KR960002876B1 - 올리고 누클레오티드탐침, 마이코박테리아 핵산 검측 및 증폭방법, 및 검측용 키트 - Google Patents

올리고 누클레오티드탐침, 마이코박테리아 핵산 검측 및 증폭방법, 및 검측용 키트 Download PDF

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Abstract

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Description

올리고 누클레오티드탐침, 마이코박테리아 핵산 검측 및 증폭방법, 및 검측용 키트
제1도는 클론 MK14의 지도임. 여기서, 플라스미드 MK14의 삽입물은 5개의 서브단편 A-E로 세분되고, DNA 상의 숫자명기 박스는 하기 표1기재 올리고누클레오티드를 나타내며, 각 단편크기와 GC함량은 주지하는 바와같음.
제2도는32P 라벨 MK14-C를 탐침으로 사용한 마이코박테리아와 비마이코박테리아(non-mycobacteria)의 서던 블럿임. 밴딩패턴은 상술된 탐침이 시험된 여하한 비마이코박테리아에 대해서도 교차반응성을 지니지 않으며, 강한 속특이성을 지님을 보여줌.
제3도는32P 라벨 MK14-D를 탐침으로 사용한 마이코박테리아와 비마이코박테리아의 서던 블럿임. 밴딩패턴은 이 탐침이 M. Kansasii 특이성만을 지니며, 다른 시험된 여하한 미생물과도 교차반응하지 아니함을 보여줌.
제4도는 폴리머라제사슬반응(RCR) 아가로즈겔임. 여기서, 프라이머로서 올리고 14-3(SEQ IN DO : 2)와 14-10(SEQ ID NO : 9)를 사용한 PCR 증폭 반응물을 1% 에티디움 브로마이드로 아가로즈겔을 염색하는 가시분석함. 화살표는 더딘 성장을 하는 마이코박테리아(주형으로서 사용된)의 모든 레인에서 발견되는 242bp 생성물을 가리킴. 포지티브 콘트롤시에는 주형으로 플라스미드 MK14(pMK14)를, 네가티브 콘트롤시에는 주형 DNA 대신 수(水)룰 사용함.
제5도는32P 라벨 MK14-C를 탐침으로 사용한, 제4도 PCR겔의 서던 블럿임. 화살표는 모든 비마이코박테리아와 마이코박테리아 M.Chelonae 및 M. fortuitum을 제외한 모든 더딘 성장 마이코박테리아와 M. gordonae에 존재하는 242bp를 가리킴. 포지티브와 네가티브 콘트롤은 제4도와 동일방법 사용.
본원은 올리고누클레오티드 탐침, 특히, 마이코박테리아 DNA와 선택적으로 혼성화할수 있는 올리고누클레오티드 탐침에 관한다.
보건의들은 마이코박테리아성 감염환자가 증가일로에 있음과 아울러 이들 새로운 감염환자들 대다수가 AID에 감염되어 있음을 보게 된다. 내과의들은 마이코박테리아성 감염(mycobacterial infection) 여부진단시 자신들과 조력관계를 갖는 임상 미생물학자들에 의지케 되지만, 대부분은 주로, 생화학적 분석이 후속되는, 당해미생물의 합산성 염색 및 배양에 의존케 된다. 이같은 방법은 시간 소모적 방법임으로 하여, 새롭고도, 특히 신속한 마이코박테리아성 감염진단 방법이 끊임없이 요망되어 왔다.
본원은 마이코박테리아 핵산과 선택적으로 혼성화할 수 있는 올리고누클레오티드 탐침을 제공한다. 올리고누클레오티드 탐침은 (a) 본질적으로 본원 SEQ ID NO : 1(MK14) DNA 서열로 구성된 올리고누클레오티드 탐침 ; (b) MK14의 마이코박테리아 핵산과의 선택적 혼성화능을 그대로 보지하는, MK14 단편 구성 올리고누클레오티드 탐침 ; (c) MK14와 혼성화함과 아울러 마이코박테리아 핵산과의 선택적 혼성화능도 지니는 올리고누클레오티드 탐침 ; 및 (d) 상술한 것중 어느 것에 상보적임과 아울러 마이코박테리아 핵산과의 선택적 혼성화능도 지니는 올리고누클레오티드 탐침으로 구성된 그룹 가운데 선택된다.
상술한 것의 첫번째 구체예는 (a) 본질적으로 본원 SEQ ID NO : 22(M. kansasii 단편 BC) DNA 서열로 구성된 올리고누클레오티드 탐침, 본질적으로 본원 SEQ ID NO : 23(M. tuerculosis 단편 BC) DNA 서열로 구성된 올리고누클레오티드 탐침, 및 본질적으로 본원 SEQ ID NO : 24(M. avium 단편 BC) 서열로 구성된 올리고누클레오티드 탐침 ; (b) 상기 (a) 탐침의 마이코박테리아 핵산과의 선택적 혼성화능을 그대로 보지하는, 상기 (a) 탐침 단편 구성 올리고누클레오티드 ; (c) 상기 (a) 탐침과 혼성화함과 아울러 마이코박테리아 핵산과의 선택적 혼성화능도 지니는 올리고누클레오티드 탐침 ; 및 (c) 상술한 것중 어느것에 상보적임과 아울러 마이코박테리아 핵산과의 선택적 혼성화능도 지나눈 올리고누클레오티드 탐침으로 구성된 그룹에서 선택된 올리고누클레오티드 탐침이다.
상술한 것의 두번째 구체예는 (a) 본질적으로 본원 SEQ ID NO : 14(MK14.-C) DNA 서열로 구성된 올리고누클레오티드 탐침 ; MK14-C의 마이코박테리아 핵산과의 선택적 혼성화능을 그대로 보지하는, MK14-C 단편 구성 올리고누클레오티드 탐침 ; (c) MK14와 혼성화함과 아울러 마이코박테리아 핵산과의 선택적 혼성화능도 지니는 올리고누클레오티드 탐침 ; 및 (d) 상술한 것중 어느 것에 상보적임과 아울러 마이크로박테리아 핵산과의 선택적 혼성화능도 지니는 올리고누클레오티드 탐침으로 구성된 그룹가운데 선택된 올리고누클레오티드 탐침이다.
상술한 것의 세번째 구체예는 (a) 본질적으로 본원 SEQ ID NO : 14(MK14.-D) DNA 서열로 구성된 올리고누클레오티드 탐침 ; (b) MK14- D의 Mycbacteria kansasii 핵산과의 선택적 혼성화능을 그대로 보지하는 MK14 단편 구성 올리고누클레오티드 탐침 ; (c) MK14 와 혼성화함과 아울러 Mycbacteria kansasii 핵산과의 선택적 혼성화능도 지니는 올리고투클레오티드 탐침 ; 및 (d) 상술한 올리고누클레오티드 탐침중 어느 것에 상보적임과 아울러 마이코박테리아 핵산과의 선택적 혼성화능도 지니는 올리고누클레오티드 탐침으로 구성된 그룹에서 선택되고, Mycbacteria kansasii 핵산에 대한 선택적 혼성화능을 지니는 올리고누클레오티드 탐침이다.
본원에는 또한 핵산 샘플내 마이코박테리아 핵산의 검측방법이 기재되어 있다. 이 방법은 상술한 올리고누클레오티드 탐침을 마이코박테리아 핵산과의 혼성화를 허용하는 조건하에서 핵산 샘플과 접촉시키는 단계 및 상술한 올리고누클레오티드 탐침이 핵산 샘플과 혼성하는지, 그렇제아니한지를 검측하는 단계로 구성되는바, 상술한 올리고누클레오티드 탐침이 핵산 샘플과 혼성화함은 핵산 샘플이 마이코박테리아 핵산을 함유한다는 것을 가리킨다.
