JP3134907B2 - コレラ菌検出用オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
コレラ菌検出用オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法Info
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査、とりわけ法
定伝染病にかかる検査、あるいは検疫業務におけるコレ
ラ菌、およびctx 遺伝子の検出に関するものである。
定伝染病にかかる検査、あるいは検疫業務におけるコレ
ラ菌、およびctx 遺伝子の検出に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】コレラ菌にかかる検査では、検査材料は
患者の糞便、食品、または患者の周辺環境から採取され
た水（飲料水、河川水、および海水等）および底泥であ
る。これらの検体からコレラ菌を検出し、同定しようと
する場合、一次増菌培養、二次増菌培養、分離培養を経
て抗 V. cholerae O1 血清による凝集反応試験、および
確認培養に至る操作を行う必要がある。
患者の糞便、食品、または患者の周辺環境から採取され
た水（飲料水、河川水、および海水等）および底泥であ
る。これらの検体からコレラ菌を検出し、同定しようと
する場合、一次増菌培養、二次増菌培養、分離培養を経
て抗 V. cholerae O1 血清による凝集反応試験、および
確認培養に至る操作を行う必要がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ところが、これらの培
養段階に要する時間は、それぞれ１８〜２４時間であ
り、総所要時間にすると約４日間となり、非常に長時間
である。確認培養における生化学試験では、オキシダー
ゼ試験陽性、インドール試験陽性、運動性試験、リジン
脱炭酸試験陽性等の諸性状を調べる必要がある。これら
の試験は操作も煩雑で、時間や費用もかかり、結果の判
定が困難な場合もある。
養段階に要する時間は、それぞれ１８〜２４時間であ
り、総所要時間にすると約４日間となり、非常に長時間
である。確認培養における生化学試験では、オキシダー
ゼ試験陽性、インドール試験陽性、運動性試験、リジン
脱炭酸試験陽性等の諸性状を調べる必要がある。これら
の試験は操作も煩雑で、時間や費用もかかり、結果の判
定が困難な場合もある。
【０００４】また、コレラ菌の場合、分離菌株のエンテ
ロトキシン産生性を試験することが、防疫対策上、行政
処置を行うためには必要な処置である。しかし、市販の
簡便試薬キットを使用しても、結果を得るまで１８〜２
０時間を要し、迅速性に欠け、実効的でもない。
ロトキシン産生性を試験することが、防疫対策上、行政
処置を行うためには必要な処置である。しかし、市販の
簡便試薬キットを使用しても、結果を得るまで１８〜２
０時間を要し、迅速性に欠け、実効的でもない。
【０００５】一方、最近では、オリゴヌクレオチドを用
いたＤＮＡプローブ法あるいはハイブリダイゼーション
法が試みられるようになってきた。しかし、オリゴヌク
レオチドを標識修飾したプローブにより、膜上、あるい
は他の支持体上でハイブリダイゼーションを行い、これ
を検出する場合、細菌検査において十分な検出感度と選
択性を得るのが難しい。
いたＤＮＡプローブ法あるいはハイブリダイゼーション
法が試みられるようになってきた。しかし、オリゴヌク
レオチドを標識修飾したプローブにより、膜上、あるい
は他の支持体上でハイブリダイゼーションを行い、これ
を検出する場合、細菌検査において十分な検出感度と選
択性を得るのが難しい。
【０００６】そこで、本発明は、オリゴヌクレオチドを
核酸合成反応のプライマーとして機能させる遺伝子増幅
技術により、コレラ菌の ctx遺伝子を検出するもので、
臨床検査、とりわけ伝染病にかかる検査における、簡
便、迅速、かつ高感度なコレラ菌の検査法を提供するこ
とにある。
核酸合成反応のプライマーとして機能させる遺伝子増幅
技術により、コレラ菌の ctx遺伝子を検出するもので、
臨床検査、とりわけ伝染病にかかる検査における、簡
便、迅速、かつ高感度なコレラ菌の検査法を提供するこ
とにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、コレラ菌の c
tx遺伝子と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオ
チドを作製し、このオリゴヌクレオチドをプライマーと
して遺伝子増幅に用いて、コレラ症状の原因物質である
エンテロトキシンを産生するコレラ菌のみを選択的に検
出することを特徴としている。
tx遺伝子と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオ
チドを作製し、このオリゴヌクレオチドをプライマーと
して遺伝子増幅に用いて、コレラ症状の原因物質である
エンテロトキシンを産生するコレラ菌のみを選択的に検
出することを特徴としている。
【０００８】ここで、使用するオリゴヌクレオチドは、
以下の配列群 （５’）ｄ−ＴＧＡＴＧＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴ−（３’）・ ・・（ａ：配列番号１） （５’）ｄ−ＡＣＡＧＡＧＴＧＡＧＴＡＣＴＴＴＧＡＣＣ−（３’）・・・ ・・（ｂ：配列番号２） （５’）ｄ−ＧＧＣＡＣＴＴＣＴＣＡＡＡＣＴＡＡＴＴＧＡＧ−（３’）・ ・・（ｃ：配列番号３） （５’）ｄ−ＡＴＡＣＣＡＴＣＣＡＴＡＴＡＴＴＴＧＧＧＡＧ−（３’）・ ・・（ｄ：配列番号４） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
以下の配列群 （５’）ｄ−ＴＧＡＴＧＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴ−（３’）・ ・・（ａ：配列番号１） （５’）ｄ−ＡＣＡＧＡＧＴＧＡＧＴＡＣＴＴＴＧＡＣＣ−（３’）・・・ ・・（ｂ：配列番号２） （５’）ｄ−ＧＧＣＡＣＴＴＣＴＣＡＡＡＣＴＡＡＴＴＧＡＧ−（３’）・ ・・（ｃ：配列番号３） （５’）ｄ−ＡＴＡＣＣＡＴＣＣＡＴＡＴＡＴＴＴＧＧＧＡＧ−（３’）・ ・・（ｄ：配列番号４） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
【０００９】また、遺伝子増幅は、Saiki らが開発した
Polymerase Chain Reaction 法（以下、ＰＣＲ法と略す
る；Science 230, 1350(1985) ）をもとに行っている。
この方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明
の場合は、コレラ菌の ctx遺伝子）を検出する場合、そ
の領域の両端の一方は＋鎖を、他方は−鎖をそれぞれ認
識してハイブリダイゼーションするようなオリゴヌクレ
オチドを用意し、それを熱変性により１本鎖状態にした
試料核酸に対し、鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のプ
ライマーとして機能させ、生成した２本鎖核酸を再び１
本鎖に分離し、再び同様な反応を起こさせる。この一連
の操作を繰り返すことで、２つのプライマーに挟まれた
領域は検出できるまでにコピー数が増大してくる。
Polymerase Chain Reaction 法（以下、ＰＣＲ法と略す
る；Science 230, 1350(1985) ）をもとに行っている。
この方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明
の場合は、コレラ菌の ctx遺伝子）を検出する場合、そ
の領域の両端の一方は＋鎖を、他方は−鎖をそれぞれ認
識してハイブリダイゼーションするようなオリゴヌクレ
オチドを用意し、それを熱変性により１本鎖状態にした
試料核酸に対し、鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のプ
ライマーとして機能させ、生成した２本鎖核酸を再び１
本鎖に分離し、再び同様な反応を起こさせる。この一連
の操作を繰り返すことで、２つのプライマーに挟まれた
領域は検出できるまでにコピー数が増大してくる。
【００１０】検体としては、臨床検査材料、例えば、糞
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料としてもちいる
には、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる
操作が前処理として必要となる。 しかし、プライマー
がハイブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上
存在すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界
面活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを
進行させるに十分な核酸量を持った試料液が調製でき
る。
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料としてもちいる
には、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる
操作が前処理として必要となる。 しかし、プライマー
がハイブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上
存在すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界
面活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを
進行させるに十分な核酸量を持った試料液が調製でき
る。
【００１１】本発明でプライマーとして用いられるオリ
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さ
を持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用とし
て標識されていなくてもよい。プライマーが規定してい
るコレラ菌の ctx遺伝子のヌクレオチド配列における増
幅領域は、５０塩基から２, ０００塩基、望ましくは、
１００塩基から１, ０００塩基となればよい。鋳型依存
性ヌクレオチド重合反応には、耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼを用いているが、この酵素の起源については９０〜９
５℃の温度で活性を保持していれば、どの生物種由来で
もよい。熱変性の温度は９０〜９５℃、プライマーをハ
イブリダイズさせるアニーリング操作の温度は３７〜６
５℃、重合反応は５０〜７５℃で、これを１サイクルと
したＰＣＲを２０から４２サイクル行って増幅させる。
検出はＰＣＲを終えた反応液をそのままアガロースゲル
電気泳動にかけることで、増幅されたヌクレオチド断片
の存在、およびその長さを確認できる。その結果から検
体中にプライマーが認識すべき配列を持ったヌクレオチ
ドが存在しているかどうか判定することができる。この
判定は、そのままctx 遺伝子をもつコレラ菌の有無を判
定するものとなる。
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さ
を持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用とし
て標識されていなくてもよい。プライマーが規定してい
るコレラ菌の ctx遺伝子のヌクレオチド配列における増
幅領域は、５０塩基から２, ０００塩基、望ましくは、
１００塩基から１, ０００塩基となればよい。鋳型依存
性ヌクレオチド重合反応には、耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼを用いているが、この酵素の起源については９０〜９
５℃の温度で活性を保持していれば、どの生物種由来で
もよい。熱変性の温度は９０〜９５℃、プライマーをハ
イブリダイズさせるアニーリング操作の温度は３７〜６
５℃、重合反応は５０〜７５℃で、これを１サイクルと
したＰＣＲを２０から４２サイクル行って増幅させる。
検出はＰＣＲを終えた反応液をそのままアガロースゲル
電気泳動にかけることで、増幅されたヌクレオチド断片
の存在、およびその長さを確認できる。その結果から検
体中にプライマーが認識すべき配列を持ったヌクレオチ
ドが存在しているかどうか判定することができる。この
判定は、そのままctx 遺伝子をもつコレラ菌の有無を判
定するものとなる。
【００１２】増幅されたヌクレオチド断片の検出には、
その他の電気泳動法やクロマトグラフィーも有効であ
る。また、上記配列の１つを有するオリゴヌクレオチド
をプローブとして機能させ、膜上、あるいはその他支持
体上の標的ヌクレオチド配列を選択的に検出しても良
い。
その他の電気泳動法やクロマトグラフィーも有効であ
る。また、上記配列の１つを有するオリゴヌクレオチド
をプローブとして機能させ、膜上、あるいはその他支持
体上の標的ヌクレオチド配列を選択的に検出しても良
い。
【００１３】
【作用】本発明では、コレラ菌の ctx遺伝子と選択的に
ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを作製し、この
オリゴヌクレオチドをプライマーとして遺伝子増幅に用
いて、コレラ症状の原因物質であるエンテロトキシンを
産生するコレラ菌のみを選択的に検出する。
ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを作製し、この
オリゴヌクレオチドをプライマーとして遺伝子増幅に用
いて、コレラ症状の原因物質であるエンテロトキシンを
産生するコレラ菌のみを選択的に検出する。
【００１４】
（実施例１）検体の調製 使用したコレラ菌は、コレラ患者、海産食物（エビ、ス
ッポン）、港湾および河川水等の環境水から由来したも
ので、総計６２２株を用いた。これらの菌株の血清型、
生物型の判別および菌株数内訳は、表１に示すとおりで
ある。
ッポン）、港湾および河川水等の環境水から由来したも
ので、総計６２２株を用いた。これらの菌株の血清型、
生物型の判別および菌株数内訳は、表１に示すとおりで
ある。
【００１５】
【表１】 各菌株をＬＢ培地（１％トリプトン、０. ５％イースト
エクストラクト、および１％塩化ナトリウム）に接種
し、３７℃、好気的条件下で、終夜振とう培養を行っ
た。各菌株培養液を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ
７. ５（以下ＴＥ緩衝液）で１０倍に希釈し、９５℃で
１０分間の加熱処理を行った後、これらを遠心し、その
上清を検体とした。
エクストラクト、および１％塩化ナトリウム）に接種
し、３７℃、好気的条件下で、終夜振とう培養を行っ
た。各菌株培養液を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ
７. ５（以下ＴＥ緩衝液）で１０倍に希釈し、９５℃で
１０分間の加熱処理を行った後、これらを遠心し、その
上清を検体とした。
【００１６】プライマーの合成 コレラ菌のコレラ毒素遺伝子（ctx 遺伝子）の塩基配列
（Lockman, H. and J.B. Kaper:J. Biol. Chem. 258, 1
3722-13726(1983) ）から、請求項第１項に示した(a)
から(d) までの各配列を選び、それと同じ配列を持つオ
リゴヌクレオチドを化学合成した。化学合成は、サイク
ロンプラスＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バイオリサー
チ社製）を用い、β−シアノエチルフォスホアミダイト
法により行った。合成したオリゴヌクレオチドの精製は
Ｃ18逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで
行った。
（Lockman, H. and J.B. Kaper:J. Biol. Chem. 258, 1
3722-13726(1983) ）から、請求項第１項に示した(a)
から(d) までの各配列を選び、それと同じ配列を持つオ
リゴヌクレオチドを化学合成した。化学合成は、サイク
ロンプラスＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バイオリサー
チ社製）を用い、β−シアノエチルフォスホアミダイト
法により行った。合成したオリゴヌクレオチドの精製は
Ｃ18逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで
行った。
【００１７】ＰＣＲ 前記検体液３μｌを用い、それに滅菌蒸留水１７. ０５
μｌ、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ，ｄＮＴＰ溶液４. ８
μｌ、プライマー(1) １. ０μｌ、プライマー(2) １.
０μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０．１５μｌ
を加えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応
液の入った容器にミネラルオイル（SIGMA 社製）を５０
μｌ加え、反応液上に重層した。各使用した溶液の内
容、およびプライマー(1) と(2) の組合せは、次のとお
りである。
μｌ、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ，ｄＮＴＰ溶液４. ８
μｌ、プライマー(1) １. ０μｌ、プライマー(2) １.
０μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０．１５μｌ
を加えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応
液の入った容器にミネラルオイル（SIGMA 社製）を５０
μｌ加え、反応液上に重層した。各使用した溶液の内
容、およびプライマー(1) と(2) の組合せは、次のとお
りである。
【００１８】10x 反応用緩衝液: 500mM KCl, 100mM Tri
s-HCl pH8.3, 15mM MgCl2 ,0.1%(w/V) ゼラチン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー(1) および(2): 前述した化学合成精製品の
水溶液（濃度3.75 OD/ ml ） プライマーの組合せ: 前述の化学合成精製品を下表に示した組合せで使用した 。 プライマー(1) プライマー(2) (a) (c) (b) (d) 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ: ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（5 unit/ml;Perkin Elmer Cetus社製）。
s-HCl pH8.3, 15mM MgCl2 ,0.1%(w/V) ゼラチン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー(1) および(2): 前述した化学合成精製品の
水溶液（濃度3.75 OD/ ml ） プライマーの組合せ: 前述の化学合成精製品を下表に示した組合せで使用した 。 プライマー(1) プライマー(2) (a) (c) (b) (d) 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ: ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（5 unit/ml;Perkin Elmer Cetus社製）。
【００１９】反応条件は、次のとおりである。
【００２０】熱変性：９４℃、１分 アニーリング：５５℃、１分 重合反応：７２℃、１分 熱変性からアニーリングを経て、重合反応に至る過程を
１サイクル（所要時間5.7 分）とし、これを３５サイク
ル（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に
上記反応条件をプログラムして行った。
１サイクル（所要時間5.7 分）とし、これを３５サイク
ル（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に
上記反応条件をプログラムして行った。
【００２１】検出 反応液から増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。
【００２２】アガロースゲルはゲル濃度３％（ W/V）と
し、臭化エチジウム（ 0.5μg/ml）を含むものを用い
た。泳動の条件は定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操
作方法ならびに他の条件は、Maniatis等著 Molecular C
loning 第２版（1989）に記載されている技法で行っ
た。反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、
相対移動度の比較によりヌクレオチド断片の長さを算出
した。
し、臭化エチジウム（ 0.5μg/ml）を含むものを用い
た。泳動の条件は定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操
作方法ならびに他の条件は、Maniatis等著 Molecular C
loning 第２版（1989）に記載されている技法で行っ
た。反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、
相対移動度の比較によりヌクレオチド断片の長さを算出
した。
【００２３】コロニーハイブリダイゼーション試験 ctx 遺伝子に特異的なポリヌクレオチドプローブ（Kape
r, J. B., J. G. Morris, Jr.,and M. Nishibuchi.(198
8) DNA probes for pathogenic Vibrio species, 65-7
7. In F. C. Tenover(ed), DNA probes for infectious
diseases. CRCPress, Inc., Boca Raton,Fla.）を用い
て、Grunstein らの方法（Grunstein, M. and Hogness,
D., Proc. Natl. Acad. Sci, 72, 3961(1975)）にした
がって行った。結果 前述したようにコレラ菌の ctx遺伝子は、すでに塩基配
列が決定されており、本発明のオリゴヌクレオチド、す
なわち、プライマーがＰＣＲにより増幅させるヌクレオ
チドの大きさは容易に推定できる。それによるとプライ
マー(a) と(c)の組合せを用いた場合には、１６９塩基
（または１６９塩基対）の長さのヌクレオチドが増幅さ
れてくるはずである。下に、本発明のプライマーの組合
せについて、増幅ヌクレオチドの長さ（推定値）をまと
めて記載した（各数字の単位は塩基を示す）。
r, J. B., J. G. Morris, Jr.,and M. Nishibuchi.(198
8) DNA probes for pathogenic Vibrio species, 65-7
7. In F. C. Tenover(ed), DNA probes for infectious
diseases. CRCPress, Inc., Boca Raton,Fla.）を用い
て、Grunstein らの方法（Grunstein, M. and Hogness,
D., Proc. Natl. Acad. Sci, 72, 3961(1975)）にした
がって行った。結果 前述したようにコレラ菌の ctx遺伝子は、すでに塩基配
列が決定されており、本発明のオリゴヌクレオチド、す
なわち、プライマーがＰＣＲにより増幅させるヌクレオ
チドの大きさは容易に推定できる。それによるとプライ
マー(a) と(c)の組合せを用いた場合には、１６９塩基
（または１６９塩基対）の長さのヌクレオチドが増幅さ
れてくるはずである。下に、本発明のプライマーの組合
せについて、増幅ヌクレオチドの長さ（推定値）をまと
めて記載した（各数字の単位は塩基を示す）。
【００２４】 増幅ヌクレオチドの長さ（推定値）一覧表 プライマー(1) (a) (b) プライマー(2) (c) １６９ ― (d) − ３０７ これらの推定値と増幅されたヌクレオチドの長さが一致
した場合、各プライマーの組合せは、ctx 遺伝子中の標
的としている領域を正しく増幅しており、かつ、当該菌
株は ctx遺伝子を有していると判断した。被検菌株６６
２株で調べた結果を表２に示す。各プライマーの組合せ
は、コロニーハイブリダイゼーション試験で、ctx 遺伝
子陽性と判断された菌株ＤＮＡのみを増幅し、ctx 遺伝
子陰性の菌株ＤＮＡとは全く反応しなかった。
した場合、各プライマーの組合せは、ctx 遺伝子中の標
的としている領域を正しく増幅しており、かつ、当該菌
株は ctx遺伝子を有していると判断した。被検菌株６６
２株で調べた結果を表２に示す。各プライマーの組合せ
は、コロニーハイブリダイゼーション試験で、ctx 遺伝
子陽性と判断された菌株ＤＮＡのみを増幅し、ctx 遺伝
子陰性の菌株ＤＮＡとは全く反応しなかった。
【００２５】すなわち、ctx 遺伝子を正しく増幅し、ct
x 遺伝子をもつコレラ菌を正確に検出していることを示
している。また、表２に掲載されなかった残りの組合せ
についても同様の試験結果が得られた。
x 遺伝子をもつコレラ菌を正確に検出していることを示
している。また、表２に掲載されなかった残りの組合せ
についても同様の試験結果が得られた。
【００２６】
【表２】 さらに、図１には、本発明のプライマーの組合せは、コ
レラ菌株の由来、血清型、および生物型の違いに関係な
く、ctx 遺伝子の有無を的確に捕捉していることをも示
している。なお、図１中の各レーンは、次の菌株の熱抽
出サンプルを鋳型ＤＮＡ溶液として使用したものを示
す。
レラ菌株の由来、血清型、および生物型の違いに関係な
く、ctx 遺伝子の有無を的確に捕捉していることをも示
している。なお、図１中の各レーンは、次の菌株の熱抽
出サンプルを鋳型ＤＮＡ溶液として使用したものを示
す。
【００２７】レーン１〜３；コレラ菌（エルトール・小
川型，コレラ毒素遺伝子陽性株）、 レーン４〜６；コレラ菌（エルトール・稲葉型，コレラ
毒素遺伝子陽性株） レーン７；コレラ菌（古典・小川型，コレラ毒素遺伝子
陽性株） レーン８；コレラ菌（古典・稲葉型，コレラ毒素遺伝子
陽性株） レーン９〜１０；コレラ菌（non-Ｏ１，コレラ毒素遺伝
子陽性株） レーン１１；コレラ菌（エルトール・小川型，コレラ毒
素遺伝子陰性株） レーン１２；コレラ菌（エルトール・稲葉型，コレラ毒
素遺伝子陰性株） レーン１３；毒素原性大腸菌（易熱性エンテロトキシン
遺伝子陽性株）
川型，コレラ毒素遺伝子陽性株）、 レーン４〜６；コレラ菌（エルトール・稲葉型，コレラ
毒素遺伝子陽性株） レーン７；コレラ菌（古典・小川型，コレラ毒素遺伝子
陽性株） レーン８；コレラ菌（古典・稲葉型，コレラ毒素遺伝子
陽性株） レーン９〜１０；コレラ菌（non-Ｏ１，コレラ毒素遺伝
子陽性株） レーン１１；コレラ菌（エルトール・小川型，コレラ毒
素遺伝子陰性株） レーン１２；コレラ菌（エルトール・稲葉型，コレラ毒
素遺伝子陰性株） レーン１３；毒素原性大腸菌（易熱性エンテロトキシン
遺伝子陽性株）
【００２８】（実施例２）実施例１で得られた結果が c
tx遺伝子をもつコレラ菌に対して、選択的なものかどう
かを確かめるため、臨床検査において検査対象となる、
コレラ菌以外の下痢症菌等の遺伝子について本発明のプ
ライマーが反応するかどうかを調べた。方法は検体の調
製法を除いて、実施例１で示したものと同じである。
tx遺伝子をもつコレラ菌に対して、選択的なものかどう
かを確かめるため、臨床検査において検査対象となる、
コレラ菌以外の下痢症菌等の遺伝子について本発明のプ
ライマーが反応するかどうかを調べた。方法は検体の調
