JPH0499488A - 遺伝子増幅用プライマー - Google Patents
遺伝子増幅用プライマーInfo
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- JPH0499488A JPH0499488A JP2219523A JP21952390A JPH0499488A JP H0499488 A JPH0499488 A JP H0499488A JP 2219523 A JP2219523 A JP 2219523A JP 21952390 A JP21952390 A JP 21952390A JP H0499488 A JPH0499488 A JP H0499488A
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- cholera toxin
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、コレラ毒素の遺伝子を増幅することが可能な
ブライマーに関するものであり、被検体中のコレラ毒素
産生コレラ菌の検出に好適に用いられるものである。
ブライマーに関するものであり、被検体中のコレラ毒素
産生コレラ菌の検出に好適に用いられるものである。
（従来の技術）
従来、コレラ菌の検出には分離培養法、抗血清を用いた
スライド凝集反応法、また毒素の産生株と非産生株とを
見分ける必要性から毒素の抗体を用いた免疫法および毒
素の遺伝子をプローブとしたハイブリダイゼーション法
など知られている（コレラ菌と毒素原性大腸菌の検査法
、葉根出版。
スライド凝集反応法、また毒素の産生株と非産生株とを
見分ける必要性から毒素の抗体を用いた免疫法および毒
素の遺伝子をプローブとしたハイブリダイゼーション法
など知られている（コレラ菌と毒素原性大腸菌の検査法
、葉根出版。
１９８１年、ｐｌ！、ビブリオ感染症、医歯薬出版、ｐ
１２９）。
１２９）。
さらに近年、酵素的ＤＮＡ増幅法〔サイエンス（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ）；２３９巻、ｐ４８７−４９１、．１９８８
年〕を用い高感度に毒素産生コレラ菌を検出することが
試みられている（医学のあゆみ；１５０巻、ｐ５０９−
５１０．１９８９年）。
ｅｎｃｅ）；２３９巻、ｐ４８７−４９１、．１９８８
年〕を用い高感度に毒素産生コレラ菌を検出することが
試みられている（医学のあゆみ；１５０巻、ｐ５０９−
５１０．１９８９年）。
（発明が解決しようとする諜Ｂ）
しかしながら、上記のような従来法では分離培養する必
要があるので判定に長時間を要し、また感度的にも満足
いくものでなかった。また、簡便と思われるＤＮＡ増幅
法においても、コレラ菌の染色体ＤＮＡを精製する必要
があったため操作が繁雑になり、満足する手法ではなか
った。
要があるので判定に長時間を要し、また感度的にも満足
いくものでなかった。また、簡便と思われるＤＮＡ増幅
法においても、コレラ菌の染色体ＤＮＡを精製する必要
があったため操作が繁雑になり、満足する手法ではなか
った。
本発明は１ これらの問題点を解決するためＤＮＡ増幅
法において、コレラ毒素遺伝子に特異的なブライマーを
合成し１ コレラ菌の染色体ＤＮＡを精製せずに簡便に
かつ高感度に毒素産生コレラ菌を検出することを目的と
するものである。
法において、コレラ毒素遺伝子に特異的なブライマーを
合成し１ コレラ菌の染色体ＤＮＡを精製せずに簡便に
かつ高感度に毒素産生コレラ菌を検出することを目的と
するものである。
（課題を解決するための手段）
本発明者は、このような課題を解決するために鋭意研究
の結果、新たに開発したブライマーを使った酵素的増幅
法により本発明に到達した。
