JPH0789958B2 - サルモネラ菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
サルモネラ菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法Info
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- JPH0789958B2 JPH0789958B2 JP18568389A JP18568389A JPH0789958B2 JP H0789958 B2 JPH0789958 B2 JP H0789958B2 JP 18568389 A JP18568389 A JP 18568389A JP 18568389 A JP18568389 A JP 18568389A JP H0789958 B2 JPH0789958 B2 JP H0789958B2
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、臨床検査、殊に食中毒検査、または食品検出
において、Salmonella菌（Salmonella属に属する菌）を
検出する。
において、Salmonella菌（Salmonella属に属する菌）を
検出する。
［従来の技術と問題点］ 検査材料が患者の嘔吐物、糞便、食品または拭き取り材
料の場合、Salmonella菌と同定するまでには、増菌培
養、確認培養に至る操作を行わなければならない。各培
養段階に要する時間は、18〜24時間であり総所要時間に
すると約２日間となり、長時間を要する。確認培養で
は、TSI寒天、SIM培地、VP−MR培地およびリシン脱炭酸
テスト用培地に接種し、37℃で一晩培養する。したがっ
て、時間ならびに費用がかかり、操作的にも煩雑であ
る。
料の場合、Salmonella菌と同定するまでには、増菌培
養、確認培養に至る操作を行わなければならない。各培
養段階に要する時間は、18〜24時間であり総所要時間に
すると約２日間となり、長時間を要する。確認培養で
は、TSI寒天、SIM培地、VP−MR培地およびリシン脱炭酸
テスト用培地に接種し、37℃で一晩培養する。したがっ
て、時間ならびに費用がかかり、操作的にも煩雑であ
る。
一方、最近では、オリゴヌクレオチドを用いたDNAプロ
ーブ法あるいはハイブリダイゼーション法が試みられる
ようになってきた。しかし、オリゴヌクレオチドを標識
修飾したプローブにより、膜上、あるいは他の支持体上
でハイブリダイゼーションを行い、これを検出する場
合、細菌検査において十分な検出感度と選択性を得るの
が難しい。
ーブ法あるいはハイブリダイゼーション法が試みられる
ようになってきた。しかし、オリゴヌクレオチドを標識
修飾したプローブにより、膜上、あるいは他の支持体上
でハイブリダイゼーションを行い、これを検出する場
合、細菌検査において十分な検出感度と選択性を得るの
が難しい。
［発明の目的］ 本発明は、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応のプライ
マーとして用いた遺伝子増幅技術によりSalmonella菌由
来の核酸を検出するもので、簡便、迅速かつ高感度なSa
lmonella菌の検査法を提供することにある。
マーとして用いた遺伝子増幅技術によりSalmonella菌由
来の核酸を検出するもので、簡便、迅速かつ高感度なSa
lmonella菌の検査法を提供することにある。
［問題点を解決するための手段および作用］ 本発明は、オリゴヌクレオチドをプライマーとして機能
させた遺伝子増幅法によりSalmonella菌を選択的に検出
することを特徴としている。ここで、本発明のオリゴヌ
クレオチドは、本発明者の当該分野におけるこれまでの
幅広い経験と総合的な知識の集積から、先ず次の〜
の観点に基づき望ましい塩基配列を絞り込み、 標的遺伝子（すなわち検出されるべき遺伝子）が、当
該菌種に特有の病原因子の遺伝子であること それぞれオリゴヌクレオチドを適当に組合わせて遺伝
子増幅法のプライマーとして使用する場合に、その増幅
領域の大きさが200〜500bp程度であること。
させた遺伝子増幅法によりSalmonella菌を選択的に検出
することを特徴としている。ここで、本発明のオリゴヌ
クレオチドは、本発明者の当該分野におけるこれまでの
幅広い経験と総合的な知識の集積から、先ず次の〜
の観点に基づき望ましい塩基配列を絞り込み、 標的遺伝子（すなわち検出されるべき遺伝子）が、当
該菌種に特有の病原因子の遺伝子であること それぞれオリゴヌクレオチドを適当に組合わせて遺伝
子増幅法のプライマーとして使用する場合に、その増幅
領域の大きさが200〜500bp程度であること。
それぞれのオリゴヌクレオチドが19〜25個程度の塩基
からなり、そのうちのＧおよびＣの構成比が50％程度で
あること それぞれのオリゴヌクレオチドの塩基配列が他菌を有
する塩基配列とホモロジーを有しないこと Tm（℃）が特定温度以上であること（但し、Tmとは、
オリゴヌクレオチドと標的遺伝子とのハイブリッドの半
分量が解離する温度で、ハイブリッドの安定性を示す指