본원에는 또한 핵산 샘플내 마이코박테리아 핵산 검측용 킷(kit)이 기재되어 있다. 이 킷은 혼성화 용액과 상술한 올리고누클레오티드 탐침으로 구성된다. 상술한 올리고누클레오티드 탐침은 동결건조되거나 또한 상술한 혼성화 용액내에 내포될 수 있다.
본원에는 또한, 쌍을 이루는 각 올리고누클레오티드 탐침의 선택된 마이코박테리아 핵산 서열과의 혼성화를 허용하는 조건하에서 최소한 한쌍의 올리고누클레오티드 탐침을 핵산 샘플과 접촉시키는 단계 및 선택된 마이코박테리아 표적서열을 증폭시는 단계로 구성되고,상술한 탐침쌍이 모두 함께 증폭쌍을 구성하며, 상술한 쌍을 이루는 각 올리고누클레오티드 탐침이 (i) MK14의 마이코박테리아 핵산과의 선택적 혼성화능을 그대로 보지하는, SEQ ID NO : 1(MK14) 단편구성 올리고누클레오티드 탐침 ; (ii)MK14와 혼성화함과 아울러 마이코박테리아 핵산과의 선택적 혼성화능도 지니는 올리고누클레오티드 탐침 ; 및 (iii) 상술한 것중 어느 것에 상보적임과 아울러 마이코박테리아 핵산과의 선택적 혼성화능도 지니는 올리고누클레오티드 탐침으로 구성된 그룹에서 선택되는, 핵산 샘플내 선택된 마이코박테리아 핵산서열을 증폭시키는 방법이 기재되어 있다.
본원은 다양한 종류의 마이코박테리아종에 결합하는 탐침 및 특정 마이코박테리아종에 결합하는 탐침을 유리하게 제공한다. 범용 탐침은 마이코박테리아성 감염의 초기 스트린용으로 유용한 바, 현재 초기 스크린용으로 사용되는 배양 기술(6주의 배양을 필요로 하는) 보다 신속한 시크린 수단을 제공한다. 일단 초기 스크린에서 양상 판정이 있고나면 본원 종특이적 탐침이 특정 감염진단용 신속수단을 제공케 된다.
본원에서 누클레오티드 서열은 5'(왼쪽)→3'(오른쪽) 방향성을 갖는 단일 가닥으로 표기된다. 본원 사용된 단일 문자 누클레오티드 심볼은 IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissin의 추천 규정에 따른 표준 의미를 지닌다.
본원 사용된 "마이코박테리아"(Mycobacteria)라는 용어는 당업계 통상의 항산성(acid-fast), 비운동성, 간상 박테리아를 가리킨다[B. Davis et al., Microbiology, 724-742(3d Ed. 1980)참조]. 예컨대 마이코박테리아는 Mycobacterium africanum, M. avium, M. bovis, M. bovis-BCG, M.chelonae, M. fortuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. kansasii, M. microti, M. scrofulaceum, 및 M. trberculosis를 포함(그러나 이에 한하지는 않는)한다. 본원 사용 "증폭쌍"(amplification pair)"이라는 용어는 선택된 마이코박테리아 핵산 서열을 하기 상세히 설명된 플리머라제사슬반응, 리가제사슬반응, 또는 가닥치환 증폭과 같은 방법으로 증폭시킴에 있어 함께 사용되기에 적합한 것으로 선택된 본원 올리고누클레오티드 탐침쌍을 가리킨다.
본원 실행용 핵산(즉, DNA 또는 RNA) 샘플은 혹종의 적합한 소스로부터 얻어질 수 있다. 보통, 핵산 샘플은 마이코박테리아를 함유하는 것으로 의심이가는 생물학적 조직 또는 생물학적 유체샘플 형태로 얻어진다. 적합한 생물학적 유체는 타액, 기관지 세척액, 위세척액(삼킨 타액을 함유하는), 혈액, 밀크, 및 림프액을 포함(그러나 이에 한하지 않는)한다. 적합한 조직샘플은 피부 및 연조직 샘플을 포함(그러나 이에 한하지 않는)한다. 본원은 인간 및 수의 진단방법 양자 모두에 사용가능(마이코박테리아가 인간 및 동물종을 감염시키기 때문에)하고, 그에 따라 샘플도 인간 및 동물종 양자 모두에게서 수집되어진다. 본원은, 예컨대, 가축의 M. bovis (가축에 결핵을 일으킬 뿐 아니라 인간에 대한 전염성도 갖는) 감염여부진단 및 가축 밀크내 M. bovis 존, 부테스트용으로도 사용될 수 있다. 본원은 또한, 예컨대, M. avium 및 M. intracellulare(돼지, 및 닭과 비둘기같은 조류를 감염시키는) 감염 검측용으로도 사용될 수 있다. 본원은, 또, M. tuberculosis, M.kansasii, M. avium, M. intracellulaire, M. scrofulaceum 및 M. fortuitum을 포함(그러나 이에 한하지 않는 )하는 다양한 종류의 마이코박테리아(인간이 용이하게 감염되는) 감염 검측용으로도 사용될 수 있다.
본원 올리고누클레오티드 탐침은 어떤 적합한 길이(사용된 특정 분석포맷에 따라 달라질 수 있는)를 지닐 수 있다. 일반적으로, 올리고누클레오티드 탐침은 최소한 10 내지 15 누클레오티드의 길이를 갖는다. 예컨대, 마이코박테리아 검측용으로 사용되는 올리고누클레오티드 탐침은 15 내지 20 누클레오티드의 바람직한 길이를 갖는다. 올리고누클레이오티드 탐침에는 하기 상세히 설명되는 가닥 치환 증폭 탐침요소가 첨합될 수 있다. 올리고누클레오티드 탐침의 증폭상에 지향되는 핵산서열은 50 내지 150 누클레오티드의 바람직스런 길이를 갖는다.
본원 기재 특징 핵산 서열과 핵산서열 혼성화는 감소된 스트린젠시조건하에서, 중정도의 스트린젠시조건하에서 또는 심지어 표준 혼성화 분석법의 스트린젠시조건(예컨대, 탐침 용융온도 이하 20℃ 또는 30℃의 온도에서의 .5x SSC. 1% SDS 세척 스트린젠시에 의해 제공되는 조건, 또는 심지어 MK14 DNA에 대한 DNA 서열 용융온도 이하 10℃의 온도에서의 .1x SSC 및 .1% SDS 세척 스트린젠시에 의해 제공되는 조건)하에서도 행해질 수 있다. [J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2d Ed. 1989)(Cold Spring Harbor Laboratory) 참조]. 통상, 본원 기재 MK14 DNA와 혼성화하는 핵산서열은 이 MK14 DNA의 서열과 최소한 65%, 70% 심지어 75% 또는 그 이상의 상동성을 갖는다.
본원 탐침은 포스포로티오네이트, 디티오네이트, 알킬 포스포네이트 및 α-누클레오타이드를 포함하는 수정된 골격 및 천연 당-인산 골격과 함께 사용될 수 있다. 수정된 당-인산골격은 Miller and T' so, Ann. Reports Med. Chem., 23 : 295(1988)과 Moran et al., Nuc. Acids Res., 14 : 5019(1987)에 총괄적으로 설명되어 있다. 본원 탐침은 리보핵산(RN) 또는 데옥시리보핵산(DNA)으로 축조될 수 있으며, DNA가 바람직한 것으로 사료된다.
탐침사용 검측방법은 노던 블럿(RNA 검측), 서던 블럿(DNA 검측), 웨스턴 블럿(단백질 검측), 돗트 블럿(dot blots)(DNA, RNA 또는 단백질)을 포함한다. 다른 검측방법은 계심봉 장치(dipstick setup) 상에 탐침을 함유하는 킷(kit) 등을 포함한다.
