(200d)-rs11315768-rs139236122-rs10672777。
cg16476991-rs71105236。
cg04408104-rs374038625。
cg03003434-rs558700258。
cg18437209-rs11400246。
cg24133207-rs150822485。
本发明上述17个精液特异性CpG-InDel/STR标记是基于以下特点筛选得到的。
1、精液特异性CpG位点与其他三种体液的平均β值≥|0.8|。
2、精液特异性CpG位点与InDel/STR的物理距离≤400bp。
3、每个InDel/STR的最小等位基因频率(MAF)大于0.1。
4、扩增片段长度小于500bp。
进一步地，所述17个精液特异性CpG-InDel/STR标记的相关信息见表1所示。
表1 17个精液特异性CpG-InDel/STR标记的相关信息
更具体地，本发明所述的17个精液特异性CpG-InDel/STR标记是按照以下方式对应于其34条特异性PCR引物的。
cg21382890-rs57941264的特异性PCR引物为SEQ ID NO.1的上游引物和SEQIDNO.2的下游引物。
cg03070236-rs57326989的特异性PCR引物为SEQ ID NO.3的上游引物和SEQ IDNO.4的下游引物。
cg05696706-rs5895792的特异性PCR引物为SEQ ID NO.5的上游引物和SEQ IDNO.6的下游引物。
cg08066035-rs35021759的特异性PCR引物为SEQ ID NO.7的上游引物和SEQ IDNO.8的下游引物。
cg07865607-rs200660007的特异性PCR引物为SEQ ID NO.9的上游引物和SEQ IDNO.10的下游引物。
cg13885748-rs527349730的特异性PCR引物为SEQ ID NO.11的上游引物和SEQ IDNO.12的下游引物。
cg15780398-rs138945785-rs572771462的特异性PCR引物为SEQ ID NO.13的上游引物和SEQ ID NO.14的下游引物。
cg13488570-rs35471620的特异性PCR引物为SEQ ID NO.15的上游引物和SEQ IDNO.16的下游引物。
cg00115178-rs199589728-rs143958455的特异性PCR引物为SEQ ID NO.17的上游引物和SEQ ID NO.18的下游引物。
cg19640166-rs66606338的特异性PCR引物为SEQ ID NO.19的上游引物和SEQ IDNO.20的下游引物。
cg14133945-rs72410937的特异性PCR引物为SEQ ID NO.21的上游引物和SEQ IDNO.22的下游引物。
cg08716982(200d)-rs11315768-rs139236122-rs10672777的特异性PCR引物为SEQ ID NO.23的上游引物和SEQ ID NO.24的下游引物。
cg16476991-rs71105236的特异性PCR引物为SEQ ID NO.25的上游引物和SEQ IDNO.26的下游引物。
cg04408104-rs374038625的特异性PCR引物为SEQ ID NO.27的上游引物和SEQ IDNO.28的下游引物。
cg03003434-rs558700258的特异性PCR引物为SEQ ID NO.29的上游引物和SEQ IDNO.30的下游引物。
cg18437209-rs11400246的特异性PCR引物为SEQ ID NO.31的上游引物和SEQIDNO.32的下游引物。
cg24133207-rs150822485的特异性PCR引物为SEQ ID NO.33的上游引物和SEQ IDNO.34的下游引物。
更进一步地，本发明还在所述试剂盒中引入了包括用于进行其他体液来源鉴定及性别认定的特异性PCR引物。
具体地，本发明是在所述试剂盒中还包括有SEQ NO.35～42所示核苷酸序列的4对共8条特异性PCR引物。
其中，SEQ NO.35～36所示核苷酸序列的特异性PCR引物用于特异性检测来源于血液(BL)的CpG位点cg06379435。
SEQ NO.37～38所示核苷酸序列的特异性PCR引物用于特异性检测来源于阴道分泌物(VG)的CpG位点cg09765089。
SEQ NO.39～40所示核苷酸序列的特异性PCR引物用于特异性检测来源于唾液(SA)的CpG位点cg26107890。
SEQ NO.41～42所示核苷酸序列的特异性PCR引物用于特异性检测性别识别Amelogenin基因座(缩写为AMEL)。
基于上述技术内容，在本发明所述的基于CpG-InDel/STR标记的精液来源鉴定及个人识别试剂盒中包括了42条特异性PCR引物，用于检测本发明筛选出的17个精液特异性CpG-InDel/STR标记、1个阴道分泌物特异性CpG标记、1个唾液特异性CpG标记、1个血液特异性CpG标记和1个性别识别AMEL标记，从而实现本发明基于组织特异性甲基化位点对精液、血液、唾液、阴道分泌物进行来源推断，同时基于精液特异性DNA甲基化位点联合一个或多个InDel/STR连锁标记实现对精液供者的个人识别。
进一步地，本发明是将上述试剂盒用于检测的17个精液特异性CpG-InDel/STR标记以及阴道分泌物CpG位点、唾液CpG位点、血液CpG位点和性别识别Amelogenin基因座分成4组进行检测。
