JPH0349699A - 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野　］ 本発明は、臨床検査、殊に食中毒検査、または食品検査
において　ウェルシュ＠　（　Ｃｌｏｓｔｒｌｄｉｕｍ
　ｐｅｒｆｒｌＢｅｎｓ）を検出する． 〔　従来の技術と問題点　〕 検査材料が患者の嘔吐物、糞便，食品または拭き取り材
料の場合、ウェルシュ薗と同定するまでには、増菌培養
、確認培養に至る操作を行わなければならない．各培賛
段階に要する時間は、１８〜２４時間であり総所要時間
にすると約２日間となり、長時間を要する．確認培養で
は、好気培養仏　下　体色 試験、運動性試験、ゼラチン液化試験、炭水化物分解試
験、レシチナーゼ反応抑制試験ならびに牛乳凝固消化！
ｉＣ験を行う必要があり，時間的、コスト的に負担が大
きい。さらに、ウェルシュ菌の腸炎起病性、すなわち、
食中毒を起こさせるｅｎｔｅｒｏｔｏχｊａが産生され
ているかどうかを調べる必要がある，　　ｅｎｔｅｒｏ
ｔｏｘｌｎの検査法としては、ウサギ結さつ腸管反応、
マウス致死反応、モルモットあるいはウサギ皮肉反応、
培！ＩＡＩ胞致死括性などの生物学的な方法、およびゲ
ル内沈降反応、カウンター免疫電気泳動法、ラテックス
凝集反応、ＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ法など
の免疫学的な方法とがある．ラテックス凝集反応の１つ
で逆受身ラテックス凝集反応で直接検出する方法がこれ
まで最も有効な方法であったが、結果を得るまでに２０
〜２４時間を要する． 最近では，オリゴヌクレオチドを用いたＤＮＡ１ロープ
法あるいはハイプリダイゼーション法が試みられるよう
になってきた．しかし、オリゴヌクレオチドを標識修飾
した１ロープにより膜上，あるいは他の支持体上でハイ
ブリダイゼーションを行い、これを検出する場合、ｍ菌
検査において十分な検出感度と選択性を得るのが難しい
．［　発明の目的　】 本発明は、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応のプライ
マーとして機能させた遺伝子増幅技術によりウェルシュ
菌のｅｎｔｅｒｏｔｏｘｌｒ＋遺伝子を検出するもので
、食中毒検査において簡便、迅速かつ高感度なウェルシ
ュ菌についての検出法を提供することにある．

〔　実施例〕

（実施例ｌ〉 挾ＪＬｌｊＬ製 ウェルシュ薗は表１の縦の見出しに示した１１株を用い
てそれぞれを適当な増菌培地に接種し、４０℃、嫌気的
条件下で一晩１ｔ１１２を行い、その培地，１．５ｍｌ
から遠心操作により菌体を回収した．　　１０ｍＭｌ−
リスー塩酸Ｍｌｌ液（ｐＨ７．　　５）で１回洗浄後，
同Ｍ衝液にリゾチームをｌｍｇ／ｍ１となるように溶か
した液，０．５ｍｌで懸濁させ、３７℃、　１０分で溶
菌させた．溶菌液に前記ＭｆＲ液で飽和させたフェノー
ルを同容量加え、よく攪はんした．遠心後．上層液を回
収し、エタノール沈澱処理を行って核酸成分を沈澱させ
、その沈澱物を前記ＭｆＲ液、ｌｍｌに溶かして、これ
を検体とした． ＋　　　　　　．　　　ム ウェルシュ菌のｅｎｔｅｒｏｔｏｘｌｎ遺伝子のヌクレ
オチド配列に関する情報は、ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎの
アミノ酸配列（　Ｒｌｃｈａｒｄｓｏｎ　１４．ａｎｄ
　（ｉｒａｎｕｍ　Ｐ．Ｅ．　；ＦＨＢＳ　Ｌｅｔｔ−
Ｃｒｓ　１８２：４７９−４８４（１９８５＞）より逆
翻訳して得られた情報を用い，特許請求範囲第２項に示
した配列を遍び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオ
チドを化学合成した．化学合戒は島津ＤＮＡ合成機ＮＳ
−１を用い、トリエステル法により行った．合成したオ
リゴヌクレオチド断片の精製はＣＩ８逆相カラムを用い
て行った． Ｌ立上 前記検体液を３μ！を用いそれに滅菌蒸留水１６．０５
μ１、ＩＯＸ反応用パツファ−３μ！、ｄＮＴＰ溶液４
．８μｌ、プライマ−（１）１．５μｌ、プライマー（
２＞１．５μ！そして耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０、　
１５μ１を加え、３０μｌの反応液を！Ｉｌ製した．　
