CN108796042B - 遗传性贫血检测用的核酸组合物、检测试剂盒及使用方法 - Google Patents

遗传性贫血检测用的核酸组合物、检测试剂盒及使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108796042B
CN108796042B CN201810502158.7A CN201810502158A CN108796042B CN 108796042 B CN108796042 B CN 108796042B CN 201810502158 A CN201810502158 A CN 201810502158A CN 108796042 B CN108796042 B CN 108796042B
Authority
CN
China
Prior art keywords
anemia
seq
detection
alpha
thalassemia
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810502158.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108796042A (zh
Inventor
吴海涛
沈政
聂慧蓉
施念
吴灵
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beibei Stem Cell And Regenerative Medicine Translational Research Institute Co ltd
Original Assignee
Beibei Stem Cell And Regenerative Medicine Translational Research Institute Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beibei Stem Cell And Regenerative Medicine Translational Research Institute Co ltd filed Critical Beibei Stem Cell And Regenerative Medicine Translational Research Institute Co ltd
Priority to CN201810502158.7A priority Critical patent/CN108796042B/zh
Publication of CN108796042A publication Critical patent/CN108796042A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108796042B publication Critical patent/CN108796042B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material

Abstract

本发明涉及一种遗传性贫血检测用的核酸组合物、检测试剂盒及其使用方法。该遗传性贫血检测用的核酸组合物及检测试剂盒可用于同时检测包括4种缺失型α地中海贫血基因、3种非缺失型α地中海贫血基因、19种突变型β地中海贫血基因以及镰刀形贫血基因等遗传学贫血以及具体的基因突变类型。相比现有同类技术，该遗传性贫血检测试剂盒增加了几种遗传性贫血的突变检测类型，如αTHAI缺失的地中海贫血、镰刀形贫血以及71/72(+T)突变和‑28M(A‑C)突变这两种较为少见的β‑地中海贫血类型。增加的这几种遗传性贫血类型的检测，可以为临床上遗传性贫血的检测提供直观的参考和提示，因而可以大大减少临床上遗传性贫血漏检的风险，降低重型贫血患儿的出生率。

Description

遗传性贫血检测用的核酸组合物、检测试剂盒及使用方法
技术领域
本发明涉及分子生物学及生物医学技术领域，尤其是涉及一种遗传性贫血检测用的核酸组合物、检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
遗传性贫血是一种遗传性或基因突变导致生成血红蛋白的珠蛋白肽链的结构或合成速率改变，从而引起功能异常所致的一种贫血性溶血，主要包括异常血红蛋白病和珠蛋白合成障碍性贫血。镰刀形贫血是最主要的异常血红蛋白病，其是由基因突变导致珠蛋白结构改变而导致的贫血；地中海贫血是最主要的珠蛋白合成障碍性贫血，其是由基因突变导致珠蛋白肽链合成缺失或合成量异常而导致的贫血。地中海贫血主要有两种类型，分别是α珠蛋白链合成减缺导致的α-地中海贫血以及β珠蛋白链合成减缺导致的β-地中海贫血。
据世界卫生组织估计，全球约有1.5亿人携带血红蛋白病基因(遗传性贫血)，并已将血红蛋白病列为严重危害人类健康的6种常见病之一。异常血红蛋白病在我国以云南、贵州、广西、新疆等地发病率较高，地中海贫血多发于华南及西南地区。根据近10年来我国28个省市、自治区近100万人口的普查资料，异常血红蛋白病的发病率为0.33％，α地中海贫血的发病率为2.64％，β地中海贫血的发病率为0.66％。其中在某些高发地区，比如广西和广东地区，α地中海贫血的发病率高达14.95％和4.11％；β地中海贫血的发病率，广东地区为1.83％-3.36％，广西地区和海南地区发病率更高，达到5％-6％。
镰刀形贫血症是一种常染色体隐性基因遗传病。患病者的血液红细胞表现为镰刀状，其携带氧的功能只有正常红细胞的一半。镰刀形贫血是最常见的异常血红蛋白病，其β链第六位的谷氨酸被缬氨酸替代，导致HbS多聚体形成，红细胞发生镰形改变，导致溶血、贫血和血管梗阻性等继发症状。该病在黑色人种中发病率最高，例如美国黑人发病率为14％，印度希腊等地中海国家发病率也较高，我国南方地区部分省市，如广西、云南、贵州等，发病率也超过千分之一。该病目前没有特效治疗手段，主要靠输血维持，患者多在成年前死亡。此外就是应用基因诊断做出产前诊断来降低发病率。
α地中海贫血主要是基因缺失型(缺失1个α珠蛋白基因或2个α珠蛋白基因)，少数为非基因缺失型(主要为α珠蛋白基因发生点突变或少数碱基缺失)。其中我国以东南亚缺失型—αSEA、右侧缺失型－α3.7、左侧缺失型－α4.2最为常见。根据这三种基因型在个体中的不同组合，可表现为静止型、标准型、血红蛋白H病(HbH病)以及最严重的Hb Bart’s胎儿水肿综合症。非缺失型α地中海贫血，我国则以HbCS和HbQS最常见。α地中海贫血点突变型是导致α地贫漏诊的主要原因，其在我国南方的发病率也较高。HbCS和HbQS在广西地区的发病率为1.21％和0.36％，而且点突变主要位于功能性较强的α2基因，故其临床表现要较为强烈。纯合的非缺失型α地中海贫血则会导致严重的HbH病。
