JPH0789956B2 - セレウス菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
セレウス菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法Info
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- JPH0789956B2 JPH0789956B2 JP18568189A JP18568189A JPH0789956B2 JP H0789956 B2 JPH0789956 B2 JP H0789956B2 JP 18568189 A JP18568189 A JP 18568189A JP 18568189 A JP18568189 A JP 18568189A JP H0789956 B2 JPH0789956 B2 JP H0789956B2
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、臨床検査あるいは食品検査でのセレウス菌の
検出に関するものである。
検出に関するものである。
［従来の技術と問題点］ 検査材料が患者の嘔吐物、糞便、食品または拭き取り材
料の場合、セレウス菌と同定するまでには、増菌培養、
分離培養を経て純培養、確認培養に至る操作を行わなけ
ればならない。各培養段階に要する時間は、18〜24時間
であり総所要時間にすると約４日間となり、長時間を要
する。確認培養における生化学的試験では、卵黄反応、
VP反応、ゼラチン液化性、デンプン分解性、硝酸塩還元
性及び糖還元性を調べる必要があり、操作的にも煩雑で
ある。また、それに伴い、時間や費用がかかる。
料の場合、セレウス菌と同定するまでには、増菌培養、
分離培養を経て純培養、確認培養に至る操作を行わなけ
ればならない。各培養段階に要する時間は、18〜24時間
であり総所要時間にすると約４日間となり、長時間を要
する。確認培養における生化学的試験では、卵黄反応、
VP反応、ゼラチン液化性、デンプン分解性、硝酸塩還元
性及び糖還元性を調べる必要があり、操作的にも煩雑で
ある。また、それに伴い、時間や費用がかかる。
一方、最近では、オリゴヌクレオチドを用いたDNAプロ
ーブ法あるいはハイブリダイゼーション法が試みられる
ようになってきた。しかし、オリゴヌクレオチドを標識
修飾したプローブにより膜上、あるいは他の支持体上で
ハイブリダイゼイションを行い、これを検出する場合、
細菌検査において十分な検出感度と選択性を得るのが難
しい。
ーブ法あるいはハイブリダイゼーション法が試みられる
ようになってきた。しかし、オリゴヌクレオチドを標識
修飾したプローブにより膜上、あるいは他の支持体上で
ハイブリダイゼイションを行い、これを検出する場合、
細菌検査において十分な検出感度と選択性を得るのが難
しい。
［発明の目的］ 本発明は、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応のプライ
マーとして機能させた遺伝子増幅技術によりセレウス菌
由来の核酸を検出するもので、簡便、迅速かつ高感度な
セレウス菌の検査法を提供することにある。
マーとして機能させた遺伝子増幅技術によりセレウス菌
由来の核酸を検出するもので、簡便、迅速かつ高感度な
セレウス菌の検査法を提供することにある。
［問題点を解決するための手段および作用］ 本発明は、オリゴヌクレオチドをプライマーとして用い
た遺伝子増幅法でセレウス菌を選択的に検出することを
特徴としている。ここで、本発明のオリゴヌクレオチド
は、本発明者の当該分野におけるこれまでの幅広い経験
と総合的な知識の集積から、先ず次の〜の観点に基
づき望ましい塩基配列を絞り込み、 標的遺伝子（すなわち検出されるべき遺伝子）が、当
該菌種に特有の病原因子の遺伝子であること それぞれオリゴヌクレオチドを適当に組合わせて遺伝
子増幅法のプライマーとして使用する場合に、その増幅
領域の大きさが200〜500bp程度であること。
た遺伝子増幅法でセレウス菌を選択的に検出することを
特徴としている。ここで、本発明のオリゴヌクレオチド
は、本発明者の当該分野におけるこれまでの幅広い経験
と総合的な知識の集積から、先ず次の〜の観点に基
づき望ましい塩基配列を絞り込み、 標的遺伝子（すなわち検出されるべき遺伝子）が、当
該菌種に特有の病原因子の遺伝子であること それぞれオリゴヌクレオチドを適当に組合わせて遺伝