標となる） 次に選び出したオリゴヌクレオチドを組合わせて遺伝子
増幅法のプライマーとし、遺伝子増幅法およびアガロー
スゲル電気泳動法を用いて、その選択性について検討し
て決定した。遺伝子増幅の方法については、Saikiら
が、開発したPolymerase Chain Reaction法（以下、略
してPCR法;Science.230,1350（1985））をもとに行って
いる。この方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域
（本発明の場合はSalmonella菌のara C遺伝子）を検出
する場合、その領域の両端の一方は＋鎖を他方は−鎖を
それぞれ認識してハイブリダイゼーションするようなオ
リゴヌクレオチドを用意し、それを熱変性により１本鎖
状態にした試料核酸に対し鋳型依存性ヌクレオチド重合
反応のプライマーとして機能させ、生成した２本鎖核酸
を再び１本鎖に分離し、再び、同様な反応を起こさせ
る。この一連の操作を繰り返すことにより２つのプライ
マーにはさまれた領域は検出できるまでにコピー数が増
大してくる。検体としては、臨床検査材料、例えば、糞
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をPCRの試料として用いるに
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。しかし、プライマーがハ
イブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存在
すればPCRは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面活性
剤、アルカリ等で短時間処理するだけでPCR反応を進行
させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。本
発明でプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチド
は、選択性や検出感度および再現性から考えて、10塩基
以上、望ましくは15塩基以上の長さを持った核酸フラグ
メントで、化学合成あるいは天然のどちらでもよい。ま
た、プライマーは、特に検出用として標識されていなく
てもよい。プライマーが規定しているSalmonella菌のar
a C遺伝子の増幅領域は、50塩基から2,000塩基、望まし
くは、100塩基から1,000塩基となればよい。鋳型依存性
ヌクレオチド重合反応には、耐熱性DNAポリメラーゼを
用いているが、この酵素の起源については90〜95℃の温
度で活性を保持していれば、どの生物種由来でもよい。
熱変性温度は、90〜95℃、プライマーをハイブリダイズ
させるアニーリング操作の温度は37〜65℃、重合反応は
50〜75℃で、これを１サイクルとしたPCR反応を20から4
2サイクル行って増幅させる。検出は酵素反応液をその
まま、アガロースゲル電気泳動にかけることで増幅され
たヌクレオチド断片の存在およびその長さが確認でき
る。その結果から、検体中に、目的とするヌクレオチド
が存在しているかどうか判定することができる。この判
定はそのままSalmonella菌の有無を判定するものとな
る。増幅されたヌクレオチド断片の検出には、その他の
電気泳動やクロマトグラフィーも有効である。
からなり、そのうちのＧおよびＣの構成比が50％程度で
あること それぞれのオリゴヌクレオチドの塩基配列が他菌を有
する塩基配列とホモロジーを有しないこと Tm（℃）が特定温度以上であること（但し、Tmとは、
オリゴヌクレオチドと標的遺伝子とのハイブリッドの半
分量が解離する温度で、ハイブリッドの安定性を示す指
標となる） 次に選び出したオリゴヌクレオチドを組合わせて遺伝子
増幅法のプライマーとし、遺伝子増幅法およびアガロー
スゲル電気泳動法を用いて、その選択性について検討し
て決定した。遺伝子増幅の方法については、Saikiら
が、開発したPolymerase Chain Reaction法（以下、略
してPCR法;Science.230,1350（1985））をもとに行って
いる。この方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域
（本発明の場合はSalmonella菌のara C遺伝子）を検出
する場合、その領域の両端の一方は＋鎖を他方は−鎖を
それぞれ認識してハイブリダイゼーションするようなオ
リゴヌクレオチドを用意し、それを熱変性により１本鎖
状態にした試料核酸に対し鋳型依存性ヌクレオチド重合
反応のプライマーとして機能させ、生成した２本鎖核酸
を再び１本鎖に分離し、再び、同様な反応を起こさせ
る。この一連の操作を繰り返すことにより２つのプライ
マーにはさまれた領域は検出できるまでにコピー数が増
大してくる。検体としては、臨床検査材料、例えば、糞
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をPCRの試料として用いるに
