JP3030034B2 - カンピロバクターを検出するための核酸フラグメント、方法およびキット - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、カンピロバクター（Campylobacter）属に
属する細菌を検出することに関し、より詳細にはカンピ
ロバクターのrRNAまたはrRNA遺伝子を特異的に検出する
ための核酸プローブおよび組成物、並びにそれらの使用
方法を提供する。

（従来の技術、発明が解決しようとする課題） 本明細書中で用いる“カンピロバクター”なる用語
は、Bergey's Manual of Systematic Bacteriology,Vo
l.1（N.R.KriegおよびJ.G.Holt［eds.］,1986,p.111〜1
18、Williams ＆ Wilkins）においてそれとして分類さ
れた細菌を意味する。カンピロバクターの検出は種々の
医学的および公衆衛生の情況下において重要である。カ
ンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）
およびC.コーリ（C.coli）は２つの最も重要な細菌種で
あり、ヒトにおける下痢（Blaserら、1979、Ann.InTer
n.Med.91:179）および腸炎（G.K.Morrisら、編集、Amer
ican Society for Microbiology,ワシントン,D.C.）の
原因菌である。その他のカンピロバクター種はヒトや動
物において流産、敗血症および増殖性回腸炎のような疾
病を起こすことに関係している。さらに、カンピロバク
ターに似ている微生物が同性愛の男性のふん便から（Fe
nnellら、1984、J.Infec.Dis.,149:58）および胃潰瘍の
生検材料から（Kasperら、1984、Infection,12:179）分
離されている。

従って、本発明の１つの面は、一般に環境、食品また
は臨床サンプルに適用し得るカンピロバクターの迅速な
新規アッセイ系を提供することである。

カンピロバクターは標準的な実験室手法に従って同定
されている（Washington,J.A.［ed.］,Laboratory Proc
edures in Clinical Microbiology,第２版、ニューヨー
ク、Springer−Verlag,1985年、215〜217頁に記載のCam
pylobacter参照）。

本発明の他の面は、慣例的な培養技術に伴う欠点を回
避し、核酸プローブを用いてカンピロバクターを検出す
ることである。

本発明のさらに他の面は、通常のアッセイ条件下でプ
ローブに接近しやすくなりうる標的領域にハイブリダイ
ズし得るプローブを提供することである。

Kohneら（1968、Biophysical Journal８:1104〜111
8）はrRNA配列に対するプローブの作製方法を論じてい
るが、彼らはカンピロバクター特異的プローブを作製す
るのに必要な教示を与えていない。

PaceおよびCampbell（1971、Journal of Bacteriolog
y,107:543〜547）は別種の細菌からのリボソームリボ核
酸の相同性、およびそのような相同レベルを定量化する
ためのハイブリダイゼーション法を論じている。同様
に、Sogin,Sogin,およびWoese（1972、Journal of Mole
cular Evolution,１:173〜184）は異なるリボソームRNA
分子の一次構造の特性決定を利用して系統発生の関係を
評価するための論理的かつ実際的な手法を論じている。

Fox.PechmanおよびWoese（1977、International Jour
nal of Systematic Bacteriology,27:44〜57）は原核生
物系に対する１の研究法として16SリボソームRNAの比較
目録作成を論じている。しかしながら、これらの文献は
カンピロバクターに関するKohneの教示の不備を補うこ
とができない。

係属中の米国特許出願第692778号においてRashtchian
およびFittsは、ゲノムDNA配列を標的としたある種のカ
ンピロバクター特異的核酸プローブの作製を論じている
が、開示された方法は小さいオリゴヌクレオチドプロー
ブの作製には適さないであろう。

本発明のさらに他の面は、カンピロバクターを特異的
に検出しうる小型のオリゴヌクレオチドプローブを提供
することである。Romaniukら（1987,J.Bacteriol.,169:
2137〜2141）、Rashtchianら（1987、Current Microbio
l.,14:311〜317）、Lauら（1987、System and Appl.Mic
robiol.,９:231〜238）、PasterおよびDewhirst（1988,
Intnl.J.System.Bacteriol.,38:56〜62）、並びにThomp
sonら（1988,Intnl.J.System.Bacteriol.,38:190〜20
0）はカンピロバクターリボソームRNAの遺伝子機構を論
じており、種々のカンピロバクターに由来する16s rRNA
配列を提示している。しかしながら、これらの文献は最
も興味のあるターゲット領域を検索して同定するのに役
立たない。

RomaniukおよびTrust（1987,FEMS Microbiol.Lett.,4
3:331〜335）はカンピロバクター16s rRNAの領域にハイ
ブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを開示して
おり、さらに電気泳動分離したカンピロバクターゲノム
DNAの制限フラグメントへのサザンハイブリダイゼーシ
ョンによるカンピロバクター株の同定におけるそのプロ
ーブの使用を証明している。このプローブは、この限定
された情況において有用であるが、カンピロバクター菌
と非カンピロバクター菌の混合集団を含むサンプル中の
カンピロバクターを同定するのに十分な特異性をもち合
わせていない。

リボソームは、遺伝情報を細胞タンパク質（生命の主
な構造的および触媒的成分である）へ翻訳する唯一の既
知装置として役立つので、全ての生物にとって極めて重
要である。この重要性は全ての細胞がリボソームをもつ
という観測により証明される。

リボソームは３種の別個のRNA分子を含み、少なくと
も大腸菌（E.coli）では、それらの分子は5S、16Sおよ
び23S rRNAと呼ばれている。これらの名称の由来は沈降
速度により測定されたRNA分子の大きさに関係してい
る。しかしながら、実際には、それらは生物間で大きさ
が実質的に変化する。それにもかかわらず、5S、16Sお
よび23S rRNAは細菌の相同RNA分子のための一般名とし
て普通に用いられており、ここでもこの慣例に従うこと
にする。

ハイブリダイゼーションは、予め決められた反応条件
下で、２つの部分的に又は完全に相補的な１本鎖核酸が
逆平行状態で一緒になって、特異的で安定した水素結合
により２本鎖核酸を形成する方法として、一般に理解さ
れている。特定の組のハイブリダイゼーション条件のス
トリンジェンシー（stringency）はプローブ／ターゲッ
ト２本鎖の塩基組成、並びに２つの核酸間の誤対合（mi
spairing）のレベルおよび形状によって定められる。ス
トリンジェンシーはまたハイブリダイゼーション溶液中
に存在するイオン種の濃度および種類、存在する変性剤
の種類および濃度、ハイブリダイゼーション温度のよう
な反応パラメーターによっても支配される。一般に、ハ
イブリダイゼーション条件がよりストリンジェントにな
るにつれて、安定したハイブリッドを形成するために、
より長いプローブが好適になる。結果的に、ハイブリダ
イゼーションが行われる条件のストリンジェンシー（例
えば、実施しようとするアッセイの型に基づく）は使用
する好適なプローブの条件を指定するであろう。このよ
うな関係は当業者によく理解されており、容易に操作す
ることができる。一般的な事として、プローブの長さに
応じて、当業者はストリンジェント条件を約0.9モルの
塩溶液中約35〜65℃であると理解している。