进一步地，所述分组情况的相关信息见表2所示。
表2各组标记名称及对应的检测标记
更进一步地，根据上述检测标记的分组情况，本发明对各组所述检测标记各自对应的特异性PCR的正向或反向引物标记了不同的荧光标记染料，具体包括蓝色荧光标记染料羧基荧光素(FAM)、绿色荧光标记染料六氯-6-甲基荧光素(HEX)、黄色荧光标记染料四甲基-6羧基罗丹明(TRAMA)和红色荧光标记染料罗丹明(ROX)。
具体地，针对第1组，是在特异性PCR引物SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.16的5’端带有FAM荧光标记。
针对第2组，是在特异性PCR引物SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.19、SEQID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25的5’端带有HEX荧光标记；
针对第3组，是在特异性PCR引物SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29的5’端带有TAMRA荧光标记；
针对第4组，是在特异性PCR引物SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33的5’端带有ROX荧光标记。
常规地，在所述的试剂盒中，还包括了用于进行特异性PCR扩增的的必要试剂如PCR Master Mix、ddH2O，以及用于检测PCR扩增产物的必要试剂去离子甲酰胺和分子量内标。
进一步地，本发明试剂盒中的分子量内标优选使用STRtyper-21G的橙色内标SIZE-500。但本发明并不限于此，只要是具有橙色标记，长度范围在75～500bp之间的分子量内标均可使用。
本发明所述的17个精液特异性CpG-InDel/STR标记的分组以及上下游引物的核苷酸序列和引物浓度具体见表3。
表3-1用于扩增检测标记引物的核苷酸序列
上表中，引物序列中的下划线表示组织特异性位点，小写字母表示引入的不匹配碱基。*表示指示性标记。
表3-2检测标记的扩增长度及引物浓度
本发明上述提供的基于CpG-InDel/STR标记的精液来源鉴定及个人识别试剂盒利用组织特异性甲基化标记对精液、血液、唾液、阴道分泌物进行来源推断，同时利用精液特异性甲基化标记连锁的InDel/STR遗传标记实现对精液供者的个人识别。
本发明还提供了一种使用所述基于CpG-InDel/STR标记的精液来源鉴定及个人识别试剂盒检测混合斑的体液来源鉴定和精液供者的个人识别的检测方法，包括以下步骤。
1)、提取待测样本DNA，进行亚硫酸氢盐脱氨化处理，以亚硫酸氢盐转化后的DNA为模板，利用所述试剂盒中的17对精液特异性CpG-InDel/STR标记的特异性PCR引物、1对阴道分泌物CpG位点特异性PCR引物、1对唾液CpG位点特异性PCR引物、1对血液CpG位点特异性PCR引物和1对性别识别AMEL位点特异性PCR引物构建多重PCR扩增体系，进行多重PCR扩增得到扩增产物。
2)、成功扩增的PCR产物以CE验证，经毛细管电泳分离，使用基因分析软件进行基因型结果分析。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果。
1)、基于毛细管电泳平台，一次性可以检测包含17个精液特异性CpG-InDel/STR标记、三个其他体液CpG指示标记、1个性别识别标记的多重PCR反应体系，无需额外昂贵的仪器设备和试剂，也无需专业的技术人员进行分析，同时节省了检测成本并在大部分的法医实验室都可进行，适用于法医学鉴定、检测。
2)、系统性分析样本体液来源，分型准确。本发明采取的17个精液特异性CpG标记和三种其他体液的指示标记(1个阴道分泌物特异性CpG标记、1个唾液特异性CpG标记、1个血液特异性CpG标记)组织特异性强，在其他非目标体液中均无扩增产物峰干扰，因此只需要通过目标体液扩增产物峰的有无推断混合斑中的体液来源。
3)、用于个人识别的21个InDel/STR标记多态性良好。且21个InDel/STR标记通过与精液特异性CpG连锁分析，可以实现不受其他体液干扰的情况下，仅对精液供者进行个人分型，无需借助各种算法工具对混合斑进行反卷积，分型准确。
4)可以用于同时分析样本的体液来源和个人识别。
本发明的基于CpG-InDel/STR标记的精液来源鉴定及个人识别试剂盒可以满足对含有精液的混合斑同时进行体液来源的鉴定和对精液供者进行个人识别，提供了一种更为完善且简单的方法来解决性侵犯案件中法庭证据的解释工作。
附图说明
图1是标记排布示意图。
图2是人群频率调查中随机个体的电泳分析图。
图3是灵敏度检测结果。其中，a)用于转化的DNA为100ng，b)用于转化的DNA为50ng，c)用于转化的DNA为25ng，d)用于转化的DNA为10ng。
图4是模拟混合斑中精液与阴道分泌物基因组DNA以不同比例混合的扩增电泳图。
图5是模拟混合斑中精液与其他三种体液基因组DNA等比例混合的分型结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步的详细描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，从而使本领域技术人员能很好地理解和利用本发明，而不是限制本发明的保护范围。