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。しかし、プライマーがハ
イブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存在
すればPCRは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面活性
剤、アルカリ等で短時間処理するだけでPCR反応を進行
させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。本
発明でプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチド
は、選択性や検出感度および再現性から考えて、10塩基
以上、望ましくは15塩基以上の長さを持った核酸フラグ
メントで、化学合成あるいは天然のどちらでもよい。ま
た、プライマーは、特に検出用として標識されていなく
てもよい。プライマーが規定しているSalmonella菌のar
a C遺伝子の増幅領域は、50塩基から2,000塩基、望まし
くは、100塩基から1,000塩基となればよい。鋳型依存性
ヌクレオチド重合反応には、耐熱性DNAポリメラーゼを
用いているが、この酵素の起源については90〜95℃の温
度で活性を保持していれば、どの生物種由来でもよい。
熱変性温度は、90〜95℃、プライマーをハイブリダイズ
させるアニーリング操作の温度は37〜65℃、重合反応は
50〜75℃で、これを１サイクルとしたPCR反応を20から4
2サイクル行って増幅させる。検出は酵素反応液をその
まま、アガロースゲル電気泳動にかけることで増幅され
たヌクレオチド断片の存在およびその長さが確認でき
る。その結果から、検体中に、目的とするヌクレオチド
が存在しているかどうか判定することができる。この判
定はそのままSalmonella菌の有無を判定するものとな
る。増幅されたヌクレオチド断片の検出には、その他の
電気泳動やクロマトグラフィーも有効である。
［実施例］ （実施例１） 検体の調製 Salmonella菌は表１の縦の見出しに示した７菌種14株を
用いてそれぞれを適当な増菌培地に接種し、37℃、好気
的条件下で終夜培養を行い、その培地、1.5mlから遠心
操作により菌体を回収した。10mMトリス−塩酸緩衝液
（pH7.5）で１回洗浄後、同緩衝液にリゾチームを1mg/m
lとなるように溶かした液、0.5mlで懸濁させ、37℃、10
分で溶菌させた。溶菌液に前記緩衝液で飽和させたフェ
ノールを同容量加え、よく撹はんした。遠心後、上層液
を回収し、エタノール沈澱処理を行って核酸成分を沈澱
させ、その沈澱物を前記緩衝液、1mlに溶かして、これ
を検体とした。
用いてそれぞれを適当な増菌培地に接種し、37℃、好気
的条件下で終夜培養を行い、その培地、1.5mlから遠心
操作により菌体を回収した。10mMトリス−塩酸緩衝液
（pH7.5）で１回洗浄後、同緩衝液にリゾチームを1mg/m
lとなるように溶かした液、0.5mlで懸濁させ、37℃、10
分で溶菌させた。溶菌液に前記緩衝液で飽和させたフェ
ノールを同容量加え、よく撹はんした。遠心後、上層液
を回収し、エタノール沈澱処理を行って核酸成分を沈澱
させ、その沈澱物を前記緩衝液、1mlに溶かして、これ
を検体とした。
プライマーの合成 Salmonella菌のara C遺伝子の塩基配列（Clarke,P.,et
al.;Gene l8,157−163（1982）から、特許請求範囲第１
項に示した配列を選び、それと同じ配列を持つオリゴヌ
クレオチドを化学合成した。化学合成は島津DNA合成機N
S−１を用い、トリエステル法により行った。合成した
ヌクレオチド断片の精製はC18逆相カラムを用いて行っ
た。
al.;Gene l8,157−163（1982）から、特許請求範囲第１
項に示した配列を選び、それと同じ配列を持つオリゴヌ
クレオチドを化学合成した。化学合成は島津DNA合成機N
S−１を用い、トリエステル法により行った。合成した
ヌクレオチド断片の精製はC18逆相カラムを用いて行っ
た。
PCR 前記検体液を３μｌを用いそれに滅菌蒸留水16.05μ
ｌ、10×反応用バッファー３μｌ、dNTP溶液4.8μｌ、
プライマー（１）1.5μｌ、プライマー（２）1.5μｌそ
して耐熱性DNAポリメラーゼ0.15μｌを加え、30μｌの
反応液を調製した。この反応液の入った容器にミネラル
オイル（SIGMA社製）を50μｌ加え反応液上に重層す
る。各添加された液の内容を下記に示す。
ｌ、10×反応用バッファー３μｌ、dNTP溶液4.8μｌ、
プライマー（１）1.5μｌ、プライマー（２）1.5μｌそ
して耐熱性DNAポリメラーゼ0.15μｌを加え、30μｌの
反応液を調製した。この反応液の入った容器にミネラル
オイル（SIGMA社製）を50μｌ加え反応液上に重層す
る。各添加された液の内容を下記に示す。
10×反応用バッファー:500mM KCl,100mM Tris−HCl
（pH8.3）,15mM MgCl2,0.1％（w/v）ゼラチン dNTP溶液:dATP,dCTP,dGTP,dTTPを混合させたもので、各
終濃度が1.25mM プライマー（１）および（２）：前述した化学合成精製