본원 탐침 사용 결과로 형성된 혼성분자(hybrid molecule) 검측을 위하여, 통상, 탐침중의 하나에 검측 가능 마커가 부가된다. 탐침은 여러가지 방법으로 라벨될 수 있다. 탐침은 방사선 라벨되어 방사선 사진술로 검측될 수 있다. 방사선 사진술용 레벨은3H,125I,35S,14C, 및32P 를 포함한다. 통상, 방사성 동위원소의 선택은 당해 동위원소의 합성용이성 및 반감기를 포함하는 연구 편애점들에 좌우된다. 다른 검측가능 마커들은 리간드, 형광단, 화학발광단, 전기화학적 센서, 시간이 지나면 소광되는 형광, 효소, 및 항체를 포함한다. 예컨대, 항체는 리간드로 라벨될 수 있다. 본원 탐침용 다른 검측가능 마커들은 바이오틴, 방사성 누클레오티드, 효소저해제, 조효소, 루시페린, 상자성 금속, 스핀라벨 및 단클론성 항체를 포함한다. 라벨선택은 탐침 결합방식을 지시해준다.
여러가지 수단을 통해 방사성 누클레오티드들이 본원 탐침에 첨합될 수 있다. 그같은 수단은 두가닥 탐침을 닉크 번역하는 방법, 특정 삽입물을 지니는 단일 가닥 M13 플라스미드를 방사성 dNTP 존재하에서 E.coli DNA 폴리모라제또는 다른 DNA 폴리머라제의 클레누단편을 사용해 카피하는 방법, 방사성 dNTP존재하에서 역전사효소를 사용 RNA 주형으로부터 cDNA를 전사하는 방법, 방사성 rNTP 존재하에서 SP6 또는 T7 RNA 폴리머라제를 사용 SP6 프로모터 또는 T7 프로모터와 같은 강력한 프로모터를 함유하는 벡터로부터 RNA를 전사하는 방법, 터미날 트란스퍼라제를 사용 탐침의 3' 말단을 방사성 누클레오티드로 테일링하는 방법, 및 감마32P ATP 및 폴리누클레오티드 키나제를 사용 탐침의 5' 말단을 포스포릴레이션시키는 방법을 포함한다.
선택된, 또는 표적 핵산서열의 증폭은 흑종의 적합한 수단을 통해 행해질 수 있다[D. Kwoh and T. Kwoh, Am, Biotechnol. Lab. 8, 14-25(1990) 참조]. 적합한 증폭기술의 예들은 폴리머라제사슬반응, 리가제사슬반응, 가닥치환증폭, 전사-기초 증폭[D. Kwoh et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 86, 1173-1177(1989) 참조], 자기-지지서열 복제[J. Guatelli elli et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 87, 1874-1878(1990) 참조], 및 Qβ 레츨리카제시스템[P. Lizardi et al., BioTechnology 6, 1197-1202(1988) 참조]을 포함(그러나 이에 한하지는 않는)한다.
폴리머라제사슬반응(PCR)은 공지기술로 행해진다(예컨대, 본원 참고 특허 문헌 제4,683,195호 ; 제4,683,202호 ; 제4,800,159호 ; 및 4,965,188호 참조). 일반적으로, PCR은 핵산샘플(예컨대, 열안정 DNA 폴리머라제존재하의)을 혼성화 조건하에서 올리고누클레오티드 프라이머(각 특정 서열가닥과 혼성화하기에 충분할 정도로 상보적임으로 하여, 차후 자신으로부터 합성되는 신장 생성물이 본체로부터 분리되는 경우, 다른 프라이머의 신장생성물용 주형으로서 쓰여질 수 있도록 해주는)로 처리(각 특정 서열 가닥당 한개의 올리고누클레오티드 프라이머가 배당될 수 있도록) 하므로서 각 핵산가닥에 상보적인 각 프라이머의 신장 생성물을 합성하는 단계 및 검측될 서열 또는 서열들이 존재하는 경우 상기 샘플을 변성조건하에 처리하므로서 상기 프라이머 신장생성물을 그들의 주형으로부터 분리시키는 단계로 구성된다. 이들 단계들은 목적하는 정도의 증폭이 얻어질때까지 주기적으로 반복된다. 증폭 서열검측은 반응 생성물과 혼성화할 수 있는, 검측가능 라벨함유 올리고누클레오티드 탐침(예컨대, 본원 올리고누클레오티드 탐침)을 반응생성물에 부가한뒤, 라벨을 공지기술로 검측하는 방법으로 행해질 수 있다.
리가제사슬반응(LCR)은 공지기술로 행해진다[예컨대, R. weiss science 254, 1292(1991) 참조]. 일반적으로, LCR은 두쌍의 올리고누클레오티드 탐침(각 검측될 서열가닥에 한쌍씩 결합하는)을 이용해 행해지게 된다. 각 쌍은 함께 자신이 해당하는 가닥을 완전히 오버랩하게 된다. LCR은 검측될 서열의 가닥을 변성(예컨대, 분리)시키는 단계, 변성시킨 가닥을 열안정리가제존재하에서 두쌍의 올리고누클레오티드 탐침과 반응시킴으로서 각 올리고누클레오티드 탐침쌍을 함께 결찰시키는 단계, 이때 얻어진 반응 생성물을 분리시키는 단계, 및 서열이 목적하는 정도까지 증폭될때까지 이상의 단계를 주기적으로 반복하는 단계로 구성되는 바, 이상의 단계가 완료되고나면, PCR의 경우와 동일한 방법을 이용한 검측이 행해질 수 있다.