本发明实施例中涉及到的实验方法、生产工艺、仪器以及设备，其名称和简称均属于本领域内常规的名称，在相关用途领域内均非常清楚明确，本领域内技术人员能够根据该名称理解常规工艺步骤并应用相应的设备，按照常规条件或制造商建议的条件进行实施。
本发明实施例中使用的各种原料或试剂，并没有来源上的特殊限制，均为可以通过市售购买获得的常规产品。也可以按照本领域技术人员熟知的常规方法进行制备。
能够进行个人识别的遗传标记有很多种，如常染色体STR，性染色体STR如Y-STR、X-STR，DIP-STR，DIP-SNP等，目前国内外已有相应的试剂盒，用于进行法医案件中的个人识别，但未能同时满足对案件中的斑迹进行体液来源的鉴定。
实施例1：用于体液来源及精液供者个人识别的多重荧光标记检测体系的构建。
1、特异性检测位点的筛选标准：
1)精液特异性CpG位点与其他三种体液的平均β值≥|0.8|。
2)精液特异性CpG位点与InDel/STR的物理距离≤400bp。
3)每个InDel/STR的最小等位基因频率(MAF)大于0.1。
2、根据检测位点设计引物：扩增目的片段的长度控制在500bp以内；设计引物长度在18～30bp之间，引物3’末端完全与目标体液的CpG位点匹配；在引物3’末端的倒数第二个或第三个碱基额外引入一个碱基的错配；各基因座引物的Tm值尽量一致；PCR长度控制在500bp以内；引物内最好不要有连续相同的八个以上的碱基，保证引物在PCR中得到的扩增产物单一。
3、组织特异性验证：组织特异性甲基化在不同组织/体液中的甲基化水平不同，因此，通过特异性PCR以验证每个CpG位点的组织特异性。即每个特异性CpG位点在精液、唾液、血液、阴道分泌物中进行单独PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳进行初步检测。
4、多重检测体系PCR扩增：将上述筛选出的引物混合至同一反应体系中，并保证模板浓度在一定范围内，寻找引物的最适浓度，以期复合体系中的各位点可以得到最优扩增。
实施例2：用于体液来源及精液供者个人识别的多重荧光标记检测体系。
根据实施例1中的构建方法，构建得到一种多重PCR荧光标记检测体系。
1、首先建立了基于荧光标记复合扩增检测技术的17个精液特异性CpG-InDel/STR分型体系，详细情况见表1，为17个精液特异性CpG位点按照所述方式联合一个或多个InDel/STR连锁标记。
其中，17个精液特异性CpG位点共连锁18个InDel和3个STR。
2、除以上17个精液特异性CpG-InDel/STR标记位点外，检测体系的检测目标还增加了包括1个阴道分泌物特异性CpG标记、1个唾液特异性CpG标记和1个血液特异性CpG标记的3个其他体液指示标记，以及1个性别识别AMEL标记，具体列于表2中。
3、多重PCR荧光标记检测体系中，上述17对精液特异性CpG-InDel/STR标记、3个其他体液CpG指示标记和1个性别识别AMEL标记扩增引物的上下游引物如表3-1所示。为使毛细管电泳平台能够极大程度的检测多重PCR产物，在引物的5’端标记不同颜色的荧光标记，最终的荧光标记排布情况如图1所示。为使每条染色体上的扩增效率尽可能的一致，通过调整多重PCR荧光标记检测体系中每对引物的浓度，最终调整后的引物浓度如表3-2所示。
4、多重PCR荧光标记检测体系中各试剂的加样量如表4所示。
表4PCR复合扩增体系
其中，2×Multiplex PCR mastermix为Buffer、dNTP、Hs taq、Mg2+混合集成扩增试剂，DNA来源于所测样本，Primer mix为前述引物的混合物。
多重PCR荧光标记检测体系扩增程序：95℃预变性10min；94℃变性30s；56℃退火1min；72℃延伸45s；经35个循环后，72℃终延伸45min。
5、检测扩增产物：扩增产物1μL，去离子甲酰胺8.5μL，SIZE-500 0.5μL。变性方法为95℃处理5min后，-20℃处理3min。
6、PCR产物在ABI 3130遗传分析仪上分离。用GeneMapper V3.2软件进行基因型分析。
实施例3：人群频率调查。
由于本发明提供的17个精液特异性CpG-InDel/STR标记均为新设计，应用到试剂盒中时，没有对应的可用来对混合检材进行分析的频率信息。因此，需要先计算出这些InDel/STR的频率。
1、收集个体检材。
本实施例共收集了70份精液样本，均来自于中国山西省的无关健康人群。
利用Omega的MicroElute Genomic DNA kit操作步骤，提取精液样本的的基因组DNA，并通过Invitrogen Qubit4进行样本DNA定量。
2、扩增及检测。
提取待测样本的基因组DNA，通过凯杰的 Fast DNA Bisulfite Kit操作步骤对200ng基因组DNA进行亚硫酸氢盐脱氨化处理。
以转化后的单链DNA为模板，利用本发明所述试剂盒中的42条特异性引物构建多重PCR扩增体系，进行多重PCR扩增得到扩增产物。
根据实施例2提供的复合扩增体系对提取的DNA进行复合PCR扩增。
检测扩增产物：扩增产物1μL，去离子甲酰胺8.5μL，SIZE-500 0.5μL。变性方法为95℃处理5min后，-20℃处理3min。
PCR产物在ABI 3130遗传分析仪上分离。用GeneMapper V3.2软件进行基因型分析。
图2为随机无关个体分型结果。经过计算得到各人群在每个InDel/STR位点的等位基因频率，结果见表5。
表5 21个InDel/STR标记在山西人群的等位基因频率