本明細書中で用いる“プローブ”とは、予め定められ
たストリンジェンシーの条件下でターゲット核酸配列に
特異的に（すなわち、優先的に）ハイブリダイズされる
特定のヌクレオチド配列を含む、考案または選別によっ
て、合成されたあるいは生物学的につくられた酢酸（DN
AまたはRNA）を意味する。ターゲット核酸配列とは特定
のプローブが優先的にハイブリダイズし得るものであ
る。その他の有用な定義は、それらが以下の説明文中で
最初に出てきたときに、説明されるであろう。ここに引
用した文献はすべて参照によりここに包含される。

（課題を解決するための手段） 本発明は、少なくとも30ヌクレオチドの長さの核酸フ
ラグメントであって、ストリンジェント条件下で、カン
ピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・コー
リ、およびカンピロバクター・ラリディスの16S rRNA
または16S rRNA遺伝子のヌクレオチド配列位置1010−1
094（大腸菌の位置ナンバリング協定を使用）にハイブ
リダイズし、かつ緑膿菌、大腸菌またはネズミチフス菌
のrRNAまたはrRNA遺伝子にハイブリダイズしないことを
特徴とする核酸フラグメントを提供する。

本発明の種々の原理および側面によれば、特定のハイ
ブリダイゼーション条件下で、カンピロバクター・ジェ
ジュニ（Campylobacter jejuni）、C.コーリ（C.coli）
およびC.ラリディス（C.laridis）のリボソームRNA（rR
NA）分子の存在を検出できるが、検出サンプル中に存在
しうる他の関連細菌のrRNAを同一条件下で検出できない
DNAまたはRNA配列から成る核酸プローブおよびプローブ
セットが提供される。適切な被検サンプルには例えばふ
ん便、血液、他の液体または組織、並びに食品および動
物からの生物学的サンプルもしくは物質が含まれる。

本発明のプローブは多数の遺伝子学的に異なるグルー
プのカンピロバクターを同定するために用いられる。こ
れらは表１に示され、主なグループはボックスで囲むこ
とによって分類されている。これらのグループの中でい
くつかの再分割が可能であり、それはサブグループ間の
間隔をあけることによって示される。C.jejuni、C.coli
およびC.laridis−臨床（ふん便）被検物および汚染食
品からの単離物の大部分を占めるカンピロバクター種−
は別個のグループを形成する。それらは互いに密接な関
係があり、他のカンピロバクター種とは（16s rRNAヌク
レオチド配列の変異のパターンおよび程度において）区
別される。他の３つのカンピロバクターグループにはウ
オリネラ（Wolinella）属、バクテロイデス（Bacteroid
es）属、チオブラム（Thiovulum）属およびフレキシス
ピラ（Flexispira）属の代表菌を含む非カンピロバクタ
ー菌が多数混在している（表１参照）。

ここに記載のプローブは主にC.jejuni、C.coliおよび
C.laridisグループの細菌とハイブリダイズする。対象
となる臨床、食品および環境サンプル中の他のカンピロ
バクター種と比較して、それらは圧倒的に広く行き渡っ
ており、且つそれらは遺伝学的に区別し得るので、この
カンピロバクターグループに特異的なプローブが最も重
要となる。

本発明はまたこれらのプローブを利用するアッセイ系
を特徴としており、その好適な方式は上記の望ましいプ
ローブの挙動を有利に増強することができる。本発明の
アッセイ系は、カンピロバクターを検出するための現在
利用されている他の方法に対して、有利にも次の増強さ
れた性能を示す： ａ） 感度の増加；すなわち、現在用いられている方法
よりも頻繁に所定のサンプル中のカンピロバクターを検
出しうる； ｂ） 安価な試薬の使用および労力の軽減により有意な
アッセイコストの低下が見込まれる； ｃ） 生化学的にまれなカンピロバクターでさえも正確
に同定できる；および ｄ） 試験がそれ以上増殖させる必要のない非培養サン
プルに対して実施されるので、結果がより迅速に得られ
る。従って、本発明の好適な試験は、有利にも結果を得
るのにたった１日かかるだけである。

本発明プローブをrRNAに向けることによって生じる他
の利点には、検出されるrRNAが細胞塊の重要な成分を構
成するという事実が含まれることが判明した。細胞のリ
ボソーム含量の概算は変化するが、活発に増殖している
カンピロバクター菌は細胞当り5.0×10E＋３より多いリ
ボソームを含み、それ故に5.0×10E＋３コピー数のそれ
ぞれのrRNA（リボソーム中に1:1:1の化学量論量で存在
する）を含みうる。対照的に、遺伝子またはそのRNA転
写物のような他の細胞ターゲット分子は、それらが比較
的少ない量で存在するので、あまり望ましくない。

別の予期しない利点は、rRNA（およびそれらをコード
する遺伝子）が同時に存在する生物間で側方転移（late
ral transfer）を受けないように思われる点である。従
って、rRNAの一次構造は、遺伝子特異的ターゲット（例
えば、同時に存在する生物間で側方伝達を受けやすいプ
ラスミド由来の遺伝子またはその産物の場合でありう
る）ではなく、生物特異的分子ターゲットを与える。

さらに、本発明は多数のカンピロバクター（上記のも
の）を識別しうるカンピロバクターrRNAターゲット配列
に対するプローブを提供する。臨床、食品および環境サ
ンプルから最も普通に分離されるカンピロバクター種の
Campylobacter jejuni,C.coliおよびC.laridisのrRNAタ
ーゲット領域にハイブリダイズしうる２種のプローブの
好適な混合物も提供される。有利には、これらのrRNAタ
ーゲット配列は、本発明の好適なアッセイ条件下で、本
発明プローブがカンピロバクターrRNAとハイブリダイズ
するが、非カンピロバクターrRNAとは一般にハイブリダ
イズしないように、大部分の非カンピロバクターrRNAと
十分に異なるものである。これらのプローブの特徴は包
括性および排他性としてそれぞれ定義される。カンピロ
バクターに関して本発明プローブの驚くべき包括性およ
び排他性の特徴を有するプローブが形成され得るという
発見は意外なことであって、予測できないことであっ
た。

本発明の特に好適な実施態様では、ふん便被検物中の
Campylobacter jejuni、C.coliおよびC.laridisを検出
するアッセイ法が提供される。この試験は迅速であり、
感度がよく、非放射性であり、ハイブリダイゼーション
工程に先立ってサンプル中の細菌を培養する必要がな
く、しかも上記のカンピロバクターに対し非常に特異的
である。