가닥치환 증폭(SDA) 역시 공지기술로 행해진다[G. walker er al., Proc. Natl. Acad. sci. USA 89, 392-396(1992) ; G. walker et al.,Nucleic Acids Res. 20, 1691-1696(1992) 참조]. SDA는 단일 증폭 프라이머(자수적 증폭이 이루어지는)를 이용해 행해질 수 있다. 일반적으로, SDA 증폭 프라이머는5'→3'방향 플랭킹 서열(이 DNA 서열은 별다른 중요성을 지니지 않음), 당해 SDA 반응에 사용되는 제한 효소용 제한부위, 및 증폭 및/또는 검측될 표적 서열과 혼성화하는 올리고누클레오티드 서열(예컨대, 본원 올리고누클레오티드 탐침)로 구성된다. 상기 플랭킹 서열(단순히, 제한효소의 제한 부위에 대한 결합촉진용으로서 사용되는)은 약 15 내지 20 누클레오티드의 길이를 지니는 것이 그리고 상기 오리고누클레오티드 탐침 부분은 약 13 내지 15 누클레오티드의 길이를 지니는 바람직하며, 상기 제한부위는 SDA 반응에서 기능적 역할(즉, 프라이머 가닥에 첨합된 포스포로티오네이트연결부는 연속적 닉킹을 저해하지 아니하므로서, 비회문 인지부위를 사용함으로서 충족될 수 잇는 조건이 연속적 니킹 비저해조건을 창출해낸다). SDA는 단일 증폭 프라이머 및 하기와 같은 순차적 단계를 통해 행해지게 된다 ; DNA 샘플을 하나이상의 제한효소로 소화시켜 검측될 서열함유 제한단편(바람직스럽기로 약 50 내지 100 누클레오티드의 길이 및 낮은 GC 함량을 갖는)을 제조하는 단계, 이같은 제한 단편을 함유하는 반응 혼합물에 SDA 증폭 프라이머를 부가하므로서 제한 단편과 증폭 프라이머간의 두가닥 사슬(각 말단에 5' 돌출부를 갖는)을 형성시키는 단계, 증폭 탐침상의 제한부위(예컨대, Hinc II)에 결합하는 제한효소를 상기 반응혼합물에 부가하는 단계, 엑소누클리아제결여 DNA 폴리머라제[예컨대, E. coil DNA 폴리머라제I의 엑소누클라제결여형, V. Derbyshire, Science 240, 199-201(1988) 참조]를 상기 반응혼합물에 부가하는 단계, 세개의 dNTP와, 사용되는 특정제한효소용 제한부위 존재 프라이머 가닥에 포스포로 티오에이트 연결부를 첨합시키기 위해 선정한 한개의 dNTP[S](예컨대, 제한효소가 Hinc II인 경우, dGTP, dCTP, dTTP, 및 dATP[S])를 상기 반응혼합물에 부가하는 단계, 상기 DNA 폴리머라제가 dNTPs를 이용 두가닥 사슬의 3'말단을 신장시켜 표적가닥의 다운스트림 보체를 형성시키는 단계, 상기 제한효소가 증폭 프라이머상의 제한부위를 닉크하는 단계, 상기 DNA 폴리머라제가 다시 증폭 프라이머의 3' 말단을 신장시켜 앞서 형성된 표적가닥의 다운스트림보체를 치환하는 단계. 이 반응은 제한 효소가 제한부위로부터 형성되는 새로운 상보적 가닥을 연속해 닉크하고, DNA 폴리머라제가 닉크된 제한부위 기원의 새로운 상보적 가닥을 연속해 형성시키기 때문에 본질적으로 반복적 성경을 띠게 된다. SDA는 두가닥 표적 DNA 서열상의 한쌍의 프라이머 이 경우 두번째 프라이머는 상보적 가닥의 5'말단에 결합케 되는)를 이용해 행해질 수 있는 바, 이 경우 두조의 반복적 반응이 동시에 일어나고, 그에따라 반응이 지수적으로 진행(한조각의 반응 생성물이 다른 한조 반응시의 증폭 프라이머용 표적으로서 사용될 수 있기 때문에)되게 된다. 뿐만 아니라, DNA 샘플을 소화시켜 제한단편을 형성시키는 첫번째 단계도 DNA 폴리머라제의 가닥치환 활성을 이용함과 동시에 각 증폭 프라이머가 결합하는 위치에서 5'쪽에 위치하는 플랭킹 위치 존재 기질에 결합하는 한쌍의 "범퍼(bumper)" 프라이머를 부가함으로서 제거할 수 있다. 각 범퍼 프라이머 신장 생성물은 당해 증폭 프라이머 신장 생성물을 치환케 되고, 두개의 취환된 상보적 증폭 프라이머 생성물은 서로 결합, 한쌍의 SDA 프라이머를 이용한 지수적 SDA용 기질로서 사용될 수 있느 두가닥 DNA 단편을 형성케 된다.
SDA를 사용하는 경우의 본원 올리고누클레오티드 탐침은 G+C함량이 낮은(바람직스럽기로 G+C가 전체 탐침 누클레오티드 조성의 70% 이하를 구성하는)것 가운데 선택되는 것이 바람직하다. 마찬가지로, 표적 서열도 GC함량이 낮은 것을 사용한데, 이는 2차 구조 형성을 피할 수 있도록 해주기 때문이다.
핵산샘플내 마이코박테리아 핵산 검측용 킷(kit)은 최소한 하나의 본원 탐침, 및 탐침과 핵산 샘플간 혼성화를 가능케 해주는 혼성화 용액을 함유하는 바, 이 경우 탐침은 용액에 현탁된 형태로 또는 동결건조 형태로서 별개로 제공 될 수 있다. 한가지 적합한 혼성화 용액의 예로는 6x SSC(pH 7.0의 0.9M 소듐 클로라이드, 0.09 M 소듐 시트레이트), pH 8.0의 0.1M EDTA, 5x Denbardt 용액[0.1%(w/v) Ficoll Type 400, 0.1%(w/w) 폴리비닐피롤리돈, 0.1%(w/v) 소혈청알부민], 및 100㎍/㎖의 시어드되고(sheared), 변성된 연어정액 DNA(Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD 20877 USA가 Catalog No. 5565UA로 시판하는)[T. Maniatis et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 387-388(1982)(Cold Spring Habor Labororatory) 내조]. 킷(통상, 본원 방법 특정구체에 실행용 지침서를 포함하는)의 성분들은 일반적인 용기(예컨대, 무른봉인으로 봉인된 용기)에 함께 수용된다. 킷의 부가적인 임의선택 성분들(사용될 분석 포맷이 어떤것이 되는가에 따라 달라질 수 있는)은 상술한 RCR 실행용 첫번째 탐침과 함께 사용하기에 적합한 본원 두번째 탐침(또는, LCR 실행용 킷의 경우, 본원 두 쌍의 탐침), 하나 이상의 검측탐침, 및 검측단계 실행용 수단(예컨대, 검측가능 마커로 라벨시킨 본원탐침 및 검측가능 마커가 효소인 경우 임의의 효소기질)을 포함한다.
본원은 하기 실시예를 통해 보다 상세히 설명될 것인 바, 여기서, "Kb"는 킬로베이스를, "bp"는 염기쌍을 "ng"는 나도그램을, "pmoles"은 피코몰을, "㎕"는 마이크로 티터를, "mM"은 밀리몰(milliMolar), ""은 마이크로몰(microMolar)를, "DTT"는 디티오티오쓰레이톨(dithiothreitol)을, "Tm"은 융점을, 온도는 다른 언급이 없는 한 ℃를 의미한다. 이들 실시예를 본원을 예시코저함이지 이를 제한하려함이 아님에 유의해야 한다.
[실시예 1]
균주 및 게놈 DNA 제조
본원 실시예 사용 마이코박테리아는 M. africanum LCD501, M. avium ATCC25291, M. bovisCDC4, M. bovis-BCG CDC34, M. chelonae TMC1543, M. fortuitum TMC1529, M. gordonae TMC1318, M. intracellulare ATCC13950, M. kansasii TMC1201, M. microti LCDC201, M. scrofulaceum CDC78, and M. thberculosis ATCC27294. Non-mycobacteria used were Bordetella pertussis ATCC8467, Candida albicans ATCC44808, Corynebacterium diphtheriae ATCC11913, Escherichia coli ATCC11775, Flavobacterium meningisepticum ATCC13253, Nocardia asteroides ATCC3308, Rhodococcus rhodochrousATCC13808, Streptococcus pnuemoniae ATCC6306, Adenovirus Sigma D3390(Advirus), Eukaryotic DNA McCOy cells(eukDNA)이다. 더딘 성장을 하는 마이코박테리아는 M. africanum, M. avium, M. Bovis, M. bovis-BCG, M. intracellulare, M. kansasii, M. microti, M. scrofulaceum 및 M. tuberculosis이고, 신속성장을 하는 마이코박테리아는 M. chelonae, M. fortuirtum 및 M. gordonae이다. 마이코박테리아 균주 모두를 BACTEC 바이알내에서 배양한뒤 4시간 동안 70℃에서 열사멸시키고, 이 열사멸시킨 균주로부터 공지기술을 사용 게놈 DNA를 분리해내었다.[S. Visuvanathan et al., Simple Enzymatic Method for Isolation of DNA from Diverse Bateria, J. Microbiol. Meth. 10, 59-64(1989) 참조]. 비마이코박테리아 균주(non-mycrobacteria strain)를 루리아 육즙베지(Luria broth)에서 배양한뒤, 이 균주로부터 CTAB mini-prep 방법을 사용 게놈 DNA를 분리해 내었다.[예컨대, F. Asubel et. al., Current protocols in Molecular Biology(1987) 참조].