多重PCR荧光标记检测体系最终的累计个人识别概率为0.9999998，确定所构建的基于CpG-InDel/STR标记的精液来源鉴定及个人识别试剂盒可以用于精液供者的个人识别，且个人识别概率较高。
实施例4：灵敏度检测。
1、制备DNA样本。
利用Omega的MicroElute Genomic DNA kit操作步骤提取精液样本的基因组DNA，并通过Invitrogen Qubit4进行样本DNA定量。
提取待测样本的基因组DNA，通过凯杰的 Fast DNA Bisulfite Kit操作步骤分别对100ng、50ng、25ng和10ng基因组DNA进行亚硫酸氢盐脱氨化处理。
2、以转化后的单链DNA为模板，按照实施例2中方法进行PCR扩增、检测和结果分析。确定本体系的灵敏度。
详情况见图3。结果表明：如图3-a和图3-b所示，100ng和50ng均检测到精液供者完整分型。
如图3-c所示，在未转化DNA为25ng时，标记序号为7、8、13、15和17等标记的峰高均低于分析阈值(50RFU)，12则发生了等位基因丢失。
如图3-d所示，当输入的DNA为10ng时，会出现更多的等位基因丢失。
总之，为了获得精液供者完整的基因分型，建议用于亚硫酸氢盐转化的基因组DNA至少为50ng。
实施例5：模拟混合斑检材的检测。
1、制备模拟混合斑。
为了模拟混合的案例样本，将从精液中提取的DNA与阴道分泌物提取的DNA分别以16∶1、9∶1、1∶1、1∶9、1∶16、1∶32和1∶64的比例进行两两混合。
同时，还制备了精液、血液、唾液、阴道分泌物基因组DNA以1∶1∶1∶1的比例混合的复杂混合物，以评估该体系检测复杂混合斑的有效性。
随后，通过凯杰的 Fast DNA Bisulfite Kit操作步骤，分别对200ng基因组DNA进行亚硫酸氢盐脱氨化处理。
按照实施例2中方法进行扩增、检测和结果分析，详细结果如图4。
如图4-d所示，对于精液特异性CpG标记物，当混合体液中的精液比例为1/10时，缺失了7、8、13、15和17等标记。
如图4-f和图4-g所示，当精液与阴道分泌物的混合比为1∶32时，17个标记中的两个位点仍能识别精液。然而，当混合体液中的精液含量低于1.54％(1∶64)时，该体系无法区分精液。
如图4-b所示，当阴道分泌物占比达到10％时，阴道分泌物的特异性CpG标记物cg09765089的扩增产物显著。
结果表明，本发明试剂盒针对精液含量低至3.03％的混合斑，能够成功检测到精液来源。
对由四种体液等比例构成的复杂混合物的分析详细结果如图5所示，表明针对四种体液基因组DNA等比例混合，可检测到精液供者完整的个人分型，不受其他体液的干扰，同时该体系可以有效地检测法医实践中四种常见体液的存在。
本发明以上实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制本发明仅为以上所述实施例。本领域普通技术人员在不脱离本发明原理和宗旨的情况下，针对这些实施例进行的各种变化、修改、替换和变型，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 山西医科大学
<120> 基于CpG-InDel/STR标记的精液来源鉴定及个人识别试剂盒
<160> 42
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
gtggaataaa ttatgtgttt agttacac 28
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
acaaacaaaa tcctacaaaa atttaatact 30
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
gtgacgttag tgtggatgaa gttcc 25
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
ctattttctt ctcaatccca actc 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
gttagggagg ggagtgtctc 20
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
acccttcaat ctattaaaaa atcc 24
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
tggggtgagg atagggttgc c 21
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
taaaccaaaa aaactacccc tacc 24
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
tgtattttag tttgggtaat aagagtg 27
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
taacraaaaa acccccacag 20
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
gaattattgt ttagggtggt tgatagta 28
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