表の簡単な説明 本発明の原理および側面は表を参照することによりさ
らに理解されるであろう： 表１ カンピロバクター16S rRNAに存在する配列変異の
パターンの分析に基づいて発見されたカンピロバクター
種のサブグループ間の関係を示す。この表はここに記載
のプローブおよびプローブセットの変異性（包括性）を
理解するための有用な枠組みを提供する； 表2a−ｄ カンピロバクター16s rRNAのヌクレオチドタ
ーゲット配列、および本発明プローブのヌクレオチド配
列（E.coliの位置ナンバリング協定を使用、Brosius
ら、1978、Proc.Natl.Acad.Sci.USA:75:4801〜4805）並
びにWollinella、Bacteroides、FlexispiraおよびThiov
ulumを含む他の関連細菌からの16s rRNAの関連部分の整
列を示す。E.coli配列もターゲット領域の位置を確認す
るために示される。RNA配列は５′→３′の方向に書か
れており、プローブ配列はDNAであって３′→５′の方
向に書かれている。いくつかのプローブに含まれる小文
字ｃは修飾されたシトシン残基（用いるアッセイの型に
応じて、そのシトシン残基にリポーター基が結合されう
る）を示す； 表３ サイトドット（cytodot）法で試験したカンピロ
バクターおよび非カンピロバクター株の代表的サンプル
に対する好適なプローブの包括性および排他性挙動を示
す。

本発明プローブの開発において取られた第一工程は、
カンピロバクター特異的核酸プローブのターゲット部位
として役立ちうる16s rRNAの領域を同定することを含ん
でいた。実際のこととして、被検サンプル中にどの非カ
ンピロバクター菌が存在するかを推論的に予知すること
は困難である。このように非カンピロバクター菌が非常
に多く存在しうるために、所定のプローブの十分な排他
性を証明することは極めて困難であり、多大の労力を要
し、しかも予測できない結果のものである。プローブを
用いて最終的にスクリーニングされる全ての被検サンプ
ル中にどのような非カンピロバクター菌が存在しうるか
を、検索および開発の初期段階において、知る必要性を
回避するために、より厳格な基準が採用された。これは
カンピロバクター間の、およびカンピロバクターと他の
細菌グループとの間の、系統発生的関係の知識を必要と
した。排他性の基準は、もしも代表的な発生上近縁のカ
ンピロバクター類縁菌のrRNAの相同領域と十分に異なる
カンピロバクターrRNA中の特定のターゲット領域が同定
されるならば、このような配列に対するプローブは、カ
ンピロバクターと類縁菌とをハイブリダイゼーション検
定により識別するために使用できるであろうと定めるこ
とにより満たされる、という操作上のしかし以前には証
明されていない仮説が採用された。系統発生的観察に基
づいて、その後、より遠縁の生物のrRNA配列は、たとえ
それらの実際の本性が必ずしも知られていなくても、上
記の発生上近縁のカンピロバクター類縁菌よりも配列の
特定領域が予想どおりに異なるであろうと推定された。
しかしながら、そのような領域が存在するかどうか、ま
たそれらが存在するとしても、このような領域がrRNAの
どこに位置するのか、について推論的に予知することは
できない。

核酸ハイブリダイゼーションプローブの有用なターゲ
ット部位として役立ちうるカンピロバクターrRNAの領域
を同定するための第一工程として、多数のカンピロバク
ター種からの16s rRNAのほぼ完全なヌクレオチド配列が
決定された（表２参照）。これらはカンピロバクター属
の系統発生幅を代表するものとして選ばれた。rRNAのい
ろいろな部分のヌクレオチド配列は、クローニング（Ma
niatisら、1982、Molecular Cloning:A Laboratory Man
ual、コールド・スプリング・ハーバー研究所、ニュー
ヨーク、p.545）、およびrRNAをコードする遺伝子の塩
基配列決定（Maxam ＆ Gilbert、1977、Proceedings of
the National Academy of Science、USA74:560〜564;S
angerら、1977、Proceedings of the National Academy
of Science、USA74:5463〜5467）、および／または逆
転写酵素を用いるrRNA自体の直接的塩基配列決定（Lane
ら、1985、Proceedings of the National Academy of S
cience、USA82:6955〜6959）により標準実験室プロトコ
ールを用いて決定された。

このようにして得られたヌクレオチド配列は相互に、
および他の入手しうるrRNAヌクレオチド配列と、特に表
１に示した細菌から誘導されたものと、比較した。表２
に示した配列の好適な領域は、これらの種に対して有用
な包括性および排他性を示しうるものとして同定され
た。

それぞれの核酸プローブは、先に論じた望ましい特徴
が実際に得られたかどうかを厳密に立証するために別の
実験を行った：すなわち、１）近縁種を含めた全ての非
カンピロバクター菌に対する十分な排他性;2）カンピロ
バクター株に対する有用な包括性パターン；および３）
実際に用いられる種々のアッセイ条件下でのターゲット
領域の接近容易性。これらのプローブの排他性（特に極
めて多種類の非カンピロバクター菌が豊富に存在するふ
ん便サンプルにおける排他性）および包括性（カンピロ
バクターの15種およびバイオグループ、並びに多数の
“カンピロバクター様細菌”程度の包括性）を定めるの
に関係しうる生物が極めて多数存在するので、使用可能
なプローブを検定して選別するために反復戦略が採用さ
れた。培養生物のパネルを検定するほかに、適当な排他
性挙動をより厳密に証明すべく、約75のカンピロバクタ
ー培養陰性ふん便被検物がプローブを用いてスクリーニ
ングされた（実施例１−特異的）。プローブはApplied
Biosystems装置で標準ホスホルアミダイト法（Caruther
s,M.H.ら、1983、Gene Amplification and Analysis、
編集Papas,T.S.,Rosenberg、M.,Charikjian,J.G.,発行E
lsevier,ニューヨーク、３巻、１〜26頁）により都合よ
く合成できた。

“ドットブロット（dot blot）”分析は、公知方法に
従って、これらの第一作製プローブの包括性および排他
性を予備的に試験するために用いられた。知られている
ように、ドットブロット分析は一般にこの目的のために
特別に市販されているニトロセルロース、ナイロンまた
はその他の誘導体化膜のようなフィルター上に核酸もし
くは核酸集団を固定化することを包含する。DNAまたはR
NAはこのようなフィルター上に容易に固定され、その後
いろいろな核酸ハイブリダイゼーション条件（すなわ
ち、ストリンジェンシー）下で対象の核酸プローブによ
りハイブリダイゼーションについて調べられる。ターゲ
ット配列に対してヌクレオチド配列の相補性がより大き
いプローブは、相補性がより小さいプローブよりも、高
レベルのハイブリダイゼーションを起こすであろう。こ
こに記載のオリゴヌクレオチドプローブ（すなわち30〜
36ヌクレオチド）の場合、60℃で14〜16時間（0.9M NaC
l 0.12M Tris−HCl、pH7.8、6mM EDTA、0.1M KPO₄、0.1
％SDS、0.1％ピロホスフェート、0.002％フィコール、
0.02％BSAおよび0.002％ポリビニルピロリドンを含むハ
イブリダイゼーション溶液中）rRNAターゲットにハイブ
リダイズされ、続いて未結合プローブを除くために60℃
で（0.03M NaCl、0.004M Tris−HCl、pH7.8、0.2mM EDT
Aおよび0.1％SDSを含む溶液中）15分間ずつ３回ポスト
−ハイブリダイゼーション洗浄を行うことが、表および
実施例に示した特異性および感度のレベルを得るのに十
分なストリンジェンシーであるだろう。粗製（未精製）
溶菌液中に存在するDNAまたはRNAが対象の核酸を初めに
精製しないで固定化され得る技法（ここではサイトドッ
トと呼ぶ、例えばManiatis,T.,Fritsch,E.F.およびSamb
rook,J.,1982,Molecular Cloning:a Laboratory Manual
を参照）も利用できる。この後者の手法は特定の核酸中
に存在しうる特定の生物のヌクレオチド配列をスクリー
ニングするのに要する労力を相当に低減させ、さらに多
数の生物のマススクリーニングを有利に行わせしめる。
従ってそれは多数の生物に対する核酸ハイブリダイゼー
ションプローブの排他性および包括性スクリーニングの
ための最適な方法である。

