JPH03112499A - 耐熱性毒素産生病原大腸細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野　］ 本発明は、臨床検査、あるいは食品検査での耐熱性毒素
（ＳＴ）を産生ずる病原大ｉ菌の検出に関するものであ
る。

Ｃ従来の技術と問題点　］ 検査材料が患者の嘔吐物、糞便、食品または拭き取り材
料の場合、病原大腸菌と同定するまでには、増田培養、
分離培養を経て純培養、確１２培養を行わなければなら
ない、さらに、血清学的検査、エンテロトキシン産生試
験、その他生化学的試験を行うことではじめて同定され
る。各培養段階に要する時間は、１８〜２４時間であり
、その後の検査にかかる時間を合計すると１週間以上も
の長時間を要する。耐熱性毒素（ＳＴ）として産生され
るエンテロトキシンを検出する方法は、乳のみマウス法
が唯一のもので、これには、生後２〜３日のマウスを用
意しなければならず、操作も煩雑で熟練を要するもので
ある。しかも、３頭以上のマウスを用いて試験し、その
平均値を求める必要があるなど、再現性、信頼性に欠け
る点がある。

一方、最近では、オリゴヌクレオチドを用いたＤＮＡプ
ローブ法あるいはハイブリダイゼーション法が試みられ
るようになってきた。しかし、オリゴヌクレオチドを標
識修飾した１０−ブにより膜上、あるいは他の支持体上
でハイブリダイゼーションを行い、これを検出する場合
、ｍ菌検査において十分な検出感度と選択性を得るのが
難しい。

［発明の目的　］ 本発明は、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応の１ライ
マーとして機能させた遺伝子増幅技術により病原大腸菌
由来の核酸を検出するもので、簡便、迅速かつ高感度な
病原大腸菌の検査法を提供することにある。

［問題点を解決するための手段および作用　］本発明は
、オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた遺伝子
増幅法で病原大腸菌を選択的に検出することを特徴とし
ている。遺伝子増幅は、５ａｉｋｌらが、開発したＰｏ
１ｙｓｅｒｉｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ法（
以下、略してＰＣＲ法；　　５ｃｉｅｎｃｅ、２３０．
１３５０（１９８５））をもとに行っている。この方法
は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明の場合は
病原大腸菌のＳＴ遺伝子）を検出する場合、その領域の
両端の一方は土類を他方は一鎖をそれぞれＩ２識してハ
イブリダイゼーションするようなオリゴヌクレオチドを
用意し、それを熱変性により１本鎖状態にした試料核酸
に対し鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のブライマーと
して機能させ、生成した２本頭核酸を再び１本鎖に分離
し、再び、同様な反応を起こさせる。この一連の操作を
繰り返すことで２つのプライマーにはさまれた領域は検
出できるまでにコピー数が増大してくる。検体としては
、臨床検査材料、例えば、糞便、尿、血液、組織ホモジ
ェネートなど、また１食品材料でもよい、これら材料を
ＰＣＲ反応の試料として用いるには、材料中に存在する
菌体から核酸成分を遊離させる操作が前処理として必要
となる。しかし、プライマーがハイブリダイズできる核
酸が数分子から数十分子以上存在すればＰＣＲ反応は進
むので、検査材料を溶り＃素、・　界面活性剤、アルカ
リ等で短時間処理するだけでＰＣＲ反応を進行させるに
十分な核酸量を持った試料液が調製できる。

本発明でプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチ
ドは、選択性や検出感度および再現性から考えて、１０
塩基以上、望披しくは１５塩基以上の長さを持った核酸
フラグメントで、化学合成あるいは天然のどちらでもよ
い、また、プライマーは、特に検出用として標識されて
いなくてもよい。