cccaatacca ccacctaata atg 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
gaatttagga ggtggaggtt gta 23
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
cataaatacg ctaacgatca aaccg 25
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
ggatttaatt aagagtgttt cgtaagaac 29
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
aaccccaaaa cctttacttc c 21
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 17
atggggtaga gtagaaagtg atgt 24
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 18
ataccrtcat cctcctataa actg 24
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 19
tgagatgaaa ggggttttta ga 22
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 20
gaatccccct acgacttaaa cg 22
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 21
ggttattaaa gggagatggg atc 23
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 22
attaaaccaa acttaaaacc ctacac 26
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 23
agttggagaa gttattttat agttagtaac 30
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 24
acactcatac acacaacatc acat 24
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 25
aaagatttag tgaggaaagt atgc 24
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 26
ctaattatac ctcctcctaa aaatcac 27
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 27
gggaggttaa ggtaggaatt t 21
<210> 28
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 28
ctaactaact caaacgattt attactcg 28
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 29
tggttaggtt ttgggttatg t 21
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 30
caaataccta acattattct cagcg 25
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 31
agggtatttt ttagtggttt atgg 24
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 32
cattcgacat acgtaaaaca cg 22
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 33
gggttttagg gggtygttac 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 34
ccccacctac aaattctaaa 20
<210> 35
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 35
ggggtttagg ttatgttatt gttgta 26
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 36
attaaaccct actttccrac aaacg 25
<210> 37
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 37
ttcgtagttt atttaaggat tataaacgt 29
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 38
cgacttcgaa atatacctaa acg 23