子増幅法のプライマーとして使用する場合に、その増幅
領域の大きさが200〜500bp程度であること。
それぞれのオリゴヌクレオチドが19〜25個程度の塩基
からなり、そのうちのＧおよびＣの構成比が50％程度で
あること それぞれのオリゴヌクレオチドの塩基配列が他菌を有
する塩基配列とホモロジーを有しないこと Tm（℃）が特定温度以上であること（但し、Tmとは、
オリゴヌクレオチドと標的遺伝子とのハイブリッドの半
分量が解離する温度で、ハイブリッドの安定性を示す指
標となる） 次に選び出したオリゴヌクレオチドを組合わせて遺伝子
増幅法のプライマーとし、遺伝子増幅法およびアガロー
スゲル電気泳動法を用いて、その選択性について検討し
て決定した。
からなり、そのうちのＧおよびＣの構成比が50％程度で
あること それぞれのオリゴヌクレオチドの塩基配列が他菌を有
する塩基配列とホモロジーを有しないこと Tm（℃）が特定温度以上であること（但し、Tmとは、
オリゴヌクレオチドと標的遺伝子とのハイブリッドの半
分量が解離する温度で、ハイブリッドの安定性を示す指
標となる） 次に選び出したオリゴヌクレオチドを組合わせて遺伝子
増幅法のプライマーとし、遺伝子増幅法およびアガロー
スゲル電気泳動法を用いて、その選択性について検討し
て決定した。
遺伝子増幅は、Saikiらが、開発したPolymerase Chain
Reaction法（以下、略してPCR法;Science.230,1350（19
85））をもとに行っている。この方法は、ある特定のヌ
クレオチド配列領域（本発明の場合はセレウス菌のβ−
lactamase遺伝子）を検出する場合、その領域の両端の
一方は＋鎖を他方は−鎖をそれぞれ認識してハイブリダ
イゼーションするようなオリゴヌクレオチドを用意し、
それを熱変性により１本鎖状態にした試料核酸に対し鋳
型依存性ヌクレオチド重合反応のプライマーとして機能
させ、生成した２本鎖核酸を再び１本鎖に分離し、再
び、同様な反応を起こさせる。この一連の操作を繰り返
すことで２つのプライマーにはさまれた領域は検出でき
るまでにコピー数が増大してくる。検体としては、臨床
検査材料、例えば、糞便、尿、血液、組織ホモジェネー
トなど、また、食品材料でもよい。これら材料をPCR反
応の試料として用いるには、材料中に存在する菌体から
核酸成分を遊離させる操作が前処理として必要となる。
しかし、プライマーがハイブリダイズできる核酸が数分
子から数十分子以上存在すればPCR反応は進むので、検
査材料を溶菌酵素、界面活性剤、アルカリ等で短時間処
理するだけでPCR反応を進行させるに十分な核酸量を持
った試料液が調製できる。本発明でプライマーとして用
いられるオリゴヌクレオチドは、選択性や検出感度およ
び再現性から考えて、10塩基以上、望ましくは15塩基以
上の長さを持った核酸フラグメントで、化学合成あるい
は天然のどちらでもよい。また、プライマーは、特に検
出用として標識されていなくてもよい。プライマーが規
定しているセレウス菌のβ−lactamase遺伝子における
増幅領域は、50塩基から2000塩基、望ましくは、100塩
基から1000塩基となればよい。鋳型依存性ヌクレオチド
重合反応には、耐熱性DNAポリメラーゼを用いている
が、この酵素の起源については90〜95℃の温度で活性を
保持していれば、どの生物種由来でもよい。熱変性温度
は、90〜95℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニ
ーリング操作の温度は37〜65℃、重合反応は50〜75℃
で、これを１サイクルとしたPCRを20から42サイクル行
って増幅させる。検出は酵素反応液をそのまま、アガロ
ースゲル電気泳動にかけることで増幅された核酸断片の
存在およびその長さが確認できる。その結果から、検体
中に、プライマーが認識すべき配列を持った核酸が存在
しているかどうか判定することができる。この判定は、
そのままセレウス菌の有無を判定するものとなる。増幅
された核酸断片の検出には、その他の電気泳動やクロマ
トグラフィーも有効である。
Reaction法（以下、略してPCR法;Science.230,1350（19
85））をもとに行っている。この方法は、ある特定のヌ
クレオチド配列領域（本発明の場合はセレウス菌のβ−
lactamase遺伝子）を検出する場合、その領域の両端の
一方は＋鎖を他方は−鎖をそれぞれ認識してハイブリダ
イゼーションするようなオリゴヌクレオチドを用意し、
