JPH0349700A - 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

〔　産業上の利用分野　〕 本発明は臨床検査、殊に食中毒にかかる検査、あるいは
食品検査での黄色ブドウ球菌の検出に関すものである． ［　従来の技術と問題点　］ 検査材料が患者の嘔吐物、糞便、食品または拭き取り材
料の場合、黄色ブドウ球菌と同定するまでには、増薗培
養、分離培養を経て純培養、確認培養に至る操作を行わ
なければならない．各培養段階に要する時間は、　１８
〜２４時間であり総所要時間にすると約４日間となり、
長時間を要する．確認培養における生化学的試験では、
好気的発冑、ｖｐ反応、硝酸塩の還元、Ｔ　ｗ　ｅ　ｅ
　ｎ　８　０の水解、ヒアルロニダーゼ、糖分解性を調
べる必要があり、操作的にも煩雑で時間や費用もかかる
．また、ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｌｎを直接検出する方法と
して、市販の診断試薬（　Ｓ　Ｅ　Ｔ　−　Ｒ　Ｐ　Ｌ
　Ａ．　　デンカ生研）があるが、結果を得るまでに１
８〜２０時間を要する．一方、最近では、オリゴヌクレ
オチドを用いたＤＮＡプロープ法あるいはハイプリダイ
ゼーシ９ン法が試みられるようになってきた．しかし、
オリゴヌクレオチドを標ｔｌａｎｔｌａ　Ｌたプローブ
により展上、あるいは他の支持体上でハイブリダイゼイ
ションを行い、これを検出する場合、細菌検査において
十分な検出感度と選択性を得るのが難しい．

【　発明の目的〕

本発明は、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応の１ライ
マーとして機能させた遺伝子増幅技術により黄色ブドウ
球薗由来のｅｎｔｅｒｏｔｏｘｌｎ遺伝子を検出するも
ので、簡便、迅速かつ高感度な食中毒薗検査における黄
色ブドウ球菌の検査法を提供することにある． 〔　問題点を解決するための手段および作用　〕本発明
は、黄色ブドウ球菌のｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ遺伝子と
選択的にパイプリダイズするオリゴヌクレオチドを作製
し、このオリゴヌクレオチドをプライマーとして遺伝子
増幅に用い、黄色ブドウ球菌を選択的に検出することを
特徴としている．遺伝子増幅は　Ｓｉｌｋｉらが、開発
したＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏ
ｎ法《以下、略してＰＣ．Ｒ法；　　Ｓｃｌｅｎｃｅ．
２３０．　１３５０　（１９８５＞　つをもとに行って
いる．この方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（
本発明の場合は黄色ブドウ球菌のｅｎｔｅｒｏｔｏｘｌ
ｎ遺伝子つを検出する場合、その領域の両端の一方は十
鎖を他方はー鎖をそれぞれ認識してパイプリダイゼーシ
ョンするようなオリゴヌクレオチドを用意し、それを熱
変性により１本鎖状態にした試刺核酸に対し鋳型依存性
ヌクレオチド重合反応の１ライマーとして機能させ、生
成した２本ｇ核酸を再び１本鎖に分離し、再び、同様な
反応を起こさせる．この一連の操作を繰り返すことで２
つのプライマーにはさまれた領域は検出できるまでにコ
ピー数が増大してくる．検体としては，臨床検査材料、
例えば、糞便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、ま
た，食品材料でもよい．これら材料をＰＣＲ法の試料と
して用いるには、材料中に存在する薗体から核酸成分を
遊離させる操作が前処理として必要となる．　しかし，
１ライマーがハイブリダイズできる核酸が数分子から数
十分子以上存在すればＰＣＲは進むので、検査材科を溶
ｌｌＩ醇素、界面活性剤，アルカリ等で短時間処理する
