JPH0789960B2 - 黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法Info
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- JPH0789960B2 JPH0789960B2 JP18568589A JP18568589A JPH0789960B2 JP H0789960 B2 JPH0789960 B2 JP H0789960B2 JP 18568589 A JP18568589 A JP 18568589A JP 18568589 A JP18568589 A JP 18568589A JP H0789960 B2 JPH0789960 B2 JP H0789960B2
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、臨床検査、殊に食中毒にかかる検査、あるい
は食品検査での黄色ブドウ球菌の検出に関するものであ
る。
は食品検査での黄色ブドウ球菌の検出に関するものであ
る。
［従来の技術と問題点］ 検査材料が患者の嘔吐物、糞便、食品または拭き取り材
料の場合、黄色ブドウ球菌と同定するまでには、増菌培
養、分離培養を経て純培養、確認培養に至る操作を行わ
なければならない。各培養段階に要する時間は、18〜24
時間であり総所要時間にすると約４日間となり、長時間
を要する。確認培養における生化学的試験では、好気的
発育、VP反応、硝酸塩の還元、Tweer80の水解、ヒアル
ロニダーゼ、糖分解性を調べる必要があり、操作的にも
煩雑で時間や費用もかかる。また、enterotoxinを直接
検出する方法として、市販の診断試薬（SET−RPLA,デン
カ生研）があるが、結果を得るまでに18〜20時間を要す
る。
料の場合、黄色ブドウ球菌と同定するまでには、増菌培
養、分離培養を経て純培養、確認培養に至る操作を行わ
なければならない。各培養段階に要する時間は、18〜24
時間であり総所要時間にすると約４日間となり、長時間
を要する。確認培養における生化学的試験では、好気的
発育、VP反応、硝酸塩の還元、Tweer80の水解、ヒアル
ロニダーゼ、糖分解性を調べる必要があり、操作的にも
煩雑で時間や費用もかかる。また、enterotoxinを直接
検出する方法として、市販の診断試薬（SET−RPLA,デン
カ生研）があるが、結果を得るまでに18〜20時間を要す
る。
一方、最近では、オリゴヌクレオチドを用いたDNAプロ
ーブ法あるいはハイブリダイゼーション法が試みられる
ようになってきた。しかし、オリゴヌクレオチドを標識
修飾したプローブにより膜上、あるいは他の支持体上で
ハイブリダイゼイションを行い、これを検出する場合、
細菌検査において十分な検出感度と選択性を得るのが難
しい。
ーブ法あるいはハイブリダイゼーション法が試みられる
ようになってきた。しかし、オリゴヌクレオチドを標識
修飾したプローブにより膜上、あるいは他の支持体上で
ハイブリダイゼイションを行い、これを検出する場合、
細菌検査において十分な検出感度と選択性を得るのが難
しい。
［発明の目的］ 本発明は、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応のプライ
マーとして機能させた遺伝子増幅技術により黄色ブドウ
球菌由来のenterotoxin遺伝子を検出するもので、簡
便、迅速かつ高感度な食中毒菌検査における黄色ブドウ
球菌の検査法を提供することにある。
マーとして機能させた遺伝子増幅技術により黄色ブドウ
球菌由来のenterotoxin遺伝子を検出するもので、簡
便、迅速かつ高感度な食中毒菌検査における黄色ブドウ
球菌の検査法を提供することにある。
［問題点を解決するための手段および作用］ 本発明は、黄色ブドウ球菌のenterotoxin遺伝子と選択
的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを作製し、
このオリゴヌクレオチドをプライマーとして遺伝子増幅
に用い、黄色ブドウ球菌を選択的に検出することを特徴
としている。ここで、本発明のオリゴヌクレオチドは、
本発明者の当該分野におけるこれまでの幅広い経験と総
合的な知識の集積から、先ず次の〜の観点に基づき
望ましい塩基配列を絞り込み、 標的遺伝子（すなわち検出されるべき遺伝子）が、当