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 39
tttgggtttt ttatttttgg attag 25
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 40
tccraaaccc ttcctgcg 18
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 41
ttttgggttt tgtaaagaat agtg 24
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 42
aaacttaaaa ccaaccatca aaac 24

Claims (7)

1.基于CpG-InDel/STR标记的精液来源鉴定及个人识别试剂盒，包括有SEQ NO.1～34所示核苷酸序列的17对特异性PCR引物，分别对应用于特异性检测17个精液特异性CpG-InDel/STR标记，所述的17个精液特异性CpG-InDel/STR标记为17个精液特异性CpG位点按照下述方式联合一个或多个InDel/STR的连锁标记：
cg21382890-rs57941264；
cg03070236-rs57326989；
cg05696706-rs5895792；
cg08066035-rs35021759；
cg07865607-rs200660007；
cg13885748-rs527349730；
cg15780398-rs138945785-rs572771462；
cg13488570-rs35471620；
cg00115178-rs199589728-rs143958455；
cg19640166-rs66606338；
cg14133945-rs72410937；
cg08716982(200d)-rs11315768-rs139236122-rs10672777；
cg16476991-rs71105236；
cg04408104-rs374038625；
cg03003434-rs558700258；
cg18437209-rs11400246；
cg24133207-rs150822485。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是所述17个精液特异性CpG-InDel/STR标记对应的特异性PCR引物如下所述：
cg21382890-rs57941264的特异性PCR引物为SEQ ID NO.1的上游引物和SEQ ID NO.2的下游引物；
cg03070236-rs57326989的特异性PCR引物为SEQ ID NO.3的上游引物和SEQ ID NO.4的下游引物；
cg05696706-rs5895792的特异性PCR引物为SEQ ID NO.5的上游引物和SEQ ID NO.6的下游引物；
cg08066035-rs35021759的特异性PCR引物为SEQ ID NO.7的上游引物和SEQ ID NO.8的下游引物；
cg07865607-rs200660007的特异性PCR引物为SEQ ID NO.9的上游引物和SEQ IDNO.10的下游引物；
cg13885748-rs527349730的特异性PCR引物为SEQ ID NO.11的上游引物和SEQ IDNO.12的下游引物；
cg15780398-rs138945785-rs572771462的特异性PCR引物为SEQ ID NO.13的上游引物和SEQ ID NO.14的下游引物；
cg13488570-rs35471620的特异性PCR引物为SEQ ID NO.15的上游引物和SEQ IDNO.16的下游引物；
cg00115178-rs199589728-rs143958455的特异性PCR引物为SEQ ID NO.17的上游引物和SEQ ID NO.18的下游引物；
cg19640166-rs66606338的特异性PCR引物为SEQ ID NO.19的上游引物和SEQ IDNO.20的下游引物；
cg14133945-rs72410937的特异性PCR引物为SEQ ID NO.21的上游引物和SEQ IDNO.22的下游引物；
cg08716982(200d)-rs11315768-rs139236122-rs10672777的特异性PCR引物为SEQ IDNO.23的上游引物和SEQ ID NO.24的下游引物；
cg16476991-rs71105236的特异性PCR引物为SEQ ID NO.25的上游引物和SEQ IDNO.26的下游引物；
cg04408104-rs374038625的特异性PCR引物为SEQ ID NO.27的上游引物和SEQ IDNO.28的下游引物；
cg03003434-rs558700258的特异性PCR引物为SEQ ID NO.29的上游引物和SEQ IDNO.30的下游引物；
cg18437209-rs11400246的特异性PCR引物为SEQ ID NO.31的上游引物和SEQ IDNO.32的下游引物；
