CN106868187A - 多重pcr引物、试剂盒及用途 - Google Patents

多重pcr引物、试剂盒及用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于下一代测序技术检测β‑地中海贫血突变的多重PCR引物，所述多重PCR引物为如下引物对中的两对或多对：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示引物对、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示引物对、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示引物对、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示引物对、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示引物对、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示引物对。

Description

多重PCR引物、试剂盒及用途
相关申请
本申请是申请日为2015年11月4日，名称为“一种基于下一代测序技术检测β-地中海贫血突变的多重PCR引物和方法及应用”的中国专利申请201510740909.5的分案。
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及引物，特别涉及多重PCR引物、试剂盒及用途。
背景技术
β-地中海贫血是一种由于β-珠蛋白基因(HBB)突变导致肽链表达失衡而产生的单基因遗传血液病，多由β-珠蛋白基因点突变所致。β-地中海贫血是世界上最常见的遗传性之一，据统计全世界约有1亿多人携带β-地中海贫血基因。β-地中海贫血也是我国南方各省最常见、危害最大的遗传病之一，我国部分省份的B-地中海贫血携带率见表1。地中海贫血基因主要为点突变，在中国南方人群中B-地中海贫血基因覆盖了46种点突变。
表1中国南方B地贫的人群携带率
地区 β地贪携带率(％)
广州 2.54
广西 6.78
四川 2.18
贵州 4.72
台湾 1.10
香港 3.41
B-地中海贫血的基因诊断方法主要有：Sanger测序法、限制性片段长度多态性(RFLP)、反向点杂交(RDB)、等位基因特异性PCR(ARMS-PCR)。Sanger测序方法操作较繁琐，极大地限制了其在临床诊断中的应用，测序的检测通量也有限，并且对检测结果需要人工分析，分析耗时耗力。RFLP是通过识别特异性序列位点进行酶切反应，方法简便成本低廉，但其局限性是只能对有限的可产生酶切位点的突变进行检测，由于不完全或部分酶切反应还会导致假阳性或假阴性结果。反向点杂交技术的结果是用肉眼判读，失误率高，往往造成一份样本反复检测。ARMS-PCR需针对每个突变设计相应引物，每一对引物扩增条件都需优化，若需同时检测多种突变时则操作繁琐，而且也会出现假阳性或假阴性结果。
基于地中海贫血缺陷基因的市场和社会检测需求，以及目前地中海贫血缺陷基因检测现状的落后，利用高通量测序技术开发地中海贫血基因突变位点检测试剂盒势在必行。
发明内容
鉴于此，本发明提供了一种基于下一代测序技术检测β-地中海贫血突变的多重PCR引物和方法及应用。
第一方面，本发明提供了一种多重PCR引物。根据本发明的实施例，所述多重PCR引物由四对引物对组成：所述四对引物为与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物对、SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4所示引物对、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示引物对以及SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示引物对分别对应的引物序列，所述四对引物对中的至少一条引物序列比SEQ ID NO：1-8中的相应序列的3’端多或者少0～3个核苷酸。
该多重PCR引物由四对引物组成，即八条序列组成，该八条序列与SEQ ID NO：1-8一一对应，该8条序列中的一条、两条、三条、四条、五条、六条、七条或者全部八条与SEQ IDNO：1-8中的相应序列相比，在3′端多或者少0～3个核苷酸。所称序列的3′端和5′端是相对的，在本文中，3′端和5′端照本领域常规定义或者本领域技术人员常规理解。
发明人基于目标序列特点多次设计，以及多次组合试验筛选，确定了这一组多重PCR引物，该组引物均针对相同的基因HBB，序列具有接近的Tm值以及GC比例，利于在同一反应体系同一条件下进行有效扩增。而且，利用该组引物扩增获得的扩增产物的长度接近，利于后续扩增产物的分离提取操作以及进一步分析。利用该多重PCR引物，能够一次性获得高保真的HBB基因序列的至少一部分，继而能够用于一次性高效地检测HBB基因上的多个突变位点。所称的四对引物，与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2引物对相对应的引物对，能够在同一反应体系中不受其它引物对的影响地实现目标区域的至少一部分的扩增，同样地，与SEQID NO：3和SEQ ID NO：4引物对对应的引物对、与SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6引物对对应的引物对、以及SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8引物对对应的引物对能够在同一反应体系中不受其它引物对干扰或影响地实现目标区域的至少一部分的扩增。