の結果、新たに開発したブライマーを使った酵素的増幅
法により本発明に到達した。
すなわち本発明は、下記のＤＮＡ鎖１〜１６及びその相
補ＤＮＡ鎖あるいはＤＮＡ鎖１〜１６及びその相補ＤＮ
Ａ鎖と少なくとも８塩基配列が同一であるＤＮＡ鎖の中
から選ばれる二種類のＤＮＡ鎖であり、かつコレラ毒素
遺伝子上で該ＤＮＡ鎖が結合する場合に該ＤＮＡ鎖の５
″末端が３′末端より外側になるように選ばれるＤＮＡ
鎖からなるコレラ毒素遺伝子増幅用ブライマーを要旨と
するものである。
補ＤＮＡ鎖あるいはＤＮＡ鎖１〜１６及びその相補ＤＮ
Ａ鎖と少なくとも８塩基配列が同一であるＤＮＡ鎖の中
から選ばれる二種類のＤＮＡ鎖であり、かつコレラ毒素
遺伝子上で該ＤＮＡ鎖が結合する場合に該ＤＮＡ鎖の５
″末端が３′末端より外側になるように選ばれるＤＮＡ
鎖からなるコレラ毒素遺伝子増幅用ブライマーを要旨と
するものである。
ＤＮＡ−１５°ＧＴＡＡＡＧＡＴＡＡ ＴＡＴＴＴＧ
ＴＧＴＴ ＴＴＴＴＡＴＴＴＴＣ３ＤＮＡ−２５“Ａ
ＴＧＡＴＡＡＧＴＴ ＡＴＡＴＣＧＧＧＣＡ ＧＡ
ＴＴＣＴＡＧＡＣＣＴＣＣＴ ３” ＤＮＡ−３５’ＣＴＣＡＧＡＣＧＧＧ ＡＴＴＴＧＴ
ＴＡＧＧ ＣＡＣＧ ３’ＤＮＡ−４５”ＧＧＣＡ
ＴＡＣＡＧＴ ＣＣＴＣＡＴＣＣＡＧ ＡＴＧＡＡ
ＣＡＡＧ八ＤＮＡ−５へ ５°ＧＣＴＴＴＡＧＧＴＧ
ＧＧＡＴＴＣＣＡＴＡ ＣＴＣＣＣＡ八 ３゛Ｄ
ＮＡ−６５’ＣＧＴＡＡＴＡＧＧＧ ＧＣＴＡＣＡＧＡ
ＧＡ ＴＡＧＡ ３ＤＮ＾−７５°ＡＧＴＡＡＣＴＴＡ
Ｇ ＡＴＡＴＴＧＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡ ３“ＤＮＡ
−８５“ＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＡＴＡＧＡＧＣＴＴＧ
ＧＡＧＧＧＡＡＧＡＧＣＣＧ ３’ ＤＮＡ−９５”ＧＣＣＧＧＧＴＴＧＴ ＧＧＧＡＡＴＧ
ＣＴＣＣＡＡＧＡＴＣＡ ３ＤＮＡ−１０５°ＡＡＡＡ
ＡＣＣＣＡＡ ＡＧＴＣＴＡＧＧＴＧ ＴＡＡＡＡ
ＴＴＣＣＴＴＧＡＣＧ ３’ ＤＮＡ−１１５″八ＴＣＴＧＡＴＡＴＴ ＧＡＴＡＣ
ＡＣＡＴＡ ＡＴＡＧＡＡＴＴＡＡＧ ３ ＤＮＡ−１２５°ＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡ ＡＴｙｒｃ
ｃｒｃｔｒ ＴＴＴＴＴＴＡＣＡＧＴ ３ ＤＮＡ−１３５’ＴＴＣＡＧＣＡＴＡＴ ＧＣＡＣＡ
ＴＧＧＡＡ ＣＡＣＣＴＣＡＡＡＡＴＡＴＴＡＣＴＧ
ＡＴ ＴＴＧＴＧＴＧＣＡＧ ＡＡＴＣＡＣＡ
３’ＤＮＡ−１４５°ＴＴＴＴＣＧＴＡＴＡ ＣＡＧ
ＡＡＴＣＴＣＴ ＡＧＣＴＧＧＡ ３ＤＮＡ−１５
５’ＡＴＧＧＴＧＣＡＡＴ ＴＴＴＴＣＡＡＧＴＡ
ＧＡＡＧＴＡＣＣＡＡＴ ３ ＤＮＡ−１６５’ＴＡＣＣＣＴＧＡＧＧ ＡＴＴＧＣ
ＡＴＡＴＣＴＴＡＣＴＧＡＡＧＣＴＡＡＡＧＴＣＧＡＡ
ＡＡＧ ３以下１本発明の詳細な説明する。
ＴＧＴＴ ＴＴＴＴＡＴＴＴＴＣ３ＤＮＡ−２５“Ａ
ＴＧＡＴＡＡＧＴＴ ＡＴＡＴＣＧＧＧＣＡ ＧＡ
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ＡＴＡＴＣＴＴＡＣＴＧＡＡＧＣＴＡＡＡＧＴＣＧＡＡ
ＡＡＧ ３以下１本発明の詳細な説明する。
本発明のブライマーは、上記したＤ Ｎ Ａ 鎖及びそ
の相補ＤＮＡ鎖の中から選ばれるＤ Ｎ Ａ 鎖と少な
くとも８塩基配列が同一である配列を含んでいればよい
。
の相補ＤＮＡ鎖の中から選ばれるＤ Ｎ Ａ 鎖と少な
くとも８塩基配列が同一である配列を含んでいればよい
。
また９本発明でいうコレラ毒素遺伝子の塩基配列として
は、ネイチャー、３０６巻、５５１〜５５７頁１９８３
年に記載された下記に示すものがあげられる。
は、ネイチャー、３０６巻、５５１〜５５７頁１９８３
年に記載された下記に示すものがあげられる。