cg24133207-rs150822485的特异性PCR引物为SEQ ID NO.33的上游引物和SEQ IDNO.34的下游引物。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征是还包括SEQ NO.35～36所示核苷酸序列的特异性PCR引物，用于特异性检测来源于血液的CpG位点cg06379435；SEQ NO.37～38所示核苷酸序列的特异性PCR引物，用于特异性检测来源于阴道分泌物的CpG位点cg09765089；SEQ NO.39～40所示核苷酸序列的特异性PCR引物，用于特异性检测来源于唾液的CpG位点cg26107890；以及SEQ NO.41～42所示核苷酸序列的特异性PCR引物，用于特异性检测性别识别Amelogenin基因座。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征是将用于特异性检测的17个精液特异性CpG-InDel/STR标记和阴道分泌物CpG位点、唾液CpG位点、血液CpG位点和性别识别Amelogenin基因座分为以下4组：
第1组：Amelogenin基因座、cg21382890-rs57941264、cg03070236-rs57326989、cg05696706-rs5895792、cg08066035-rs35021759、cg07865607-rs200660007、cg13885748-rs527349730、cg15780398-rs138945785-rs572771462、cg13488570-rs35471620；
第2组：cg00115178-rs199589728-rs143958455、cg26107890、cg19640166-rs66606338、cg14133945-rs72410937、cg08716982(200d)-rs11315768-rs139236122-rs10672777、cg16476991-rs71105236；
第3组：cg06379435、cg04408104-rs374038625、cg03003434-rs558700258；
第4组：cg09765089、cg18437209-rs11400246、cg24133207-rs150822485。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征是：
在特异性PCR引物SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.16的5’端带有FAM荧光标记；
在特异性PCR引物SEQ ID NO.18、SEQ ID NO. 39、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQID NO.23、SEQ ID NO.25的5’端带有HEX荧光标记；
在特异性PCR引物SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29的5’端带有TAMRA荧光标记；
在特异性PCR引物SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33的5’端带有ROX荧光标记。
6.根据权利要求1～5任一所述的试剂盒，其特征是在所述试剂盒中还包括用于检测PCR扩增产物的去离子甲酰胺和分子量内标SIZE-500。
7.使用权利要求1～6任一所述试剂盒进行精液来源鉴定及个人识别的方法，包括以下步骤：
1）、提取待测样本DNA，进行亚硫酸氢盐脱氨化处理，以亚硫酸氢盐转化后的DNA为模板，利用试剂盒中17对精液特异性CpG-InDel/STR标记的特异性PCR引物、1对阴道分泌物CpG位点特异性PCR引物、1对唾液CpG位点特异性PCR引物、1对血液CpG位点特异性PCR引物和1对性别识别AMEL位点特异性PCR引物构建多重PCR扩增体系，进行多重PCR扩增得到扩增产物；
2）、成功扩增的PCR产物以CE验证，经毛细管电泳分离，使用基因分析软件进行基因型结果分析。
CN202210308280.7A 2022-03-28 2022-03-28 基于CpG-InDel/STR标记的精液来源鉴定及个人识别试剂盒 Active CN114480678B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210308280.7A CN114480678B (zh) 2022-03-28 2022-03-28 基于CpG-InDel/STR标记的精液来源鉴定及个人识别试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210308280.7A CN114480678B (zh) 2022-03-28 2022-03-28 基于CpG-InDel/STR标记的精液来源鉴定及个人识别试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114480678A CN114480678A (zh) 2022-05-13
CN114480678B true CN114480678B (zh) 2023-09-05

Family

ID=81489147

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210308280.7A Active CN114480678B (zh) 2022-03-28 2022-03-28 基于CpG-InDel/STR标记的精液来源鉴定及个人识别试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114480678B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106868150A (zh) * 2017-03-09 2017-06-20 广州市刑事科学技术研究所 一种人类常染色体和Y染色体InDel遗传多态性位点复合扩增试剂盒及其应用