該菌種に特有の病原因子の遺伝子であること それぞれオリゴヌクレオチドを適当に組合わせて遺伝
子増幅法のプライマーとして使用する場合に、その増幅
領域の大きさが200〜500bp程度であること。
的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを作製し、
このオリゴヌクレオチドをプライマーとして遺伝子増幅
に用い、黄色ブドウ球菌を選択的に検出することを特徴
としている。ここで、本発明のオリゴヌクレオチドは、
本発明者の当該分野におけるこれまでの幅広い経験と総
合的な知識の集積から、先ず次の〜の観点に基づき
望ましい塩基配列を絞り込み、 標的遺伝子（すなわち検出されるべき遺伝子）が、当
該菌種に特有の病原因子の遺伝子であること それぞれオリゴヌクレオチドを適当に組合わせて遺伝
子増幅法のプライマーとして使用する場合に、その増幅
領域の大きさが200〜500bp程度であること。
それぞれのオリゴヌクレオチドが19〜25個程度の塩基
からなり、そのうちのＧおよびＣの構成比が50％程度で
あること それぞれのオリゴヌクレオチドの塩基配列が他菌を有
する塩基配列とホモロジーを有しないこと Tm（℃）が特定温度以上であること（但し、Tmとは、
オリゴヌクレオチドと標的遺伝子とのハイブリッドの半
分量が解離する温度で、ハイブリッドの安定性を示す指
標となる） 次に選び出したオリゴヌクレオチドを組合わせて遺伝子
増幅法のプライマーとし、遺伝子増幅法およびアガロー
スゲル電気泳動法を用いて、その選択性について検討し
て決定した。
からなり、そのうちのＧおよびＣの構成比が50％程度で
あること それぞれのオリゴヌクレオチドの塩基配列が他菌を有
する塩基配列とホモロジーを有しないこと Tm（℃）が特定温度以上であること（但し、Tmとは、
オリゴヌクレオチドと標的遺伝子とのハイブリッドの半
分量が解離する温度で、ハイブリッドの安定性を示す指
標となる） 次に選び出したオリゴヌクレオチドを組合わせて遺伝子
増幅法のプライマーとし、遺伝子増幅法およびアガロー
スゲル電気泳動法を用いて、その選択性について検討し
て決定した。
遺伝子増幅は、Saikiらが、開発したPolymerase Chain
Reaction法（以下、略してPCR法;Science.230,1350（19
85））をもとに行っている。この方法は、ある特定のヌ
クレオチド配列領域（本発明の場合は黄色ブドウ球菌の
enterotoxin遺伝子）を検出する場合、その領域の両端
の一方は＋鎖を他方は−鎖をそれぞれ認識してハイブリ
ダイゼーションするようなオリゴヌクレオチドを用意
し、それを熱変性により１本鎖状態にした試料核酸に対
し鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のプライマーとして
機能させ、生成した２本鎖核酸を再び１本鎖に分離し、
再び、同様な反応を起こさせる。この一連の操作を繰り
返すことで２つのプライマーにはさまれた領域は検出で
きるまでにコピー数が増大してくる。検体としては、臨
床検査材料、例えば、糞便、尿、血液、組織ホモジェネ
ートなど、また、食品材料でもよい。これら材料をPCR
反応の試料として用いるには、材料中に存在する菌体か
ら核酸成分を遊離させる操作が前処理として必要とな
る。しかし、プライマーがハイブリダイズできる核酸が
数分子から数十分子以上存在すればPCRは進むので、検
査材料を溶菌酵素、界面活性剤、アルカリ等で短時間処
理するだけでPCR反応を進行させるに十分な核酸量を持
った試料液が調製できる。本発明でプライマーとして用
いられるオリゴヌクレオチドは、選択性や検出感度およ
び再現性から考えて、10塩基以上、望ましくは15塩基以
上の長さを持った核酸フラグメントで、化学合成あるい
は天然のどちらでもよい。また、プライマーは、特に検
出用として標識されていなくてもよい。プライマーが規
定している黄色ブドウ球菌のenterotoxin遺伝子のヌク
レオチド配列における増幅領域は、50塩基から2,000塩
基、望ましくは、100塩基から1,000塩基となればよい。
鋳型依存性ヌクレオチド重合反応には、耐熱性DNAポリ
メラーゼを用いているが、この酵素の起源については90
〜95℃の温度で活性を保持していれば、どの生物種由来
でもよい。熱変性温度は、90〜95℃、プライマーをハイ