だけでＰＣＲを進行させるに十分な核酸量を持った試ｆ
ｌ液が調製できる．本発明で１ライマーとして用いられ
るオリゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現
性から考えて、　１０塩基以上、望ましくは１５塩基以
上の長さを持った核酸フラグメントで、化学合成あるい
は天然のどちらでもよい．また、プライマーは、特に検
出用として標識されていなくてもよい．プライマーが規
定している黄色ブドウ球菌のｅｎｔｅｒｏｔｏｘｌｎ遺
伝子のヌクレオチド配列における増幅領域は，５０塩基
から２．０　０　０塩基、望ましくは．　　Ｚｏｏ塩基
から１，０００塩基となればよい．鋳型依存性ヌクレオ
チド重合反応には、耐燕性ＤＮＡポリメラーゼを用いて
いるが、この酵素の起源については９０〜９５℃の温度
で活性を保持していれば、どの生物種由来でもよい．熱
変性温度は、９０〜９５℃、１ライマーをパイプリダイ
ズさせるアニーリング操作の温度は３７〜６５℃、重合
反応は５０〜７５℃で、これを１サイクルとしたＰＣＲ
を２０から４２サイクル行って増輻させる．検出は酵素
反応液をそのまま、アガロースゲル電気泳動におけるこ
とで増幅されたヌク，レオチド断片の存在およびその長
さが確認できる．その結果から、検体中に、プライマー
が認識すべき配列を持った核酸が存在しているかどうか
判定することができる．この判定は、そのまま黄色ブド
ウ球菌の有無を判定するものとなる．増幅された核酸断
片の検出には、　その他の電気泳動やクロマトグラフィ
ーも有効である． 〔　実施例　】 （実施例ｌ） １生立１ｌ 費色ブドウ球菌はｌ！ｌの櫂の見出しに示した４株を用
いてそれぞれを適当な増国培地に接種し、３７℃、好気
的条件下で終夜墳費を行い、その培地，１．　　５ｍｌ
から遠心操作により薗体を回収し仏下糸も た．１０ｍＭ｝リスー塩酸ｙ１衝液（ｐＨ７．５）で１
［８］洗浄後、同Ｍｌ液にリゾチームをｌｍｇ／ｍ１と
なるように溶かした液、０．５ｍｌで懸濁させ，３７℃
、　１０分で溶菌させた．溶菌液に前記ＭｆＲ液で飽和
させたフェノールを同容量を加え、よく攬はんした．遠
心後，上層液を回収し、エタノール沈澱処理を行って核
酸成分を沈澱させ、その沈澱物を前記緩衝液，　ｌｍｌ
に溶かして，これを検体とした． 一　　　▲ 黄色ブドウ球菌のｅｎｔｅｒｏｔｏｘｌｎ　Ｂ遺伝子の
塩基配列（　ｌａａｅｌｌｌ，Ｄ．Ｍ　ａｔ　ａｌＨＰ
ｒｏｃ．！ｌａｔｌ．＾ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２，
５８５０−５８５４　（１９８５））から、特許請求範
囲第２項、第４項に示した配列を選び、それと同じ配列
を持つオリゴヌクレオチドを化学合成した．化学合成は
島津ＤＮＡ合成機ＮＳ−　１を用い、トリエステル法に
より行った．合成したオリゴヌクレオチド断片のＭ製は
Ｃ１８逆相カラムを用いて行った． ２』Σ旦 前記検体液を３μ１を用いそれに滅薗蒸留水１６．０５
μ１、ＩＯＸ反応用バッファ−３μ１、ｄＮＴＰ溶液４
。８μ１、プライマー（ａ＞．ｉ．　　５μ１、プライ
マー（ｂ）１。　５μｌそして耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼ０．　１５μ霊を加え、３０μ１の反応液を調製した
．　　この反応液の入った容器にミネラルオイル（ＳＩ
ＧＮＡ社製〉を５０μ！加え反応液上に重層する．各添
加された液の内容を下記に示す． １０Ｘ反応用バッフｙ−：　　５００ｍＭ　　ＫＣＩ，
１００ｍＭ　　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　＜ｐ｝１８．　
　　３），１５ｍＭ　　ＭｇＣＩ＊．ｏ．１％（Ｗ／Ｖ
）ゼラチン ｄ　ＮＴＰ溶液：　　ｄＡＴＰ，　　ｄＣＴＰ．　　ｄ
ＧＴＰ，ｄＴＴＰを混合させたもので各終濃度が１．２