CN110551830A (zh) * 2019-09-27 2019-12-10 湖北崇新司法鉴定中心 人y-str基因座荧光标记试剂盒及检测方法
CN110628921A (zh) * 2019-11-14 2019-12-31 山西医科大学 一种人DIP-InDel基因座荧光标记试剂盒及检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106868150A (zh) * 2017-03-09 2017-06-20 广州市刑事科学技术研究所 一种人类常染色体和Y染色体InDel遗传多态性位点复合扩增试剂盒及其应用
CN110551830A (zh) * 2019-09-27 2019-12-10 湖北崇新司法鉴定中心 人y-str基因座荧光标记试剂盒及检测方法
CN110628921A (zh) * 2019-11-14 2019-12-31 山西医科大学 一种人DIP-InDel基因座荧光标记试剂盒及检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN114480678A (zh) 2022-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Szewc-McFadden et al. Identification of polymorphic, conserved simple sequence repeats (SSRs) in cultivated Brassica species
US5437975A (en) Consensus sequence primed polymerase chain reaction method for fingerprinting genomes
EP0620862B1 (en) Method for the identification of microorganisms by the utilization of directed and arbitrary dna amplification
Ma et al. Species identification of medicinal pteridophytes by a DNA barcode marker, the chloroplast psbA-trnH intergenic region
CN107385064B (zh) 一种同时扩增人常染色体snp和str位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用
CN107849618A (zh) 鉴别和检测水生生物传染病致病病毒的遗传标记以及使用其的致病病毒鉴别和检测方法
CN106868187A (zh) 多重pcr引物、试剂盒及用途
CN111979303A (zh) 一种核酸检测试剂盒、方法及其应用
CN105524983A (zh) 基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多个特定基因的方法和试剂盒
CN110656187A (zh) 多重raa以及多重pcr检测病变组织或犬粪便中棘球绦虫的试剂盒及检测方法
CN110724762B (zh) 一种非洲猪瘟病毒的lamp检测引物及检测方法
CN107557488B (zh) 甘蓝型油菜芥菜细胞质雄性不育育性恢复基因的分子标记
CN104031989B (zh) 一种人基因组dna26个基因座的复合扩增的试剂盒
CN107338287A (zh) Taqman‑MGB探针检测绵羊BMPR‑IB基因A746G突变的试剂盒和方法
CN114480678B (zh) 基于CpG-InDel/STR标记的精液来源鉴定及个人识别试剂盒
SG174036A1 (en) Multiplex analysis of nucleic acids
CN115976227A (zh) 一种基于CpG-SNP连锁标记的血液来源鉴定及个人识别的试剂盒以及检测方法
NL2031160B1 (en) Primer Set, Probe and Application for Distinguishing Brucella S2 Vaccine Strain from Wild Strain
CN102102127A (zh) 一种适用于转人α-乳清蛋白基因牛的快速简便检测方法
CN110551830B (zh) 人y-str基因座荧光标记试剂盒及检测方法
CN110628921B (zh) 一种人DIP-InDel基因座荧光标记试剂盒及检测方法
CN110093436B (zh) 用于鉴定桉树无性系的snp位点多色荧光检测引物、试剂盒、检测方法及其应用
CN112708658A (zh) 一种多重耐药基因检测的液态芯片引物组及其应用
CN105779570A (zh) 一种检测snp位点的方法
CN116377112B (zh) 十二种弱寄生蜜环菌通用多态性微卫星分子标记及其引物与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant