CN106811511B - 日本血吸虫地域特异性相关单核苷酸多态性及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了日本血吸虫地域特异性相关基因ND2及其应用。具体地，本发明提供了一种检测日本血吸虫地域特异性的方法，它包括检测个体的日本血吸虫ND2基因的两个单核苷酸多态性SNP位点，从而区分日本血吸虫来源于湖区还是山区。基于本发明，通过简单的PCR扩增和测序，就能分辨来自中国西南山区和长江中下游湖沼区的日本血吸虫，有助于准确、快速地鉴定血吸虫病患者的初始感染地，判断是否异地感染的输入性病例，并为研究日本血吸虫的遗传和进化提供了依据。

Description

日本血吸虫地域特异性相关单核苷酸多态性及其应用

技术领域

本发明属于分子生物和遗传学领域，具体地说，本发明涉及一种利用线 粒体上的单核苷酸多态性位点作为分子标记鉴定日本血吸虫地域株的方法以 及线粒体DNA在日本血吸虫群体的遗传变异和进化方面中的应用。

背景技术

日本血吸虫是一种人兽共患寄生虫，主要流行于东亚及东南亚地区。目 前，我国尚有12个血吸虫病流行省(直辖市、自治区)，约2亿人受此病威 胁，18万人受到感染。流行地区主要分为西南山区和长江中下游湖沼区2种生 态类型，不同的生态环境内可能存在不同的虫株，而不同的虫株对宿主的感 染力和致病性可能存在差异。

近年来，众多的分子标记被应用于日本血吸虫的群体地域遗传研究中，如等 位酶、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性(RAPD)、微卫星 (STR)等。然而，日本血吸虫的线粒体基因组序列全长为14085nt，包括12 个蛋白编码基因、22个tRNA基因和2个rDNA基因(参考序列GenBank ID: 10445372)。

因此，从这些基因中找到地域高相关性基因，从而鉴别日本血吸虫的不 同地域株、鉴定血吸虫病患者的初始感染地，对于我国血吸虫病的预防和控 制有重要意义。

发明内容

本发明的目的就是提供一种鉴别日本血吸虫地域特异性的方法及检测试剂 盒。

本发明第一方面，提供了一种鉴别日本血吸虫地域特异性的方法，包括步 骤：

i)日本血吸虫ND2基因特异性引物扩增样品的日本血吸虫ND2基因，得到扩 增产物；和

2)检测扩增产物是否存在以下单核苷酸多态性SNP位点：

第30位T→A；和/或

第811位G→A；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO:1。

在另一优选例中，当第30位为T和/或第811位为G时，所述的日本血吸虫为湖 区日本血吸虫；或

当第30位为A和/或第811位为A时，所述的日本血吸虫为山区日本血吸虫。

在另一优选例中，所述的日本血吸虫样本包括虫卵、毛蚴、尾蚴、和/或成 虫样本。

在另一优选例中，所述的湖区日本血吸虫包括中国长江中下游湖区日本血吸 虫。

在另一优选例中，所述的山区日本血吸虫包括中国西南山区日本血吸虫。

本发明第二方面，提供了一种日本血吸虫ND2基因或其单核苷酸多态性位点 在制备鉴别日本血吸虫地域特异性和/或判断血吸虫病初始感染地的试剂或试剂 盒中的用途，其中所述的单核苷酸多态性(SNP)位点是：

第30位T→A；

第811位G→A；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO:1。

在另一优选例中，所述的试剂包括引物、探针、芯片、或抗体。

在另一优选例中，所述的试剂盒含有一种或多种选自下组的试剂：

(a)日本血吸虫ND2基因或一种或多种所述SNP位点的特异性引物；

(b)用于检测一种或多种所述SNP位点的特异性探针；

(c)用于检测一种或多种所述SNP位点的芯片；

(d)用于检测一种或多种所述SNP位点所对应的氨基酸突变的特异性抗体。

在另一优选例中，所述的特异性引物具有SEQ ID NO:2-3所示的序列。

本发明第三方面，提供了一种检测日本血吸虫地域特异性和/或判断血吸虫 病初始感染地的试剂盒，它包括：

(a)日本血吸虫ND2基因或一种或多种SNP位点的特异性引物；

(b)用于检测一种或多种SNP位点的特异性探针；

(c)用于检测一种或多种SNP位点的芯片；

(d)用于检测一种或多种SNP位点所对应的氨基酸突变的特异性抗体；

其中所述的单核苷酸多态性(SNP)位点是：

第30位T→A；

第811位G→A；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO:1。

在另一优选例中，所述试剂盒含有特异性扩增日本血吸虫ND2基因单核苷酸 多态性的特异性引物，并且所述的引物扩增出的扩增产物的长度为100-2000bp。

在另一优选例中，所述的特异性引物具有SEQ ID NO:2-3所示的序列。

在另一优选例中，所述的试剂盒还任选地含有选自下组的试剂：

(a)与所述SNP位点的结合的探针；

(b)识别所述SNP位点的限制性内切酶。

本发明第四方面，提供了一种试剂在制备检测检测日本血吸虫地域特异性和 /或判断血吸虫病初始感染地的试剂盒的用途，其中所述试剂选自下组：

(a)日本血吸虫ND2基因的特异性引物；

(b)用于检测一种或多种所述SNP位点的特异性探针；

(c)用于检测一种或多种所述SNP位点的芯片；或

(d)用于检测一种或多种所述SNP位点所对应的氨基酸突变的特异性抗体。

本发明第五方面，提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸如SEQ ID NO.:4- 48所示。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方 案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为中国大陆9个流行区(安徽贵池、安徽铜陵、湖南岳阳、湖南常德、 湖北武汉、江西南昌、江西都昌、四川西昌和云南洱源)的日本血吸虫样本线 粒体序列在本发明提供的第一个单核苷酸多态性位(ND2基因第30个碱基) 的序列比对结果。其中：GC代表安徽贵池，TL代表安徽铜陵，LG代表湖南 岳阳，WY代表湖南常德，WH代表湖北武汉，NC代表江西南昌，DC代表江 西都昌，SC代表四川西昌，YN代表云南洱源。

图2为中国大陆9个流行区(安徽贵池、安徽铜陵、湖南岳阳、湖南常德、 湖北武汉、江西南昌、江西都昌、四川西昌和云南洱源)的日本血吸虫样本线 粒体序列在本发明提供的第二个单核苷酸多态性位点(ND2基因第811个碱 基)的序列比对结果。各缩写代表地域同图1.

具体实施方式

本发明人经过深入而广泛的研究，对大量候选基因的SNP进行了测定和分 析。首次发现和证明了日本血吸虫ND2基因组序列与日本血吸虫地域特异性密切 相关，因此可作为辅助性检测日本血吸虫地域特异性(或其易感性)的特异性 SNP。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明人通过对119个来自不同流行区的日本血吸虫成虫线粒体 基因组全序列进行二代测序和序列比对筛选所获得了2个来源于ND2基因的单 核苷酸多态性位点，这2个单核苷酸多态性位点可作为鉴别日本血吸虫在中国 区域山区和湖区株的有效遗传标记。基于本发明成果，通过简单的PCR扩增 和测序，就能分辨来自中国西南山区和长江中下游湖沼区的日本血吸虫，有 助于准确、快速地鉴定血吸虫病患者的初始感染地，判断是否异地感染的输 入性病例，并为研究日本血吸虫的遗传和进化提供了依据。

日本血吸虫线粒体基因ND2

自上世纪80年代以来，线粒体DNA(mtDNA)分析方法在遗传学、系统 分类学、分子生态学、群体遗传及人类学等方面得到了广泛的应用。线粒体 DNA具有分子结构简单、无内含子，突变率高、进化速度快，稳定母系遗 传、无重组等特点，非常有利于进行遗传进化及亲缘学分析，已经成为相关 领域中应用最广泛的分子标记。

近年来，众多的分子标记被应用于日本血吸虫的群体遗传研究中，如等 位酶、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性(RAPD)、微卫 星(STR)等。然而线粒体基因作为一种中性的分子标记，因其突变率高、 进化速度快(是核基因的四倍)、遗传稳定的特点，在日本血吸虫遗传分类 鉴定方面，具有更大的优势。

日本血吸虫的线粒体基因组序列全长为14085nt，包括12个蛋白编码基 因、22个tRNA基因和2个rDNA基因(参考序列GenBank ID:10445372)。其 中NADH脱氢酶第二亚基(NADH dehydrogenase subunit 2，ND2)基因全长 855nt，编码284个氨基酸，是遗传分析中常用的线粒体基因之一。

日本血吸虫ND2基因的应用

基于本发明的新发现，日本血吸虫ND2基因、蛋白或多肽有多方面的新用 途。这些用途包括(但不限于)：用于辅助性诊断日本血吸虫地域特异性，或用于 筛选用于检测日本血吸虫地域特性的物质，如抗体、多肽或其它配体。

另一方面，本发明还包括对ND2 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多 克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于 日本血吸虫ND2基因产物或片段。较佳地，指那些能与日本血吸虫ND2基因产物或 片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗 体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分 子；或嵌合抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如， 纯化的日本血吸虫ND2基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱 导多克隆抗体的产生。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以 利用杂交瘤技术来制备。本发明的各类抗体可以利用日本血吸虫ND2基因产物的 片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制 备或利用多肽合成仪合成。与日本血吸虫ND2基因产物的未修饰形式结合的抗体 可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后 修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如 酵母或昆虫细胞)中产生的基因产

抗人ND2蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测样本ND2蛋白的多少和 /或突变与否。一种优选的抗ND2抗体是不识别正常ND2但识别突变ND2的抗体，或 者识别正常ND2但不识别突变ND2的抗体。利用这些抗体，可以方便地进行蛋白质 水平的日本血吸虫地域特异性检测。

本发明还涉及定量和定位检测人ND2蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是 本领域所熟知的，且包括ELISA等。

一种检测检测样品中是否存在ND2蛋白的方法是利用ND2蛋白的特异性抗体 进行检测，它包括：将样品与ND2蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合 物，形成了抗体复合物就表示样品中存在ND2蛋白。

最方便的检测本发明SNP的方法，是通过用日本血吸虫ND2基因特异性引物扩 增样品的日本血吸虫ND2基因，得到扩增产物；然后检测扩增产物中是否存在本 发明单核苷酸多态性。例如，可通过测序或特异性探针进行检测。

应理解，在本发明首次揭示了日本血吸虫ND2基因的SNP与日本血吸虫地域特 异性的相关性之后，本领域技术人员可以方便地设计出可特异性扩增出含该SNP 位置的扩增产物，然后通过测序等方法确定是否存在本发明所揭示的SNP或突 变。通常，引物的长度为15-50bp，较佳地为20-30bp。虽然引物与模板序列完全 互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补(尤 其是引物的5’端)的情况下，也能够特异性地扩增(即仅扩增出所需的片段)。含 有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明范围之内，只要该引物扩 增出的扩增产物含有本发明SNP的对应位置。

虽然扩增产物的长度没有特别限制，但是通常扩增产物的长度为100- 2000bp，较佳地为150-1500bp，更佳地为200-1000bp。一种优选扩增产物可分别 含有SEQ ID NO:1中第30位和第811位，更优选地，所述扩增产物同时含有SEQ ID NO:1中第30位和第811位。在本发明中，提供了一种可同时扩增这两个位点的引 物，其优选序列如SEQ ID NO.:2-3所示。(TTTGCCATAGTTCGTTTTCC， SEQ ID NO.:2；AACCTTATTCGGACCCTTAC，SEQ ID NO.:3)

一种优选的检测方法包括步骤：

(1)采集血吸虫成虫，提取单个虫体的基因组DNA；

(2)以线粒体基因组全序列(GenBank ID:10445372)为模板，设计并合成扩 增2个单核苷酸多态性位点所在线粒体片段的特异性引物对；

(3)在适当条件(已优化)下用(1)中所提取的单条血吸虫成虫DNA为模 板，用(2)中所设计的引物进行PCR扩增

(4)对PCR产物进行纯化并测序；

(5)阅读测序结果，定位所选的SNP位置，通过2个位点上的碱基类型快速 判断日本血吸虫个体的来源地，即，来源于湖区或者是山区。

较佳地，步骤(3)所述已优化的PCR反应体系为：

每个PCR反应(总体积20μl)包含DNA聚合酶(TaKaRa)1.25U，10X PCR Buffer 2μl(Mg²⁺终浓度1.5mM)，dNTP Mixture 2μl(dATP,dGTP,dCTP, dTTP,终浓度各0.25mM)，特异性上下游引物各0.5μmol，日本血吸虫基因组 DNA 20～30ng。

步骤(3)所述优化的PCR扩增程序为：

①94℃预变性10min；

②94℃变性30s；

③49℃退火30s；

④72℃延伸90s；

⑤步骤②—④重复35个循环后，72℃延伸5min。

试剂盒

本发明还提供了一种检测日本血吸虫地域特异性的试剂盒，它包括：

(a)日本血吸虫ND2基因或一种或多种SNP位点的特异性引物；

(b)用于检测一种或多种SNP位点的特异性探针；

(c)用于检测一种或多种SNP位点的芯片；

(d)用于检测一种或多种SNP位点所对应的氨基酸突变的特异性抗体；

其中所述的单核苷酸多态性(SNP)位点是：

第30位T→A；

第811位G→A；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO:1。

优选地，所述试剂盒含有特异性扩增日本血吸虫ND2基因单核苷酸多态性的 特异性引物，并且所述的引物扩增出的扩增产物的长度为100-2000bp。

更佳地，所述的特异性引物具有SEQ ID NO:2-3所示的序列。

更佳地，所述的试剂盒还任选地含有选自下组的试剂：

(a)与所述SNP位点的结合的探针；

(b)识别所述SNP位点的限制性内切酶。

本发明的主要优点在于：

本发明提供的2个单核苷酸多态性位点可作为鉴别日本血吸虫在中国区域 山区和湖区株的有效遗传标记。基于本发明成果，通过简单的PCR扩增和测 序，就能分辨来自中国西南山区和长江中下游湖沼区的日本血吸虫，有助于 准确、快速地鉴定血吸虫病患者的初始感染地，判断是否异地感染的输入性 病例，并为研究日本血吸虫的遗传和进化提供了依据。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建 议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1 中国大陆不同流行区的日本血吸虫所属群体区分

方法：

(1)收集来自安徽贵池(GC)、安徽铜陵、湖南岳阳、湖南常德、湖北武 汉、江西南昌、江西都昌、四川西昌和云南洱源这9个流行区的日本血吸虫样 本，提取单个个体的基因组DNA。用于提取高质量基因组DNA的试剂为 QIAGEN公司(德)生产的DNeasy Blood&TissueKit试剂盒。具体方法如下：

将单条日本血吸虫成虫放入1.5ml EP管中，加入1.0mM EDTA和10mM Tris缓冲液500μl。振荡后吸尽液体，重复三次。加入试剂盒中提供的ATL缓 冲液180μl；加入20μl蛋白酶K，振荡混匀。在56℃水浴中孵育4h，中间振荡 数次。从水浴中取出后振荡15s，加入200μl缓冲液AL，振荡混匀。再加入 200μl 95％以上的乙醇，混匀。将所有液体移入DNeasy抽提柱里，8000g离心 1min，弃滤液。向抽提柱中加入500μl缓冲液AW1，8000g离心1min，弃滤 液。再向抽提柱中加入500μl缓冲液AW2，12000g离心3min，弃滤液。保留的 抽提柱移入新的EP管中，加入150μl缓冲液AE(或ddH₂O)。室温下静置1min， 12000g离心1min。滤液中即含有基因组DNA，-20℃保存。

获得的基因组DNA如下表所示：

样本号	SEQ ID NO.:	样本缩写
			1	4	dc
2	5	dc1
			3	6	dc2
4	7	dc3
			5	8	dc4
6	9	gc
			7	10	gc1
8	11	gc2
			9	12	gc3
10	13	gc4
			11	14	lg

12	15	LG1
			13	16	LG2
14	17	LG3
			15	18	LG4
16	19	NC1
			17	20	NC2
18	21	NC3
			19	22	NC4
20	23	NC5
			21	24	SC
22	25	SC1
			23	26	SC2
24	27	SC3
			25	28	SC4
26	29	TL
			27	30	TL1
28	31	TL2
			29	32	TL3
30	33	TL4
			31	34	WH
32	35	WH1
			33	36	WH2
34	37	WH3
			35	38	WH4
36	39	WY
			37	40	WY1
38	41	WY2
			39	42	WY3
40	43	WY4
			41	44	YN
42	45	YN1
			43	46	YN2
44	47	YN3
			45	48	YN4

(2)合成特异性扩增引物的方法为固相亚磷酰胺三酯法，由生工生物工程 (上海)股份有限公司合成，用PAGE法纯化。

(3)所用PCR反应体系为20μl：包括2μl 10×Buffer，四种dNTP各 0.25mM，Taq DNA聚合酶1.25U，上、下游引物各0.5μmol，模板DNA 20— 30ng。

扩增反应在LifePro PCR仪上进行，反应条件为：

①94℃预变性10min；

②94℃变性30s；

③49℃退火30s；

④72℃延伸90s；

⑤步骤②—④重复35个循环后，72℃延伸5min。

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，送至华大基因上海分公司进行测 序。采用ABI3730进行双向测序，测序引物即扩增所用引物。测序结果经拼接 和人工校对后，用MEGA5.1软件进行多序列联配，以展示多态性位点。

结果如图1和图2所示，在本发明所提供的、可用于鉴定日本血吸虫地 域株的2个单核苷酸多态性位点处，来自长江中下游湖区7个地点(安徽贵 池、安徽铜陵、湖南岳阳、湖南常德、湖北武汉、江西南昌及江西都昌)的 样本均与来自西南山区2个地点(四川西昌和云南洱源)的样本有明显的碱 基差异。图1所示为ND2基因第30个碱基处的T/A突变，图2所示为ND2 基因第811个碱基处的G/A突变。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文 献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容 之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样 落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (11)

1.一种鉴别日本血吸虫地域特异性的非诊断性方法，包括步骤：

1 )日本血吸虫ND2基因特异性引物扩增样品的日本血吸虫ND2基因，得到扩增产物；和

2)检测扩增产物是否存在以下单核苷酸多态性(SNP)位点：

第30位T→A；和/或

第811位G→A；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO:1。

2.如权利要求1所述的方法，当第30位为T和/或第811位为G时，所述的日本血吸虫为湖区日本血吸虫；或

当第30位为A和/或第811位为A时，所述的日本血吸虫为山区日本血吸虫。

3.如权利要求1所述的方法，所述的日本血吸虫样本包括虫卵、毛蚴、尾蚴和/或成虫样本。

4.一种检测试剂在制备鉴别日本血吸虫地域特异性和/或判断血吸虫病初始感染地的诊断试剂或试剂盒中的用途，其中所述的检测试剂用于检测以下单核苷酸多态性(SNP)位点：

第30位T→A；和/或

第811位G→A；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO:1。

5.如权利要求4所述的用途，所述的检测试剂包括引物、探针、芯片或抗体。

6.如权利要求4所述的用途，所述的检测试剂包括：

(a)用于检测一种或多种所述SNP位点的特异性引物；

(b)用于检测一种或多种所述SNP位点的特异性探针；

(c)用于检测一种或多种所述SNP位点的芯片；和/或

(d)用于检测一种或多种所述SNP位点所对应的氨基酸突变的特异性抗体。

7.如权利要求6所述的用途，所述的特异性引物具有SEQ ID NO:2-3所示的序列。

8.一种检测日本血吸虫地域特异性和/或判断血吸虫病初始感染地的试剂盒，它包括：

(a)用于检测一种或多种SNP位点的特异性引物；

(b)用于检测一种或多种SNP位点的特异性探针；

(c)用于检测一种或多种SNP位点的芯片；和/或

(d)用于检测一种或多种SNP位点所对应的氨基酸突变的特异性抗体；

其中所述的单核苷酸多态性(SNP)位点是：

第30位T→A；和/或

第811位G→A；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO:1。

9.如权利要求8所述的试剂盒，所述试剂盒还包括日本血吸虫ND2基因。

10.如权利要求8所述的试剂盒，所述试剂盒含有特异性扩增日本血吸虫ND2基因单核苷酸多态性的特异性引物，并且所述的引物扩增出的扩增产物的长度为100-2000bp。

11.如权利要求10所述的试剂盒，所述的特异性引物具有SEQ ID NO:2-3所示的序列。

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