カンピロバクターを含むサンプル中に存在しうる細菌
の型を示す非カンピロバクター菌の一覧表を実施例４に
示す。先に論じたように、このように広い表示の細菌に
対して良好な排他性を示すプローブは、より広い表示の
より遠縁の腸内細菌に対して同様にふるまうことが予測
される。この予測は実施例１−特異的（ここでは好適な
プローブ（好適なアッセイ系を使用）が試験した75のカ
ンピロバクター培養陰性ふん便の被検物のうち75に存在
する非カンピロバクター菌のいずれとも交差反応しなか
った）に示すデータによって裏付けられる。

いくつかの他の事柄もプローブの最適なデザイン特性
に影響を及ぼす。第一の考慮すべき事柄はプローブ自体
に関するプローブの形状（すなわち、分子内相互作用）
である。16sおよび23s rRNAの有用なターゲット配列
は、大抵の場合、自己相補性の多大の可能性を示す領域
に位置することが見出された。その結果、これらの領域
に対するプローブは十分に長くなければならず、またタ
ーゲット分子それ自体の二次構造と競うに適した形状を
していなければならない。第二に、このようよな（明確
な構造をもつ）ターゲット領域に対するプローブもまた
自己相補性を示すことがある。プローブとターゲット配
列との起こりうる相互作用は、ターゲットまたはプロー
ブ配列のそれら自体への分子内アニーリングを支配する
パラメーターと同じ型のパラメーターによって支配され
るので、自己相補的プローブは、特に溶液ハイブリダイ
ゼーション条件下で、それらのターゲット配列へのハイ
ブリダイゼーションのために接近し難くなるかもしれな
い。従って、プローブデザインの１つの重要な面はこの
ような自己相補性を最小限度に抑えることである。それ
にはカンピロバクター特異的配列の最大利用と許容しう
るプローブ形状との間で妥協することが必要になる。

プローブデザインにおける第二の考慮すべき事柄は包
括性の基準に関して生起する。好適なプローブは、適当
な排他性挙動を示すが、全ての希望するカンピロバクタ
ー菌のrRNAにハイブリダイズし得るものである。カンピ
ロバクター属それ自体は様々な表現型および遺伝子型
（後述するように、rRNAを含む）を示す細菌から成るの
で、“理想的”なプローブのデザインは非常に困難なこ
とである。実際に、単一の“普遍的”なカンピロバクタ
ープローブを検索するよりもむしろ、それぞれのプロー
ブが有用な水準の包括性と共に適当な排他性を示す一組
のカンピロバクター特異的プローブを検索する方が好ま
しい。全体として、好適なプローブセットは理想的には
大部分または全部のカンピロバクターを検出するが、非
カンピロバクター菌を検出しないであろう。このような
プローブセットでは、例えば、一方のプローブが１つま
たは2,3の重要なカンピロバクター株以外の全部を検出
でき、他方のプローブが第一プローブによって検出され
なかった2,3のカンピロバクター株にのみハイブリダイ
ズできる。こうして、下記のプローブは包括性に関して
個々に特徴づけられるが、先に詳述した特異的プローブ
の“セット”の概念は好ましくは、個々のプローブの重
要性を定める際に、およびアッセイキットを作製する際
に考慮されることが理解されるであろう。

プローブのデザインおよび分析の最終工程は、実際の
（例えば、食品／臨床／環境）サンプルを試験し、その
後望ましい性質が実際のアッセイ条件下で最適化される
ように、最終的なプローブセット用の適当なプローブを
選択することから成っている。

プローブ 前記のプローブ選択の戦略はサンプル中のカンピロバ
クター菌を同定するのに有用なプローブを数多くもたら
した。表の簡単な説明の項で概説したように、表２は代
表的なカンピロバクター株のrRNA中のそれらのターゲッ
ト部位において整列されたプローブ配列を示す。表2A〜
2Dは好適なプローブを詳述するものである。

表３は種々のカンピロバクターおよび非カンピロバク
ター菌の“サイトブロット”に対するプローブのハイブ
リダイゼーション挙動を示す。この実験では、プローブ
は検出および定量化のために³²Pで放射性標識された。
ハイブリダイゼーション条件は上述したハイブリダイゼ
ーション溶液中60℃で14〜16時間ハイブリダイズさせる
ことから成っていた。

しかしながら、より高度なストリンジェンシーのアッ
セイ系を用いる場合は、同程度の感度（ハイブリダイゼ
ーション効率）を維持するために、より長いプローブの
使用が望ましいことは容易に理解されるであろう。

表2Aはカンピロバクター16S rRNAの124〜225領域（E.
coliの位置の番号付けを使用）ターゲットとした４種の
プローブを示す。345および346と呼ばれるプローブはま
たそれぞれAR197およびAR196という名称のもとで同定さ
れた。両方のプローブはカンピロバクター属の細菌由来
のrRNAに特異的にハイブリダイズすることが立証され
た。いくつかの高感度アッセイ系において、プローブ34
5および346は通常のふん便サンプル中に存在する若干の
非カンピロバクター菌に対して望ましくない交差ハイブ
リダイゼーションを示し、従ってこれらのプローブはあ
まり好ましくない。別の配列分析に基づいて、プローブ
999および732が考案されて、試験された。これらは
“親”プローブよりも短かく（プローブ345および346が
50ヌクレオチド長であるのに対して、それぞれ31および
35ヌクレオチド長である）、またそれらは16S rRNA124
〜225領域に存在するカンピロバクター特異的配列位置
の異なる部分を利用しているために、このターゲット領
域の熱力学的に有利な二次構造に対してプローブ345お
よび346とはやや異なる関係を有している。全体とし
て、プローブ999および732は有利にもカンピロバクター
のターゲット種（C.jejuni、C.coliおよびC.laridis）
に対して等しい（すなわち、完全な）包括性を示し、か
つプローブ345および346によって示されたものに比べて
改良された排他性を示す。プローブ999および732は非−
C.jejuni、C.coliおよびC.laridisへの有意に少ないハ
イブリダイゼーションを示すが、これは目下好適なアッ
セイ系において改良された排他性を与える許容しうる妥
協のため（また、ふん便中の種々のカンピロバクター種
の相対的発生率−C.jejuni＞C.coli＞C.laridis＞＞＞
他の全てのカンピロバクター−のため）であると考えら
れる。

それ故に、プローブ732および999は前記の包括性およ
び排他性挙動のために、そしてまたそれらの見掛け感度
のために、ここに記載された最適なプローブである。プ
ローブ732および999のハイブリダイゼーション挙動は表
３および実施例１〜４に詳述される。表３はサイトドッ
ト法での個々のプローブの挙動を示す。実施例１〜４は
最適の二重特異的液体ハイブリダイゼーションにおいて
併用されたプローブのハイブリダイゼーション挙動を詳
述している。

二重特異的アッセイ系（以下で詳述する一実施例１）
では、ポジティブの結果を得るために両方のプローブの
ハイブリダイゼーションが必要であることに気づく。従
って、このアッセイ系においては、いずれかのプローブ
単独による望ましくないハイブリダイゼーション（すな
わち、非カンピロバクターへのハイブリダイゼーショ
ン）の影響が無くならないにしても、有意に減ぜられ
る。

表2Bはカンピロバクター16S rRNAの391〜501領域（E.
coliの位置の番号付けを使用）をターゲットとした、11
04および1105と呼ばれる２つのプローブを記述してい
る。プローブ1104はこれまでに試験した全てのC.jejuni
（５）、C.coli（３）およびC.laridis（５）にハイブ
リダイズし、さらに部分的に同定された臨床単離物（主
としてC.jejuni）62のうち58にハイブリダイズする。そ
れはまた全てではないにしても多数の他のカンピロバク
ター種にもハイブリダイズする。試験した非カンピロバ
クターのうち、W.curvaのみがプローブ1104によって有
意な程度に検出される。プローブ1105はこれまでに試験
した全てのカンピロバクター株および種にハイブリダイ
ズする。それはまた表１および２に示したBacteroides
およびWolinella株にもハイブリダイズするが、腸内細
菌株のE.coli、S.typhimurium（ネズミチフス菌）など
にはハイブリダイズしない。プローブ1105またはその誘
導体は、そのハイブリダイゼーション挙動により、表１
に示したカンピロバクターおよび“類縁菌”の全グルー
プの同定／検出に最も役立つ“広範囲特異的”プローブ
でありうる。この全グループは、いろいろな遺伝子およ
び生化学的基準によって、他の全ての細菌から完全に区
別されることに留意されたい。天然サンプル（例えば臨
床、食品または環境サンプル）中のそのグループの細菌
の存在を検出するのに有用なプローブまたはプローブセ
ットは、これらのまだ十分には解明されていない細菌の
発生および疫学を研究する上で、価値ある検索手段とな
るだろう。非−C.jejuni、C.coliおよびC.laridisの多
くは分離または培養するのが非常に困難であるので、環
境中でのそれらの伝播またはヒトや動物の病気とそれら
との関係についてはあまり知られていない。これらのプ
ローブはこのような理解を得るのに有用な道具として役
立つであろう。

表2Cはカンピロバクター16S rRNAの973−1049領域
（E.coliの位置の番号付けを使用）をターゲットとし
た、1130、1132および1133と呼ばれる３種のプローブを
記述している。全てのプローブは試験したC.jejuni、C.
coliおよびC.laridisに対して十分な包括生を示し（表
３）、さらに62全部の臨床単離物を検出する。少数の非
−jejuni、coliまたはlaridisカンピロバクター株への
限定されたハイブリダイゼーションが使用したハイブリ
ダイゼーション条件下でこの領域に対して３種のプロー
ブすべてによって示される。これらのプローブはすべて
優れた排他性挙動を示し、カンピロバクター特異的プロ
ーブとして極めて有用であるように思われる。

プローブ1132および1133は１つの位置でのみ相違する
ことに注意されたい。この相違はこの位置でのターゲッ
トカンピロバクター間に観察された異質性（heterogene
ity）を反映している。

表2Cの説明文中で最初に言及した類似体−Ｃは、その
Ｃ−４位置が1,3−プロパンジアミン側鎖で修飾された
２′−デオキシシチジンである（Schulman,L.H.ら、198
1,Nucl.Acids Res.,９,1203〜1217）。この化合物はCar
uthersによって開発された固相合成法を用いてDNAプロ
ーブに組み込むことのできるホスホルアミダイトに転化
される（Caruthers,M.H.ら、1982、Genetic Engineerin
g、Setlow,A.およびHollaender,J.K.（編集）、Vol.4、
p.1〜17、Plenum Press、ニューヨーク）。その後この
第一アミンは、例えば合成オリゴヌクレオチドの検出に
用いられるビオチンまたはフルオレセインリガンドによ
り、選択的に誘導体化される（Rashtchian,A.ら、198
7、Clin.Chem.,33/9,1526〜1530）。

表2DはプローブAR351として先に記載された351を含む
２種のプローブを記述している。他方のプローブ1134は
プローブ351から誘導されたものであってプローブ351よ
り短いが、カンピロバクター16S rRNA中の同一の新規構
造要素を利用している。351および1134は両方ともカン
ピロバクター16S rRNAの1424−1489領域をターゲットと
している。表2Dにおいて、プローブ351および1134のタ
ーゲット配列の中央付近に、カンピロバクターrRNAはこ
の領域のE.coli配列に対して６ヌクレオチドの保存的欠
失をもつことに注目されたい。E.coliの構造は大多数の
真正細菌によって示される構造を代表しており、従って
プローブ1134をカンピロバクターに対し特異的なものに
している。カンピロバクター間およびカンピロバクター
とBacteroides、Wolinellaなどとの間に見られるこの欠
失部位近辺の更なるヌクレオチド変異は、プローブ1134
および351のハイブリダイゼーションをカンピロバクタ
ーのC.jejuni、C.coliおよびC.laridisグループに限定
するのに役立っている。2,3の他のカンピロバクターへ
の若干の限定されたハイブリダイゼーションがドットブ
ロットにおいて検出されるが（表３）、非カンピロバク
ターへのハイブリダイゼーションは全く検出されない。

実施例１−全体的：ホモポリマー捕獲、二重プローブ液
体ハイブリダイゼーション法 カンピロバクターおよび／または非カンピロバクター
菌を含む培養物を適当を培地で増殖させ、次いで多数の
適当な溶菌剤（例えば、NaOH、グアニジン塩、洗剤、酵
素処理、またはそれらのいくつかの組合せ）のうちいず
れかを用いて核酸を放出させる。ハイブリダイゼーショ
ンは２つの異なるプローブまたはプローブセット（その
うちの少なくとも１つは、両方である必要はないが、検
出しようとする生物に特異的でなければならない）を用
いて実施される。本実施例において、カンピロバクター
特異的“捕獲”プローブ732はその３′末端に20〜200デ
オキシアデノシン（dA）残基を酵素的に付加され、そし
てリポータープローブ999は捕獲されたターゲット分子
を検出するための放射性リン（³²P）または他の小型リ
ガンド（例えば、フルオレセインまたはビオチン、この
実験では前者を用いる）で化学的または酵素的に標識さ
れる。