５ｍＭ プライマー（＆〉および（ｂ）：　　前述した化学合成
猜製品の各水溶液（　５　０ＤＵ／巽Ｉ） 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ：ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（　５　ａｎｌｔ／　ｍｌ；　　Ｐｅｒｋｌｎ　Ｅｌｍ
ｓｒ　Ｃｅｔｕｓ社製〉 反応条件は、次の通りである． 熱変性：　９４℃　１分 アニーリング：　３７℃　１分 重合反応：　６０″ＣＩ分 熱変性からア二一リングを経て重合反応に至る過程を１
サイクル（所要時間５．７分）とし、これを４２サイク
ル（総所要時間約４時間）行った．これらの操作は、Ｐ
ｅｒｋｉｎ　Ｅｌｓｅｒ　Ｃｅｔｕｓ社製ＤＮＡ　Ｔｅ
ｒｔａｌ　Ｃｙｃｌｅｒに上記反応条件をプログラムす
ることにより行った． １皿 反応液から、増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロース電気泳動を以下の様に行った． アガロースゲルはゲル濃度２％（ｗ／ｖ）とし、臭化エ
チジウム（０．５μｇ／ｍ　＋　つを含むものを用いた
．泳動の電気的条件は、定電圧１００■、時間は３０分
行った．操作方法ならびに他の条件はＭａｎｌｉｔｌｓ
等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｌｎｇ（１９８２）
に記載されている技法で行った．反応液の他に分子量マ
ーカーも、同時に泳動を行い、相対移動度の比較により
ヌクレオチド断片の長さを算出した．級壜 前述したように、黄色ブドウ球薗のｊｎｔｅｒｏｔｏ＊
１ｎＢ遺伝子は、すでに塩基配列が決定されており、本
発明のオリゴヌクレオチド、すなわち、１ライマーがＰ
ＣＲにより，増幅させてくるヌクレオチドの大きさは推
定できる．それによると、プライマー（ａ）と（ｂ）で
は、４８６塩基の長さのヌクレオチドが増幅されてくる
はずである．表１に示した数値は、上記方法で増幅され
てきたヌクレオチドの長さを測定した結果で、単位はキ
ロ塩基対である．同表からわかるように、各プライマー
の組合せとも、推定されたヌクレオチドの長さと一致し
ており、これらが、ｅｎｔｓｒｏｔｏｘｉｎ遺伝子の標
的としている領域を正しく増幅してきていることを示し
ている． 表　　１ Ｓｔａｐｈｙｌｏｅｏｃｃｕｓ　　ａｕｒｅｕｓ（４）
　　　　　０．４９（実施例２） 実施例１で得られた結果が、黄色ブドウ球菌に対し選択
的なものか確かめるため、臨床検査において黄色ブドウ
球菌以外で検査対象となり得る菌種について比較検肘し
た． 方法は、実施例１に示したものと同じであるが、（７）
．　（１０）と（１１）の株については嫌気的条件下、
４Ｏ℃で終夜培養を行い、ＰＣＲ法に適用しうる試料を
調製してきた．検体の調製において培養した薗は、表２
の縦の見出しに示した１２菌株である．また、ヒト胎盤
由来ＤＮＡは１μｇ／ｍ＋の濃度のものを調製し、これ
も同様にＰＣＲを行わせた．結果を表２に示す．表１と
同様、欄内の数値の単位はキロ塩基対である．一部の菌
種においてＰＣＢの副次的産物とみられる、増幅された
ヌクレオチド断片が検出されたが、どれもｅｎｔｅｒｏ
ｔｏｘｌｎ遺伝子の配列から推定されるのヌクレオチド
の長さとは異なっている．黄色ブドウ球菌と同じｅｎｔ
ｅｒｏｔｏｘｉｎ遺伝子をこれらの菌種が持っていれば
実詰例１の結果と同じ長さのヌクレオチドが検出される
はずである．従って、これら菌種由来の増幅されたヌク
レオチドはｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ遺伝子を認識して生
戒されたものではないことが明がであり、黄色ブドウ球
菌を容易に区別し検出できることがわかる．なお、本発
明の実施例に用いているアガロース電気泳動を前述の泳
動条件で行えば１００塩基対以下の範囲であれば５がら
１０基対、　１００から５００塩基対の範囲であれば１
０がら２ｏ塩基対のヌクレオチド断片の長さの違いがあ
ればそれらを区別することができ、さらに、アクリルア
ミドなどをゲルに用いることでヌクレオチド断片の長さ
の測定の猜度を向上させれば、選択的検出における信頼
度はさらに高まるものと考えられ表 ２ 菌株名 プライマーの組合せ （＆）　＋　（ｂ） Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ．ｕｓ　　ａｕｒｅｕｓ（Ｊ
ＣＭ２４１３）　　　　０．４９Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ　　ｅｐｌｄｅｒｍｉｄｌｓ（１）　　　　　
１．００Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　　ｅｐｌｄｅ
ｒｍｉｄｌｓ（２）　　　　　０．６５Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ　　ｅｐｌｄｅｒｓｌｄｉｓ（３）Ｓｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　　ｅｐｌｄｅｒｓｉｄｌｓ
（４）　　　　　０．４０Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｃｅｒ
ｅｕｓ（５）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　　ｔｙｐｈｌｓｕ
ｒｌｕｓ（６）　　　　　　　　　０．４０Ｃａｍｐｙ
ｌｏｂｉｃｔｃｒ　　ＪｅＪｕｎｌ（７）Ｅｓｃｈｅｒ
ｌｃｈｌａ　　ｃｏｌｌ（８）　　　　　　　　　　　
　　　０．１５Ｖｉｂｒｌｏ　　ｐａｒａｈａｅ自ｏ１
ｙｔｌｃｕｓ（９）　　　　　　　　　０．１５Ｃｌｏ
ｓｔｒｉｄｌｕｒ　ｐｅｒｆｒｌｎｇｅｎｓ（１０）Ｂ
ａｃｔｅｒｏｌｄｅｓ　　ｙｕｌｇａｔｕｓ（１１）　
　　　　　　　　　１．００Ｙｅｒｓｌｎｉａ　　ｅｎ
ｔｅｒｏｃｏｌｌｔｌｃａ（１２）Ｈｕｍａｎ　　ｐｌ
ａｃｅｎｔａ（１３＞に示す． （１）ＪＣＭ２４１４，　（５）ＪＣＭ２１５１．　（
７）ＪＣＭ２０１３．　（８）ＪＣ旧６４９，（１０）
ＪＣＭ３８１１６．　（１１）ＪＣＭ５８２６：理化学
研究所，　（２）　ｌＦＯ３７６２，　（３）　ＩＦＯ
１２９９３．　（４）　ＩＦＯ１３３８９　（６）　Ｉ
ＦＯ１２５２９　＜９＞　ＩＦＯ１２７１１：発酵研究
所．　（１２）＾ＴＣＣ９６１０：＾ｍｅｒｉｃａｎ　
ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　　Ｃｏｌｌｅｃｔｌｏｎ．（
１３）Ｈｕｍａｎ　　ｐｌａｃｅｎｔａｌ　　ＤＮ＾　
ＯＩＩＣＯ社製 〔　発明の効果〕 本発明では、ＰＣＲ法を用いたことで、黄色ブドウ球菌
の検出において、遺伝子増幅作用による高い検出感度と
、２つあるいは、それ以上の１ライマーで反応が規定さ
れることによる高い選択性を得ることができる．また、
高い検出感度のため多量の検体を必要とせず、検体の前
処理が簡便で済む．しかも、反応時間が短く、検出も簡
単な機材だけで行え、操作も容易なため同定までの時間
を大幅に短縮できる．以下の実施例に示すが、反応時間
が４時間、検出にががる操作が３０分である．また、検
出にアガロースゲル電気泳動と臭化エチジウムによる核
酸染色法をもちいることで、プライマＴ等に標識せずに
検出が行え、しがち、核酸の長さが［認できるので結果
の信頼性が高いものとなる． 食中毒菌としての黄色ブドウ球薗は，その特徴の１つと
してｅｎｔｅｒｏｔｏχｉｎ産生能を有しており、この
タンパク質の１種であるｅｎｔｃｒｏｔｏｘｉｎがヒト
に食中ＪＩ症状をおこさせる原因成分である．従って，
プライマーが標的とするヌクレオチド配列にｅｎｔｃｒ
ｏｔｏｘｌｎ遺伝子をもちいることで食中毒原因ｗｂし
ての黄色ブドウ球菌を選択的検出することができる．

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）検体中における黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌ
   ｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）を選択的に検出するため
   のオリゴヌクレオチド、または、黄色ブドウ球菌のｅｎ
   ｔｅｒｏｔｏｘｉｎ遺伝子をコードするヌクレオチド配
   列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるよ
   うに化学合成されたオリゴヌクレオチドであつて、 合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ’−ＣＣＡＧＡＴＧＡＧＴＴＧＣＡＣＡＡＡ
   ＴＣＧ（３’）…（ａ） （５’）ｄ−ＣＡＣＣＡＡＡＴＡＧＴＧＡＣＧＡＧＴＴ
   Ａ（３’）…（ｂ） または対応する相補的配列から成ることを特徴とするオ
   リゴヌクレオチド。
2. （２）請求項第１項に記載された各オリゴヌクレオチド
   の配列のうち、少なくとも連続した１０塩基以上を含む
   オリゴヌクレオチド。
3. （３）検体中における黄色ブドウ球菌のｅｎｔｅｒｏｔ
   ｏｘｉｎＢ遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチド
   であつて該オリゴヌクレオチド配列が （５’）ｄ−ＣＣＡＧＡＴＧＡＧＴＴＧＣＡＣＡＡＡＴ
   ＣＧ（３’）…（ａ） （５’）ｄ−ＣＡＣＣＡＡＡＴＡＧＴＧＡＣＧＡＧＴＴ
   Ａ（３’）…（ｂ） または対応する相補的配列から成ることを特徴とする請
   求項第１項記載のオリゴヌクレオチド。
4. （４）請求項第１項に記載された配列のうち、少なくと
   も１つを有するオリゴヌクレオチドを鎖長反応のプライ
   マーとして機能させ、標的ヌクレオチド配列を選択的に
   増幅させることを特徴とする方法であって、 （ａ）検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプ
   ライマーをハイブリダイズさせ４種のヌクレオチドの重
   合反応により鎖長反応を行わせ、 （ｂ）得られた２本鎖標的ヌクレオチド配列を１本鎖に
   分離した場合その相補鎖は他方のプライマーによる鎖長
   反応の鋳型として機能し、 （ｃ）これら２種のプライマーによる同時の鎖長反応、
   プライマー鎖長生成物の鋳型からの分離、そして新たな
   プライマーによるハイブリダイゼーションを繰り返すこ
   とにより特定のヌクレオチド配列を増幅させ、電気泳動
   、クロマトグラフイーで増幅されたヌクレオチド断片を
   検出し、 （ｄ）その結果、前記検体中に認識されるべき配列が存
   在しているか否かを判定することで、黄色ブドウ球菌の
   検出を行うことを含む方法。
5. （５）請求項第４項記載の方法における反応物から電気
   泳動、ないしクロマトグラフイーにより、増幅されたヌ
   クレオチド配列を分離し、この塩基対数を決定すること
   により黄色ブドウ球菌の検出を行うことを含む方法。
6. （６）請求項第４項記載の方法における反応物からアガ
   ロース電気泳動および臭化エチジウムによる核酸染色を
   行うことによる検出方法。
7. （７）請求項第１項記載の配列の１つを有するオリゴヌ
   クレオチドをプローブとして機能させ、膜上あるいはそ
   の他支持体上の標的ヌクレオチド配列を選択的に検出す
   る方法。
8. （８）請求項第１項記載の配列の１つを有するオリゴヌ
   クレオチドが標識物で修飾されていることを特徴とする
   請求項第７項記載の方法。