前記の塩基配列には１本発明に用いられるＤＮＡ鎖１〜
１６が結合する部分も示している。
１６が結合する部分も示している。
本発明で用いられる二種類のＤＮＡ鎖は、コレラ毒素遺
伝子に結合した場合に、ＤＮＡ鎖の５゜末端が３“末端
より外側になるように選択される必要がある。
伝子に結合した場合に、ＤＮＡ鎖の５゜末端が３“末端
より外側になるように選択される必要がある。
本発明に用いられるＤＮＡ鎖は、任意の好適な方法１例
えばリン酸トリエステル法（Ｓ、Ａ、ナーランク、メソ
ド・イン・エンザイムオロジー６８巻、９０真、１９７
９年）などにより合成できるが、オートメーション化さ
れたミリジエン社やアプライド・バイオ・システム社の
ＤＮＡ合成装置によっても簡単に合成できる。
えばリン酸トリエステル法（Ｓ、Ａ、ナーランク、メソ
ド・イン・エンザイムオロジー６８巻、９０真、１９７
９年）などにより合成できるが、オートメーション化さ
れたミリジエン社やアプライド・バイオ・システム社の
ＤＮＡ合成装置によっても簡単に合成できる。
次に２本発明のプライマーを用いて、検体中のコレラ毒
素産生コレラ菌の検出方法を説明する。
素産生コレラ菌の検出方法を説明する。
サンプルの菌体を極微量（１０〜１００菌体）サンプル
チューブに摂取し、熱を加えることによりＤＮＡを変性
（−本鎖にする）させ、ｉ！当な条件下で本発明の一組
のプライマーにＤＮＡポリメラーゼを働かせる（酵素的
ＤＮＡ増幅法）、そしてサンプル菌体中に目的とするコ
レラ毒素遺伝子が存在すれば、二つのブライマーにより
決められる特定のサイズのＤＮＡが合成され、その合成
されたＤＮＡを電気泳動法で確認することにより、コレ
ラ毒素遺伝子の存在を知ることができる。より詳細には
下痢患者でコレラ菌が原因である疑いのある場合、患者
の便を直接バッファーに懸濁させその一部をサンプルと
するか、もしくは寒天培地に直接塗抹し一夜培養して生
じたコロニーをバッファーに懸濁させる。次に９４°Ｃ
で５分間煮沸しＤＮＡを変性させ、コレラ毒素遺伝子に
特異的なブライマーによりＤＮＡの増幅を行い、電気泳
動法により増幅されたＤＮＡのサイズを測定する。
チューブに摂取し、熱を加えることによりＤＮＡを変性
（−本鎖にする）させ、ｉ！当な条件下で本発明の一組
のプライマーにＤＮＡポリメラーゼを働かせる（酵素的
ＤＮＡ増幅法）、そしてサンプル菌体中に目的とするコ
レラ毒素遺伝子が存在すれば、二つのブライマーにより
決められる特定のサイズのＤＮＡが合成され、その合成
されたＤＮＡを電気泳動法で確認することにより、コレ
ラ毒素遺伝子の存在を知ることができる。より詳細には
下痢患者でコレラ菌が原因である疑いのある場合、患者
の便を直接バッファーに懸濁させその一部をサンプルと
するか、もしくは寒天培地に直接塗抹し一夜培養して生
じたコロニーをバッファーに懸濁させる。次に９４°Ｃ
で５分間煮沸しＤＮＡを変性させ、コレラ毒素遺伝子に
特異的なブライマーによりＤＮＡの増幅を行い、電気泳
動法により増幅されたＤＮＡのサイズを測定する。
もしもこの患者の便中にコレラ遺伝子を所有するコレラ
菌が含まれていれば電気泳動法により特定のサイズのＤ
ＮＡバンドが認められ、下痢がコレラ菌によることが判
る。
菌が含まれていれば電気泳動法により特定のサイズのＤ
ＮＡバンドが認められ、下痢がコレラ菌によることが判
る。
（実施例）
以下１本発明を実施例によって具体的に説明する。
実施例１
本実施例は２本発明を用いてコレラ毒素産生能のある菌
体を検出しようとするものである。次のヌクレオチド配
列を有する２４塩基の２種類のプライマー ５’ＧＧＣＡＴＡＣＡＧＴ ＣＣＴＣＡＴＣＣＡＧ
ＡＴＧＡ ３’５’ＴＧＧＡＧＣＡＴＴＣＣＣＡＣ
ＡＡＣＣＣＧ ＧＣＧＧ ３’は、ミリジエン社のＤＮ
Ａ合成装置により合成した。サンプルは大阪国際空港検