一般的に、培養／純化後、被検サンプル中に存在する
細菌は少量のアリコートに分けて試験管に移す。溶菌し
た後、捕獲および検出用プローブを加え、以下（実施例
１−特異的）に示すような適当な溶液中適当な温度でハ
イブリダイゼーションを進行させる。その後、ターゲッ
ト／プローブ複合体を含む溶液は15〜3000ヌクレオチド
長のデオキシチミジン（dT）を結合させた表面に、dAと
dTをハイブリダイズさせる条件下で接触させる。本実施
例では、ターゲット／プローブ溶液中に浸漬させるプラ
スチック製の“浸漬片（dipstick）”にdTを結合させ
た。カンピロバクターリボソームRNAが被検サンプル中
に存在する場合、dA付加したカンピロバクター特異的捕
獲プローブは存在するターゲットrRNA配列にハイブリダ
イズし、続いて浸漬片上に捕獲されるであろう。ハイブ
リダイズされなかった核酸および細胞破片は以下で述べ
るように洗い落とされ、dA−dt2本鎖によって表面に結
合された捕獲DNA−RNA複合体が残る。リポータープロー
ブもまた、正しいターゲット核酸が存在するときだけ、
相互作用の鎖−捕獲表面−dT:dA−捕獲プローブ：ター
ゲット：リポータープローブ−を介して浸漬片に結合さ
れる。結合されたリガンド誘導体化（例えば、フルオレ
セイン化）リポータープローブはその後、リガンド結合
性酵素複合体（例えば、本実施例では西洋ワサビペルオ
キシダーゼ結合抗フルオレセイン抗体）の添加により検
出される。検出複合体の特異的結合を可能にする条件下
でインキュベーションし、未結合酵素を洗い落とし、発
色性基質を添加し、その結果として発色させ（一般には
20〜30分）、場合により発色終止液を加えた後、色の濃
さを比色定量法により測定する。この読取り（一般には
0.1→2.0吸光単位の範囲）はネガティブ対照レベルと比
較し、閾値またはカットオフ値を定め、そして実験レベ
ルの“有意性”の決定を行う。

実施例１−特異的 臨床ふん便被検物の場合、サンプル1gをカンピロバク
ターふん便処理緩衝液（3.25Mグアニジンチオシアネー
ト、0.4M Tris−HCl（7.5）、0.08M EDTA、13％デキス
トラン硫酸5000、0.325％サルコシル）3mに加えて、
サンプルが均質になるまでボルデックス混合した。

それぞれのハイブリダイゼーションのために処理済み
サンプル0.70mを使用した。各サンプルから放出され
た核酸は0.05mの特異的な捕獲／検出プローブ（1.0μ
g/mの好適な捕獲プローブ732および0.5μg/mの検出
プローブ999−FITCを含む）の添加により検出した。捕
獲用浸漬片をそれぞれの試験管（溶菌液と特異的プロー
ブを含む）に入れた。内容物は37℃の水浴中で60分間イ
ンキュベーションして、特異的捕獲／リポータープロー
ブのターゲット核酸へのハイブリダイゼーション、およ
びこれらの特異的DNA/rRNAハイブリッドの上記浸漬片へ
の捕獲を行わせた。

ハイブリダイゼーション後、浸漬片はその活性dt被覆
部分をおおうのに十分な洗液（50mM Tris、pH7.5、150m
M NaCl 2mM EDTAおよび0.1％Tween20、室温）を含む洗
浄浴中に１分間浸漬することにより洗った。

洗浄した浸漬片は洗浄浴から取り出し、吸収紙で吸い
取って乾かし、0.75mの抗体−酵素複合体（抗フルオ
レセイン−西洋ワサビペルオキシダーゼを洗浄緩衝液で
希釈したもの）を含む１組の試験管に入れ、その後室温
で20分間インキュベーションを行った。

抗原−抗体反応を起こさせた後、浸漬片を試験管から
取り出し、先の２つの段落において記載した方法と同じ
方法で洗浄し、乾かした。その浸漬片は基質−色原体混
合物（尿素−ペルオキシド：テトラメチルベンジジン
〔Ventrex、メイン州ポートランド〕、2:1）を含む１組
のラベルを付けた試験管に入れ、室温で20分間インキュ
ベーションした。その後浸漬片を取り出し、0.25mの4
N硫酸を加えて発色段階を終わらせた。サンプルの吸光
度は波長450nmの光線を用んて比色定量法により測定し
た。

OD値が0.1以上のサンプルはカンピロバクターに対し
陽性であると見なされ、それより低い吸光度をもつサン
プルはカンピロバクターの不在を示していた。上記のよ
うに試験した148のふん便被検物から得られた結果を以
下に示す： 実施例２ 異なる濃度のC.jejuniを播種した陰性採集ふん便に対
して上記方法を繰り返した。次の結果が得られた： 本発明はrRNAの検出について記載されたが、ここに記載
のプローブおよびそれらの相補的なプローブはrRNAをコ
ードする遺伝子（DNA）を検出する際にも有用であるこ
とが容易に理解されるであろう。従って、このようなプ
ローブはここに記載のプローブの均等物であると考えら
れ、本発明の精神および範囲並びに特許請求の範囲に含
まれるものである。

実施例３ 実施例１の方法に従って、カンピロバクター単離物を
陰性の採集ふん便に10⁷CFU/mの濃度で“播種”し、好
適な液体ハイブリダイゼーション法で捕獲プローブ732
および検出プローブ999−FITCを用いて試験した。掲載
した細菌株の供給源は表３に示す通りである。得られた
結果は次の通りであった： 実施例４ 実施例３の方法に従って、非カンピロバクター単離物
を陰性の採集ふん便に10⁸CFU/mの濃度で“播種”し、
捕獲プローブ732および検出プローブ999−FITCを用いて
好適な液体ハイブリダイゼーション法により試験した。
掲載した細菌株の供給源は表３に示した通りであり、さ
らに（６）はSilliker Laboratories（イリノイ州シカ
ゴ）である。観察された結果は次の通りであった： 説明 16S rRNAは５′→３′方向に書かれており、プロ
ーブ配列はDNAとして３→５′方向に書かれている。16S
rRNA配列はE.coli配列（プローブターゲット領域を確
認するための基準として用いられる）に対して整列させ
てある。E.coli配列の上の数字はE.coli 16S rRNA配列
の５′末端から数えたヌクレオチド残基の番号を意味す
る。C.A.G.Uはそれぞれリボヌクレオチド塩基のシトシ
ン、アデノシン、グアノシンおよびウリジンを表す。RN
A配列中の文字W.Y.M.HおよびＮは不確定のヌクレオチド
の指定を表す：すなわちＷ＝ＡまたはＵ、Ｙ＝Ｃまたは
Ｕ、Ｍ＝ＣまたはＡ、Ｈ＝A,CまたはＵ、Ｎ＝A,C,Gまた
はＵ。RNA配列中の小文字はその位置でのヌクレオチド
の存在の不確定を示す。破線はヌクレオチドがその配列
のその位置に存在しないことを示す整列ギャップであ
る。プローブ345は米国特許出願第821393号に記載され
るプローブAR197に相当し、そしてプローブ346はプロー
ブAR196に相当する。