β地中海贫血也可分为缺失型与非缺失型，大多数β地中海贫血属于非缺失型突变(点突变或者少数几个碱基缺失及插入)。β地中海贫血在我国广西、云南、广东、海南、台湾、香港、四川等南方省市地区发病率较高，是南方最常见、危害性最高的遗传病之一，其表型分为β0(即无β珠蛋白产生)和β+(有较低水平β珠蛋白产生)。轻型β地中海贫血为杂合子，重型β地中海贫血多为纯合子或双重杂合子。我国最常见β地中海贫血基因突变有：CD41－42(－CTTT)、IVS－Ⅱ－654(C＞T)、CD17(A＞T)等，以上在我国南方地区患病人群基因频率超过90％。
目前常见的遗传性贫血检测方法主要有跨越断裂点PCR(GAP-PCR)、PCR-反向点杂交(PCR-RDB)以及PCR-寡核苷酸探针(PCR-ASO)、微阵列芯片、荧光PCR熔解曲线法、PCR-流式荧光杂交法等。国内临床最主要的应用方法为PCR-反向点杂交法。以上方法中，跨越断裂点PCR已经应用于临床检测，但只适用于缺失型α-地中海贫血基因检测，对点突变或少数几个碱基缺失及插入检测不出。微阵列芯片、荧光PCR熔解曲线法以及PCR-流式荧光杂交法等检测的精度较好，范围也较大，但其操作要求条件高，需要精密仪器以及荧光探针等，检测费用较高，不太适合大规模推广。PCR-反向点杂交法是目前临床上进行基因检测最常用的检测方法，其精度高，操作简单，花费低，对仪器以及操作人员水平要求不高，便于大规模推广应用。
目前绝大多数的检测方法或试剂盒产品都是进行地中海贫血的检测，并且检测通量有限，国内尚无进行镰刀形贫血基因检测的适用于临床的检测产品和方法。另外，在我国南方沿海地区，尤其是两广地区，因为与越南泰国等交流与通婚等，THAI缺失导致的地中海贫血也时有发生，但目前并没有针对这类地中海贫血的检测产品和检测方法。此外，α珠蛋白基因簇高GC含量和高同源性，PCR扩增难度大，现有检测试剂盒普遍存在引物设计不合理、检测探针准确度差的问题，给结果判定造成了不少麻烦，不利于在科研或临床应用中推广。因此设计检测范围更广、操作更方便、结果更准确的遗传性贫血检测产品显得尤为必要。
发明内容
基于此，有必要提供一种遗传性贫血检测用的核酸组合物、检测试剂盒及其使用方法。
一种遗传性贫血检测用的核酸组合物，包括PCR扩增引物和检测探针；
所述PCR扩增引物包括：序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的αTHAI缺失型地中海贫血的扩增引物对、序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的αSEA缺失型地中海贫血的扩增引物对、序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的α4.2缺失型地中海贫血的扩增引物对、序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的α3.7缺失型地中海贫血的扩增引物对、序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的非缺失型α地中海贫血的扩增引物对、以及序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的和序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的β地中海贫血和镰刀型贫血的扩增引物对；
所述检测探针包括44条序列或互补序列分别如SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.58所示的突变探针和对照探针。
一种遗传性贫血检测试剂盒，包括基底和上述遗传性贫血检测用的核酸组合物，所述PCR扩增引物的5’端具有连接标记物，各所述突变探针和各所述对照探针固定于所述基底的不同区域。
在其中一个实施例中，所述序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的α3.7缺失型地中海贫血的扩增引物对独立于其他各扩增引物对存放。
在其中一个实施例中，所述连接标记物为生物素、亲和素或链霉亲和素。
在其中一个实施例中，各所述突变探针和各所述对照探针的5’端具有氨基标记。
在其中一个实施例中，所述基底为尼龙膜。
在其中一个实施例中，所述遗传性贫血检测试剂盒还包括杂交缓冲液、清洗缓冲液、柠檬酸钠溶液、显色剂以及氧化剂中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述杂交缓冲液为2×SSC与0.1wt％SDS的混合溶液；所述清洗缓冲液为0.5×SSC与0.1wt％SDS的混合溶液；所述柠檬酸钠溶液的pH 5.0，浓度为0.1M；所述显色剂为TMB；所述氧化剂是浓度为3wt％的过氧化氢。
一种上述任一实施例所述的遗传性贫血检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
配制PCR反应液，其中所述序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的α3.7缺失型地中海贫血的扩增引物对独立于其他各扩增引物对单独用于配制第一PCR反应液，其他各扩增引物对混合在一起配制第二PCR反应液；
对所述第一PCR反应液和所述第二PCR反应液进行PCR扩增反应，反应结束后将产物混合；
将混合的产物与固定在基底上的检测探针进行显色反应。
在其中一个实施例中，所述PCR反应的条件是：98℃、30s；98℃、10s，65℃、20s，72℃、60s，共35个循环；72℃、7min。
上述遗传性贫血检测用的核酸组合物以及检测试剂盒可用于同时检测包括4种缺失型α地中海贫血基因(-α3.7、-α4.2、-αSEA和-αTHAI)、3种非缺失型α地中海贫血基因(-αCSα、-αQSα和-αWSα)、19种突变型β地中海贫血基因以及镰刀形贫血基因等遗传学贫血以及具体的基因突变类型。相比现有同类技术，该遗传性贫血检测用的核酸组合物增加了几种遗传性贫血的突变检测类型，如αTHAI缺失的地中海贫血、镰刀形贫血以及71/72(+T)突变和-28M(A-C)突变这两种较为少见的β-地中海贫血类型。增加的这几种遗传性贫血类型的检测，可以为临床上遗传性贫血的检测提供直观的参考和提示，因而可以大大减少临床上遗传性贫血漏检的风险，降低重型贫血患儿的出生率。
尤其是，该遗传性贫血检测用的核酸组合物以及检测试剂盒创造性地通过的引物设计，部分扩增引物对扩增的目的片段同时涵盖多个突变位点，因而一次扩增就能够进行多个突变型的检测，避免了因扩增引物设计过多而影响多重PCR扩增的效果，保证了扩增的效率以及扩增的质量，提高了检测结果的准确性和可靠性。进一步，在检测探针设计时，充分考虑扩增的目的片段的保守性，部分遗传性贫血突变型共用一个对照探针，部分对照探针位于扩增的目的片段之中，因而对照探针不仅仅可以作为阴性对照来检测，也可以作为阳性样本扩增效果的进一步验证，这样进一步提高了检测结果的可信度。
该遗传性贫血检测用的核酸组合物以及检测试剂盒适用于婚前、孕期、新生儿、遗传学贫血高发区人群以及有遗传学贫血家族史的人群等多种类型的患者的检测，其检测结果可以作为中间结果或者参考结果进行遗传性贫血的辅助筛查和诊断，检测时间短、成本低、效率高、操作方便，重复性好，易于推广。
此外，本发明经过大量创造性的实验，对遗传性贫血检测试剂盒的使用方法过程中的各项参数进行优化和调整，使得可以通过使用一个DNA聚合酶以及一次PCR扩增，即可得到所需的全部杂交片段，大大节省了人力、时间和仪器资源，且样本来源广泛，可以使用血液、血片、唾液和尿液等各类样本组织，操作方便，便于推广。
附图说明
图1a、1b和1c为遗传性贫血检测用的核酸组合物中PCR引物和检测探针的设计示意图；
图2为基底上各检测探针的分布示意图；
图3为正常人基因组DNA的检测结果；
图4为41/42M/N的β地贫杂合子的检测结果；
图5为镰刀形贫血杂合子的检测结果；
图6为αWSα的WS突变杂合子的检测结果；
图7为-α4.2/αα的缺失型α地贫突变杂合子的检测结果；
图8为-αSEA/αα的缺失型α地贫突变杂合子的检测结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明采用PCR-点杂交的方法，根据遗传性贫血的各个基因型设计相应的较佳的PCR扩增引物和检测探针，构成遗传性贫血检测用的核酸组合物，再用生物素、亲和素或链霉亲和素等连接标记物来标记PCR扩增引物，用氨基等连接基团标记检测探针，将检测探针预先标记在羧基修饰的尼龙膜等基底上，然后将特异的PCR扩增片段与检测探针杂交，最后通过显影识别遗传性贫血的类型。本发明在遗传性贫血的检测时基本上只要通过一台PCR仪一个扩增反应就能够将所设计的所有贫血基因型的基因片段扩增出来，有效的增加了扩增效率；并且通过对检测探针进行优化设计，显著增加检测探针与扩增片段的结合程度；此外，增加了包括镰刀形贫血类型在内的一些贫血检测类型，使得贫血检测和筛选更具推广性。
本发明设计的各PCR扩增引物要求在各贫血类型的基因组上扩增出单一片段，而且各引物的Tm接近，最高不要超过5℃。根据各贫血类型的突变信息设计相应的检测探针，要求设计的检测探针长度在15-25nt之间，GC含量40％-70％之间，Tm值50-60℃，且各检测探针的Tm接近，最高不要超过5℃。
在一具体的实例中，PCR扩增引物的5’端都为生物素标记，检测探针的5’端都为氨基标记。PCR扩增引物和检测探针在合成之后均经HPLC纯化处理。
图1a、1b和1c所示的是最终设计的PCR引物和检测探针的相对位置示意图，图中P1-P11分别代表检测-α4.2缺失突变、-α3.7缺失突变、αCS与对照、αQS与对照、αWS与对照、正常基因、-αTHAI缺失突变、-αSEA缺失突变的寡核苷酸探针，P12-P44分别代表检测β-地中海贫血和镰刀形贫血的突变探针及对照探针。最终设计的PCR扩增引物和检测探针的序列如下表1和表2所示：
表1
Figure BDA0001670718490000051
Figure BDA0001670718490000061
表2
Figure BDA0001670718490000062
Figure BDA0001670718490000071
表2中N代表正常对照探针，M代表突变探针。其中-28M1为-28(A-G)突变探针；-28M2为-28(A-C)突变探针；71/72M1为71/72(+A)突变探针；71/72M1为71/72(+T)突变探针；41/42M和43M有共同的对照探针41/42N；-28M1、-28M2、-29M、-30M和-32M有共同对照探针-28N；71/72M1和71/72M2有共同对照探针71/72N；14/15M和17M有共同对照探针14/15N。
优选地，直接选用序列如表2中所示序列的检测探针进行固定。
本发明的遗传性贫血检测试剂盒进一步还包括杂交缓冲液、清洗缓冲液、柠檬酸钠溶液、显色剂以及氧化剂中的至少一种。在一个具体的实例中，所述杂交缓冲液为2×SSC与0.1wt％SDS的混合溶液；所述清洗缓冲液为0.5×SSC与0.1wt％SDS的混合溶液；所述柠檬酸钠溶液的pH 5.0，浓度为0.1M；所述显色剂为TMB；所述氧化剂是浓度为3wt％的过氧化氢。如可以按照下表3中的主要成分和规格来设计检测试剂盒。
表3
Figure BDA0001670718490000081
本发明的遗传性贫血检测试剂盒在使用时，使用Phusion High-Fidelity DNA聚合酶扩增试剂盒(Thermo，货号F-530S)，其中反应液分成两部分配置。因-α3.7缺失突变扩增片段GC含量非常高，故使用试剂盒里的5×GC buffer，引物mix1包括3.7-F1(10μM)和3.7-R1(10μM)；其他的扩增片段因GC含量不太高，故使用5×F buffer，引物mix2包括β-F1(10μM)、β-R1(10μM)、β-F2(10μM)、β-R2(10μM)、α-F1(10μM)、α-R1(10μM)、THAI-F1(10μM)、THAI-R1(10μM)、SEA-F1(10μM)、SEA-R1(10μM)、4.2-F1(10μM)和4.2-R1(10μM)。
模板均为样本提取的基因组DNA(gDNA template)，浓度10-100ng/μl。
在一具体的实例中，第一PCR反应液的配方如下：
Figure BDA0001670718490000082
第二PCR反应液的配方如下：
Figure BDA0001670718490000083
更具体地，在一实例中，经过大量对比实验优化，第一PCR反应液和第二PCR反应液的共同的一较佳的PCR扩增反应条件确定是：98℃、30s；98℃、10s，65℃、20s，72℃、60s，共35个循环；72℃、7min；4℃存放。
本发明的遗传性贫血检测试剂盒在使用时，因涉及多对PCR扩增引物，不同的PCR扩增引物所需的退火温度等也都不同，故需要不断优化反应的退火温度、退火和延伸时间等，来得到特异性好、扩增效率高的反应条件和反应体系。
研究发现，该遗传性贫血检测试剂盒在使用时，杂交温度、杂交时间和洗膜时间等都对杂交反应和后续的显色有很大的影响，会直接影响结果的判读。本发明经过一系列的优化实验，确定了较佳的和最终的杂交条件。
例如，在一具体的实例中，杂交过程可按照如下步骤进行：
取一15ml塑料管，标明患者编号，放入同样标有患者编号的基底，加入A液(含2×SSC、0.1wt％SDS)12～15ml，加入全部PCR产物，拧紧盖子。将管放入沸水中加热10分钟，取出放入45℃杂交箱杂交1.5小时。同时在杂交箱里预热50ml B液(0.5×SSC、0.1wt％SDS)。
洗膜过程可按照如下步骤进行：
取出基底，移至装有45℃预热的B液(0.5×SSC、0.1wt％SDS)的50ml管中，杂交炉中进行洗涤10分钟(每管50ml溶液，最多可同时洗涤10张基底)。
显色过程可按照如下步骤进行：
用A液配制1:4000的Streptavidin-POD Conjugate溶液(Roche，货号1089153)，用50ml管，室温浸泡30分钟，期间使用旋转仪，使溶液缓慢摇晃或颠倒混匀，溶液和基底充分接触。弃去Streptavidin-POD Conjugate溶液，用A溶液室温洗两次，每次摇晃洗涤5min。用C溶液(0.1M pH5.0的NaCitrate(柠檬酸钠))室温洗膜两次，每次2分钟。配制显色液(19mlC溶液+1ml D溶液(TMB溶液)+10μl E溶液(3wt％H2O2溶液))，将基底避光浸泡3-5分钟可见斑点显现。
在使用过程中，还可以配合其他试剂或试剂盒以及相应的设备等一起使用，例如：
全血基因组提取试剂盒：可以是但不限于用promege的Wizard Genomic DNAPurificaiton Kit(货号A1120)或CWBIO的Blood Genomic DNA Midi Kit(1-5ml)(货号CW0541S)；
或唾液DNA提取试剂盒：可以是但不限于用百代生物的BIOG唾液DNA提取试剂盒(货号51043)；
或尿液DNA提取试剂盒：可以是但不限于用百代生物的BIOG尿液DNA提取试剂盒(货号51045)；
或血片DNA提取试剂盒：可以是但不限于用CWBIO的FTAcard DNA Kit(货号CW2275S)；
POD溶液：可以是但不限于用Roche的Streptavidin-POD conjugate(货号1089153)；
EDAC：可以是但不限于用Sigma的1-ETHYL-3-(3-DIMETHYLAMINOPROPYL)CARBODIIMIDE(货号E7750)；
PCR仪：常见的PCR仪都可，如德国耶拿的PCR(型号tadvanced 96G)；
分子杂交炉：如Thermo的分子杂交炉(型号Shanke'n'stack)；
旋转混匀器：如Life technologies的旋转混匀器(型号HulaMixer)。
基因组DNA的提取与制备可以参考但不限于如下方法：基因组DNA一般来自全血样品(1-5ml)，使用上述全血基因组DNA提取试剂盒进行提取，提取出的DNA经过Nanodrop2000进行浓度和纯度的测定，一般要求提取出的全血基因组DNA浓度为10-1000ng/μl，纯度A260/280为1.8-2.0之间。基因组DNA也可以通过其他来源的样本获取，比如唾液(3-5ml)、尿液(3-5ml)或血片。使用上述专门的唾液、尿液或血片DNA提取试剂盒，可以获得唾液、尿液或血片基因组DNA。提取出的DNA浓度较全血来源的DNA低，纯度也低于全血来源的DNA。要求其他来源的基因组DNA浓度为10-50ng/μl，纯度A260/280为1.6-2.0之间。
最后根据基底上不同区域的对照探针和突变探针的摆放顺序，可以得到相应的突变检测结果。该结果可以直观地显示出是否有相应的贫血基因突变，配合其他检测结果一起可最终诊断是否患有相应的遗传性贫血。
图2所示的为一具体实例中的基底上不同区域的检测探针的分布。最终判读时，空白对照膜条所有位点均不显色，否则应为污染，说明实验失败。以下列举了几例情形。
例如，当样本为正常无突变时，膜条上所有后缀标记为N(对照探针)的位点均显示为有色(实际是蓝色)斑点“·”，其他位点不显色，如下表4所示。
表4
41/42N· 654N· -28N· CAPN· BeN· 71/72N· 14/15N· SCDN·
41/42M 654M -28M1 CAPM BeM 71/72M1 14/15M SCDM
43M -32M -28M2 -29M -30M 71/72M2 17M
CD31N· 27/28N· IVS1-1N· IVS1-5N· ICN· WSN· QSN· CSN·
CD31M 27/28M IVS1-1M IVS1-5M ICM WSM QSM CSM
αN· αTHAI M αSEAM α3.7M α4.2M
非缺失突变杂合子，包括β地贫杂合子、镰刀形贫血突变杂合子、非缺失α突变杂合子，对应位点的突变探针为有色斑点“·”，所有位点的对照探针均显色为有色斑点“·”。以41/42突变杂合子(41/42M/N)为例，如下表5所示。
表5
Figure BDA0001670718490000101
Figure BDA0001670718490000111
非缺失突变纯合子，包括β地贫杂合子、镰刀形贫血突变杂合子、非缺失α突变纯合子，对应位点的突变探针为有色斑点“·”，对应位点的对照探针不显色，其他位点的对照探针均显色为有色斑点“·”。以41/42突变纯合子(41/42M/M)为例，如下表6所示。
表6
41/42N 654N· -28N· CAPN· BeN· 71/72N· 14/15N· SCDN·
41/42M· 654M -28M1 CAPM BeM 71/72M1 14/15M SCDM
43M -32M -28M2 -29M -30M 71/72M2 17M
CD31N· 27/28N· IVS1-1N· IVS1-5N· ICN· WSN· QSN· CSN·
CD31M 27/28M IVS1-1M IVS1-5M ICM WSM QSM CSM
αN· αTHAI M αSEAM α3.7M α4.2M
缺失型α突变杂合子，对应位点的突变探针为有色斑点“·”，所有位点的对照探针均显色为有色斑点“·”。以αTHAI突变杂合子(-αTHAI/αα)为例，如下表7所示。
表7
41/42N· 654N· -28N· CAPN· BeN· 71/72N· 14/15N· SCDN·
41/42M 654M -28M1 CAPM BeM 71/72M1 14/15M SCDM
43M -32M -28M2 -29M -30M 71/72M2 17M
CD31N· 27/28N· IVS1-1N· IVS1-5N· ICN· WSN· QSN· CSN·
CD31M 27/28M IVS1-1M IVS1-5M ICM WSM QSM CSM
αN· αTHAI M· αSEAM α3.7M α4.2M
缺失型α突变纯合子，对应位点的突变探针为有色斑点“·”，对应位点的对照探针不显色，其他位点的对照探针均显色为有色斑点“·”。以α3.7突变杂合子(-α3.7/-α3.7)为例，如下表8所示。
表8
Figure BDA0001670718490000112
Figure BDA0001670718490000121
复合型非缺失突变，包括β地贫复合非缺失α突变、β地贫复合镰刀形贫血突变、镰刀形贫血突变复合非缺失α突变，对应的两种突变的突变探针均显色，所有的对照探针均显色。以41/42M/N，-αTHAI/αα为例，如下表9所示。
表9
41/42N· 654N· -28N· CAPN· BeN· 71/72N· 14/15N· SCDN·
41/42M· 654M -28M1 CAPM BeM 71/72M1 14/15M SCDM
43M -32M -28M2 -29M -30M 71/72M2 17M
CD31N· 27/28N· IVS1-1N· IVS1-5N· ICN· WSN· QSN· CSN·
CD31M 27/28M IVS1-1M IVS1-5M ICM WSM QSM CSM
αN· αTHAI M· αSEAM α3.7M α4.2M
缺失型α突变复合非缺失型突变，包括缺失α突变复合β地贫、缺失α突变复合镰刀形贫血突变、缺失α突变复合非缺失α突变，对应的两种突变的突变探针均显色，所有的对照探针均显色。以αWSα/-α3.7为例，如下表10所示。
表10