疫所で分離された患者由来のコレラ菌２０株で、それぞ
れ分離培養後ストックしていたものを用いた。ＤＮＡ増
幅の条件は１０ｍＭ ）リス−ＨＣｌ （ｐＨ８，
５）５０ｍＭ ＫＣＩ、１．５ｍＭ ＭｇＣ１，，
０，０１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン、２００μＭ ｄＡＴ
Ｐ。
体を検出しようとするものである。次のヌクレオチド配
列を有する２４塩基の２種類のプライマー ５’ＧＧＣＡＴＡＣＡＧＴ ＣＣＴＣＡＴＣＣＡＧ
ＡＴＧＡ ３’５’ＴＧＧＡＧＣＡＴＴＣＣＣＡＣ
ＡＡＣＣＣＧ ＧＣＧＧ ３’は、ミリジエン社のＤＮ
Ａ合成装置により合成した。サンプルは大阪国際空港検
疫所で分離された患者由来のコレラ菌２０株で、それぞ
れ分離培養後ストックしていたものを用いた。ＤＮＡ増
幅の条件は１０ｍＭ ）リス−ＨＣｌ （ｐＨ８，
５）５０ｍＭ ＫＣＩ、１．５ｍＭ ＭｇＣ１，，
０，０１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン、２００μＭ ｄＡＴ
Ｐ。
２００μＭ ｄＴＴＰ、２００ｕＭ ｄＣＴＰ。
２００μＭ ｄＧＴＰ、１μＭおよび 各ブライマー
を含む反応１１００μ！にそれぞれの菌体を懸濁し、９
４°Ｃで５分間煮沸させ菌体の破砕および２本鎖ＤＮＡ
の１本鎖への変性を行った。次に卓上遠心機により２０
秒間遠心分離を行い、２．５単位のタンクＤＮＡポリメ
ラーゼ（シータス社）を加え、さらにサンプルの蒸発を
おさえるために５０ＩＩｌのパラフィンオイルを加えた
。自動恒温槽はコイ・ラボラトリ−社のテンプサイクラ
−を用いた。ＰＣＲの条件はまず９４°Ｃで１分間煮沸
し、鋳型であるコレラ菌の染色体ＤＮＡを一本鎖に変性
し１次に６５°Ｃで１分３０秒間変性した染色体ＤＮＡ
にプライマーを結合（アニーリング）させ、７２°Ｃで
１分３０秒間タックＤＮＡポリメラーゼにより伸張反応
を行った。以下３合計３５サイクル増幅を行い、増幅反
応終了後１反応液の１／Ｉ ０！である１０μ！を５％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により展開し、エチジ
ウムブロマイドで染色後、ＵＶ照射により増幅したＤＮ
Ａバンドの有無およびサイズを確認した。その結果図１
に示すようにコロニーハイブリダイゼーションによりコ
レラ毒素遺伝子プローブと陽性反応を呈したサンプルは
すべて２６８塩基対の増幅ＤＮＡバンドが確認され、双
方の結果が完全に一致し。
を含む反応１１００μ！にそれぞれの菌体を懸濁し、９
４°Ｃで５分間煮沸させ菌体の破砕および２本鎖ＤＮＡ
の１本鎖への変性を行った。次に卓上遠心機により２０
秒間遠心分離を行い、２．５単位のタンクＤＮＡポリメ
ラーゼ（シータス社）を加え、さらにサンプルの蒸発を
おさえるために５０ＩＩｌのパラフィンオイルを加えた
。自動恒温槽はコイ・ラボラトリ−社のテンプサイクラ
−を用いた。ＰＣＲの条件はまず９４°Ｃで１分間煮沸
し、鋳型であるコレラ菌の染色体ＤＮＡを一本鎖に変性
し１次に６５°Ｃで１分３０秒間変性した染色体ＤＮＡ
にプライマーを結合（アニーリング）させ、７２°Ｃで
１分３０秒間タックＤＮＡポリメラーゼにより伸張反応
を行った。以下３合計３５サイクル増幅を行い、増幅反
応終了後１反応液の１／Ｉ ０！である１０μ！を５％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により展開し、エチジ
ウムブロマイドで染色後、ＵＶ照射により増幅したＤＮ
Ａバンドの有無およびサイズを確認した。その結果図１
に示すようにコロニーハイブリダイゼーションによりコ
レラ毒素遺伝子プローブと陽性反応を呈したサンプルは
すべて２６８塩基対の増幅ＤＮＡバンドが確認され、双
方の結果が完全に一致し。