[실시예 2]
[M. Kanasasii 라이브라리]
Sau3AI(GIBCO BRL)를 사용 M. kansasii 게놈 DNA 를 절단하였다. 단편 크기는 1.4kb에서200bp 이상이었다. BamHi(GIBCO BRL)를 사용해 벡터[BlueScipt SK +(stratagene)]를 소화시킨뒤, 송아지장기원 알칼라인 포스파타제(CIAP)(Boehringer Mannheim Biochemicals)를 사용 포스파타제처리를 하였다. 50mM 트리스-HCI pH 7.5, 7mM MgCl2, 1mM DTT, 1mM ATP 및 1 Unit/10㎕ T4 DNA Ligase(GIBCO BRL)하에서 삽입물 750ng을 벡터 20ng에 결찰시켰다. 이 결찰물을 15℃에서 하룻밤 항온배양시킨뒤, 수용능을 지닌 JM 109 세포(stratagene)의 형질 전환에 사용하였다. 100개의 독립 분리개체를 얻었다.
[실시예 3]
[클론 MK14의 동정과 서열화]
상기 실시예 2에서 얻은 1000개의 클론 가운데 15개를 다양한 마이코박테리아 DNA 및 비마이코박테리아 DNA로 구성된 게놈 블럿 스크린용으로 선정하였다. 15개의 클론가운데, MK14(SEQ ID No : 1)는 모든 마이코박테리아와 혼성화하나, 시험된 여하한 비마이코박테리아와도 교차혼성화하지 않음을 확인하였다.
MK14를[α-35S]-데옥시아데노신 트리포스페이트(NEN-Dupont)를 이용한 시쿼나제버젼(sequenase version) 2.0킷(United States Biochemicals)을 사용해 서열화하였다. MK14를 또 업자천장, 다이 프라이머킷(dye primerkit)을 이용한 Applied Biosystems 373A DNA 서열화기(Sequencer)를 사용해 서열화하였다.
[서열화 4]
[올리고누클레오티드 합성]
업자헌장 Applied Biosystems 380B 합성기를 사용해 올리고누클레오티드(올리고들)를 합성하였다. 이 올리고들(oligos)을 50℃에서 탈 블럭화시킨뒤, 업자권장 올리고누클레오티드 정제카트리지를 사용해 정제하였다. 표1에 올리고누클레오티드의 이름과 서열을 기재하였다.
[표 1]
올리고누클레오티드 14-3(SEQ ID NO : 2)의 경우, MK14(SEQ ID NO : 1)내 98번 위치에 해당하는 위치의 T가 부재코 있음에 주목해야 될 것인데, 이는 이 탐침의 합성이 초기 서열 정보에 기초하는 때문인 것으로 풀이된다. 이러한 변화는 상술한 올리고누클레오티드로 합성됨으로서 변화를 수용케된 MK14 단편(아래 기술된)에 아무런 역효과도 미치지 아니하였다.
[실시예 5]
[폴리머라제사슬반응을 이용한 MK14 단편 A-E의 생산]
클론 MK14를 주형으로 MK14 폴라스미드와 실시예 4의 올리고누클레오티드 프라이머를 이용한 폴리머라제사슬 반응을 사용 1도의 패턴과 같은 다섯개의 작은 단편 A-E로 나누었다.
pH 8.3의 100mM 트리스-HCl, 50mM kcl, 1.5mM MgCl₂, 0.001%(w/v) 젤라틴, 200dATP, 200dGTP, 200dTTP, 1.0의 각 프라이머, 주형으로서 100mg/100㎕ 게놈 DNA 또는 50ng/100㎕ 플라스미드 DNA로 구성된 25-100㎕의 반응물내에서 폴리머라제사슬 반응 증폭을 행하였다. 이 반응물을 광물유로 오버래이드 시킨뒤, 95℃에서 5분 동안 가열하였다. 2.5 Units/100㎕ Amplitaq 폴리머라제(perkin Elmer Cetus)를 부가, 싸이클링을 개시시켰다. 이 샘플을 1분 30초 동안 94℃에서, 2분동안 37-50℃에서 3분동안 72℃에서 항온 배양시킴으로서 25-30회 싸이클시킨뒤, 72℃에서 7분동안 항온 배양하여, 4℃에서 저장하였다.
단편 A(SEQ ID NO : 12)는 MK14의 5-59번 누클레오티드 단편B(SEQ ID NO : 13)는 MK14의 96-202번 누클레오티드(상기 실시예 4의 주석에서와 같은)로, 단편 C(SEQ ID NO : 14)는 MK14의 203-337번 누클레오티드로, 그리고 단편 Z는 MK14의 430-527번누클레오티드로 구성된다.
[실시예 6]
[게놈 서던 블럿 분석법을 이용한 MK14 단편 A-E의 혼성화 패턴 분석]
다양한 마이코박테리아 및 비마이코박테리아 기원 게놈 DNA의 서던 블럿 분석용 탐침으로서 상기 실시예 5에서 얻은 MK14 단편 A-E를 사용하였다. 모든 단편들이 독특한 혼성화 패턴을 보여주었다. 단편 C(MK14-c)(SEQ ID NO : 14)는 강한 속 특이성(제2도)을, 단편 D(MK14-D)(SEQ ID NO : 15)는 강한 M.kansasii 특이성(제3도)을 보여주었다. 단편 A(MK14-A)(SEQ ID NO : 12)는 모든 시험된 마이코박테리아종과 혼성화하긴 했지만, 소수의 비마이코박테리아종과의 교차 반응도 일으켰다. 단편 B(MK14-B)(SEQ ID NO : 13)는 M.kansasii와는 강하게, TB 콤플렉스 미생물 및 M. gordonae와는 약하게 혼성화하였고, 시험된 비마이코박테리아종과는 어떠한 교차 반응성도 보여주지 아니하였다. 단편 E(Mk14-E)(SEQ ID NO : 16)은 M. bovis, M. gordonae, M. intracell ulare 및 M. kansasii와 양호하게 혼성화(다른 시험된 마이코박테리아종과는 혼성화하지 아니한)하였고, 시험된 비마이코박테리아종과는 여하한 교차 반응성도 보여주지 아니하였다.
서던 블럿 분석을 위해, 게놈 DNA를 PstI(GIBCO BRL)로 소화시켰다. 이 반응물을 0.8% 아가로즈 겔상에서 분리시킨뒤, 나일론 막에 옮겼다(GIBCO BRL nylon-1 또는 NEN-Dupont Gene Screen)[J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2d Ed. 1989)(Cold Spring Harbor Laboratory) 참조]. 다음엔, 필테를 UV 교차 결합(stratalinker)시킨 뒤, 혼성화(GIBCO BRL)(Sambrook et. al)시켰다. 이 탐침들을 [α-32P]-데옥시시티딘 트리포스페이스(MEN-Dupont)를 이용한 랜덤 프라이머(Boehringer Mannbeim Biochemicals)로 라벨시켰다. 블럿을 예견 Tm 이하온돈 -25℃ 내지 -10℃에서 세척(Sambrook et. al.)하였다. 필터를 XAR-5 필름에 1-7일 동안 노출시켰다.