本发明提供的多重PCR引物能够用于高效的获取HBB基因序列，以及用于β-地中海贫血突变多样性的高效检测，可覆盖中国南方人群β-地中海贫血突变的多个点突变位点。
根据本发明的实施例，上述多重PCR引物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述四对引物对为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物对、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示引物对、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示引物以及SEQID NO：7和SEQ ID NO：8所示引物对。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物对、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示引物对、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示引物对以及SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示引物对均能够在同一反应体系中不受其它引物对的影响、高保真地实现HBB基因序列的至少一部分的扩增，以及用于β-地中海贫血突变多样性的高效检测。本领域技术人员可以理解，一组能够在同一反应体系同一条件下实现目标区域准确、高保真扩增的引物对序列，其中的任一部分引物对序列的组合，也同样能够在同一反应体系同一条件下实现目标区域的有效扩增；反之亦成立。
根据本发明的实施例，所述多重PCR引物还包括以下引物对中的一对或者两对：SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示引物对以及SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示引物对。SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示引物对、和/或SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示引物对分别/均能够在同一反应体系中不受其它引物对的影响、高保真地实现HBB基因序列的至少一部分的扩增，以及用于β-地中海贫血突变多样性的高效检测。
第二方面，本发明提出了前面第一方面或者任一实施例中的多重PCR引物在获得和/或检测HBB基因序列中的用途。
第三方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括前面第一方面或者任一实施例中的多重PCR引物。前述对本发明一方面或者任一实施例中多重PCR引物的优点和技术特征的描述，同样适用本发明这一方面的试剂盒，在此不再赘述。
第四方面，本发明提出了所称的试剂盒在下列至少之一中的用途：获得和/或检测HBB基因序列；检测β-地中海贫血症；检测β-地中海贫血突变多态性。
第五方面，本发明提出了一种获得HBB基因序列的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括利用前面任一实施例中的多重PCR引物进行扩增的步骤。前述对本发明一方面或者任一实施例中多重PCR引物的优点和技术特征的描述，同样适用本发明这一方面的试剂盒，在此不再赘述。该方法能够高效地获得高保真的HBB基因序列，利于HBB基因序列的后续检测分析。
第六方面，本发明提出了一种检测HBB基因序列的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)利用前面的获得HBB基因序列的方法对待测样品中的至少一部分核酸进行扩增，获得扩增产物；(2)分析所述扩增产物，以获得HBB基因检测结果。
根据本发明的实施例，上述HBB基因检测的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述核酸为DNA和/或RNA。
根据本发明的具体实施例，当所述核酸为DNA时，进行多重PCR的体系可参照普通PCR体系进行配置。
根据本发明的实施例，所述核酸为RNA，步骤(1)包括：(1-1)利用所述多重PCR引物中的上游或下游引物将所述RNA反转录为cDNA；(1-2)利用所述多重PCR引物中相应的下游或上游引物对所述cDNA进行扩增，获得双链DNA；(1-3)利用所述多重PCR引物对所述双链DNA进行扩增，获得所述扩增产物。根据本发明的具体实施例，当所述取核酸为RNA时，要先进行逆转录合成cDNA，再合成第二链DNA，获得双链DNA，以获得后续多重PCR的模板。逆转录合成cDNA的步骤可看作是一个循环的多重PCR(只采用上游引物组或下游引物组)，合成第二链DNA的步骤也可看作是一个循环的多重PCR(只采用下游引物组或上游引物组)。