本発明によりコレラ毒素産生能のある菌体が検出可能で
あることが示された。
あることが示された。
実施例２
本実施例は１本発明を用いたコレラ毒素産生能のある菌
体の検出限界を求めるものである。プライマーは ５“ＣＴＣＡＧＡＣＧＧＧ ＡＴＴＴＧＴＴＡＧＧ
ＣＡＣＧ ３″５’ＴＣＴＡＴＣＴＣＴＧ ＴＡ
ＧＣＣＣＣＴＡＴ ＴＡＣＧ ３″を用いた。菌体
は、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒ
ａｅ）０１ ６１Ｈ−１５１株を１％トリプトン、０．
５％酵母エキス、１％ＮａｃＩ！、ｐＨ７，０を含む培
地で６時間振とう培養したものを、同培地で希釈し平板
寒天培地に植菌し生菌数を求めた。その生菌数に基づき
、１０μｌ中に１．１０，１０２．１０’、１０’
１０５菌体を含むサンプルを調製した。菌体の破砕お
よびＤＮＡの変性は凍結していたサンプルを融解させ、
９４°Ｃで３分間煮沸する方法を用いた。ＤＮＡ増幅の
条件は実施例１に従い、３０および４０サイクルの増幅
を行った。その結果、３０サイクルでは数十菌体、４０
サイクルでは数菌体が検出でき（図２）２本発明が高感
度であることが示された。
体の検出限界を求めるものである。プライマーは ５“ＣＴＣＡＧＡＣＧＧＧ ＡＴＴＴＧＴＴＡＧＧ
ＣＡＣＧ ３″５’ＴＣＴＡＴＣＴＣＴＧ ＴＡ
ＧＣＣＣＣＴＡＴ ＴＡＣＧ ３″を用いた。菌体
は、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒ
ａｅ）０１ ６１Ｈ−１５１株を１％トリプトン、０．
５％酵母エキス、１％ＮａｃＩ！、ｐＨ７，０を含む培
地で６時間振とう培養したものを、同培地で希釈し平板
寒天培地に植菌し生菌数を求めた。その生菌数に基づき
、１０μｌ中に１．１０，１０２．１０’、１０’
１０５菌体を含むサンプルを調製した。菌体の破砕お
よびＤＮＡの変性は凍結していたサンプルを融解させ、
９４°Ｃで３分間煮沸する方法を用いた。ＤＮＡ増幅の
条件は実施例１に従い、３０および４０サイクルの増幅
を行った。その結果、３０サイクルでは数十菌体、４０
サイクルでは数菌体が検出でき（図２）２本発明が高感
度であることが示された。
実施例３
本実施例は本発明によるブライマーの特異性を求めたも
のである。コレラ毒素（ＣＴ）と遺伝子レベルで約８０
％の相同性のある毒素原性大腸菌の易熱性エンテロトキ
シン（ＬＴ）を２組のブライマーを用いて増幅した。用
いたブライマーは本発明による ５’ＡＡＣＴＴＡＧＡＴＡ ＴＴＧＣＴＣＣＡＧＣＡＧ
ＣＡ ３’ （ＣＴ １ ）５’ＴＧＡＧＧＴＧＴＴ
ＣＣＡＴＧＴＧＣＡＴＡ ＴＧＣＴ ３’ （
ＣＴ ２ ）と比較のために以下のものを用いた。
のである。コレラ毒素（ＣＴ）と遺伝子レベルで約８０
％の相同性のある毒素原性大腸菌の易熱性エンテロトキ
シン（ＬＴ）を２組のブライマーを用いて増幅した。用
いたブライマーは本発明による ５’ＡＡＣＴＴＡＧＡＴＡ ＴＴＧＣＴＣＣＡＧＣＡＧ
ＣＡ ３’ （ＣＴ １ ）５’ＴＧＡＧＧＴＧＴＴ
ＣＣＡＴＧＴＧＣＡＴＡ ＴＧＣＴ ３’ （
ＣＴ ２ ）と比較のために以下のものを用いた。
５’ＴＧＡＣＣＧＡＴＡＣＴＣＡＡＴＧ八八ＴＡＴへへ
（ＣＴ３）５″ＴＡＴＧＡＡＴＣＣＣＡＣＣＴ
ＣＣＣＧＣＡ ＧＡＡ ３° （ＣＴ４）増幅条件は実
施例１．２に従った。その結果プライマーＣＴ３ Ｃ
Ｔ４ではＬＴ遺伝子とＣＴ遺伝子の区別ができずＬＴ遺
伝子を増幅したが１本発明によるブライマーＣＴ１．Ｃ
Ｔ２ではＬＴを増幅せず、ＣＴと区別が可能で特異性も
高いことが示された（図３）。
（ＣＴ３）５″ＴＡＴＧＡＡＴＣＣＣＡＣＣＴ
ＣＣＣＧＣＡ ＧＡＡ ３° （ＣＴ４）増幅条件は実
施例１．２に従った。その結果プライマーＣＴ３ Ｃ
Ｔ４ではＬＴ遺伝子とＣＴ遺伝子の区別ができずＬＴ遺