[실시예 7]
[게놈 서던 블럿 분석법을 이용한 MK14 단편 C1과 C2의 혼성화 패턴 분석]
단편 MK14-C를 올리고누클레오티드 MK14-13(TAG TAT CGA CTG CGT)(SEQ ID NO : 17)와, MK14-14(TCT TGC CCG TTG GGG)(SEQ ID NO : 18 ), 그리고 올리고누클레오티드 MK14-15CCCC CAA CGG CGA AGA)(SEQ ID NO : 19)와 MK14-10C(SEQ ID NO : 9)를 이용한 상기 PCR 증폭 방법을 사용해 두개의 작은 단편으로 나눔으로서, 단편 MK14-C1(SEQ ID NO : 20)(전자로부터)과 단편 MK14-C2(SEQ ID NO : 21)(후자로부터)를 얻었다. MK14-C1은 더딘 성장을 보여주는 모든 마이코박테리아 혼성화하엿으나, M. fortuitum 및 M. gordonae와는 혼성화하지 아니하였다. 단편 MK14-C2는 시험된 모든 마이코박테리아와 혼성하였으나, 시험된 비마이코박테리아 NDA와는 교차 혼성화하지 아니하였다.
[실시예 8]
[단편 MK14-C의 PCR 분석]
MK14-C를 PCR 분석법으로 추가 분석하였다. 주형으로 많은 마이코박테리아 DNA 및 비마이코박테리아 DNA가 사용된 올리고 14-3(SEQ ID NO : 2) 및 14-10(SEQ ID NO : 9) 함유 PCR 증폭 반응물은 가장 좋은 속특이성(제4도)을 보여주었다. 이들 올리고들은 단편 B 및 C함유 242bp의 생성물(제1도)(SEQ ID NO : 22)을 증폭시켰다. 시험된 더딘 성장 마이코박테리아에 모두에는 정화한 크기의 생성물이 존재하였다. 신속 성장 마이코박테리아인 M. chelonae, M. fortuitum 및 M. gordonae는 에티디움 브로마이드 염색된 아가로즈겔상에 여하한 242bp 밴드는 보여주지 아니하였다. 증폭된 생성물의 내부 영역에 특이적인 탐침은 에티디움 브로마이드로 염색된 아가로즈겔상에는 나타나지 아니하는 특수한 생성물을 보여줄 것으로 생각된다. 더딘 성장을 하는 마이코박테리아에서 보여진 242bp 생성물이 실지로는 MK14-C-유사생성물임이 입증된 바 있다.
상술한 PCR 증폭 반응물상에서 MK14-C를 탐침으로 사용하여 서던 블럿을 행하였다. 상술한 게놈 서던 블럿과 동일한 방법(PCR 반응물 5㎕를 1.0% 아가로즈 겔상에 분리시킨 것을 제외한)으로 PCR 서던 블럿을 행하였다. 이 탐침은 더딘 성장을 하는 마이코박테리아 및 M. gordonae와는 혼성화하였지만, M.chelonae, M. fortuitum, E. Coli, B. pertussis, N. asterodes, R. rhodochrous 또는 진핵세포 DNA와는 혼성화하지 아니하였다(제5도).
[실시예 9]
[M. avium 및 M. Tuberculosis 기원 MK14 단편 B 및 C의 서브클로닝]
모든 마이코박테리아를 증폭시킬 수 있는 올리고누클레오티드의 선정여부는 서로 다른 종간 MK14-C DNA 서열의 상동성이 어느정도인가에 좌우되고, 이 때문에 두개의 부가적인 종, M. avium과 M. tuberculosis 기원 유사 DNA를 서열화하게 되었다. M. kansasii 서열에 대한 새로운 서열의 비교는 특정 올리고누클레오티드의 디자인에 사용될 수 있게 된다.
올리고 14-3(SEQ IN NO : 2) 및 14-10(SEQ ID NO : 9) 와 주형으로 M. avium, M.tuberculosis 그리고 M. kansasii 게놈 DNA를 사용하여 PCR 증폭 반응을 행하였다. 저융점 아가로즈(GIBCO BRL)을 사용 242bp 생성물을 분리해내었다. 이 생성물 pH 8.8 의 50mM 트리스 - HCI 10mM MgCl₂,5%글리세롤, 5mM DTT, 5mM ATP 및 10Units/20㎕ 폴리누클레오티드 키나제(strataene) 사용해 37℃에서 30분 동안 키나제처리하였다. 벡터(BlueScript SK+)를 Hinc Ⅱ(GIBCO BRL)를 사용해 소화시킨 뒤, CIAP(Boehringer Mannheim Biochemicals)를 사용해 포스파타제처리하였다. 삽입물과 벡터를 15℃에서 하룻밤 항온배양 3대 1비로 결찰시켰다. 가 서브클론들을 상술한 바와같이 서열화하였다.
M. kansasii 단편 BC(SEQ ID NO : 22)와 M. tuberculosis 단편 BC(SEQ ID NO ; 23) 또는 M. avium 단편 BC(SEQ ID NO : 24)를 비교한 결과 상동성이 각각 79%와 80%였다. 심지어 M. avium과 M. tuberculosis를 비교한 경우에도 상동성은 76%였다. 세개 모두를 함께 비교했을때의 상동성은 69%였다.
[실시예 10]
[올리고 14-23 및 14-15 이용 프라이머 신장에 의한 PCR 증폭의 스크리닝]
동일한 PCR 증폭 반응물 조(set)를 올리고 14-23이용 프라이버 신장에 의한 특이성을 토대로 스크린하였다(제4도). 올리고 14-23(CAT GTG AAT GGG A)(SEQ ID NO : 25)을 상술한 서열 상동성 정보를 사용해 디자인하였다. 이 결과는 서던 블럿과 동일한 특이성을 보여주었다(기재되지 아니한 데이타). 다양한 밴드 강도들은 올리고 서열로 설명될 수 있다. 올리고 서열은 M. tuberculosis와 M. kansasii에서 동일하였으나, M.avium에서는 하나의 미스매치가 존재하였다.
프라이머 신장을 위해, 2pmoles의 올리고누클레오티드 14-23을 4.6pmoles을 [g-32P]-아데노신 트리포스페이트(NEN-Dupont)과 1unit/㎕ 폴리누클레오티드 키나제(stratagene)을 이용한 1X REact 1(BRL)사용해 키나제처리하였다. 이 반응물을 37℃에서 30분동안 항온 배양한뒤, 10분동안 65℃까지 가열하였다. 다음엔, 반응물을 TE(10mM 트리스/8.0, 1mM EDTA)를 사용 2X 부피로 희석하였다. 프라이머 신장 반응을 위해, PCR 반응의 반응물 5㎕를 1X PCR 완충액(Perkin Elmer Cetus), 0.125mM dNTP'S, 및 라벨된 프라이머 0.05pmoles/10㎕를 사용 10㎕까지 희석하였다. 반응물을 10분동안 95℃까지 가열한뒤, 실온으로 냉각시켰다. 1.5units의 커다란 클레누단편(BRL)을 부가한뒤, 샘플을 37℃에서 10분 동안부항온배양하였다. 정지용액(USB)를 부가한 후, 샘플을 8% 아크릴아마이드 변성겔상에서 분리시키기에 앞서 5분동안 95℃까지 가열하였다. 다음엔 겔은 XAR 필름에 2-16시간 동안 노출시켰다.
또다른 프라이머 신장 반응을 올리고 14-15(SEQ ID NO : 16)을 이용한 동일한 PCR 증폭 생성물상에서 행하였다. 이 올리고는 M. kansasii, M. tuberculosis 및 M. avium간에 매우 작은 상동성(13bp 당 6-7개의 미스매치를 수반한)을 지녔다. 검측된 유일한 생성물은 M. kansasii 와 콘트롤 플라스키드인 pMK14로부터 기원한 것이었다(기재되지 아니한 데이타).