41/42N· 654N· -28N· CAPN· BeN· 71/72N· 14/15N· SCDN·
41/42M 654M -28M1 CAPM BeM 71/72M1 14/15M SCDM
43M -32M -28M2 -29M -30M 71/72M2 17M
CD31N· 27/28N· IVS1-1N· IVS1-5N· ICN· WSN· QSN· CSN·
CD31M 27/28M IVS1-1M IVS1-5M ICM WSM· QSM CSM
αN· αTHAI M αSEAM α3.7M· α4.2M
以下结合具体实施例对本发明的遗传性贫血检测试剂盒及其使用方法作进一步的说明。
实施例1
使用本发明的遗传性贫血检测试剂盒和上述试剂盒的使用方法，对正常人以及几个临床样本进行检测和验证。正常人样本来自申请人单位的志愿者，临床样本来自佛山市妇幼保健医院(所有样本都经佛山市妇幼保健医院的伦理委员会的批准，且征得患者的知情同意)，并且已经经过测序法等鉴定为41/42M/N、镰刀形贫血杂合子、αWSα、-α4.2/αα和-αSEA/αα的贫血类型。图3到图8分别是使用本发明的检测试剂盒检测的正常人、41/42M/N、镰刀形贫血杂合子、αWSα、-α4.2/αα和-αSEA/αα的检测结果，由图可以看出，所有检测结果均与原鉴定结果一致。
实施例2：不同来源的样本提取的基因组情况及检测情况
为了分析不同来源的样本，例如外周血、唾液、尿液和血片来源的样本，使用对应的基因组提取试剂盒提取基因组DNA的浓度、纯度和检测情况，本实施例收集了5个志愿者的不同来源的样本进行比较。其中所用的基因组提取试剂盒为：
全血基因组提取试剂盒：使用CWBIO的Blood Genomic DNA Midi Kit(1-5ml)(货号CW0541S)；
唾液DNA提取试剂盒：使用百代生物的BIOG唾液DNA提取试剂盒(货号51043)；
尿液DNA提取试剂盒：使用百代生物的BIOG尿液DNA提取试剂盒(货号51045)；
血片DNA提取试剂盒：使用CWBIO的FTAcard DNA Kit(货号CW2275S)。
提取的基因组DNA情况如下表11所示(所有的DNA均溶解于50μl超纯水中)。
表11
Figure BDA0001670718490000131
上述志愿者1-5均来自申请人单位的员工，三男两女。由上表11可以看出，不同来源的样本，提取出的基因组DNA中，外周血来源的DNA浓度和纯度最好，唾液、尿液和血片来源的DNA浓度和纯度较差。征得志愿者同意后采用本发明的检测试剂盒对这五名志愿者进行了检测，发现志愿者1-5均正常。使用这几个志愿者提供的不同来源的样本DNA进行PCR、杂交和显影后，发现使用外周血来源、唾液、尿液和血片来源的样本提取的基因组DNA进行检测，结果没有明显不同，说明这几个来源的样本都可以作为本发明检测试剂盒使用时的样本来源。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 北昊干细胞与再生医学研究院有限公司
<120> 遗传性贫血检测用的核酸组合物、检测试剂盒及使用方法
<160> 58
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgcagtgct agaagggagt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cctggacttg agtgggcatg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgcccttcac cctcccacag 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tctgcctcag cctcccgact 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acagttcctg ggtaaatgcc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctcacctcaa cctccacctc 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cccctcgcca agtccaccc 19
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaagcactct agggtccagc g 21
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cccaccacca agacctactt cc 22
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctgctgccca ctcagacttt attc 24
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtacggctgt catcacttag acctca 26
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgcagcttgt cacagtgcag ctcact 26
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtgtacacat attgaccaaa 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
agcacacaga ccagcacgtt 20
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cacctcggcc tcccaaa 17
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccttctctcc cctgtccttt 20
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gctccagctt aacggtat 18
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aataccgtca agctggag 18
<210> 19
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcctccctgg acaag 15
<210> 20
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
acgcctcccc ggacaa 16
<210> 21
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gcggtgcacg cctccc 16
<210> 22
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
agggaggcct gcaccgc 17