微生物の説明 E.coli＝GenBank Data BaseからのEsche
richia coli配列;C.jejuni1＝Campylobacter jejuni N9
41株、マサチューセッツ大学メディカルセンター（マサ
チューセッツ州ウスター）、Gary Doernからの臨床単離
物;C.jejuni2およびC.jejuni3はそれぞれアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）から供給さ
れた29428株および33560株である;C.coli＝Campylobact
er coli ATCC33559株;C.laridis＝Campylobacter larid
is ATCC35223株;C.fetus f＝Campylobacte fetusのfetu
s亜種5396株（フランス、パリ、パスツール研究所のコ
レクション）、個人的関係のP.Romaniukからの配列;C.h
yoint＝Campylobacter hyointestinalis ATCC35217株;
C.cryaero＝Campylobacter cryaerophila ATCC43157株;
Thiovulum細胞はD.Stahlによって増菌培養物から単離さ
れ（Stahlら、1987、Intn'l J.System.Bacteriol.,37:1
16〜122を参照）、D.StahlおよびD.Laneによって塩基配
列が決定された（Romaniukら、1987,J.Bacteriol.,169:
2137〜2141に報告されている）;W.succino＝Wollinella
succinogenes（Lauら、1987、System.＆ Appl.Microbi
ol.,９:231〜238からの配列）;F.rappini＝Flexispira
rappini 1937−38264株、ナショナル・アニマル・ディ
ズィーズ・センター（アイオワ州アメス）、J.Brynerに
よって提供された細胞;C.pylori＝Camylobacter pylori
ATCC43504株。

説明 微生物の説明および配列の表記法は表2Aと同じで
あるが、次の説明を追加する:C.jejuni5＝Campylobacte
r jejuni UVIC株（ブリティッシュ・コロンビア大学
（ブリティッシュ・コロンビア州バンクーバー）、P.Ro
maniukから個人的関係により提供された）;C.jejuni6＝
Campylobacter jejuni NCTC11392株（P.Romaniuk）;C.c
oli2＝Campylobacter coliNCTC11366株（P.Romaniuk）;
C.laridis2＝Campylobacter laridis ATCC35221（Roman
iukら、1987およびThompsonら、1988からの配列のD.Lan
eによる混成物）;C.fetus1＝Campylobacter fetusのfet
us亜種VPI H641株（Paster ＆ Dewhirst,1988）、ATCC2
7374（Thompsonら、1988）、およびCIP5396（Romaniuk
ら、1987）からの逆転写配列のD.Laneによる混合物;C.f
etus2＝Campylobacter fetusのvenerialis亜種ATCC1943
8株（Thompsonら、1988）および未同定株（P.Romaniu
k、個人的関係）の混成物;C.concisus＝FDC（Forsyth D
ental Ce−nter）288株、FDC484株（マサチューセッツ
州ボストン、ホーサイス・デンタル・センター、B.Pas
−ter ＆ F.Dewhirst、個人的関係）およびATCC13086株
（Thompsonら、1988）から誘導されたCampylo−bacter
concisus混成物;W.curva＝Wollinellacurva ATCC35224;
W.recta＝Wollinella rectaATCC33238;B.gracilis＝Bac
teroides gracilisATCC33236;B.ureolyt＝Bacteroides
ureolyt−icus ATCC33387;C.sputoruml＝ATCC33562株
（表2Aで定義されたC.sputorum）およびATCC33491株か
ら誘導されたCampylobacter sputorumのbub−ulus亜種
の混成物;C.sputorum2＝Ｓ−17株（Tho−mpsonら、198
8）および（Romaniukら、個人的関係）から誘導されたC
ampylobacter sputorumのsputorum亜種の混成物;C.crya
ero2＝Campylo−bacter cryaerophila ATCC11885（Thom
psonら、1988）;C.cinaedi＝Campylobacter cinaedi AT
CC35683（Thompsonら、1988）;C.fennell＝Campylobact
er fennelliae ATCC35684（Thompsonら、1988）;S＝Ｃ
またはＧ（ヌクレオチド指定における不確定）。

説明 微生物の説明および配列の表記法は表2Aおよび2B
と同じであるが、次の説明を追加する:C.sputorum＝Cam
pylobacter sputorumのbubulusら亜種ATCC33562。オリ
ゴヌクレオチドプローブのいくつかは一方の末端または
両方の末端に小文字ｃをもっている。これは種々の“検
出”リガンド（例えば、ビオチン、フルオレセイン）を
容易に結合することができる“類似体c"残基を示す。そ
れらは他の点でプローブの挙動に影響を及ぼすことはな
い。直接合成により類似体ｃを３末端に付加する場合、
初めに便宜上Ｔ残基がしばしばカップリングされる。そ
のＴ残基はそれがプローブとターゲット配列とのハイブ
リダイゼーションに必ずしも関与しないという点で、
“厳密な意味”でプローブの不可欠な部分ではない。

説明 微生物の説明および配列の表記法は表2A、2Bおよ
び2Cと同じであるが、次の説明を追加する:C.jejuni4＝
CAMPMERG、多数のC.jejuni株からの16S rRNA部分的逆転
写配列の混成物（Lauら、Systematic ＆ Appl.Microbio
l.,1987、９:231〜238）。C.hyoint配列中のCGジヌクレ
オチドをはさむかっこは、これらの２つのヌクレオチド
を同定するバンドがシークエンシングゲル上をやや変則
的に泳動したことを示す。

説明 それぞれの菌株のサイトドットによるハイブリダ
イゼーションは各プローブを陽性（＋）または陰性
（−）としておおざっぱにふりわけた。陽性信号は最強
（すなわち、C.jejuni、C.coliおよびC.laridis株）か
ら変動（例えば、非−jejuni、coliまたはlaridisカン
ピロバクター株）または微弱（すなわち、非カンピロバ
クター）まで変化する。62の臨床単離物は全てを種レベ
ルまで決定したわけではない。恐らく大部分はC.jejun
i、C.coliまたはC.laridis株である。

掲載した細菌株の供給源は次の通りである： （１） アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（メリーランド州ロックビル） （２） マサチューセッツ大学、メディカルセンター
（マサチューセッツ州ウスター）、Gary Doern （３）VAメディカルセンター（コロラド州デンバー）、
M.J.Dlaser （４） バーモント保健省（バーモント州バーリント
ン）、Tanya Sanderos （５）GTS イン−ハウス単離物

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 レイ・エイ・マクミラン アメリカ合衆国マサチューセッツ州 01545，シュリュースバリー，ブルック デール・サークル 14 (72)発明者 デービッド・ジェイ・レーン アメリカ合衆国マサチューセッツ州 01757，ミルフォード，オリオレ・ドラ イブ・ ９ (72)発明者 マーク・エル・コリンズ アメリカ合衆国マサチューセッツ州 01520，ホールデン，マルデン・ストリ ート 435 (72)発明者 ジェームス・イー・アウェル アメリカ合衆国マサチューセッツ州 02056，ノーフォーク，ローレンス・ス トリート 35 (72)発明者 アヨーブ・ラシュチャン アメリカ合衆国メリーランド州02879, ガイザーズバーグ，チューリップ・グロ ーヴ・ロード 9121 (56)参考文献 特開 昭62−228096（ＪＰ，Ａ) 特表 平１−503356（ＪＰ，Ａ) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌｏｇｙ，196（５）（1987）ｐ. 2134−2141 ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，43（1987）ｐ．331 −335