ブリダイズさせるアニーリング操作の温度は37〜65℃、
重合反応は50〜75℃で、これを１サイクルとしたPCRを2
0から42サイクル行って増幅させる。検出は酵素反応液
をそのまま、アガロースゲル電気泳動にかけることで増
幅されたヌクレオチド断片の存在およびその長さが確認
できる。その結果から、検体中に、プライマーが認識す
べき配列を持った核酸が存在しているかどうか判定する
ことができる。この判定は、そのまま黄色ブドウ球菌の
有無を判定するものとなる。増幅された核酸断片の検出
には、その他の電気泳動やクロマトグラフィーも有効で
ある。
Reaction法（以下、略してPCR法;Science.230,1350（19
85））をもとに行っている。この方法は、ある特定のヌ
クレオチド配列領域（本発明の場合は黄色ブドウ球菌の
enterotoxin遺伝子）を検出する場合、その領域の両端
の一方は＋鎖を他方は−鎖をそれぞれ認識してハイブリ
ダイゼーションするようなオリゴヌクレオチドを用意
し、それを熱変性により１本鎖状態にした試料核酸に対
し鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のプライマーとして
機能させ、生成した２本鎖核酸を再び１本鎖に分離し、
再び、同様な反応を起こさせる。この一連の操作を繰り
返すことで２つのプライマーにはさまれた領域は検出で
きるまでにコピー数が増大してくる。検体としては、臨
床検査材料、例えば、糞便、尿、血液、組織ホモジェネ
ートなど、また、食品材料でもよい。これら材料をPCR
反応の試料として用いるには、材料中に存在する菌体か
ら核酸成分を遊離させる操作が前処理として必要とな
る。しかし、プライマーがハイブリダイズできる核酸が
数分子から数十分子以上存在すればPCRは進むので、検
査材料を溶菌酵素、界面活性剤、アルカリ等で短時間処
理するだけでPCR反応を進行させるに十分な核酸量を持
った試料液が調製できる。本発明でプライマーとして用
いられるオリゴヌクレオチドは、選択性や検出感度およ
び再現性から考えて、10塩基以上、望ましくは15塩基以
上の長さを持った核酸フラグメントで、化学合成あるい
は天然のどちらでもよい。また、プライマーは、特に検
出用として標識されていなくてもよい。プライマーが規
定している黄色ブドウ球菌のenterotoxin遺伝子のヌク
レオチド配列における増幅領域は、50塩基から2,000塩
基、望ましくは、100塩基から1,000塩基となればよい。
鋳型依存性ヌクレオチド重合反応には、耐熱性DNAポリ
メラーゼを用いているが、この酵素の起源については90
〜95℃の温度で活性を保持していれば、どの生物種由来
でもよい。熱変性温度は、90〜95℃、プライマーをハイ
ブリダイズさせるアニーリング操作の温度は37〜65℃、
重合反応は50〜75℃で、これを１サイクルとしたPCRを2
0から42サイクル行って増幅させる。検出は酵素反応液
をそのまま、アガロースゲル電気泳動にかけることで増
幅されたヌクレオチド断片の存在およびその長さが確認
できる。その結果から、検体中に、プライマーが認識す
べき配列を持った核酸が存在しているかどうか判定する
ことができる。この判定は、そのまま黄色ブドウ球菌の
有無を判定するものとなる。増幅された核酸断片の検出
には、その他の電気泳動やクロマトグラフィーも有効で
ある。
［実施例］ （実施例１） 検体の調製 黄色ブドウ球菌は表１の縦の見出しに示した４株を用い
てそれぞれを適当な増菌培地に接種し、37℃、好気的条
件下で終晩培養を行い、その培地、1.5mlから遠心操作
により菌体を回収した。10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.
5）で１回洗浄後、同緩衝液にリゾチームを1mg/mlとな
るように溶かした液、0.5mlで懸濁させ、37℃、10分で
溶菌させた。溶菌液に前記緩衝液で飽和させたフェノー
ルを同容量を加え、よく撹はんした。遠心後、上層液を
回収し、エタノール沈澱処理を行って核酸成分を沈澱さ
せ、その沈澱物を前記緩衝液、1mlに溶かして、これを
検体とした。
てそれぞれを適当な増菌培地に接種し、37℃、好気的条
件下で終晩培養を行い、その培地、1.5mlから遠心操作
により菌体を回収した。10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.