この反応液の入った容器にミネラルオイル（ＳＩＧＭＡ
社製）を５０μ１加え反応液上に重層する．各添加され
た液の内容を下記に示す． ｔＯＸ反応用バッフ７　　：　　５００ｍＭ　　ＫＣＩ
，１００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ＰＨ８．　　３）
，１５ｍＭ　　ＭｇＣｌ＊，０．１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチ
ン． ｄＮＴＰ溶液：　　ｄＡＴＰ，　　ｄＣＴＰ，　　ｄＧ
ＴＰ，ｄＴＴＰを混合させたもので各終濃度が１，２５
ｍＭ． プライマ−（１）および（２）：　前述した化学合成Ｎ
製品の各水溶液（５０Ｄυ／ｍｌ）プライマーの組合せ
は、特許請求範囲第２項に示した配列（（五）〜（Ｃ）
》より、次の組合せを用いた． マー　　　＋　　　マー （ａ−）　　　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　
　（ｂ）（直）　　　　　　　　　　　＋　　　　　　
　（ｃ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ：　　Ｔａｑ　　Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（　５　ｕｎｉｔ／　ｍｌ；　　Ｐｅ
ｒｋｌｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ社製）２ 反応条件は、次の通りである． 熱変性：　９４℃　　１分 アニーリング：　３７℃　１分 重合反応：６０’ＣＩ分 熱変性からア二一リングを経て重合反応に至る過程を１
サイクル（５．７分〉とし、これを４２サイクル《総所
要時間約４時間》行った．これらの操作は、　Ｐｅｒｋ
ｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ社製　Ｄ？ｌＡ　Ｔｈｅ
ｒｍａｌＣｙｃｌｅｒに上記反応条件を７口グラムする
ことで行った． 撞二出 反応液から、増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロース電気泳動を以下の様に行った． アガロースゲルはゲル濃度２％（Ｗ／Ｖ）とし、臭化エ
チジウム（０．５μｇ／ｍｌ）を含むものを用いた．泳
動の電気的条件は、定電圧１　０　０　Ｖ．時間は３０
分行った．操作方法ならびに他の条件は１４ｉｎｌａＮ
ｓ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ！（１９８２
）に記載されている技法で行った．反応液の他に分子量
マーカーの泳動も、同時に行い、相対移動度の比較によ
りヌクレオ，チド断片の長さを算出した．級１ 前述したように、逆Ｗ４訳したウェルシュ菌のｅｎｔｅ
ｒｏｔｏｘｉｎ遺伝子のヌクレオチド配列から、本発明
のオリゴヌクレオチド、すなわち、プライマーがＰＣＲ
により、増幅されてくるヌクレオナドの大きさは推定で
きる．それによると、プライマー（ａ）と（ｂ）では、
　７２８塩基、　（ａ）と（ｃ）では、　６０２塩基の
長さのヌクレオチドが増幅されてくるはずである．表１
に示した数値は、上記方法で増輻されてきたヌクレオチ
ドの長さを測定した結果で， 単位はキロ塩基対である． 同表では（５）、 （ｌ１）の株を除き、 各プライマーの組合せとも、 （７》、 推 定されたヌクレオチドの長さと一致しており、これらの
株にはｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ 遺伝子が存在し、 標的 としている領域を正しく増幅してきていることを示して
いる． 菌株名 Ｃｌｏｓｔｒｌｄｉｕｍ Ｃｌｏｓｔｒｌｄｌｕｍ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｌｕｍ Ｃｌｏｓｔｒｌｄｌｕｉｉ Ｃｌｏｓｔｒｌｄｌｕｓ 表　　１ プライマーの組合せ （ａ）＋　（ｂ）　（ａ）＋　（ｃ） ｐｅｒｆｒｌｎｇｅｎｓ（１） ｐｅｒｆｒｌＢｅｎｓ　（２） ｐ＠ｒｆｒｌｎｇｅｎｓ（３） ｐｅｒｆｒｌＢｅｎｓ（４） ｐｅｒｆｒｌｎｇｅｎｓ（５） ０．７３ ０．７３ ０．７３ ０．７３ ０．６０ ０．６０ ０．６０ ０，６０ Ｃｌｏｓｔｒｌｄｌｕｍ　　ｐｅｒｆｒｌｎｇｅｎｓ（
９）　　　　０．７３Ｃｌｏｓｔｒｌｄｌｕｍ　　ｐｅ
ｒｆｒｌｎｇｅｎｓ（１０）　　　０．７３Ｃｌｏｓｔ
ｒｌｄｌｕｍ　　ｐｅｒｆｒｌｎｇｅｎｓ（１１）　　
　０．３００．６０ ０、６０ （１）から（１１）までのウェルシュ菌（　Ｃｌｏｓｔ
ｒｌｄｌｕｓ＋ Ｐ ２１，（８）Ａ丁Ｃは２９２２，（９）ＡＴＣは２９２
４．（１０）＾ＴＣは２９２５：Ａｍｅｒｌｃａｎ　　
Ｔｙｐｅ　　Ｃｕｌｔｕｒｅ　　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
，（１１）ＪＣｌ４３８１６：埋化字研究所 （実施例２） 実施例１で得られた結果が、ウェルシュ菌に対し選択的
なものかどうか確かめるため、臨床検査においてウェル
シュ菌以外で検査対象となり得る菌種について比較検討
した． 方法は、実ＭＡ例１に示したものと同じであるが、（６
）、（７）、（９）は嫌気的条件下、４０℃で、それ以
外の株は好気的条件下、３７℃で一晩培養を行った．検
体の調製において培養した菌は、表２の縦の見出しに示
した１０ｉ！１株である．また，ヒト胎盤由来ＤＮＡは
１μｇ／ｍｌの濃度のものをｙ４製し、これも同様にＰ
ＣＲを行わせた． 結果を表２に示す．表１と同様、潤内の数値の単位はキ
ロ塩基対である．一部の菌種においてＰＣＲ反応の副次
的産物とみられる増幅されたヌクレオチドが検出された
が、　どれもｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ遺伝子の塩基配列
から推定されるヌクレオチドの長さとは異なっている．
ウェルシュ菌と同じｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ遺伝子をこ
れらのｍＮが持っていれば実施例ｌの結果と同じ長さの
ヌクレオチドがはずである．従って、こｈら菌種由来の
増幅されたヌクレオチドはｅｎｔｅｒｏｌｘｉｎ遺伝子
を！！　！ｌ　Ｌて生成されたものではないことが明か
であり、ウェルシュ菌とは容易に区別し検出できること
がわかる．なお、本発明の実施例に用いているアガロー
ス電気泳動を前述の泳動条件で行えば１００塩基対以下
の範囲であれば５から１０塩基対、　ｌＯＯから５００
垣基対の範囲であれば１０から２０塩基対のヌクレオチ
ドの長さの違いを区別することができる．さらに、アク
リルアミドなどをゲルに用いることでヌクレオチドの長
さの測定の精度を向上させれば、選択的検出における信
頼度はさらに高まるものと考えられる． ｃ以下余白） 表 ２ 菌株名 ブライマーの組合せ （ａ）”　（ｂ）　　（ａ）　＋　（ｃ）はｏｓｔｒＩ
ｄｉｕｍ　　ｐｅｒｆＢｎｇｅｎｓ　　　　　　Ｏ．７
３　　　　　０．６０（ＡＴＣは２９１７） Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｃｅｒｅｕｓ（１）　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　０．２０Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ　　ｔｙｐｈｌｍｕｒｌｕｍ（２）　　　　０．６
０　　　　　　　−Ｓｔａｐｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　　ａ
ｕｒｅｕｓ（３）　　　　　　０．４５　　　　　０．
３５Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｌａ　　ｃｏｌ１（４）　　　
　　　　　　０．６０　　　　　０．６５Ｖｉｂｒｌｏ
　　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（５）　　　０
．４５　　　　　　　−Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　
　ＪｅＪｕｎｉ（６）　　　　　　　０．３５Ｂｉｃｔ
ｅｒｏｉｄｅｓ　　ｖｕｌｇａｔｕｓ（７）　　　　　
　０．４５Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　　ｆａｅｃａｌ
ｌｓ（８＞　　　　　０．４５Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　　ａｃｌｄｏｐｈｌｌｕｓ（９）　　０．４５　
　　　　　　−Ｙｅｒｓｉｎｉａ　　ｅｎｔｅｒｏｃｏ
ｌｉｔｉｃａ（１０）　　　０．Ｈｌ　　　　　　　−
Ｈｕ＋ｓａｎ　　ｐｌａｓｅｎｔａ（１１）（１）ＪＣ
Ｍ２１５２．（３）ＪＣＭ２４１３．（４）ＪＣＭ１６
４９．（６）ＪＣＭ２０１３，（７）ＪＣＭ５８２６．
　＜８＞ＪＣＭ５８０３．　（９）ＪＣＭ１１３２：理
化学研究所，　（２）ＩＦＯ１２５２９，　（５）ＩＦ
Ｏ１２７１１：発酵研究所．　（１０）＾ＴＣＣ９６１
０：＾ｇ＋ｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ　　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，（１１）Ｉ｛ｕｍａｎ　
　ｐｌａｃｅｎｔａｌ　　ＤＮＡ：Ｏｎｃｏ社製（ｃＡ
施例３） 実施例１で用いたウェルシュ閉（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍｐｃｒｆｒｌｎｇｅｎｓ）　１　１株についてｅｎｔ
ｅｒｏｔｏｘｉｎの産生能について検討した． 友二法 ラテックス凝集法を用いた市販のｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉ
ｎ検出用キット （　ＰＥＴ−ＲＰＬＡ：デンカ生研） により、 のマニュアルに従って各ウェルシュ菌についてのｅｎｔ
ｅｒｏｔｏｘｌｎ 活性を調べた． 結二果 表３はその結果である． −の判定は、 同マ ニュアルの判定基準に則って行った． なお、 Ｐ　Ｃ Ｒによる結果は、 実施例１と同じ方法によるもの である． 菌株名 ラテックス凝集法 ＰＣＲ反応での Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（５） Ｃ．ｐｅｒｆｒｌＢｅｎｓ（６） Ｃ．ｐｅｒｆｒｌｎｇｅｎｓ（７） Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ　（８） Ｃ，ｐｅｒｆｒ１ｎｇｅｎｓ（９） Ｃ．ｐｅｒｆｒｌｎｇｅｎｓ　（１０）Ｃ．ｐｅｒｆｒ
ｉｎｇｅｎｓ（１１） ０．７３ ０．７３ ０．７３ ０、７３ ０．３０ ０，６０ ０，６０ ０．６０ ０．６０ の株番号および入手先は表１ を参照． 表に示した結果から明らかなように、市販キットによる
ラテックス１１集法で十とでている株については、ＰＣ
Ｒ法でも正確な長さのヌクレオチド断片が生成されてい
る．−となった株については、ＰＣＲ反応による増幅ヌ
クレオチド断片が生成されないか、生成しても長さが大
きく異なっている．このように、市販キットによるラテ
ックスａ２集法と本発明の方法と結果は一致しており、
このことは、ウェルシュ菌のｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ産
生能がｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ遺伝子の有無で検査でき
ることを示している．したがって、ｅｎｔｅｒｏｔｏｘ
ｌｎ遺伝子の存在を直接，検出することは、ｅｎｔｅｒ
ｏｔｏｘｉｎ産生能を持ったウェルシュ菌を検出してい
ることと同じ意味を持つ・　　本発明は、ウェルシュ菌
のｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ遺伝子を直接、検出すること
で食中毒菌としてのウェルシュ菌の検出を行うもので、
以上の結果は、本発明の目的に添うものである． ［　発明の効果］ 本発明では、ＰＣＲ法を用いたことで、遺伝子増幅作用
による高い検出感度と、２つあるいは、それ以上のプラ
イマーで反応が規定されることによる高い選択性を実現
することができる．また、高い検出感度のため多量の検
体を必要とせず，検体の前処理が簡便で済む．しかも、
反応時間が短く、検出も簡単な機材だけで済み、操作も
容易なため同定までの時間を大幅に短縮でき、検査の効
率化を図ることができる．以下の実施例に示すが、反応
時間が４時間、検出にががる操作が３０分である．また
、検出にアガロースゲル電気泳動と臭化エチジウムによ
る核酸染色法を用いることで、１ライマー等に標識せず
に検出が行え，しがち、核酸の長さが確１Σできるので
結果の信頼性が高いものとなる． １ライマーが標的とするヌクレオチド配列にウェルシュ
菌のｅｎｔｅｒｏｔｏｘｌｎ遺伝子を用いたことによる
効果は、次の通りである．　　ウェルシュ菌にはｅｎｔ
ｅｒｏｔｏｘｌｎを産生する株と産生しない株があり，
前者のｅｎｔｅｒｏｔｏｘｌｎ’産生株が、食中Ｓ原因
菌となっている．また、ヒトの糞便中にはｅｎｔｅｒｏ
ｔｏｘｌｎ非産生の常在性ウェルシュ薗がいる．特に、
糞便を検体として食中毒検査を行う場合、ｅｎｔｅｒｏ
ｔｏｘｉｎを産生しているか否かが重要となる．従って
、ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｌｎ遺伝子を標的とすることで食
中ｌｌＭ因薗としてのウェルシュ菌を選択的に検出する
ことができる．

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）検体中において食中毒原因菌となるウエルシュ菌
   （Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）
   を選択的に検出するため、ウエルシュ菌のｅｎｔｅｒｏ
   ｔｏｘｉｎ遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的
   とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学
   合成されたオリゴヌクレオチドであつて、合成ヌクレオ
   チドが以下の配列群、（５’）ｄ−ＡＡＴＡＣＡＴＡＴ
   ＴＧＴＣＣＴＧＣＡＴＣ（３’）…（ａ） （５’）ｄ−ＧＴＡＡＴＡＧＡＴＡＡＡＧＧＡＧＡＴＧ
   Ｇ（３’）…（ｂ） （５’）ｄ−ＧＴＡＧＴＡＧＧＡＴＴＴＡＴＡＣＡＡＧ
   Ｃ（３’）…（ｃ） または対応する相補的配列から選ばれた配列からなるこ
   とを特徴とするオリゴヌクレオチド。
2. （２）請求項第１項に記載された各オリゴヌクレオチド
   の配列のうち、少なくとも連続した１０塩基以上のオリ
   ゴヌクレオチド。
3. （３）請求項第１項に記載されたオリゴヌクレオチドの
   配列のうち少なくとも１つを鎖長反応のプライマーとし
   て機能させ、標的ヌクレオチド配列を選択的に増幅させ
   ることを特徴とする方法であって、 （ａ）検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプ
   ライマーをハイブリダイズさせ４種のヌクレオチドの重
   合反応により鎖長反応を行わせ、 （ｂ）得られた２本鎖ヌクレオチド配列を１本鎖に分離
   した場合その相補鎖は他方のプライマーによる鎖長反応
   の鋳型として機能し、 （ｃ）これら２種のプライマーによる同時の鎖長反応、
   鎖長生成物の鋳型からの分離、そして新たなプライマー
   によるハイブリダイゼーシヨンを繰り返すことにより特
   定のヌクレオチド配列を増幅させ、それを電気泳動、ク
   ロマトグラフイーで検出し、 （ｄ）その結果、前記検体中に認識されるべきヌクレオ
   チド配列を持つ核酸が存在しているか否かを判定するこ
   とで、ウエルシュ菌の検出を行うことを含む方法。
4. （４）請求項第３項記載の方法における反応物から電気
   泳動、ないしクロマトグラフィーにより増輻されたヌク
   レオチド配列を分離し、この塩基対数を決定することに
   より前記検体中に認識されるべき配列が存在しているか
   否かを判定することでウエルシュ菌の検出を行うことを
   含む方法。
5. （５）請求項第３項記載の方法における反応物からアガ
   ロース電気泳動及び臭化エチジウムによる核酸染色を行
   うことによる検出方法。
6. （６）請求項第１項に記載されたオリゴヌクレオチドの
   配列１つを有するオリゴヌクレオチドをプローブとして
   機能させ、膜上あるいはその他支持体上の標的ヌクレオ
   チド配列を選択的に検出する方法。
7. （７）請求項第１項に記載されたオリゴヌクレオチドの
   配列の１つを有するオリゴヌクレオチドが標識物で修飾
   されていることを特徴とする請求項第６項記載の方法。