根据本发明的实施例，所述多重PCR反应的体系中，上游引物组中的各上游引物等摩尔混合；下游引物组中的各下游引物等摩尔混合。
根据本发明的具体实施例，所述多重PCR反应的体系中，模板量50ng～1μg/50μl体系。
根据本发明的具体实施例，所述多重PCR反应的程序为：
上述程序具体为：95℃预变性15min，95℃变性15s，60℃退火2min，72℃延伸3min，循环30～40次(优选为35次)，最后72℃后延伸10min。
根据本发明的再一具体实施例，所述多重PCR反应结束后，电泳，割胶回收片段长度为240-270bp的DNA片段。
如本发明所述的，“上游引物组”或“下游引物组”为如第一方面所述的多重PCR引物中各引物对的上游引物或下游引物组成的上游引物组或下游引物组；具体地，本发明用“F”表示上游引物，用“R”表示下游引物，如表2所示。
根据本发明的实施例，步骤(2)包括：(2-1)对所述扩增产物进行测序；以及(2-2)将测序结果与HBB基因野生型序列比对，以确定HBB基因的突变位点。
第七方面，本发明提出了一种检测β-地中海贫血症的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用前面所述的HBB基因检测方法进行HBB基因检测，获得检测结果，所述待测样品来自受检者；以及依据检测结果，评估受检者的患β-地中海贫血症风险。
根据本发明的实施例，上述检测β-地中海贫血症的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，利用前面所述的HBB基因检测方法进行HBB基因检测，获得检测结果是通过如下方式实现的：将所得多重PCR产物进行建库，进行高通量测序，并通过生物信息学分析获得高通量测序结果。进而依据测序结果，分析β-地中海贫血突变，评估受检者的患β-地中海贫血症风险。
根据本发明的具体实施例，所述检测结果具有表3所示的突变位点的至少之一，是患者患有β地中海贫血症的指示。
本发明提供的基于下一代测序技术检测β-地中海贫血突变的多重PCR引物及方法的有益效果为：1)覆盖了南方人群几十种点突变位点；2)平均扩增产物的长度在250bp左右，扩增的产物可用于所有的下一代测序平台。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明实施例提供的单独引物PCR的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为本发明实施例提供的多重PCR的琼脂糖凝胶电泳图；以及
图3为本发明实施例提供的测序深度的生物信息学分析结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
材料及试剂说明：
β地中海贫血患者：来源于深圳市人民医院，患者知情同意。非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。
具体地，本发明引物如表2所示：
表2：多重PCR引物序列
设计引物：采用Oligo 7.0和MFEprimer-2.0对引物二聚体以及茎环错配进行分析，在包含突变位点的外显子两端设计引物，扩增的序列平均长度在250bp左右，且6对引物的退火温度基本一致。
本实施例提供的引物组覆盖了南方人群46个点突变位点。由于很小的序列变化将导致引物扩增效果显著降低，发明人分别针对不同目的区域的不同区段设计了多组多重PCR引物组，在经过预实验筛选后，综合产物片段长度和点突变覆盖范围，本发明选取了扩增效果最佳的引物组，如表2所示。
表3为46种见于中国南方人群导致表达降低的β地中海贫血点突变及对应的本发明的引物。
表3
实施例1
实施例1提供了一种β-地中海贫血突变待测DNA样品的制备方法，包括如下步骤：
收集的新鲜外周血样本各2毫升(ml)，采用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen，Cat.No：51304)试剂盒提取基因组DNA，并用Nanodrop2000(Thermo)测定DNA的浓度及纯度，然后保存基因组DNA。
实施例2
实施例2提供了一种采用检测β-地中海贫血突变的多重PCR引物构建β-地中海贫血突变测序文库的方法，包括如下步骤：
1、多重PCR：
以实施例1所得基因组DNA为扩增模板，采用SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：12所示共6对引物对，再采用QIAGEN公司Multiplex PCR试剂盒(货号：206143)，按试剂盒说明书配置多重PCR体系。反应体系如表4所示：
表4：
多重PCR缓冲液(Multiplex Buffer，2×) 25μl
Q溶剂(Q solution，5×) 10μl
引物 5μl
DNA 10μl
Total 50μl
各引物等摩尔混合，引物总浓度是10微摩尔，模板量可以调整，本实施例中采用200ng。
再按下述多重PCR的条件设置PCR仪器程序，进行多重PCR：
PCR结束后，4℃保存PCR产物并电泳检测，在紫外下切下约240-270bp左右的目的片段。直接回收剩余的PCR产物，得到27uL纯化后的产物，回收步骤采用QIAGEN公司QIAquick胶纯化试剂盒，按常规实验室操作进行)。
为充分说明书本发明实施例的有益效果，本发明单独对表2中的6对引物进行PCR预实验，PCR体系和循环参数等均与上述多重PCR一样，除引物分别替换为表2的P1(HBB-1F和HBB-1R)、P2(HBB-2F和HBB-2R)、P3(HBB-3F和HBB-3R)、P4(HBB-4F和HBB-4R)、P5(HBB-5F和HBB-5R)和P6(HBB-6F和HBB-6R)共6对引物。
6对引物单独PCR的扩增产物电泳图谱如图1所示。6对引物的退火温度基本一致，扩增效率一致，扩增产物长度基本接近，平均长度在250bp左右。6对引物的扩增产物覆盖了β-地中海贫血突变的46种点突变位点。
2、加尾：
取纯化后的PCR产物，在产物3’末端加A尾，配置体系如表5所示(其中，Klenowexo-购自NEB，货号：M0212)：
表5：
将该体系置于37℃下30min。利用QIAGEN公司QIAquick胶纯化试剂盒纯化加A尾的PCR产物。
3、加接头：
在DNA两端加上测序用的接头，配置体系如表6所示(其中，Quick ligase购自NEB，M2200L)：
表6：
5×quick ligase buffer 10μl
Adaptor 1μl
Quick ligase 5μl
加A尾的PCR产物 25μl
9μl
Total 50μl
其中，Adaptor的序列如SEQ ID NO：13所示：
5’-/5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC/ideoxyU/ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3’(SEQ ID NO：13)。
随后将该体系置于20℃下15min。然后加入3μL的USER，37℃放置15min。最后通过QIAGEN公司QIAquick胶回收试剂盒纯化连接产物。
4、产物上加入测序用的标签序列，配置体系如表7所示(具体步骤参照illumina高通量测序文库构建说明书)
表7：
5×Q5 Solution buffer 10μl
dNTP(10mM) 1μl
P1(P5序列+common序列+接头序列) 1μl
Index(P7序列+标签序列Index+接头序列) 1μl
Q5酶 0.5μl
纯化后的连接产物 36.5μl
Total 50μl
将配置的体系按下述程序进行PCR反应：
PCR结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物富集片段的大小，选取370bp的目的片段进行切胶回收，并纯化至30μL。
琼脂糖凝胶电泳结果图2所示。在图2中，T1泳道可以明显看到在300bp-400bp之间有一条带，为加上接头的片段(370bp，箭头所指处)，与理论相符。
5、将步骤4获得的纯化产物直接用Miseq平台测序进行测序。
测序结果是fastq格式的数据，通过生物信息学分析获得β地中海贫血点突变情况。测序深度见图3。本实施例使用PE150试剂盒进行测序，即片段两端各测序150bp。生物信息学分析测序深度如图3所示，横坐标是利用每对引物得到的扩增产物，纵坐标是测序深度。由图3可知，本实施例测序结果中覆盖了所有引物对的扩增产物，并且分布比较平均。
效果实施例1
采用实施例2的方法，对14例样品分别进行多重PCR、加A尾、加接头、加标签序列、高通量测序及生物信息学分析，获得如下结果，部分结果如表8所示：
表8：β-地中海贫血突变检测结果
如表8所示，在14例样品中，共检测到11处突变。特别值得注意的是，经过对样品测序的数据分析，证实所设计的目标序列在每个DNA样品中均得到有效的扩增，从而反映出所提供的检测方案具有较好的特异性和适用性。
在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市瀚海基因生物科技有限公司
<120> 多重PCR引物、试剂盒及用途
<130> PI2015018_2
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 多重PCR引物（HBB-1F）
<400> 1
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<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 多重PCR引物（HBB-1R）
<400> 2
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<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 多重PCR引物（HBB-2F）
<400> 3
agaagtctgc cgttactgc 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 多重PCR引物（HBB-2R）
<400> 4
gacagatccc caaaggact 19
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 多重PCR引物（HBB-3F）
<400> 5
caagacaggt ttaagg 16
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 多重PCR引物（HBB-3R）
<400> 6
ccaggtgagc caggccat 18
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 多重PCR引物（HBB-4F）
<400> 7
caacctcaag ggcaccttt 19
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 多重PCR引物（HBB-4R）
<400> 8
agcaaataaa agaaactaaa acgat 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 多重PCR引物（HBB-5F）
<400> 9
aacagtgata atttctgggt taagg 25
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 多重PCR引物（HBB-5R）
<400> 10
ccaaagtgat gggccagc 18
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 多重PCR引物（HBB-6F）
<400> 11
caggctgcct atcagaaag 19
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 多重PCR引物（HBB-6R）
<400> 12
atgcactgac ctcccacatt c 21
<210> 13
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Adaptor的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 磷酸化修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> 脱氧修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (65)..(65)
<223> 硫代磷酸酯修饰
<400> 13
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cuacactctt tccctacacg acgctcttcc 60
gatct 65

Claims (10)

1.一种多重PCR引物，其特征在于，由以下四对引物对组成：
所述四对引物为与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示引物对、SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示引物对、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示引物对以及SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示引物对分别对应的引物序列，所述四对引物对中的至少一条引物序列比SEQ ID NO:1-8中的相应序列的3’端多或者少0～3个核苷酸。
2.权利要求1的多重PCR引物，其特征在于，所述四对引物对为SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示引物对、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示引物对、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示引物以及SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示引物对。
3.权利要求1或2的多重PCR引物，其特征在于，所述多重PCR引物还包括以下引物对中的至少一对：
SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示引物对、以及SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示引物对。
4.一种试剂盒，其包括权利要求1-3任一多重PCR引物。
5.权利要求1-3任一多重PCR引物或者权利要求4的试剂盒在获得和/或检测HBB基因序列中的用途。
6.一种获取HBB基因序列的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1-3任一多重PCR引物进行多重PCR，以获得HBB基因序列。
7.一种检测HBB基因序列的方法，其特征在于，包括：
(1)利用权利要求6的方法对待测样品中的至少一部分核酸进行扩增，获得扩增产物；
(2)分析所述扩增产物，以获得HBB基因序列检测结果。
8.权利要求7的方法，其特征在于，所述核酸为DNA和/或RNA。
9.权利要求8的方法，其特征在于，所述核酸为RNA，步骤(1)包括：
(1-1)利用所述多重PCR引物中的上游或下游引物将所述RNA反转录为cDNA；
(1-2)利用所述多重PCR引物中相应的下游或上游引物对所述cDNA进行扩增，获得双链DNA；
(1-3)利用所述多重PCR引物对所述双链DNA进行扩增，获得所述扩增产物。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括：
(2-1)对所述扩增产物进行测序；以及
(2-2)将测序结果与HBB基因野生型序列比对，以确定HBB基因的突变位点。
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