5）で１回洗浄後、同緩衝液にリゾチームを1mg/mlとな
るように溶かした液、0.5mlで懸濁させ、37℃、10分で
溶菌させた。溶菌液に前記緩衝液で飽和させたフェノー
ルを同容量を加え、よく撹はんした。遠心後、上層液を
回収し、エタノール沈澱処理を行って核酸成分を沈澱さ
せ、その沈澱物を前記緩衝液、1mlに溶かして、これを
検体とした。
プライマーの合成 黄色ブドウ球菌のenterotoxin B遺伝子の塩基配列（Ran
elli,D.M et al;Proc.Natl.Acad.Sci.USA82,5850−5854
（1985））から、特許請求範囲第１項に示した配列を選
び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合
成した。化学合成は島津DNA合成機NS−１を用い、トリ
エステル法により行った。合成したオリゴヌクレオチド
断片の精製はC18逆相カラムを用いて行った。
elli,D.M et al;Proc.Natl.Acad.Sci.USA82,5850−5854
（1985））から、特許請求範囲第１項に示した配列を選
び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合
成した。化学合成は島津DNA合成機NS−１を用い、トリ
エステル法により行った。合成したオリゴヌクレオチド
断片の精製はC18逆相カラムを用いて行った。
PCR 前記検体液を３μｌを用いそれに滅菌蒸留水16.05μ
ｌ、10×反応用バッファー３μｌ、dNTP溶液4.8μｌ、
プライマー（ａ）1.5μｌ、プライマー（ｂ）1.5μｌそ
して耐熱性DNAポリメラーゼ0.15μｌを加え、30μｌの
反応液を調製した。この反応液の入った容器にミネラル
オイル（SIGMA社製）を50μｌ加え反応液上に重層す
る。各添加された液の内容を下記に示す。
ｌ、10×反応用バッファー３μｌ、dNTP溶液4.8μｌ、
プライマー（ａ）1.5μｌ、プライマー（ｂ）1.5μｌそ
して耐熱性DNAポリメラーゼ0.15μｌを加え、30μｌの
反応液を調製した。この反応液の入った容器にミネラル
オイル（SIGMA社製）を50μｌ加え反応液上に重層す
る。各添加された液の内容を下記に示す。
10×反応用バッファー:500mM KCl,100mM Tris−HCl
（pH8.3）,15mM MgCl2,0.1％（w/v）ゼラチン dNTP溶液:dATP,dCTP,dGTP,dTTPを混合させたもので、各
終濃度が1.25mM プライマー（ａ）および（ｂ）：前述した化学合成精製
品の各水溶液（50DU/ml） 耐熱性DNAポリメラーゼ:Teq DNAポリメラーゼ（5unit/
ml;Perkin Elmer Cetus社製） 反応条件は、次の通りである。
（pH8.3）,15mM MgCl2,0.1％（w/v）ゼラチン dNTP溶液:dATP,dCTP,dGTP,dTTPを混合させたもので、各
終濃度が1.25mM プライマー（ａ）および（ｂ）：前述した化学合成精製
品の各水溶液（50DU/ml） 耐熱性DNAポリメラーゼ:Teq DNAポリメラーゼ（5unit/
ml;Perkin Elmer Cetus社製） 反応条件は、次の通りである。
熱変性:94℃ １分 アニーリング:37℃ １分 重合反応:60℃ １分 熱変性からアニーリングを経て重合反応に至る過程を１
サイクル（所要時間5.7分）とし、これを42サイクル
（総所要時間約４時間）行った。これらの操作は、Perk
in Elmer Cetus社製DNA Termal Cyclerに上記反応条件
をプログラムすることにより行った。
サイクル（所要時間5.7分）とし、これを42サイクル
（総所要時間約４時間）行った。これらの操作は、Perk
in Elmer Cetus社製DNA Termal Cyclerに上記反応条件
をプログラムすることにより行った。
検出 反応液から、増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロース電気泳動を以下の様に行った。
め、アガロース電気泳動を以下の様に行った。
アガロースゲルはゲル濃度２％（w/v）とし、臭化エチ
ジウム（0.5μg/ml）を含むものを用いた。泳動の電気
的条件は、定電圧100V、時間は30分行った。操作方法な
らびに他の条件はManiatis等、Molecular Cloning（198
2）に記載されている技法で行った。反応液の他に分子
量マーカーも、同時に泳動を行い、相対移動度の比較に
よりヌクレオチド断片の長さを算出した。
ジウム（0.5μg/ml）を含むものを用いた。泳動の電気
的条件は、定電圧100V、時間は30分行った。操作方法な
らびに他の条件はManiatis等、Molecular Cloning（198