プライマーが規定してい°る病原大Ｍｉｄの５Ｔ３ｆｔ
伝子における増幅領域は、５０塩基から２０００塩基と
なればよい、鋳型依存性ヌクレオチド重合反応には、耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、この酵素の起
源については９０〜９５℃の温度で活性を保持していれ
ば、どの生物種由来でもよい、熱変性温度は、９０〜９
５℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング
操作の温度は３７〜６５℃、重合反応は５０〜７５℃で
。

これを１サイクルとしたＰＣＲを２０がら４２サイクル
行って増幅させる。検出は酵素反応液をそのまま、アガ
ロースゲル電気泳動にかけることで増幅された核酸断片
の存在およびその長さが確認できる。その結果から、検
体中に、プライマーが認識すべき配列を持った核酸が存
在しているがどうか判定することができる。この判定は
、そのまま病原大腸２の有無を判定するものとなる。増
幅された核酸断片の検出には、その他の電気泳動やクロ
マトグラフィーも有効である。

［実施例］ （実施例１） １止二１１ 病原大腸菌の検索には表１の縦の見出しに示した下痢症
患者から分離した大腸菌４０株を用いた。

これらの臨床分離株は大阪大学微生物病研究所よりアル
カリ固定された試料をもらい受けなもので、そこからＤ
ＮＡ抽出を行った。抽出法はアルカリ固定された菌体を
再度０．　ＩＮ水酸化ナトリウムに懸濁し、６０℃、１
５分で溶菌させた。溶菌液に前記緩衝液で飽和させたフ
ェノールを同容量を加え、よく攪はんした。遠心後、上
層液を回収し、エタノール沈澱処理を行って核酸成分を
沈澱させ、その沈澱物を前記緩衝液、１ｍｌに溶かして
、これを検体とした。

−マー　ム 病原大腸菌のＳＴ遺伝子の塩基配列（Ｍｏ５ｅｌｅｙ。

Ｓ、Ｌ、、ｅｔ　ａｌ、Ｉｎｆｅｃｔ、ｌｍ５ｕｎ、　
３９．１１６７−１１７４（１９８３））から、特許請
求範囲第１項に示した配列（（ａ）、（ｂ））を選び、
それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成し
な、化学合成は島津ＤＮＡ合成機Ｎ５−１を用い、トリ
エステル法により行った０合成したオリゴヌクレオチド
断片の精製は０１８逆相カラムを用いて行った。

Ｌ立１ 前記検体液を３μｌを用いそれに滅菌蒸留水１６．０５
／ｊ　Ｉ、ＩＯＸ反応用バッフｙ−３μｌ、ｄＮＴＰ溶
液４，８μＩ、プライマー（１）１．５μｌ、プライマ
ー（２）１．５μｌそして耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＯ
，１５μｌを加え、　３０ｕ１の反応液を調製した。　
　この反応液の入った容器にミネラルオイル（ＳＩＧＭ
Ａ社製）を５０μｍ加え反応液上にｔ贋する。各添加さ
れた液の内容を下記に示す。

１０Ｘ反応用バッフｒ−：　　５００ｍＭ　　ＫＣＩ。

１００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，３）。

１５ｍＭ　　ＭｇＣＩ２．　０．　１％（ｗ／ｖ）ゼラ
チン ｄＮＴＰ溶液：　　ｄＡＴＰ、　　ｄＣＴＰ、　　ｄＧ
ＴＰ。

ｄＴＴＰを混合させたもので、各終濃度が１．２５ｍＭ プライマー（ａ）および（ｂ）：　　前述した化学合成
精製品の各水溶液（５０ＤＵ／　ｍｌ　） 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ：ＴａｑＤＮ−Ａポリメラー
ゼ（５ｕｎｉｔ／　ｍｌ；　　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｆｉｌｍ
ｅｒ　Ｃｅｔｕｓ社製） 反応条件は、次の通りである。

熱変性：　９４℃　１分 アニーリング；　３７℃　１分 重合反応：　６０℃　１分 熱変性からアニーリングを経て重合反応に至る過程を１
サイクル（所要時間５．７分）とし、これを４２サイク
ル（総所要時間約４時間）行った。