M. gordonae의 경미한 밴드 역시 존재하였다. 두개의 서로 다른 올리고를 프라이머 신장에 의한 동일한 PCR 증폭 반응물 검측용으로 사용한 결과, 극적으로 아주 서로 프로필을 얻었다. 올리고 14-23은 속특이성을 보여준데 반해, 올리고 14-15는 M-kansasii 특이성을 보여주었다. 이것은 본원 제공된 서열이 사용되는 분석 및 검측방법에 따라서는 M. kansasii, M. tuberculosis 또는 M. avium 특이성용으로 사용될 수 있음을 보여준다 하겠다. 서던 블럿과 프라이머 신장 분석 양자모두에 있어, N. asteroides와 M.fortuktum은 비교적 장시간의 노출후에도 매우 약한 혼성화를 보여주었다.
상술한 실시예는 본원을 예시코저 함이지, 이를 제한하려 함이 아님에 그리고 본원은 하기 청구범위 및 이 청구범위의 균등물에 의해 한정됨에 유의해야만 한다.
[서열목차]
(1) 밀반정보
(ⅰ) 출원인 : 패트리시아 에이. 스피어즈 다릴 디. 생크
(ⅱ) 발명의 명칭 : 마이코박테리아 탐침
(ⅲ) 서열수 : 25
(ⅳ) 해당 주소 :
(A) 수신인 : 리차드 제이, 로드릭
(B) 가 : 1백톤 드라이브
(C) 시 : 프랭클린 레이크
(D) 주 : 뉴저지
(E) 국 : 미합중국
(F) 제트아이피 : 60606
(ⅴ) 컴퓨터 판독형 :
(A) 미디엄 타입 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환기종
(C) 오퍼레이팅 시스템 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0 Version #1.25
(ⅵ) 최근 출원자료 :
(A) 출원번호 :
(B) 출원일 :
(C) 분류 :
(ⅷ) 대리인벙보 :
(A) 성명 : 브라이언 케이 . 스티어월트
(B) 등록번호 : 33,213
(C) 레퍼런스 /다킷 넘버 : P-2512
(ⅸ) 원거리 통신정보 :
(A) 전화 : 201-847-5317
(B) 텔레펙스 : 201-848-9228
(2) SEQ ID NO : 1에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특성
(A) 길이 : 염기쌍 531개
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형태 : 단일
(D) 토폴러지 : 선상
(ⅱ) 분자타입 : cDNA
() 서열 명세 : SEQ ID NO : 1 :
(2) SEQ ID NO : 2에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특성
(A) 길이 : 염기쌍 20개
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형태 : 단일
(D) 토폴러지 : 선상
(ⅱ) 분자타입 : cDNA
() 서열 명세 : SEQ ID NO : 2 :
(2) SEQ ID NO : 3에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특성
(A) 길이 : 염기쌍 20개
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형태 : 단일
(D) 토폴러지 : 선상
(ⅱ) 분자 타입 : cDNA
() 서열 명세 : SEQ ID NO : 3 :
(2) SEQ ID NO : 4에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특성
(A) 길이 : 염기쌍 20개
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형태 : 단일
(D) 토폴러지 : 선상
(ⅱ) 분자타입 : cDNA
() 서열 명세 : SEQ ID NO : 4 :
(2) SEQ ID NO : 5에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특성
(A) 길이 : 염기쌍 20개
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형태 : 단일
(D) 토폴러지 : 선상
(ⅱ) 분자타입 : cDNA
() 서열 명세 : SEQ ID NO : 5 :
(2) SEQ ID NO : 6에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특성
(A) 길이 : 염기쌍 20개
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형태 : 단일
(D) 토폴러지 : 선상
(ⅱ) 분자타입 : cDNA
() 서열 명세 : SEQ ID NO : 6 :
(2) SEQ ID NO : 7에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특성
(A) 길이 : 염기쌍 20개
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형태 : 단일
(D) 토폴러지 : 선상
(ⅱ) 분자타입 : cDNA
() 서열 명세 : SEQ ID NO : 7 :
(2) SEQ ID NO : 8에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특성
(A) 길이 : 염기쌍 20개
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형태 : 단일
(D) 토폴러지 : 선상
(ⅱ) 분자타입 : cDNA
() 서열 명세 : SEQ ID NO : 8 :
(2) SEQ ID NO : 9에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특성
(A) 길이 : 염기쌍 20개
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형태 : 단일
(D) 토폴러지 : 선상
(ⅱ) 분자타입 : cDNA
() 서열 명세 : SEQ ID NO : 9 :
(2) SEQ ID NO : 10에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특성
(A) 길이 : 염기쌍 20개
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형태 : 단일
(D) 토폴러지 : 선상
(ⅱ) 분자타입 : cDNA
() 서열 명세 : SEQ ID NO : 10
:
(2) SEQ ID NO : 11에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특성
(A) 길이 : 염기쌍 20개
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형태 : 단일
(D) 토폴러지 : 선상
(ⅱ) 분자타입 : cDNA
() 서열 명세 : SEQ ID NO : 11 :
(2) SEQ ID NO : 12에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특성
(A) 길이 : 염기쌍 91개
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형태 : 단일
(D) 토폴러지 : 선상
(ⅱ) 분자타입 : cDNA
() 서열 명세 : SEQ ID NO : 12 :
(2) SEQ ID NO : 13에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특성
(A) 길이 : 염기쌍 107개
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형태 : 단일
(D) 토폴러지 : 선상
(ⅱ) 분자타입 : cDNA
() 서열 명세 : SEQ ID NO : 13 :
(2) SEQ ID NO : 14에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특성
(A) 길이 : 염기쌍 135개
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형태 : 단일
(D) 토폴러지 : 선상
(ⅱ) 분자타입 : cDNA
() 서열 명세 : SEQ ID NO : 14 :
(2) SEQ ID NO : 15에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특성
(A) 길이 : 염기쌍 92개
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형태 : 단일
(D) 토폴러지 : 선상
(ⅱ) 분자타입 : cDNA
() 서열 명세 : SEQ ID NO : 15 :
(2) SEQ ID NO : 16에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특성
(A) 길이 : 염기쌍 98개
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형태 : 단일
(D) 토폴러지 : 선상
(ⅱ) 분자타입 : cDNA
() 서열 명세 : SEQ ID NO : 16 :
(2) SEQ ID NO : 17에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특성
(A) 길이 : 염기쌍 15개
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형태 : 단일
(D) 토폴러지 : 선상
(ⅱ) 분자타입 : cDNA
() 서열 명세 : SEQ ID NO : 17 :
(2) SEQ ID NO : 18에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특성
(A) 길이 : 염기쌍 15개
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형태 : 단일
(D) 토폴러지 : 선상
(ⅱ) 분자타입 : cDNA
() 서열 명세 : SEQ ID NO : 18 :
(2) SEQ ID NO : 19에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특성
(A) 길이 : 염기쌍 15개
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형태 : 단일
(D) 토폴러지 : 선상
(ⅱ) 분자타입 : cDNA
() 서열 명세 : SEQ ID NO : 19 :
(2) SEQ ID NO : 20에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특성
(A) 길이 : 염기쌍 73개
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형태 : 단일
(D) 토폴러지 : 선상
(ⅱ) 분자타입 : cDNA
() 서열 명세 : SEQ ID NO : 20 :
(2) SEQ ID NO : 21에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특성
(A) 길이 : 염기쌍 61개
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형태 : 단일
(D) 토폴러지 : 선상
(ⅱ) 분자타입 : cDNA
() 서열 명세 : SEQ ID NO : 21 :
(2) SEQ ID NO : 22에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특성
(A) 길이 : 염기쌍 241개
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형태 : 단일
(D) 토폴러지 : 선상
(ⅱ) 분자타입 : cDNA
() 서열 명세 : SEQ ID NO : 22 :
(2) SEQ ID NO : 23에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특성
(A) 길이 : 염기쌍 230개
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형태 : 단일
(D) 토폴러지 : 선상
(ⅱ) 분자타입 : cDNA
() 서열 명세 : SEQ ID NO : 23 :
(2) SEQ ID NO : 24에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특성
(A) 길이 : 염기쌍 230개
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형태 : 단일
(D) 토폴러지 : 선상
(ⅱ) 분자타입 : cDNA
() 서열 명세 : SEQ ID NO : 24 :
(2) SEQ ID NO : 25에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특성
(A) 길이 : 염기쌍 13개
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형태 : 단일
(D) 토폴러지 : 선상
(ⅱ) 분자타입 : cDNA
() 서열 명세 : SEQ ID NO : 25 :

Claims (9)

  1. (a) 본질적으로 본원 SEQ ID NO : 1(MK14) DNA 서열로 구성된 올리고누클레오티드 탐침 ; (b) MK14의 마이코박테리아 핵산과의 선택적 혼성화능을 그대로 보지하는 MK14 단편 구성 올리고누클레오티드 탐침 ; (c) MK14와 혼성화함과 아울러 마이코박테리아 핵산과의 선택적 혼성화능도 지니는 올리고누클레오티드 탐침 ; (d) 상술한 것중 어느 것에 상보적임과 아울러 마이코박테리아 핵산과의 선택적 혼성화능도 지니는 올리고누클레오티드 탐침으로 구성된 그룹 가운데 선택되며, 마이코박테리아 핵산과 혼성화할 수 있는 올리고누클레오티드 탐침.