Claims (12)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】少なくとも30ヌクレオチドの長さの核酸フ
   ラグメントであって、ストリンジェント条件下で、カン
   ピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・コー
   リ、およびカンピロバクター・ラリディスの16S rRNA
   または16S rRNA遺伝子のヌクレオチド配列位置1010−1
   049（大腸菌の位置ナンバリング協定を使用）にハイブ
   リダイズし、かつ緑膿菌、大腸菌またはネズミチフス菌
   のrRNAまたはrRNA遺伝子にハイブリダイズしないことを
   特徴とする核酸フラグメント。
2. 【請求項２】前記フラグメントが、領域1010−1049（大
   腸菌の位置ナンバリング協定を使用）から選ばれる少な
   くとも33個の連続ヌクレオチドに相補的である、請求項
   １記載の核酸フラグメント。
3. 【請求項３】プローブ1132（５′−CGTCTCTAAGTTCTAGCA
   AGCTAGCACCCTCATATCCT−３′）、およびプローブ1133
   （５′−CGTCTCTAAGTTCTAGCAAGCTAGCACCCTCTTATCCT−
   ３′）より成る群から選ばれる、請求項１記載のフラグ
   メント。
4. 【請求項４】プローブ1132（５′−CGTCTCTAAGTTCTAGCA
   AGCTAGCACCCTCATATCCT−３′）、プローブ1133（５′−
   CGTCTCTAAGTTCTAGCAAGCTAGCACCCTCTTATCCT−３′）の配
   列、プローブ1132または1133の配列に相補的な配列、お
   よびストリンジェント条件下で前記の配列にハイブリダ
   イズする配列よりなる群から選択される配列を有する請
   求項１記載の第１の核酸フラグメント；および 第１の核酸フラグメントとは異なり、プローブ1132
   （５′−CGTCTCTAAGTTCTAGCAAGCTAGCACCCTCATATCCT−
   ３′）、プローブ1133（５′−CGTCTCTAAGTTCTAGCAAGCT
   AGCACCCTCTTATCCT−３′）、プローブ1130（５′−CAAG
   GTTCTTAGGATATCAAGCCCAGGTAAGGTTCTCT−３′）の配列、
   プローブ1132、1133または1130の配列に相補的な配列、
   およびストリンジェント条件下で前記の配列にハイブリ
   ダイズする配列よりなる群から選択される配列を有する
   少なくとも30ヌクレオチドの長さの第２の核酸フラグメ
   ント を含む核酸フラグメント対。
5. 【請求項５】前記フラグメントが、ハイブリダイゼーシ
   ョン条件下で、1132（５′−CGTCTCTAAGTTCTAGCAAGCTAG
   CACCCTCATATCCT−３′）、1133（５′−CGTCTCTAAGTTCT
   AGCAAGCTAGCACCCTCTTATCCT−３′）、および前記のもの
   のいずれかに相補的なプローブ全部より成る群から選ば
   れるプローブにハイブリダイズしうる、請求項１記載の
   核酸フラグメント。
6. 【請求項６】サンプル中のカンピロバクターの存在を検
   出する方法であって： （ａ）請求項１記載の核酸フラグメントとサンプルと
   を、前記サンプル中に存在するならば、前記フラグメン
   トがカンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター
   ・コーリ、および／またはカンピロバクター・ラリディ
   スのrRNAにハイブリダイズする条件下で接触させて、ハ
   イブリッド核酸複合体を形成させ； そして （ｂ）前記ハイブリッド複合体を、前記サンプル中の前
   記カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・
   コーリ、および／またはカンピロバクター・ラリディス
   の存在の指標として検出する の各工程を含む方法。
7. 【請求項７】前記核酸フラグメントが、ハイブリダイゼ
   ーション条件下で、1132（５′−CGTCTCTAAGTTCTAGCAAG
   CTAGCACCCTCATATCCT−３′）、1133（５′−CGTCTCTAAG
   TTCTAGCAAGCTAGCACCCTCTTATCCT−３′）、および前記の
   もののいずれかに相補的なプローブ全部より成る群から
   選ばれるプローブにハイブリダイズしうる、請求項６記
   載の方法。
8. 【請求項８】試料を、 プローブ1132（５′−CGTCTCTAAGTTCTAGCAAGCTAGCACCCT
   CATATCCT−３′）、プローブ1133（５′−CGTCTCTAAGTT
   CTAGCAAGCTAGCACCCTCTTATCCT−３′）の配列、プローブ
   1132または1133の配列に相補的な配列、およびストリン
   ジェント条件下で前記の配列にハイブリダイズする配列
   よりなる群から選択される配列を有する請求項１の第１
   の核酸フラグメント；および 第１の核酸フラグメントとは異なり、プローブ1132
   （５′−CGTCTCTAAGTTCTAGCAAGCTAGCACCCTCATATCCT−
   ３′）、プローブ1133（５′−CGTCTCTAAGTTCTAGCAAGCT
   AGCACCCTCTTATCCT−３′）、プローブ1130（５′−CAAG
   GTTCTTAGGATATCAAGCCCAGGTAAGGTTCTCT−３′）の配列、
   プローブ1132、1133または1130の配列に相補的な配列、
   およびストリンジェント条件下で前記の配列にハイブリ
   ダイズする配列よりなる群から選択される配列を有する
   少なくとも30ヌクレオチドの長さの第２の核酸フラグメ
   ント、 を含む少なくとも１対の核酸フラグメントと接触させ
   る、請求項６記載の方法。
9. 【請求項９】カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロ
   バクター・コーリ、およびカンピロバクター・ラリディ
   ス検出用のアッセイキットであって、少なくとも１つの
   容器に収容された請求項１記載の核酸フラグメント、お
   よびサンプル中のカンピロバクター・ジェジュニ、カン
   ピロバクター・コーリ、および／またはカンピロバクタ
   ー・ラリディスの群の少なくとも１種の細菌の存在を検
   出すべく前記核酸フラグメントを利用するための説明書
   を含むキット。
10. 【請求項１０】カンピロバクター・ジェジュニ、カンピ
    ロバクター・コーリ、およびカンピロバクター・ラリデ
    ィス検出用のアッセイキットであって、少なくとも１つ
    の容器に収容された請求項１記載の核酸フラグメント、
    およびサンプル中のカンピロバクター・ジェジュニ、カ
    ンピロバクター・コーリ、およびカンピロバクター・ラ
    リディスの群の少なくとも１種の細菌の存在を検出すべ
    く前記核酸フラグメントを利用するための説明書を含む
    キット。
11. 【請求項１１】前記フラグメントがプローブ1132（５′
    −CGTCTCTAAGTTCTAGCAAGCTAGCACCCTCATATCCT−３′） またはその相補物である、請求項５記載のフラグメン
    ト。
12. 【請求項１２】前記フラグメントがプローブ1133（５′
    −CGTCTCTAAGTTCTAGCAAGCTAGCACCCTCTTATCCT−３′） またはその相補物である、請求項５記載のフラグメン
    ト。