伝子を増幅したが１本発明によるブライマーＣＴ１．Ｃ
Ｔ２ではＬＴを増幅せず、ＣＴと区別が可能で特異性も
高いことが示された（図３）。
（発明の効果）
本発明によれば、従来の分離培養法や、ＤＮＡの精製を
必要とした酵素的ＤＮＡ増幅法に比べ短時間（４〜５時
間）にコレラ菌が検出できる。また菌体を直接用いた検
査が可能なため、極微量のコレラ菌も検出可能である。
必要とした酵素的ＤＮＡ増幅法に比べ短時間（４〜５時
間）にコレラ菌が検出できる。また菌体を直接用いた検
査が可能なため、極微量のコレラ菌も検出可能である。
さらにコレラ毒素遺伝子を増幅するブライマーを用いて
いるので２食品中に存在する毒素産生能のないコレラ菌
は検出せず、毒素産生能のありなしが判定でき、産業上
非常に有用である。
いるので２食品中に存在する毒素産生能のないコレラ菌
は検出せず、毒素産生能のありなしが判定でき、産業上
非常に有用である。
第１図は、コロニーハイブリダイゼーション法と本手法
の結果が対応することを確認した実験である。コロニー
ハイブリダイゼーション法によりコレラ毒素遺伝子と陽
性反応を呈したものを士。 陰性反応を呈したものを−で示しである。画布の矢印は
本手法による増幅ＤＮＡハンド２６８塩基対を示す。コ
ロニーハイブリダイゼーション法と本手法の結果がすべ
て一敗している。 第２図は、菌体を直接用いての検出限界を示したもので
ある。左が３０サイクル、右が４０サイクルで上側に菌
体数を示している。３０サイクルでは数十菌体、４０サ
イクルでは数菌体のサンプルが検出可能である。 第３図は、ブライマーの特異性を調べたものである。１
．はブライマーＣＴ３．ＣＴ４によるＰＣＲＴ：ｃＴと
ＬＴの区別はつかず、ＬＴを増幅している。２．は本発
明によるブライマーＣＴＩ、ＣＴ２によるＰＣＲで、こ
れらのブライマーの組合せではＬＴを検出せず、特異性
が高いことが示されている。
の結果が対応することを確認した実験である。コロニー
ハイブリダイゼーション法によりコレラ毒素遺伝子と陽
性反応を呈したものを士。 陰性反応を呈したものを−で示しである。画布の矢印は
本手法による増幅ＤＮＡハンド２６８塩基対を示す。コ
ロニーハイブリダイゼーション法と本手法の結果がすべ
て一敗している。 第２図は、菌体を直接用いての検出限界を示したもので
ある。左が３０サイクル、右が４０サイクルで上側に菌
体数を示している。３０サイクルでは数十菌体、４０サ
イクルでは数菌体のサンプルが検出可能である。 第３図は、ブライマーの特異性を調べたものである。１
．はブライマーＣＴ３．ＣＴ４によるＰＣＲＴ：ｃＴと
ＬＴの区別はつかず、ＬＴを増幅している。２．は本発
明によるブライマーＣＴＩ、ＣＴ２によるＰＣＲで、こ
れらのブライマーの組合せではＬＴを検出せず、特異性
が高いことが示されている。
Claims (2)
- （１）下記のＤＮＡ鎖１〜１６及びその相補ＤＮＡ鎖の
中から選ばれる二種類のＤＮＡ鎖であり、かつコレラ毒
素遺伝子上で該ＤＮＡ鎖が結合する場合に該ＤＮＡ鎖の
５’末端が３’末端より外側になるように選ばれるＤＮ
Ａ鎖からなるコレラ毒素遺伝子増幅用プライマー。 【遺伝子配列があります】 - （２）請求項１記載のＤＮＡ鎖１〜１６及びその相補Ｄ
ＮＡ鎖と少なくとも８塩基配列が同一であるＤＮＡ鎖の
中から選ばれる二種類のＤＮＡ鎖であり、かつコレラ毒
素遺伝子上で該ＤＮＡ鎖が結合する場合に該ＤＮＡ鎖の
５’末端が３’末端より外側になるように選ばれるＤＮ