それを熱変性により１本鎖状態にした試料核酸に対し鋳
型依存性ヌクレオチド重合反応のプライマーとして機能
させ、生成した２本鎖核酸を再び１本鎖に分離し、再
び、同様な反応を起こさせる。この一連の操作を繰り返
すことで２つのプライマーにはさまれた領域は検出でき
るまでにコピー数が増大してくる。検体としては、臨床
検査材料、例えば、糞便、尿、血液、組織ホモジェネー
トなど、また、食品材料でもよい。これら材料をPCR反
応の試料として用いるには、材料中に存在する菌体から
核酸成分を遊離させる操作が前処理として必要となる。
しかし、プライマーがハイブリダイズできる核酸が数分
子から数十分子以上存在すればPCR反応は進むので、検
査材料を溶菌酵素、界面活性剤、アルカリ等で短時間処
理するだけでPCR反応を進行させるに十分な核酸量を持
った試料液が調製できる。本発明でプライマーとして用
いられるオリゴヌクレオチドは、選択性や検出感度およ
び再現性から考えて、10塩基以上、望ましくは15塩基以
上の長さを持った核酸フラグメントで、化学合成あるい
は天然のどちらでもよい。また、プライマーは、特に検
出用として標識されていなくてもよい。プライマーが規
定しているセレウス菌のβ−lactamase遺伝子における
増幅領域は、50塩基から2000塩基、望ましくは、100塩
基から1000塩基となればよい。鋳型依存性ヌクレオチド
重合反応には、耐熱性DNAポリメラーゼを用いている
が、この酵素の起源については90〜95℃の温度で活性を
保持していれば、どの生物種由来でもよい。熱変性温度
は、90〜95℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニ
ーリング操作の温度は37〜65℃、重合反応は50〜75℃
で、これを１サイクルとしたPCRを20から42サイクル行
って増幅させる。検出は酵素反応液をそのまま、アガロ
ースゲル電気泳動にかけることで増幅された核酸断片の
存在およびその長さが確認できる。その結果から、検体
中に、プライマーが認識すべき配列を持った核酸が存在
しているかどうか判定することができる。この判定は、
そのままセレウス菌の有無を判定するものとなる。増幅
された核酸断片の検出には、その他の電気泳動やクロマ
トグラフィーも有効である。
［実施例］ （実施例１） 検体の調製 セレウス菌は表１の縦の見出しに示した６株を用いてそ
れぞれを適当な増菌培地に接種し、37℃、好気的条件下
で一晩培養を行い、その培地、1.5mlから遠心操作によ
り菌体を回収した。10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）
で１回洗浄後、同緩衝液にリゾチームを1mg/mlとなるよ
うに溶かした液、0.5mlで懸濁させ、37℃、10分で溶菌
させた。溶菌液に前記緩衝液で飽和させたフェノールを
同容量を加え、よく撹はんした。遠心後、上層液を回収
し、エタノール沈澱処理を行って核酸成分を沈澱させ、
その沈澱物を前記緩衝液、1mlに溶かして、これを検体
とした。
れぞれを適当な増菌培地に接種し、37℃、好気的条件下
で一晩培養を行い、その培地、1.5mlから遠心操作によ
り菌体を回収した。10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）
で１回洗浄後、同緩衝液にリゾチームを1mg/mlとなるよ
うに溶かした液、0.5mlで懸濁させ、37℃、10分で溶菌
させた。溶菌液に前記緩衝液で飽和させたフェノールを
同容量を加え、よく撹はんした。遠心後、上層液を回収
し、エタノール沈澱処理を行って核酸成分を沈澱させ、
その沈澱物を前記緩衝液、1mlに溶かして、これを検体
とした。
プライマーの合成 セレウス菌のβ−lactamase I型およびII型遺伝子の塩
基配列（Wang,W.,et al.;J.Bacteriol.163,487−492（1
985）:Hussain,M.,et al.;J.Bacteriol.164,223−229
（1985））から、特許請求範囲第１項、第２項、第３項
に示した配列（（ａ）、（ｂ）、（ｃ）はβ−lactamas
e I型遺伝子、（ｄ）、（ｅ）はβ−lactamase II型遺
伝子より、）を選び、それと同じ配列を持つオリゴヌク
レオチドを化学合成した。化学合成は島津DNA合成機NS
−１を用い、トリエステル法により行った。合成したオ
リゴヌクレオチド断片の精製はC18逆相カラムを用いて
行った。