2）に記載されている技法で行った。反応液の他に分子
量マーカーも、同時に泳動を行い、相対移動度の比較に
よりヌクレオチド断片の長さを算出した。
結果 前述したように、黄色ブドウ球菌のenterotoxin B遺伝
子は、すでに塩基配列が決定されており、本発明のオリ
ゴヌクレオチド、すなわち、プライマーがPCRにより、
増幅させてくるヌクレオチドの大きさは推定できる。そ
れによると、プライマー（ａ）と（ｂ）では、486塩基
の長さのヌクレオチドが増幅されてくるはずである。表
１に示した数値は、上記方法で増幅されてきたヌクレオ
チドの長さを測定した結果で、単位はキロ塩基対であ
る。同表からわかるように、各プライマーの組合せと
も、推定されたヌクレオチドの長さと一致しており、こ
れらが、enterotoxin遺伝子の標的としている領域を正
しく増幅してきていることを示している。
子は、すでに塩基配列が決定されており、本発明のオリ
ゴヌクレオチド、すなわち、プライマーがPCRにより、
増幅させてくるヌクレオチドの大きさは推定できる。そ
れによると、プライマー（ａ）と（ｂ）では、486塩基
の長さのヌクレオチドが増幅されてくるはずである。表
１に示した数値は、上記方法で増幅されてきたヌクレオ
チドの長さを測定した結果で、単位はキロ塩基対であ
る。同表からわかるように、各プライマーの組合せと
も、推定されたヌクレオチドの長さと一致しており、こ
れらが、enterotoxin遺伝子の標的としている領域を正
しく増幅してきていることを示している。
（実施例２） 実施例１で得られた結果が、黄色ブドウ球菌に対し選択
的なものか確かめるため、臨床検査において黄色ブドウ
球菌以外で検査対象となり得る菌種について比較検討し
た。
的なものか確かめるため、臨床検査において黄色ブドウ
球菌以外で検査対象となり得る菌種について比較検討し
た。
方法は、実施例１に示したものと同じであるが、
（７），（10）と（11）の株については嫌気的条件下、
40℃で終夜培養を行い、PCR法に適用しうる試料を調製
してきた。検体の調製において培養した菌は、表２の縦
の見出しに示した12菌株である。また、ヒト胎盤由来DN
Aは１μg/mlの濃度のものを調製し、これも同様にPCRを
行わせた。
（７），（10）と（11）の株については嫌気的条件下、
40℃で終夜培養を行い、PCR法に適用しうる試料を調製
してきた。検体の調製において培養した菌は、表２の縦
の見出しに示した12菌株である。また、ヒト胎盤由来DN
Aは１μg/mlの濃度のものを調製し、これも同様にPCRを
行わせた。
結果を表２に示す。表１と同様、欄内の数値の単位はキ
ロ塩基対である。一部の菌種においてPCRの副次的産物
とみられる。増幅されたヌクレオチド断片が検出された
が、どれもenterotoxin遺伝子の配列から推定されるの
ヌクレオチドの長さとは異なっている。黄色ブドウ球菌
と同じenterotoxin遺伝子をこれらの菌種が持っていれ
ば実施例１の結果と同じ長さのヌクレオチドが検出され
るはずである。従って、これら菌種由来の増幅されたヌ
クレオチドはenterotoxin遺伝子を認識して生成された
ものではないことが明かであり、黄色ブドウ球菌を容易
に区別し検出できることがわかる。なお、本発明の実施
例に用いているアガロース電気泳動を前述の泳動条件で
行えば100塩基対以下の範囲であれば５から10基対、100
から500塩基対の範囲であれば10から20塩基対のヌクレ
オチド断片の長さの違いがあればそれらを区別すること
ができ、さらに、アクリルアミドなどをゲルに用いるこ
とでヌクレオチド断片の長さの測定の精度を向上させれ
ば、選択的検出における信頼度はさらに高まるものと考
えられる。
ロ塩基対である。一部の菌種においてPCRの副次的産物
とみられる。増幅されたヌクレオチド断片が検出された
が、どれもenterotoxin遺伝子の配列から推定されるの
ヌクレオチドの長さとは異なっている。黄色ブドウ球菌
と同じenterotoxin遺伝子をこれらの菌種が持っていれ
ば実施例１の結果と同じ長さのヌクレオチドが検出され
るはずである。従って、これら菌種由来の増幅されたヌ
クレオチドはenterotoxin遺伝子を認識して生成された
ものではないことが明かであり、黄色ブドウ球菌を容易
に区別し検出できることがわかる。なお、本発明の実施
例に用いているアガロース電気泳動を前述の泳動条件で
行えば100塩基対以下の範囲であれば５から10基対、100
から500塩基対の範囲であれば10から20塩基対のヌクレ
オチド断片の長さの違いがあればそれらを区別すること
ができ、さらに、アクリルアミドなどをゲルに用いるこ
とでヌクレオチド断片の長さの測定の精度を向上させれ
ば、選択的検出における信頼度はさらに高まるものと考