製法を除いて、実施例１で示したものと同じである。
【００２９】検体の調製 表３中に示した各菌株をそれぞれ適当な増菌培地に接種
し、３７℃、好気的、または嫌気的条件下で終夜培養を
行った（このうち嫌気的条件下で培養した菌株は、Clos
tridium perfringens 、Campylobacter jejuni、Bacter
oides fragilis、Bacteroides vulgatus、およびLactob
acillus acidophilus である）。各菌株培養液０. ５ｍ
ｌから遠心操作により、菌体を回収し、ＴＥ緩衝液で菌
体を１回洗浄した。
し、３７℃、好気的、または嫌気的条件下で終夜培養を
行った（このうち嫌気的条件下で培養した菌株は、Clos
tridium perfringens 、Campylobacter jejuni、Bacter
oides fragilis、Bacteroides vulgatus、およびLactob
acillus acidophilus である）。各菌株培養液０. ５ｍ
ｌから遠心操作により、菌体を回収し、ＴＥ緩衝液で菌
体を１回洗浄した。
【００３０】この菌体に５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７.
５に溶解したＮ- アセチルムラミニダーゼ溶液、および
アクロモペプチダーゼ溶液を各終濃度が５０μｇ／ｍ
ｌ、および１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で１
０分間処理し、溶菌した。ＴＥ緩衝液飽和でさせたフェ
ノールおよびクロロフォルムからなる混合液（混合比
１：１）を溶菌液に加えて、よく撹拌した。遠心後、上
層液を回収し、エタノール処理を行って、核酸成分を沈
澱させた。この沈澱物を１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶かして
検体とした。また、ヒト胎盤由来ＤＮＡ（Human placen
ta DNA）は、１μｇ／ｍｌの濃度のものを調製し、これ
も同様にＰＣＲを行わせた。
５に溶解したＮ- アセチルムラミニダーゼ溶液、および
アクロモペプチダーゼ溶液を各終濃度が５０μｇ／ｍ
ｌ、および１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で１
０分間処理し、溶菌した。ＴＥ緩衝液飽和でさせたフェ
ノールおよびクロロフォルムからなる混合液（混合比
１：１）を溶菌液に加えて、よく撹拌した。遠心後、上
層液を回収し、エタノール処理を行って、核酸成分を沈
澱させた。この沈澱物を１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶かして
検体とした。また、ヒト胎盤由来ＤＮＡ（Human placen
ta DNA）は、１μｇ／ｍｌの濃度のものを調製し、これ
も同様にＰＣＲを行わせた。
【００３１】結果 表３に一部のプライマーの組合せにおける試験結果を示
す。表中のプライマーの全ての組合せは、下痢症菌ＤＮ
Ａをはじめとする種々のＤＮＡ全てについて、それらの
ＤＮＡを増幅することはなかった。
す。表中のプライマーの全ての組合せは、下痢症菌ＤＮ
Ａをはじめとする種々のＤＮＡ全てについて、それらの
ＤＮＡを増幅することはなかった。
【００３２】
【表３】 したがって、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプ
ライマーは、ctx 遺伝子をもつコレラ菌にのみ、選択的
に反応するものと断言できる。表２に掲載されなかった
残りの各組合せについても同様な試験結果が得られた。
ライマーは、ctx 遺伝子をもつコレラ菌にのみ、選択的
に反応するものと断言できる。表２に掲載されなかった
残りの各組合せについても同様な試験結果が得られた。
【００３３】なお、本発明の実施例で用いているアガロ
ースゲル電気泳動法を前述の条件で行えば、１００塩基
（または１００塩基対）以下の長さのヌクレオチドであ
れば、５から１０塩基（塩基対）、また、１００から５
００塩基（塩基対）の範囲のヌクレオチドであれば、１
０から２０塩基（塩基対）のヌクレオチドの長さの違い
を区別可能である。
ースゲル電気泳動法を前述の条件で行えば、１００塩基
（または１００塩基対）以下の長さのヌクレオチドであ
れば、５から１０塩基（塩基対）、また、１００から５
００塩基（塩基対）の範囲のヌクレオチドであれば、１
０から２０塩基（塩基対）のヌクレオチドの長さの違い
を区別可能である。
【００３４】さらに、アクリルアミドなどをゲル材に用
いることで、ヌクレオチドの長さの測定精度を向上させ
ることができ、ctx 遺伝子の選択的検出における信頼度
は、さらに高まるものと考えられる。
いることで、ヌクレオチドの長さの測定精度を向上させ
ることができ、ctx 遺伝子の選択的検出における信頼度
は、さらに高まるものと考えられる。
【００３５】
【発明の効果】本発明では、ＰＣＲ法を用いたこと、お
よびコレラの病原因子であるエンテロトキシン（コレラ
毒素）の遺伝子（ctx 遺伝子）を標的とするプライマー
を用いたことにより、ctx 遺伝子を有するコレラ菌の検
出において、遺伝子増幅作用による高い検出感度と、２
つ、あるいは、それ以上の数のプライマーで反応が規定
されることによる高い選択性とが得られる。
よびコレラの病原因子であるエンテロトキシン（コレラ
毒素）の遺伝子（ctx 遺伝子）を標的とするプライマー
を用いたことにより、ctx 遺伝子を有するコレラ菌の検
出において、遺伝子増幅作用による高い検出感度と、２
つ、あるいは、それ以上の数のプライマーで反応が規定