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cccttcctgg tctttgaata aa 22
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
caagtacact ccagcctgga 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tgggtgacaa agcaagcatc 20
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tgactcctga ggagaagt 18
<210> 27
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tgactcctgt ggagaag 17
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cagaggttct ttgagtcctt 20
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
caaaggactc aacctctgg 19
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cccagaggtt cttttagtc 19
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ggttaaggca atagcaatag 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tctgggttaa ggtaatagca 20
<210> 33
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gggcataaaa gtcaggg 17
<210> 34
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ccctgacttc tatgccc 17
<210> 35
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ccctgacttg tatgcc 16
<210> 36
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ccctgacttt catgccc 17
<210> 37
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
cctgactttt gtgccc 16
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
acttttattc ccagccctg 19
<210> 39
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
acctcaaaca gacacca 17
<210> 40
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
catggtgtct gaggttg 17
<210> 41
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
cagggcctca ccacca 16
<210> 42
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ttggtggtaa ggccct 16
<210> 43
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
tcggtgcctt tagtgat 17
<210> 44
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
ggtgccttta agtgatg 17
<210> 45
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ggtgcctttt agtgatg 17
<210> 46
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
ttcaccttgc cccacag 17
<210> 47
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ccctggtggg gcaagg 16
<210> 48
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ctgtggggct aggtgaa 17
<210> 49
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
cttaggctgc tggtgg 16
<210> 50
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
cttaggtgct ggtggt 16
<210> 51
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
cccagggcct cacca 15
<210> 52
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ggtgaggccc ctgg 14
<210> 53
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ataccaacct gcccag 16
<210> 54
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
ctgggcagat tggtat 16
<210> 55
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
ccttgatacc aacctgc 17
<210> 56
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gcaggttgct atcaag 16
<210> 57
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
ccatggtgca tctgact 17
<210> 58
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
gatgcaccct ggtgtct 17

Claims (8)

1.一种遗传性贫血检测用的核酸组合物，其特征在于，包括PCR扩增引物和检测探针；