  2. 제1항에 있어서, 본질적 본원 SEQ ID NO : 12(MK14-A), SEQ IN NO : 13(MK14-B), SEQ ID NO : 14(MK14-C), SEQ ID NO : 15(MK14-D), SEQ ID NO : 16(MK14-E), SEQ ID NO : 20(MK14-C1), 및 SEQ ID NO : 21(MK14-C2) 서열로 구성되는 탐침으로 구성된 그룹에서 선택된 올리고누클레오티드 탐침.
  3. 제1항에 있어서, (a) 본질적으로 본원 SEQ ID NO : 22(M. kansasii 단편 BC) DNA 서열로 구성된 올리고누클레오티드 탐침, 본질적으로 본원 SEQ ID NO : 23(M. tuberculosis 단편 BC) DNA 서열로 구성된 올리고누클레오티드 탐침, 및 본질적으로 본원 SEQ ID NO : 24(M. avium 단편 BC) 서열로 구성된 올리고누클레오티드 탐침 ; (b) 상기 (a) 탐침의 마이코박테리아 핵산과의 선택적 혼성화능을 그대로 보지하는, (a) 탐침 단편 구성 올리고누클레오티드 ; (c) 상기 (a) 탐침과 혼성화함과 아울러 마이코 박테리아 핵산과의 선택적 혼성화능도 지니는 올리고누클레오티드 탐침 ; 및 (d) 상술한 것중 어느 것에 상보적임과 아울러 마이코박테리아 핵산과의 선택적 혼성화능도 지니는 올리고누클레오티드 탐침으로 구성된 그룹에서 선택된 올리고누클레오티드 탐침.
  4. (a) (i) 본질적으로 본원 SEQ ID NO : 1(MK14) DAN 서열로 구성된 올리고누클레오티드 탐침 ; (ii) MK14의 마이코박테리아 핵산과의 혼성화능을 그대로 보지하는, MK14 단편 구성 올리고누클레오티드 탐침 ; (iii) MK14와 혼성화함과 아울러 마이코박테리아 핵산과의 선택적 혼성화능도 지니는 올리고누클레오티드 탐침 ; 및 (iv) 상술한 것중 어느 것에 상보적임과 아울러 마이코박테리아 핵산과의 선택적 혼성화능도 지니는 올리고누클레오티드 탐침으로 구성된 그룹 가운데 선택된 올리고누클레오티드 탐침을 마이코박테리아 핵산과의 혼성화를 허용하는 조건하에서 핵산 샘플과 접촉시키는 단계 ; 및 (b) 상술한 올리고누클레오티드 탐침이 핵산 샘플과 혼성화하는지, 그렇지 아니한지를 검측하는 단계로 구성되고, 핵산 샘플과의 상술한 올리고누클레오티드의 혼성화가 핵산 샘플이 마이코박테리아 핵산을 함유함을 가리키게 되는 핵산 샘플내 마이코박테리아 핵산 검측방법.
  5. 제4항에 있어서, 상술한 검측 단계전에 가닥치환 단계를 추가로 포함하는 방법.
  6. 쌍을 이루는 각 올리고누클레오티드 탐침의 선택된 마이코박테리아 핵산 서열과의 혼성화를 허용하는 조건하에서 최소한 한쌍의 올리고누클레오티드 탐침을 핵산 샘플과 접촉시키는 단계 및 선택된 마이코박테리아 표적서열을 상술한 최소한 한쌍의 올리고누클레오티드 탐침과 상술한 핵산 샘플을 주기적으로 반응시켜 증폭시키므로서 증폭 생성물을 얻는 단계로 구성되고, 상술한 탐침쌍이 모두 함께 증폭쌍을 구성하며, 상술한 쌍을 이루는 각 올리고누클레오티드 탐침이 (i) MK14의 마이코박테리아 핵산과의 선택적 혼성화능을 그대로 보지하는, SEQ ID NO : 1(MK14) 단편 구성 올리고누클레오티드 탐침 ; (ii) MK14와 혼성화함과 아울러 마이코박테리아 핵산과의 선택적 혼성화능도 지니는 올리고누클레오티드 탐침 ; 및 (ⅲ) 상술한 것중 어느것에 상보적임과 아울러 마이코박테리아 핵산과의 선택적 혼성화능도 지니는 올리고누클레오티드 탐침으로 구성된 그룹에서 선택되는, 핵산 샘플내 선택된 마이코박테리아 핵산 서열을 증폭시키는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 증폭단계가 가닥치환 증폭으로 행해지는 방법.
  8. (i) 본질적으로 본원 SEQ ID NO : 1(MK14) DNA 서열로 구성된 올리고누클레오티드 탐침 ; (ii) MK14의 마이코박테리아 핵산과의 선택적 혼성화능을 그대로 보지하는, MK14 단편 구성 올리고누클레오티드 탐침; (iii) MK14와 혼성화함과 아울러 마이코박테리아 핵산과의 선택적 혼성화능도 지니는, 길이가 최소한 10 누클레오티드이고, MK14 핵산과의 상동성이 최소한 60%인 올리고누클레오티드 탐침 ; 및 (iv) 상술한 것중 어느것에 상보적임과 아울러 마이코박테리아 핵산과의 선택적 혼성화능도 지니는 올리고누클레오티드 탐침으로 구성된 그룹 가운데 선택된 올리고누클레오티드 탐침과 혼성화 용액으로 구성된 핵산 샘플내 마이코박테리아 핵산 검측용 킷(kit).
  9. 제8항에 있어서, 상술한 올리고누클레오티드 탐침이 본질적으로 본원 SEQ ID NO : 12(MK14-A), SEQ ID NO : 13(MK14-B), SEQ ID NO : 14(MK14-C), SEQ ID NO : 15(MK14-D), SEQ ID NO : 16(MK14-E), SEQ ID NO : 20(MK14-C1) 및 SEQ ID NO : 21(MK14-C2) 서열로 구성되는 올리고누클레오티드 탐침으로 구성된 그룹에서 선택되는 킷(kit)
KR1019930009146A 1992-05-26 1993-05-26 올리고 누클레오티드탐침, 마이코박테리아 핵산 검측 및 증폭방법, 및 검측용 키트 KR960002876B1 (ko)

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