品の各水溶液（50DU/ml） プライマーの組合せは、特許請求範囲第２項に示した配
列（（ａ）〜（ｃ））より、次の組合せを用いた。プライマー（１）＋プライマー（２） （ａ） ＋ （ｂ） （ａ） ＋ （ｃ） 耐熱性DNAポリメラーゼ:Taq DNAポリメラーゼ（5unit/
ml;Perkin Elmer Cetus社製） 反応条件は、次の通りである。
（pH8.3）,15mM MgCl2,0.1％（w/v）ゼラチン dNTP溶液:dATP,dCTP,dGTP,dTTPを混合させたもので、各
終濃度が1.25mM プライマー（１）および（２）：前述した化学合成精製
品の各水溶液（50DU/ml） プライマーの組合せは、特許請求範囲第２項に示した配
列（（ａ）〜（ｃ））より、次の組合せを用いた。プライマー（１）＋プライマー（２） （ａ） ＋ （ｂ） （ａ） ＋ （ｃ） 耐熱性DNAポリメラーゼ:Taq DNAポリメラーゼ（5unit/
ml;Perkin Elmer Cetus社製） 反応条件は、次の通りである。
熱変性:94℃ １分 アニーリング:37℃ １分 重合反応:60℃ １分 熱変性からアニーリングを経て重合反応に至る過程を１
サイクル（所要時間5.7分）とし、これを42サイクル
（総所要時間約４時間）行った。これらの操作は、Perk
in Elmer Cetus社製DNA Thermal Cyclerに上記反応条件
をプログラムすることで行った。
サイクル（所要時間5.7分）とし、これを42サイクル
（総所要時間約４時間）行った。これらの操作は、Perk
in Elmer Cetus社製DNA Thermal Cyclerに上記反応条件
をプログラムすることで行った。
検出 反応液から、増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロース電気泳動を以下の様に行った。
め、アガロース電気泳動を以下の様に行った。
アガロースゲルはゲル濃度２％（w/v）とし、臭化エチ
ジウム（0.5μg/ml）を含むものを用いた。泳動の電気
的条件は、定電圧100V、時間は30分行った。操作方法な
らびに他の条件はManiatis等、Molecular Cloning（198
2）に記載されている技法で行った。反応液の他に分子
量マーカーの泳動も、同時に行い、相対移動度の比較に
より、ヌクレオチド断片の長さを算出した。
ジウム（0.5μg/ml）を含むものを用いた。泳動の電気
的条件は、定電圧100V、時間は30分行った。操作方法な
らびに他の条件はManiatis等、Molecular Cloning（198
2）に記載されている技法で行った。反応液の他に分子
量マーカーの泳動も、同時に行い、相対移動度の比較に
より、ヌクレオチド断片の長さを算出した。
結果 前述したように、ara C遺伝子は、すでに塩基配列が決
定されており、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわ
ち、プライマーがPCRにより、増幅させてくるヌクレオ
チドの大きさは推定できる。それによると、プライマー
（ａ）と（ｂ）では、329塩基、（ａ）と（ｃ）では、5
39塩基の長さのヌクレオチドが増幅されてくるはずであ
る。表１に示した数値は、上記方法で増幅されてきたヌ
クレオチドの長さを測定した結果で、単位はキロ塩基対
である。同表からわかるように、各プライマーの組合せ
とも、推定されたヌクレオチドの長さと一致しており、
これらが、ara C遺伝子の標的としている領域を正しく
増幅してきていることを示している。
定されており、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわ
ち、プライマーがPCRにより、増幅させてくるヌクレオ
チドの大きさは推定できる。それによると、プライマー
（ａ）と（ｂ）では、329塩基、（ａ）と（ｃ）では、5
39塩基の長さのヌクレオチドが増幅されてくるはずであ
る。表１に示した数値は、上記方法で増幅されてきたヌ
クレオチドの長さを測定した結果で、単位はキロ塩基対
である。同表からわかるように、各プライマーの組合せ
とも、推定されたヌクレオチドの長さと一致しており、
これらが、ara C遺伝子の標的としている領域を正しく
増幅してきていることを示している。
（実施例２） 実施例１で得られた結果が、Salmonella菌に対し選択的
なものか確かめるため、臨床検査においてSalmonella菌
以外で検査対象となり得る菌種について比較検討した。
なものか確かめるため、臨床検査においてSalmonella菌
以外で検査対象となり得る菌種について比較検討した。
方法は、実施例１に示したものと同じであるが、
（２），（６），（18）の株については嫌気的条件下、
40℃で終夜培養を行い、PCR法に適用しうる試料を調製
してきた。検体の調製において培養した菌は、表２の縦
の見出しに示した11菌株である。また、ヒト胎盤由来DN
Aは１μg/mlの濃度のものを調製し、これも同様にPCRを
行わせた。
（２），（６），（18）の株については嫌気的条件下、
40℃で終夜培養を行い、PCR法に適用しうる試料を調製
してきた。検体の調製において培養した菌は、表２の縦
の見出しに示した11菌株である。また、ヒト胎盤由来DN
Aは１μg/mlの濃度のものを調製し、これも同様にPCRを
行わせた。
結果を表２に示す。表１と同様、欄内の数値の単位はキ
ロ塩基対である。一部の菌種においてPCRの副次的産物
とみられる。増幅されたヌクレオチド断片が検出された
が、どれもara C遺伝子の塩基配列から推定されるヌク
レオチド断片の長さとは異なっている。Salmonella菌と
同じara C遺伝子をこれらの菌種が持っていれば実施例
１の結果と同じ長さのヌクレオチドがはずである。従っ
て、これらの菌種由来の増幅されたヌクレオチド断片は
ara C遺伝子を認識して生成されたものではないことが
明かであり、Salmonella菌とは容易に区別し、検出でき
ることがわかる。なお、本発明の実施例にに用いている
アガロース電気泳動を前述の泳動条件で行えば100塩基
対以下の範囲であれば５から10塩基対、100から500塩基
対の範囲であれば10から20塩基対のヌクレオチドの長さ
の違いを区別することがでる。さらに、アクリルアミド
などをゲルに用いることでヌクレオチドの長さの測定の
精度を向上させれば、選択的検出における信頼度はさら
に高まるものと考えられる。
ロ塩基対である。一部の菌種においてPCRの副次的産物
とみられる。増幅されたヌクレオチド断片が検出された
が、どれもara C遺伝子の塩基配列から推定されるヌク
レオチド断片の長さとは異なっている。Salmonella菌と
同じara C遺伝子をこれらの菌種が持っていれば実施例
１の結果と同じ長さのヌクレオチドがはずである。従っ
て、これらの菌種由来の増幅されたヌクレオチド断片は
ara C遺伝子を認識して生成されたものではないことが
明かであり、Salmonella菌とは容易に区別し、検出でき
ることがわかる。なお、本発明の実施例にに用いている
アガロース電気泳動を前述の泳動条件で行えば100塩基
対以下の範囲であれば５から10塩基対、100から500塩基
対の範囲であれば10から20塩基対のヌクレオチドの長さ
の違いを区別することがでる。さらに、アクリルアミド
などをゲルに用いることでヌクレオチドの長さの測定の
精度を向上させれば、選択的検出における信頼度はさら
に高まるものと考えられる。
［発明の効果］ 本発明では、PCR法を用いたことで、Salmonella菌の検
出において、遺伝子増幅作用による高い検出感度と、２
つあるいは、それ以上のプライマーで反応が規定される
ことによる高い選択性を得ることができる。また、高い
検出感度のため、多量の検体を必要とせず、検体の前処
理が簡便で済む。しかも、反応時間が短く、検出も簡単
な機材だけで済み、操作も容易なため同定までの時間を
大幅に短縮できる。以下の実施例に示すが、反応時間が
４時間、検出にかかる操作が30分である。また、検出に
アガロースゲル電気泳動と臭化エチジウムによる核酸染
色法をもちいることで、プライマー等に標識せずに検出
が行え、しかも、核酸の長さが確認できるので結果の信
頼性が高いものとなる。Salmonella菌のara C遺伝子
は、Salmonella属に属する全ての菌株に普遍的に存在し
ていると考えらる。したがって、この遺伝子を標的とす
ることでSalmonella属菌種を一括して検出することがで
きる。一方、ヌクレオチド配列における他の生物種のar
a C遺伝子とは相同性が少ないことからSalmonella菌に
対する選択性は維持される。
出において、遺伝子増幅作用による高い検出感度と、２
つあるいは、それ以上のプライマーで反応が規定される
ことによる高い選択性を得ることができる。また、高い
検出感度のため、多量の検体を必要とせず、検体の前処
理が簡便で済む。しかも、反応時間が短く、検出も簡単
な機材だけで済み、操作も容易なため同定までの時間を
大幅に短縮できる。以下の実施例に示すが、反応時間が
４時間、検出にかかる操作が30分である。また、検出に
アガロースゲル電気泳動と臭化エチジウムによる核酸染
色法をもちいることで、プライマー等に標識せずに検出
が行え、しかも、核酸の長さが確認できるので結果の信
頼性が高いものとなる。Salmonella菌のara C遺伝子
は、Salmonella属に属する全ての菌株に普遍的に存在し
ていると考えらる。したがって、この遺伝子を標的とす
ることでSalmonella属菌種を一括して検出することがで
きる。一方、ヌクレオチド配列における他の生物種のar
a C遺伝子とは相同性が少ないことからSalmonella菌に
対する選択性は維持される。
Claims (2)
- 【請求項１】検体中に存在するサルモネラ（Salmonell
a）属に分類される菌を選択的に検出するため、サルモ
ネラ菌のara C遺伝子をコードするヌクレオチド配列を
標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるように
化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、 合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５′）ｄ−GGCGAGCAGTTTGTCTGTC（３′） ……（ａ） （５′）ｄ−TACCGCCATACGTCTGAGC（３′） ……（ｂ） （５′）ｄ−GTTTCGCCTGGCTGATACG（３′） ……（ｃ） または対応する相補的配列から選ばれた配列からなるこ
とを特徴とするオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】請求項第１項に記載されたオリゴヌクレオ
チドの配列のうち増幅されるべきヌクレオチド配列の両
端を規定する２つのオリゴヌクレオチドを鎖長反応のプ
ライマーとして機能させ、標的ヌクレオチド配列を選択
的に増幅させることを特徴とするサルモネラ菌の検出方
法であって、 （ａ）検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列に前
記プライマーをハイブリダイズさせ４種のヌクレオチド
の重合反応により鎖長反応を行わせ、 （ｂ）得られた２本鎖ヌクレオチド配列を１本鎖に分離
した場合その相補鎖は更なる鎖長反応の鋳型として機能
し、 （ｃ）前記プライマーによる鎖長反応、鎖長生成物の鋳
型からの分離、そして更なるプライマーによるハイブリ
ダイゼーションを繰り返すことにより特定のヌクレオチ
ド配列を増幅させ、 （ｄ）前記検体中に認識されるべきヌクレオチド配列を
持つ核酸が存在しているか否かを判定することでサルモ
ネラ菌の検出を行う方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18568389A JPH0789958B2 (ja) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | サルモネラ菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
| DE69032778T DE69032778T2 (de) | 1989-07-18 | 1990-07-17 | Verfahren zur Untersuchung von durch Mikroorganismen verursachten Lebensmittelvergiftungen und Reagens dafür |
| EP90113661A EP0409159B1 (en) | 1989-07-18 | 1990-07-17 | Method for testing causative microorganism of food poisoning and reagents therefor |
| US08/126,754 US5529910A (en) | 1989-07-18 | 1993-09-27 | Method for testing causative microorganisms of food poisioning and reagents therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18568389A JPH0789958B2 (ja) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | サルモネラ菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0349698A JPH0349698A (ja) | 1991-03-04 |
| JPH0789958B2 true JPH0789958B2 (ja) | 1995-10-04 |
Family
ID=16175040
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18568389A Expired - Fee Related JPH0789958B2 (ja) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | サルモネラ菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0789958B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2451498A1 (en) | 2001-06-22 | 2003-01-03 | Marshfield Clinic | Methods and oligonucleotides for the detection of salmonella sp., e. coli o157:h7, and listeria monocytogenes |
-
1989
- 1989-07-18 JP JP18568389A patent/JPH0789958B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0349698A (ja) | 1991-03-04 |
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