Ａ鎖からなるコレラ毒素遺伝子増幅用プライマー。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2219523A JPH0499488A (ja) | 1990-08-20 | 1990-08-20 | 遺伝子増幅用プライマー |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2219523A JPH0499488A (ja) | 1990-08-20 | 1990-08-20 | 遺伝子増幅用プライマー |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0499488A true JPH0499488A (ja) | 1992-03-31 |
Family
ID=16736815
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2219523A Pending JPH0499488A (ja) | 1990-08-20 | 1990-08-20 | 遺伝子増幅用プライマー |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0499488A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH078279A (ja) * | 1993-06-15 | 1995-01-13 | Shimadzu Corp | コレラ菌検出用オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
| EP0669399A2 (en) * | 1994-02-28 | 1995-08-30 | Shimadzu Corporation | Oligonucleotides and method for detecting bacteria |
-
1990
- 1990-08-20 JP JP2219523A patent/JPH0499488A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH078279A (ja) * | 1993-06-15 | 1995-01-13 | Shimadzu Corp | コレラ菌検出用オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
| EP0669399A2 (en) * | 1994-02-28 | 1995-08-30 | Shimadzu Corporation | Oligonucleotides and method for detecting bacteria |
| US5795717A (en) * | 1994-02-28 | 1998-08-18 | Shimadzu Corporation | Oligonucleotides for detecting bacteria and detection process |
| EP1036846A2 (en) * | 1994-02-28 | 2000-09-20 | Shimadzu Corporation | Oligonucleotides for detecting bacteria and detection process |
| EP1036846A3 (en) * | 1994-02-28 | 2000-10-18 | Shimadzu Corporation | Oligonucleotides for detecting bacteria and detection process |
| US6218110B1 (en) | 1994-02-28 | 2001-04-17 | Shimadzu Corporation | Oligonucleotides for detecting verotoxin-producing E. coli and detection process |
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