基配列（Wang,W.,et al.;J.Bacteriol.163,487−492（1
985）:Hussain,M.,et al.;J.Bacteriol.164,223−229
（1985））から、特許請求範囲第１項、第２項、第３項
に示した配列（（ａ）、（ｂ）、（ｃ）はβ−lactamas
e I型遺伝子、（ｄ）、（ｅ）はβ−lactamase II型遺
伝子より、）を選び、それと同じ配列を持つオリゴヌク
レオチドを化学合成した。化学合成は島津DNA合成機NS
−１を用い、トリエステル法により行った。合成したオ
リゴヌクレオチド断片の精製はC18逆相カラムを用いて
行った。
PCR 前記検体液を３μｌを用いそれに滅菌蒸留水16.05μ
ｌ、10×反応用バッファー３μｌ、dNTP溶液4.8μｌ、
プライマー（１）1.5μｌ、プライマー（２）0.5μｌそ
して耐熱性DNAポリメラーゼ0.15μｌを加え、30μｌの
反応液を調製した。この反応液の入った容器にミネラル
オイル（SIGMA社製）を50μｌ加え反応液上に重層す
る。各添加された液の内容を下記に示す。
ｌ、10×反応用バッファー３μｌ、dNTP溶液4.8μｌ、
プライマー（１）1.5μｌ、プライマー（２）0.5μｌそ
して耐熱性DNAポリメラーゼ0.15μｌを加え、30μｌの
反応液を調製した。この反応液の入った容器にミネラル
オイル（SIGMA社製）を50μｌ加え反応液上に重層す
る。各添加された液の内容を下記に示す。
10×反応用バッファー:500mM KCl,100mM Tris−HCl
（pH8.3）,15mM MgCl2,0.1％（w/v）ゼラチン dNTP溶液:dATP,dCTP,dGTP,dTTPを混合させたもので、各
終濃度が1.25mM プライマー（１）および（２）：前述した化学合成精製
品の各水溶液（50DU/ml） プライマーの組合せは、特許請求範囲第２項、第４項、
第６項に示した配列（（ａ）〜（ｅ））より、次の組合
せを用いた。プライマー（１）＋プライマー（２） （ａ） ＋ （ｂ） （ａ） ＋ （ｃ） （ｄ） ＋ （ｅ） 耐熱性DNAポリメラーゼ:Teq DNAポリメラーゼ（5unit/
ml;Perkin Elmer Cetus社製） 反応条件は、次の通りである。
（pH8.3）,15mM MgCl2,0.1％（w/v）ゼラチン dNTP溶液:dATP,dCTP,dGTP,dTTPを混合させたもので、各
終濃度が1.25mM プライマー（１）および（２）：前述した化学合成精製
品の各水溶液（50DU/ml） プライマーの組合せは、特許請求範囲第２項、第４項、
第６項に示した配列（（ａ）〜（ｅ））より、次の組合
せを用いた。プライマー（１）＋プライマー（２） （ａ） ＋ （ｂ） （ａ） ＋ （ｃ） （ｄ） ＋ （ｅ） 耐熱性DNAポリメラーゼ:Teq DNAポリメラーゼ（5unit/
ml;Perkin Elmer Cetus社製） 反応条件は、次の通りである。
熱変性:94℃ １分 アニーリング:37℃ １分 重合反応:60℃ １分 熱変性からアニーリングを経て重合反応に至る過程を１
サイクル（所要時間5.7分）とし、これを42サイクル
（総所要時間約４時間）行った。これらの操作は、Perk
in Elmer Cetus社製DNA Thermal Cyclerに上記反応条件
をプログラムすることにより行った。
サイクル（所要時間5.7分）とし、これを42サイクル
（総所要時間約４時間）行った。これらの操作は、Perk
in Elmer Cetus社製DNA Thermal Cyclerに上記反応条件
をプログラムすることにより行った。
検出 反応液から、増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロース電気泳動を以下の様に行った。
め、アガロース電気泳動を以下の様に行った。
アガロースゲルはゲル濃度２％（w/v）とし、臭化エチ
ジウム（0.5μg/ml）を含むものを用いた。泳動の電気
的条件は、定電圧100V、時間は30分行った。操作方法な
らびに他の条件はManiatis等、Molecular Cloning（198
2）に記載されている技法で行った。反応液の他に分子
量マーカーの泳動も、同時に行い、相対移動度の比較に
より、ゲル中、紫外線光等で検出されたヌクレオチド断
片の長さを算出した。
ジウム（0.5μg/ml）を含むものを用いた。泳動の電気
的条件は、定電圧100V、時間は30分行った。操作方法な