えられる。
［発明の効果］ 本発明では、PCR法を用いたことで、黄色ブドウ球菌の
検出において、遺伝子増幅作用による高い検出感度と、
２つあるいは、それ以上のプライマーで反応が規定され
ることによる高い選択性を得ることができる。また、高
い検出感度のため多量の検体を必要とせず、検体の前処
理が簡便で済む。しかも、反応時間が短く、検出も簡単
な機材だけで行え、操作も容易なため同定までの時間を
大幅に短縮できる。以下の実施例に示すが、反応時間が
４時間、検出にかかる操作が30分である。また、検出に
アガロースゲル電気泳動と臭化エチジウムによる核酸染
色法をもちいることで、プライマー等に標識せずに検出
が行え、しかも、核酸の長さが確認できるので結果の信
頼性が高いものとなる。
検出において、遺伝子増幅作用による高い検出感度と、
２つあるいは、それ以上のプライマーで反応が規定され
ることによる高い選択性を得ることができる。また、高
い検出感度のため多量の検体を必要とせず、検体の前処
理が簡便で済む。しかも、反応時間が短く、検出も簡単
な機材だけで行え、操作も容易なため同定までの時間を
大幅に短縮できる。以下の実施例に示すが、反応時間が
４時間、検出にかかる操作が30分である。また、検出に
アガロースゲル電気泳動と臭化エチジウムによる核酸染
色法をもちいることで、プライマー等に標識せずに検出
が行え、しかも、核酸の長さが確認できるので結果の信
頼性が高いものとなる。
食中毒菌としての黄色ブドウ球菌は、その特徴の１つと
してenterotoxin産生能を有しており、このタンパク質
の１種であるenterotoxinがヒトに食中毒症状をおこさ
せる原因成分である。従って、プライマーが標的とする
ヌクレオチド配列にenterotoxin遺伝子をもちいること
で食中毒原因菌としての黄色ブドウ球菌を選択的的検出
することができる。
してenterotoxin産生能を有しており、このタンパク質
の１種であるenterotoxinがヒトに食中毒症状をおこさ
せる原因成分である。従って、プライマーが標的とする
ヌクレオチド配列にenterotoxin遺伝子をもちいること
で食中毒原因菌としての黄色ブドウ球菌を選択的的検出
することができる。
Claims (2)
- 【請求項１】検体中における黄色ブドウ球菌（Staphylo
coccus aureus）を選択的に検出するため、黄色ブドウ
球菌のエンテロトキシン（enterotoxina）遺伝子をコー
ドするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド
配列と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレ
オチドであって、 合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５′）ｄ−CCAGATGAGTTGCACAAATCG（３′） ……
（ａ） （５′）ｄ−CACCAAATAGTGACGAGTTA（３′）……（ｂ） または対応する相補的配列から選ばれた配列からなるこ
とを特徴とするオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】請求項第１項に記載されたオリゴヌクレオ
チドの配列のうち増幅されるべきヌクレオチド配列の両
端を規定する２つのオリゴヌクレオチドを鎖長反応のプ
ライマーとして機能させ、標的ヌクレオチド配列を選択
的に増幅させることを特徴とする黄色ブドウ球菌の検出
方法であって、 （ａ）検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列に前
記プライマーをハイブリダイズさせ４種のヌクレオチド
の重合反応により鎖長反応を行わせ、 （ｂ）得られた２本鎖ヌクレオチド配列を１本鎖に分離
した場合その相補鎖は更なる鎖長反応の鋳型として機能
し、 （ｃ）前記プライマーによる鎖長反応、鎖長生成物の鋳
型からの分離、そして更なるプライマーによるハイブリ
ダイゼーションを繰り返すことにより特定のヌクレオチ
ド配列を増幅させ、 （ｄ）前記検体中に認識されるべきヌクレオチド配列を
持つ核酸が存在しているか否かを判定することで黄色ブ
ドウ球菌の検出を行う方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18568589A JPH0789960B2 (ja) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | 黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
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