これらの操作は、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕ
ｓ社製　ＤＮＡＴｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒに上記反
応条件をプログラムすることにより行った。

柾皿 反応液から、増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロース電気泳動を以下の様に行った。

アガロースゲルはゲル濃度２％（ｗ／ｖ）とし、臭化エ
チジウム（０，５μｇ／ｍｌ）を含むものを用いた。泳
動の電気的条件は、定電圧１００Ｖ、時間は３０分行っ
た。操作方法ならびに他の条件はＭａｎｉａｔｌｓ等、
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２）に記
載されている技法で行った０反応液の他に分子量マーカ
ーの泳動も、同時に行い、相対移動度の比較により、ゲ
ル中、紫外線光等で検出されたヌクレオチド断片の長さ
を算出しな。

前述したように、ＳＴ遺伝子は、すでに塩基配列が決定
されており、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわち、
プライマーがＰＣＨにより、増幅させてくるヌクレオチ
ドの大きさは推定できる。

それによると、プライマー　（ａ）と（ｂ）では８０塩
基の長さのヌクレオチドが増幅されてくるはずである１
表１は、上記方法で増幅されてきたヌクレオチドの長さ
を測定した結果（ＰＣＲ）、推定値と一致したものは＋
、一致しないものはその大きさを示し、何も反応しなか
ったものは、　−と示しな。

ＳＭと示したものは、前述した乳のみマウス法である。

同表かられかるように、各プライマーの組合せとも反応
したものについては、推定されたヌクレオチドの長さと
一致しており　ＳＴとの結果についても強い相関がある
。　したがって、これらが、ＳＴ遺伝子の標的としてい
る領域を正しく増幅してきていることが強く示唆される
結果であり、ＳＴ産生病原大腸菌の検出に有効であるこ
とを示している。

（以下余白） 表 菌株番号 ５Ｍ ＰＣＲ 菌株番号 ５Ｍ ＰＣＲ １ （以下余白） （実施例２） 実施例１で得られた結果が、病原大腸菌に対し選択的な
ものか確かめるため、臨床検査において病原大腸菌以外
で検査対象となり得る菌種について比較検ｊｆした。

方法は、実施例１に示したものと同じであるが、Ｃａｍ
ｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　Ｊｅｊｕｎｉ、ＣＩｏｓｔｒｉ
ｄｌｕｍ　ｐｅｒｆｒｌｎｇｅｎｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉ
ｄｅｓ　ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ
　ｆａｅｃａｌｉｓ。

Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ
については嫌気的条件下、３７°Ｃで終夜培養を行い、
ＰＣＲ法に適用しうる試料を調製した。検体の調製にお
いて培養した菌は、表２の縦の見出しに示した１２菌株
である。また、ヒト胎盤由来Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｈｕｍａｎ
　ｐｌａｃｅｎｔａ）は１μｇ　／　ｍ　Ｉの濃度のも
のを調製し、これも同様にＰＣＲを行わせた。　　結果
を表２に示す。

欄内の数値は増幅されたＤＮＡの大きさを示しており、
単位はキロ塩基対である。病原大腸菌と同じＳＴ遺伝子
をこの菌種が持っていれば実施例１の結果と同じ長さの
ヌクレオチド断片が検出されるはずである。従って、こ
の菌種由来の増幅されたヌクレオチドはＳＴ遺伝子を認
識して生成されたものではないことが明かであり、病原
大腸菌とは容易に区別し検出できることがわかる。なお
、本発明の実施例にに用いているアガロース電気泳動を
前述の泳動条件行えば１００塩基対以下の範囲であれば
５から１０塩基対、１００から５００塩基対の範囲であ
れば１０から２０塩基対のヌクレオチドの長さの違いを
区別することがでる。さらに、アクリルアミドなどをゲ
ルに用いることでヌクレオチドの長さの測定の精度を向
上させれば、選択的検出における信頼度は、さらに高ま
るものと考えられる。

（以下余白） 表　　　　２ 菌種基　　　　保存機閏略１号および株番号Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ　　　　　ＪＣＭ２１５２　　　
　０．２０Ｙｅｒｓｊｎｉａ　　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉ
ｔｉｃａ　　ＡＴＣＣ９６ＬＯＶｉｂｒｉｏ　　ｃｈｏ
ｌｅｒａｅ　　　　　　　　ＡＴＣＣ９４５８０，６０
Ｖｉｂｒｉｏ　　ｃｈｏｌｅｒａｅ　　　　　　　　Ａ
ＴＣＣ９４５９ｖ＋ｂ目ｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ　　　　
　　ＡＴＣＣ２５ｇ７２　　　０．６０Ｈｕｍａｎ　　
ｐｌａｃｅｎｔａ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　Ｏ，１０［発明の効果　］ 本発明では、ＰＣＲ法を用いたことで、病原大腸菌の検
出において、遺伝子増幅作用による高い検出感度と、２
つあるいは、それ以上の１ライマーで反応が規定される
ことによる高い選択性を得ることができる。また、高い
検出感度のため多量の検体を必要とせず、検体の前処理
が簡便で済む。

しかも、反応時間が短く、検出も簡単な機材で済み、操
作も容易なため同定までの時間を大幅に短時間、検出に
かかる操作が３０分である。また、検出にアガロースゲ
ル電気泳動と臭化エチジウムによる核酸染色法をもちい
ることで、プライマー等に標識せずに検出が行え、しか
も、核酸の長さが確認できるので結果の信頼性が高いも
のとなる。

食中毒原因菌としての病原大腸菌を同定する際、ＳＴを
産生しているかどうがの確ｚ２が重要となっている。他
の生物種でＳＴ産生能を持つものは無いことから、プラ
イマーが標的とするヌクレオチド配列にＳＴ遺伝子をも
ちいることで病原大ｊ！苗の選択的的検出が可能となる
。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）検体中に存在する耐熱性毒素（ＳＴ）産生能をも
   った病原大腸菌を選択的に検出するためのオリゴヌクレ
   オチド、または、病原大腸菌の耐熱性毒素遺伝子（ＳＴ
   遺伝子）をコードするヌクレオチド配列を標的とし、そ
   のヌクレオチド配列と相補的となるように化学合成され
   たオリゴヌクレオチドであって、 合成ヌクレオチドが以下の配列群、 【遺伝子配列があります】・・・（ａ） 【遺伝子配列があります】・・・（ｂ） または対応する相補的配列から成ることを特徴とするオ
   リゴヌクレオチド。
2. （２）請求項第１項に記載された配列のうち、少なくと
   も１つを有するオリゴヌクレオチドを鎖長反応のプライ
   マーとして機能させ、標的ヌクレオチド配列を選択的に
   増幅させることを特徴とする方法であって、 （ａ）検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプ
   ライマーをハイブリダイズさせ４種のヌクレオチドの重
   合反応により鎖長反応を行わせ、 （ｂ）得られた２本鎖ヌクレオチド配列を１本鎖に分離
   した場合、その相補鎖は他方のプライマーによる鎖長反
   応の鋳型として機能し、 （ｃ）これら２種のプライマーによる同時の鎖長反応、
   鎖長生成物の鋳型からの分離、そして新たなプライマー
   によるハイブリダイゼーションを繰り返すことにより特
   定のヌクレオチド配列が増幅され、電気泳動、クロマト
   グラフィーで増幅されたヌクレオチド断片を検出し、 （ｄ）その結果、前記検体中に認識されるべき配列が存
   在しているか否かを判定することで病原大腸菌の検出を
   行うことを含む方法。
3. （３）請求項第２項記載の方法における反応物を用いア
   ガロース電気泳動および臭化エチジウムによる核酸染色
   を行うことによる検出方法。