らびに他の条件はManiatis等、Molecular Cloning（198
2）に記載されている技法で行った。反応液の他に分子
量マーカーの泳動も、同時に行い、相対移動度の比較に
より、ゲル中、紫外線光等で検出されたヌクレオチド断
片の長さを算出した。
結果 前述したように、β−lactamase遺伝子のＩ型、II型と
も、すでに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴ
ヌクレオチド、すなわち、プライマーがPCRにより、増
幅させてくるヌクレオチドの大きさは推定できる。それ
によると、プライマー（ａ）と（ｂ）では、156塩基、
（ａ）と（ｃ）では、313塩基、（ｄ）と（ｅ）では、2
32塩基の長さのヌクレオチドが増幅されてくるはずであ
る。表１に示した数値は、上記方法で増幅されてきたヌ
クレオチドの長さを測定した結果で、単位はキロ塩基対
である。同表からわかるように、各プライマーの組合せ
とも、推定されたヌクレオチドの長さと一致しており、
これらが、β−lactamase遺伝子の標的としている領域
を正しく増幅してきていることを示している。
も、すでに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴ
ヌクレオチド、すなわち、プライマーがPCRにより、増
幅させてくるヌクレオチドの大きさは推定できる。それ
によると、プライマー（ａ）と（ｂ）では、156塩基、
（ａ）と（ｃ）では、313塩基、（ｄ）と（ｅ）では、2
32塩基の長さのヌクレオチドが増幅されてくるはずであ
る。表１に示した数値は、上記方法で増幅されてきたヌ
クレオチドの長さを測定した結果で、単位はキロ塩基対
である。同表からわかるように、各プライマーの組合せ
とも、推定されたヌクレオチドの長さと一致しており、
これらが、β−lactamase遺伝子の標的としている領域
を正しく増幅してきていることを示している。
（実施例２） 実施例１で得られた結果が、セレウス菌に対し選択的な
ものか確かめるため、臨床検査においてセレウス菌以外
で検査対象となり得る菌種について比較検討した。
ものか確かめるため、臨床検査においてセレウス菌以外
で検査対象となり得る菌種について比較検討した。
方法は、実施例１に示したものと同じであるが、（３）
と（７）の株については嫌気的条件下、37℃で終夜培養
を行い、PCR法に適用しうる試料を調製した。検体の調
製において培養した菌は、表２の縦の見出しに示した７
菌株である。また、ヒト胎盤由来DNAは１μg/mlの濃度
のものを調製し、これも同様にPCRを行わせた。結果を
表２に示す。表１と同様、欄内の数値の単位はキロ塩基
対である。一部の菌種においてPCRの副次的産物とみら
れる。増幅されたヌクレオチド断片が検出されたが、ど
れもβ−lactamase遺伝子の塩基配列から推定されるヌ
クレオチド断片の長さとは異なっている。セレウス菌と
同じβ−lactamase遺伝子をこれらの菌種が持っていれ
ば実施例１の結果と同じ長さのヌクレオチド断片が検出
されるはずである。従って、これら菌種由来の増幅され
たヌクレオチドはβ−lactamase遺伝子を認識して生成
されたものではないことが明かであり、セレウス菌とは
容易に区別し検出できることがわかる。なお、本発明の
実施例にに用いているアガロース電気泳動を前述の泳動
条件行えば100塩基対以下の範囲であれば５から10塩基
対、100から500塩基対の範囲であれば10から20塩基対の
ヌクレオチドの長さの違いを区別することがでる。さら
に、アクリルアミドなどをゲルに用いることでヌクレオ
チドの長さの測定の精度を向上させれば、選択的検出に
おける信頼度はさらに高まるものと考えられる。
と（７）の株については嫌気的条件下、37℃で終夜培養
を行い、PCR法に適用しうる試料を調製した。検体の調
製において培養した菌は、表２の縦の見出しに示した７
菌株である。また、ヒト胎盤由来DNAは１μg/mlの濃度
のものを調製し、これも同様にPCRを行わせた。結果を
表２に示す。表１と同様、欄内の数値の単位はキロ塩基
対である。一部の菌種においてPCRの副次的産物とみら
れる。増幅されたヌクレオチド断片が検出されたが、ど
れもβ−lactamase遺伝子の塩基配列から推定されるヌ
クレオチド断片の長さとは異なっている。セレウス菌と
同じβ−lactamase遺伝子をこれらの菌種が持っていれ
ば実施例１の結果と同じ長さのヌクレオチド断片が検出
されるはずである。従って、これら菌種由来の増幅され
たヌクレオチドはβ−lactamase遺伝子を認識して生成
されたものではないことが明かであり、セレウス菌とは
容易に区別し検出できることがわかる。なお、本発明の
実施例にに用いているアガロース電気泳動を前述の泳動
条件行えば100塩基対以下の範囲であれば５から10塩基
対、100から500塩基対の範囲であれば10から20塩基対の
ヌクレオチドの長さの違いを区別することがでる。さら
に、アクリルアミドなどをゲルに用いることでヌクレオ
チドの長さの測定の精度を向上させれば、選択的検出に
おける信頼度はさらに高まるものと考えられる。
（実施例３） 本発明による方法で検体中のセレウス菌がどこまで微量
検出できたかを以下に示す。
検出できたかを以下に示す。
方法 セレウス菌（JCM2152株）を100mlの増菌用培地に接種
し、好気的条件下、37℃で終夜培養を行った。この培養
液から遠心操作により菌体を回収し、10mM Tris−HCl
（pH7.5）緩衝液で１回洗浄し、同緩衝液に溶かしたリ
ゾチーム溶液（1mg/ml）、20mlに懸濁させ、37℃、10分
で溶菌させた。この溶菌液に20％（w/v）SDS水溶液1ml
を加え、同温度で10分、そしてプロティナーゼＫを終濃
度750μg/となるように加え、さらに30分加温した。そ
して、同容量の飽和フェノール（上記緩衝液に飽和させ
た、）を加え、よく撹はんした後、遠心して上層液を回
収した。この溶液に豚膵臓リボヌクレアーゼを終濃度50
μg/mlとなるように加え、37℃、60分加温した。
し、好気的条件下、37℃で終夜培養を行った。この培養
液から遠心操作により菌体を回収し、10mM Tris−HCl
（pH7.5）緩衝液で１回洗浄し、同緩衝液に溶かしたリ
ゾチーム溶液（1mg/ml）、20mlに懸濁させ、37℃、10分
で溶菌させた。この溶菌液に20％（w/v）SDS水溶液1ml
を加え、同温度で10分、そしてプロティナーゼＫを終濃
度750μg/となるように加え、さらに30分加温した。そ
して、同容量の飽和フェノール（上記緩衝液に飽和させ
た、）を加え、よく撹はんした後、遠心して上層液を回
収した。この溶液に豚膵臓リボヌクレアーゼを終濃度50
μg/mlとなるように加え、37℃、60分加温した。
この液に前記フェノールを同容量加え、よく撹はんした
後、遠心した上層を回収した。エタノール沈澱を行うた
めに、回収液の1/10容量の3M酢酸ナトリウム緩衝液（pH
5.2）を加え、混ぜた後、回収液の２倍容量のエタノー
ルを加え撹はんした。析出した糸状のDNAを遠心操作に
より、回収した後、10mlの10mM Tris−HCl（pH7,5）緩
衝液に再溶解させ、精製DNA標品を得た。そして、この
標品中のDNA量を波長260nmの吸光度より算定した。
後、遠心した上層を回収した。エタノール沈澱を行うた
めに、回収液の1/10容量の3M酢酸ナトリウム緩衝液（pH
5.2）を加え、混ぜた後、回収液の２倍容量のエタノー
ルを加え撹はんした。析出した糸状のDNAを遠心操作に
より、回収した後、10mlの10mM Tris−HCl（pH7,5）緩
衝液に再溶解させ、精製DNA標品を得た。そして、この
標品中のDNA量を波長260nmの吸光度より算定した。
セレウス菌の染色体DNA1μｇは３×108個のセレウス菌
に相当することから、PCR系に持ち込むDNA量で何個のセ
レウス菌が存在すれば検出できるか算定した。PCR、そ
の他の手順は実施例１に示した通りである。プライマー
の組合せは（ａ）＋（ｃ）を用いた。増幅されたヌクレ
オチド断片の検出は、泳動したゲルをトランスイルミネ
ーター上で写真撮影し、フィルム上でバンドの確認を行
った。カメラは、Mamiya RB67,フィルムは、Polaroid t
ype667,撮影条件は、絞り:5.6、シャッタースピード:1
秒で、Kenko R1フィルターを使用した。
に相当することから、PCR系に持ち込むDNA量で何個のセ
レウス菌が存在すれば検出できるか算定した。PCR、そ
の他の手順は実施例１に示した通りである。プライマー
の組合せは（ａ）＋（ｃ）を用いた。増幅されたヌクレ
オチド断片の検出は、泳動したゲルをトランスイルミネ
ーター上で写真撮影し、フィルム上でバンドの確認を行
った。カメラは、Mamiya RB67,フィルムは、Polaroid t
ype667,撮影条件は、絞り:5.6、シャッタースピード:1
秒で、Kenko R1フィルターを使用した。
結果 以下の写真に結果を示した。
レーン番号（５）でも目的とするバンドが確認できた。
これは、セレウス菌染色体DNAの30分子相当のDNA量を検
出しており、理論的には、セレウス菌、30個が検体中に
存在していれば検出できることになる。
これは、セレウス菌染色体DNAの30分子相当のDNA量を検
出しており、理論的には、セレウス菌、30個が検体中に
存在していれば検出できることになる。
本発明による方法の検出感度はPCRにおけるサイクル数
を増加させることで、さらに高められる可能性がある。
しかし、これ以上検出感度を高めて、数分子、あるいは
１分子の検出が可能となっても確率論的要素が加わり、
再現性が悪くなると考えられるので、本発明の目的から
考えて、意味の無いものであろう。
を増加させることで、さらに高められる可能性がある。
しかし、これ以上検出感度を高めて、数分子、あるいは
１分子の検出が可能となっても確率論的要素が加わり、
再現性が悪くなると考えられるので、本発明の目的から
考えて、意味の無いものであろう。
この方法をさらに改善するための条件は、PCR系に、い
かに多くの標的ヌクレオチドを持ち込むことができるか
にある。これは、検体をPCRに用いることができるまで
に処理する過程において、標的ヌクレオチドをできるだ
け効率よく精製し、濃縮することである。実施例１、
２、あるいは３の方法における検体の調製過程をさらに
効率化することで、材料中に低密度で存在するセレウス
菌を容易に検出できると考えられる。
かに多くの標的ヌクレオチドを持ち込むことができるか
にある。これは、検体をPCRに用いることができるまで
に処理する過程において、標的ヌクレオチドをできるだ
け効率よく精製し、濃縮することである。実施例１、
２、あるいは３の方法における検体の調製過程をさらに
効率化することで、材料中に低密度で存在するセレウス
菌を容易に検出できると考えられる。
［発明の効果］ 本発明では、PCR法を用いたことで、セレウス菌の検出
において、遺伝子増幅作用による高い検出感度と、２つ
あるいは、それ以上のプライマーで反応が規定されるこ
とによる高い選択性を得ることができる。また、高い検
出感度のため多量の検体を必要とせず、検体の前処理が
簡便で済む。しかも、反応時間が短く、検出も簡単な機
材で済み、操作も容易なため同定までの時間を大幅に短
縮できる。以下の実施例に示すが、反応時間が４時間、
検出にかかる操作が30分である。また、検出にアガロー
スゲル電気泳動と臭化エチジウムによる核酸染色法をも
ちいることで、プライマー等に標識せずに検出が行え、
しかも、核酸の長さが確認できるので結果の信頼性が高
いものとなる。セレウス菌は、その特徴としてβ−lact
amase活性を有しており、セレウス菌の全ての菌株に
は、β−lactamase遺伝子が存在していると考えらる。
しかも、他の生物種でβ−lactamase活性を持つものは
少ないことから、プライマーが標的とするヌクレオチド
配列にβ−lactamase遺伝子をもちいることでセレウス
菌の選択的的検出が可能となる。
において、遺伝子増幅作用による高い検出感度と、２つ
あるいは、それ以上のプライマーで反応が規定されるこ
とによる高い選択性を得ることができる。また、高い検
出感度のため多量の検体を必要とせず、検体の前処理が
簡便で済む。しかも、反応時間が短く、検出も簡単な機
材で済み、操作も容易なため同定までの時間を大幅に短
縮できる。以下の実施例に示すが、反応時間が４時間、
検出にかかる操作が30分である。また、検出にアガロー
スゲル電気泳動と臭化エチジウムによる核酸染色法をも
ちいることで、プライマー等に標識せずに検出が行え、
しかも、核酸の長さが確認できるので結果の信頼性が高
いものとなる。セレウス菌は、その特徴としてβ−lact
amase活性を有しており、セレウス菌の全ての菌株に
は、β−lactamase遺伝子が存在していると考えらる。
しかも、他の生物種でβ−lactamase活性を持つものは
少ないことから、プライマーが標的とするヌクレオチド
配列にβ−lactamase遺伝子をもちいることでセレウス
菌の選択的的検出が可能となる。
Claims (3)
- 【請求項１】検体中におけるセレウス菌のβ−lactamas
e I型遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的と
し、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学合
成されたオリゴヌクレオチドであって、 合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５′）ｄ−GGTTTAAGTATTACAAGCC（３′） ……（ａ） （５′）ｄ−GCATATACACCTAATCGAGC（３′）……（ｂ） （５′）ｄ−CCACTAAGTCTTCTTTCG（３′） ……（ｃ） または対応する相補的配列から選ばれた配列からなるこ
とを特徴とするオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】検体中におけるセレウス菌のβ−lactamas
e II型遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的と
し、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学合
成されたオリゴヌクレオチドであって、 合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５′）ｄ−TTCTGTATGCCCTTTCCCTG（３′）……（ｄ） （５′）ｄ−ATTTCAGAAGCGCGTAACGG（３′）……（ｅ） または対応する相補的配列から選ばれた配列からなるこ
とを特徴とするオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３】請求項１又は２に記載されたオリゴヌクレ
オチドの配列のうち増幅されるべきヌクレオチド配列の
両端を規定する２つのオリゴヌクレオチドを鎖長反応の
プライマーとして機能させ、標的ヌクレオチド配列を選
択的に増幅させることを特徴とするセレウス菌の検出方
法であって、 （ａ）検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列に前
記プライマーをハイブリダイズさせ４種のヌクレオチド
の重合反応により鎖長反応を行わせ、 （ｂ）得られた２本鎖ヌクレオチド配列を１本鎖に分離
した場合その相補鎖は更なる鎖長反応の鋳型として機能
し、 （ｃ）前記プライマーによる鎖長反応、鎖長生成物の鋳
型からの分離、そして更なるプライマーによるハイブリ
ダイゼーションを繰り返すことにより特定のヌクレオチ
ド配列を増幅させ、 （ｄ）前記検体中に認識されるべきヌクレオチド配列を
持つ核酸が存在しているか否かを判定することでセレウ
ス菌の検出を行う方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18568189A JPH0789956B2 (ja) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | セレウス菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18568189A JPH0789956B2 (ja) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | セレウス菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0349696A JPH0349696A (ja) | 1991-03-04 |
| JPH0789956B2 true JPH0789956B2 (ja) | 1995-10-04 |
Family
ID=16175008
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18568189A Expired - Lifetime JPH0789956B2 (ja) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | セレウス菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0789956B2 (ja) |
-
1989
- 1989-07-18 JP JP18568189A patent/JPH0789956B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0349696A (ja) | 1991-03-04 |
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