所述PCR扩增引物包括：序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的αTHAI缺失型地中海贫血的扩增引物对、序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的αSEA缺失型地中海贫血的扩增引物对、序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的α4.2缺失型地中海贫血的扩增引物对、序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的α3.7缺失型地中海贫血的扩增引物对、序列如SEQID NO.9和SEQ ID NO.10所示的非缺失型α地中海贫血的扩增引物对、以及序列如SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12所示的和序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的β地中海贫血和镰刀型贫血的扩增引物对；
所述检测探针包括44条序列或互补序列分别如SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.58所示的突变探针和对照探针。
2.一种遗传性贫血检测试剂盒，其特征在于，包括基底和如权利要求1所述的遗传性贫血检测用的核酸组合物，所述PCR扩增引物的5’端具有连接标记物，各所述突变探针和各所述对照探针固定于所述基底的不同区域。
3.如权利要求2所述的遗传性贫血检测试剂盒，其特征在于，所述序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的α3.7缺失型地中海贫血的扩增引物对独立于其他各扩增引物对存放。
4.如权利要求2所述的遗传性贫血检测试剂盒，其特征在于，所述连接标记物为生物素、亲和素或链霉亲和素。
5.如权利要求2所述的遗传性贫血检测试剂盒，其特征在于，各所述突变探针和各所述对照探针的5’端具有氨基标记。
6.如权利要求2所述的遗传性贫血检测试剂盒，其特征在于，所述基底为尼龙膜。
7.如权利要求2～6中任一项所述的遗传性贫血检测试剂盒，其特征在于，还包括杂交缓冲液、清洗缓冲液、柠檬酸钠溶液、显色剂以及氧化剂中的至少一种。
8.如权利要求7所述的遗传性贫血检测试剂盒，其特征在于，所述杂交缓冲液为2×SSC与0.1wt％SDS的混合溶液；所述清洗缓冲液为0.5×SSC与0.1wt％SDS的混合溶液；所述柠檬酸钠溶液的pH 5.0，浓度为0.1M；所述显色剂为TMB；所述氧化剂是浓度为3wt％的过氧化氢。
CN201810502158.7A 2018-05-23 2018-05-23 遗传性贫血检测用的核酸组合物、检测试剂盒及使用方法 Active CN108796042B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810502158.7A CN108796042B (zh) 2018-05-23 2018-05-23 遗传性贫血检测用的核酸组合物、检测试剂盒及使用方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810502158.7A CN108796042B (zh) 2018-05-23 2018-05-23 遗传性贫血检测用的核酸组合物、检测试剂盒及使用方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108796042A CN108796042A (zh) 2018-11-13
CN108796042B true CN108796042B (zh) 2022-04-05

Family

ID=64092907

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810502158.7A Active CN108796042B (zh) 2018-05-23 2018-05-23 遗传性贫血检测用的核酸组合物、检测试剂盒及使用方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108796042B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110093413A (zh) * 2019-04-09 2019-08-06 深圳市卫生健康发展研究中心 检测β地中海贫血的引物组和试剂盒
CN111455039B (zh) * 2020-04-09 2021-08-17 广东凯普生物科技股份有限公司 一种检测α-地中海贫血的核酸组合物、其基因芯片、其试剂盒及其应用
CN111593119A (zh) * 2020-06-28 2020-08-28 成都市妇女儿童中心医院 用于检测母体血液中胎儿游离DNA β-地中海贫血突变的探针及试剂盒

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1626671A (zh) * 2003-12-10 2005-06-15 深圳益生堂生物企业有限公司 缺失型α珠蛋白基因的多重PCR检测
CN101092647A (zh) * 2007-04-25 2007-12-26 亚能生物技术（深圳）有限公司 诊断α－地中海贫血的核酸膜条及试剂盒
CN102181560A (zh) * 2011-04-29 2011-09-14 潮州凯普生物化学有限公司 α,β-地中海贫血的突变基因联合检测试剂盒
CN102220411A (zh) * 2010-04-16 2011-10-19 中山大学达安基因股份有限公司 一种一体化检测α、β突变型地中海贫血的试剂盒
CN102943115A (zh) * 2012-11-28 2013-02-27 亚能生物技术（深圳）有限公司 α和β地中海贫血基因检测的核酸膜条及试剂盒
CN103602752A (zh) * 2013-12-06 2014-02-26 亚能生物技术（深圳）有限公司 一种检测稀有缺失型地中海贫血的引物组和试剂盒
CN104212910A (zh) * 2014-09-28 2014-12-17 广东凯普生物科技股份有限公司 单管扩增同时检测α和β地中海贫血基因试剂盒
CN105755137A (zh) * 2016-04-14 2016-07-13 亚能生物技术（深圳）有限公司 一种α-地中海贫血基因检测试剂盒
CN106834530A (zh) * 2015-11-04 2017-06-13 深圳市瀚海基因生物科技有限公司 引物、试剂盒以及检测hbb基因序列的方法
CN107245528A (zh) * 2017-08-04 2017-10-13 黄德珍 一种针对中国人群常见地贫突变基因的快速检测试剂盒