されることによる高い選択性とが得られる。
【００３６】また、検出感度が高いので、多量の検体を
必要とせず、検体の前処理も簡便で済む。本発明におけ
る実施例では、反応時間３時間、検出にかかる操作が３
０分であった。そのうえ、検出にアガロースゲル電気泳
動法と臭化エチジウムによる核酸染色法を用いること
で、プライマー等を標識せずに検出が行える。しかも増
幅されたヌクレオチドの長さを確認できるので、試験結
果の信頼性は高いものとなる。
必要とせず、検体の前処理も簡便で済む。本発明におけ
る実施例では、反応時間３時間、検出にかかる操作が３
０分であった。そのうえ、検出にアガロースゲル電気泳
動法と臭化エチジウムによる核酸染色法を用いること
で、プライマー等を標識せずに検出が行える。しかも増
幅されたヌクレオチドの長さを確認できるので、試験結
果の信頼性は高いものとなる。
【００３７】コレラ菌の検査には、発見患者の迅速・適
切な治療と防疫措置のために、遅滞のない正確な結果が
要求される。また、コレラの病原体とされる真性コレラ
菌であるかどうかは、病原体とみなされた菌株が、血清
型Ｏ１に該当する菌であるかどうかで判定されていた。
切な治療と防疫措置のために、遅滞のない正確な結果が
要求される。また、コレラの病原体とされる真性コレラ
菌であるかどうかは、病原体とみなされた菌株が、血清
型Ｏ１に該当する菌であるかどうかで判定されていた。
【００３８】しかし、最近では、血清型Ｏ１に該当しな
い菌（Vibrio cholerae non O1）においても、血清型Ｏ
１の菌と同じコレラ毒素を産生し、コレラ症状を発現さ
せていることが多数報告されてきている。このような菌
に対しては、血清型を調べることは無意味となり、その
菌株がコレラ毒素の産生能を有しているかどうかを調べ
ることこそ必要となる。本発明は、コレラの病原因子で
あるコレラ毒素をコードしている ctx遺伝子を選択的に
検出するものである。したがって、本発明により、コレ
ラの病原体としてのコレラ菌の検出を正確に行うことが
可能となる。
い菌（Vibrio cholerae non O1）においても、血清型Ｏ
１の菌と同じコレラ毒素を産生し、コレラ症状を発現さ
せていることが多数報告されてきている。このような菌
に対しては、血清型を調べることは無意味となり、その
菌株がコレラ毒素の産生能を有しているかどうかを調べ
ることこそ必要となる。本発明は、コレラの病原因子で
あるコレラ毒素をコードしている ctx遺伝子を選択的に
検出するものである。したがって、本発明により、コレ
ラの病原体としてのコレラ菌の検出を正確に行うことが
可能となる。
【００３９】
配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；１ 配列の長さ ２２塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Vibrio cholerae 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＧＡＴＧＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＧＴＣ
ＡＧＧＴ
ＡＧＧＴ
【００４０】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；２ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Vibrio cholerae 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＣＡＧＡＧＴＧＡＧＴＡＣＴＴＴＧＡ
ＣＣ
ＣＣ
【００４１】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；３ 配列の長さ ２２塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Vibrio cholerae 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＧＧＣＡＣＴＴＣＴＣＡＡＡＣＴＡＡＴ
ＴＧＡＧ
ＴＧＡＧ
【００４２】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；４ 配列の長さ ２２塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Vibrio cholerae 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＴＡＣＣＡＴＣＣＡＴＡＴＡＴＴ
ＴＧＧＧＡＧ
ＴＧＧＧＡＧ
【図１】アガロース電気泳動図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平４−99488（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−222033（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−297489（ＪＰ，Ａ)
Claims (2)
- 【請求項１】検体中に存在するコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ
ｈｏｌｅｒａｅ）の産生するエンテロトキシン（コレ
ラ毒素、ＣＴ）の遺伝子（以下、ｃｔｘ遺伝子）をコー
ドするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド
配列と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレ
オチドであって、合成ヌクレオチドが以下の配列群 （５’）ｄ−ＴＧＡＴＧＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴ−（３’）・ ・・（ａ：配列番号１） （５’）ｄ−ＡＣＡＧＡＧＴＧＡＧＴＡＣＴＴＴＧＡＣＣ−（３’）・・・ ・・（ｂ：配列番号２） （５’）ｄ−ＧＧＣＡＣＴＴＣＴＣＡＡＡＣＴＡＡＴＴＧＡＧ−（３’）・ ・・（ｃ：配列番号３） （５’）ｄ−ＡＴＡＣＣＡＴＣＣＡＴＡＴＡＴＴＴＧＧＧＡＧ−（３’）・ ・・（ｄ：配列番号４） または対応する相補的配列からなることを特徴とするコ
レラ菌検出用オリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 請求項第１項に記載された配列のうち、
少なくとも１つを有するオリゴヌクレオチドを鎖長反応
のプライマーとして機能させ、標的ヌクレオチド配列を
選択的に増幅させることを特徴とする方法であって、 (a) 検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプラ
イマーをハイブリダイズさせ、４種のヌクレオチドの重
合反応により鎖長反応を行わせ、 (b) 得られた２本鎖の標的ヌクレオチド配列を１本鎖に
分離した場合、その相補鎖は他方のプライマーによる鎖
長反応の鋳型として機能し、 (c) これら２種のプライマーによるハイブリダイゼ−シ
ョンを繰り返すことにより、特定のヌクレオチド配列が
増幅され、増幅されたヌクレオチド断片を検出し、 (d) その結果、前記検体中に認識されるべき配列が存在
しているか否かを判定することでコレラ菌の検出を行う
ことを特徴とするコレラ菌の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05143180A JP3134907B2 (ja) | 1993-06-15 | 1993-06-15 | コレラ菌検出用オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05143180A JP3134907B2 (ja) | 1993-06-15 | 1993-06-15 | コレラ菌検出用オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH078279A JPH078279A (ja) | 1995-01-13 |
| JP3134907B2 true JP3134907B2 (ja) | 2001-02-13 |
Family
ID=15332755
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP05143180A Expired - Lifetime JP3134907B2 (ja) | 1993-06-15 | 1993-06-15 | コレラ菌検出用オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3134907B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100941990B1 (ko) | 2007-07-20 | 2010-02-11 | 서강대학교산학협력단 | 콜레라－유발 비브리오 콜레라에 검출용 유전자 증폭키트및 마이크로어레이 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0669399B1 (en) * | 1994-02-28 | 2003-10-01 | Shimadzu Corporation | Oligonucleotides and method for detecting bacteria |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4666837A (en) * | 1982-05-24 | 1987-05-19 | Smithkline-Rit | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing the A and B subunits of cholera toxin and preparations containing so-obtained subunit or subunits |
| JPH0499488A (ja) * | 1990-08-20 | 1992-03-31 | Unitika Ltd | 遺伝子増幅用プライマー |
| JP2905945B2 (ja) * | 1991-03-26 | 1999-06-14 | 塩野義製薬株式会社 | Ｖｅｒｏ毒素遺伝子の型別検出方法およびそれに用いるプライマ− |
-
1993
- 1993-06-15 JP JP05143180A patent/JP3134907B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100941990B1 (ko) | 2007-07-20 | 2010-02-11 | 서강대학교산학협력단 | 콜레라－유발 비브리오 콜레라에 검출용 유전자 증폭키트및 마이크로어레이 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH078279A (ja) | 1995-01-13 |
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