CN108165581A (zh) * 2017-12-14 2018-06-15 广州医科大学附属第三医院（广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院） 采用单链核苷酸片段体外修复hba2基因突变的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104988218A (zh) * 2015-06-24 2015-10-21 深圳益生堂生物企业有限公司 一种非缺失型α-地中海贫血基因检测的核酸膜条、试剂盒及检测方法

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1626671A (zh) * 2003-12-10 2005-06-15 深圳益生堂生物企业有限公司 缺失型α珠蛋白基因的多重PCR检测
CN101092647A (zh) * 2007-04-25 2007-12-26 亚能生物技术（深圳）有限公司 诊断α－地中海贫血的核酸膜条及试剂盒
CN102220411A (zh) * 2010-04-16 2011-10-19 中山大学达安基因股份有限公司 一种一体化检测α、β突变型地中海贫血的试剂盒
CN102181560A (zh) * 2011-04-29 2011-09-14 潮州凯普生物化学有限公司 α,β-地中海贫血的突变基因联合检测试剂盒
CN102943115A (zh) * 2012-11-28 2013-02-27 亚能生物技术（深圳）有限公司 α和β地中海贫血基因检测的核酸膜条及试剂盒
CN103602752A (zh) * 2013-12-06 2014-02-26 亚能生物技术（深圳）有限公司 一种检测稀有缺失型地中海贫血的引物组和试剂盒
CN104212910A (zh) * 2014-09-28 2014-12-17 广东凯普生物科技股份有限公司 单管扩增同时检测α和β地中海贫血基因试剂盒
CN106834530A (zh) * 2015-11-04 2017-06-13 深圳市瀚海基因生物科技有限公司 引物、试剂盒以及检测hbb基因序列的方法
CN106868187A (zh) * 2015-11-04 2017-06-20 深圳市瀚海基因生物科技有限公司 多重pcr引物、试剂盒及用途
CN105755137A (zh) * 2016-04-14 2016-07-13 亚能生物技术（深圳）有限公司 一种α-地中海贫血基因检测试剂盒
CN107245528A (zh) * 2017-08-04 2017-10-13 黄德珍 一种针对中国人群常见地贫突变基因的快速检测试剂盒
CN108165581A (zh) * 2017-12-14 2018-06-15 广州医科大学附属第三医院（广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院） 采用单链核苷酸片段体外修复hba2基因突变的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Single-tube nonaplex microsatellite PCR panel for preimplantation genetic diagnosis of Hb Bart"s hydrops fetalis syndrome;Min Chen等;《Prenatal diagnosis》;20150301;第35卷(第6期);结果第1部分，图1，表1，补充表S2 *
α-地中海贫血无创产前诊断研究进展;王梓茗尹爱华;《中国产前诊断杂志》;20171220;第9卷(第04期);第38-42页 *
多重荧光定量PCR快速检测缺失型α地中海贫血;彭建明等;《广东医学》;20130608;第34卷(第8期);第1195-1196页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108796042A (zh) 2018-11-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108796042B (zh) 遗传性贫血检测用的核酸组合物、检测试剂盒及使用方法
JP2013501514A (ja) 染色体異数性の検出方法
CN102220434B (zh) 用于诊断非综合征耳聋的杂交膜条、pcr引物及试剂盒
CN104212904A (zh) 一种用于快速检测人类cyp2c19基因多态性的试剂盒及其使用方法
CN107841537A (zh) 一种全预混mthfr和mtrr多重pcr基因多态性检测试剂盒和方法
CN113614246A (zh) 用于鉴别肿瘤模型的方法和组合物
CN104328182A (zh) 一种用于检测pdgfra基因热点突变的引物、探针、锁核苷酸探针、试剂盒及检测方法
CN110484621A (zh) 一种肝癌早期预警的方法
Tanaka et al. Pulmonary Mycobacterium avium complex infection: association with NRAMP1 polymorphisms
CN114182023B (zh) 横纹肌肉瘤中F-circP3F的检测试剂盒及方法
CN110564861A (zh) 人类Y染色体STR基因座和InDel位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用
CN102925560A (zh) HRM法检测突变型α-地中海贫血基因的试剂盒和方法
WO2017185758A1 (zh) 用于微嵌合检测和个体识别的引物、探针、试剂盒及方法
CN115927356B (zh) Slc45a2致病突变基因、致病突变体及在制备眼皮肤白化病ⅳ型诊断试剂盒中的应用
CN104726604B (zh) 一种腐败检材降解dna的检测方法及其应用
CN108753945B (zh) 与中国儿童肥胖和/或高三酰甘油血症相关的snp位点及其应用
CN113215257B (zh) 一种用于检测乳腺癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法
CN103502469A (zh) 强直性脊柱炎易感性单核苷酸多态性的检测方法、试剂盒及其应用
CN113549689B (zh) 一种检测pros1基因外显子的试剂盒及方法
CN106811511B (zh) 日本血吸虫地域特异性相关单核苷酸多态性及其应用
CN115216533A (zh) 一种用于诊断威尔逊病的生物标志物、扩增引物组、检测试剂及应用
CN108676871B (zh) 二型糖尿病诊断标志物
CN107043808A (zh) Ugt1a1基因多态性检测引物肽核酸及其试剂盒
CN113215258A (zh) 一种用于检测结直肠癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法
CN112941205A (zh) 一种RhD血型基因RHD634G＞A等位基因及检测

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant