JPH03164199A - 結核菌の迅速同定方法及び同定用試薬キット - Google Patents
結核菌の迅速同定方法及び同定用試薬キットInfo
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- JPH03164199A JPH03164199A JP25077789A JP25077789A JPH03164199A JP H03164199 A JPH03164199 A JP H03164199A JP 25077789 A JP25077789 A JP 25077789A JP 25077789 A JP25077789 A JP 25077789A JP H03164199 A JPH03164199 A JP H03164199A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は結核菌を迅速に検出、同定する方法及びそれに
使用する同定用試薬キットに関する．更に詳しくは、結
核菌に特異的なＤＮＡ（デオキシリボ核酸）の一部を増
幅し、検出同定する方法及びキットに関するものである
．〔従来の技術〕 結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕ
ｌｏｓｉｓ）はヒト結核の病原体であり、その検出と同
定は治療及び予防対策上、きわめて重要である．検査材
料としては喀痰が用いられることが多いが、病状に応じ
てうがい水、胃洗浄液、大便、尿、すい液、臓器片等も
用いられる。結核菌は発育が遅く、ス他の抗酸菌と形態
学的に区別がつかないので、通常の細菌学的方法では時
には数ケ月に及ぶ培養期間と比較的繁雑な同定操作を必
要とし、より簡便迅速な同定方法の開発が切望されてい
た． 一方、近年の分子生物学の進展は目覚ましく、ウイルス
や細菌等の感染症診断にも遺伝子工学的手法が導入され
つつある。遺伝子工学的手法による結核菌の同定法とし
ては、結核菌に特異的なりボゾーマルＲＮＡ （ ｒ−
ＲＮＡ ）に着目し、これと相補的に結合するＤＮＡブ
ローブを用いて同定する方法が開発されている．〔発明
が解決しようとする課題〕 しかしながら、遺伝子工学的手法を用いた場合でも、前
述の細菌学的方法と同様、一定期間培養して増菌した集
落から検査材料を得なければならず、喀痰等を直接に検
査材料とするには不向きであり、迅速性に欠けるという
難点があった． 本発明は結核菌を短時間で特異的に検出、同定し得る方
法及びそれに使用するキットを提供することを目的とす
る． 〔課題を解決するための手段〕 上記目的を達成するために、本発明の同定方法では、結
核菌に特異的な塩基配列をＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェ
イン・リアクション〉法にて増幅し、特異的目的塩基配
列を検出、同定するようにした． 本発明の同定方法に用いられる検査材料としては喀痰、
うがい水、胃洗浄液、大便、尿、すい液、臓器片等であ
り、これらの検査材料中に含まれる結核菌を慣用的方法
で破壊し、ＤＮＡを遊離させる． ＰＣＲ法としてはサイエンス（ Ｓｃ ｉｅｎｃｅ ）
１９８８年、２３９巻、４８７〜４９１．頁（Ｓａｉ
ｋｉ， Ｒ． Ｋ．等〉に記載されている方法があるが
、これ以外にも公知の方法が適用できる． 特異的な塩基配列は、第５図に示す結核菌ＤＮＡの１９
キロダルトン（ＫＤａ）を中心とする遺伝子領域から任
意に選択することができる．例えばセンスプライマーと
して５’−ＧＴＧ ＡＡＧＣＧＴ ＧＧＡ ＣＴＧ Ａ
ＣＧ ＧＴＣ−３’を、アンチセンスプライマーとして
５’一ＧＴＣ ＧＴＧ ＧＴＣ ＴＣＡ ＣＣＧ ＣＴ
ＴＣＣＴ−３’、又は５゜−ＣＣＧ ＴＣＧ ＡＴＧ
ＡＣＧ ＡＣＣ ＴＴＣ ＴＧＣ−３’、更には５’−
ＡＴＧ ＴＴＧ ＡＣＡ ＴＴＧ ＣＣＧ ＧＣＣＧＣ
Ｇ−３’を使用することにより選択することができる．
これらのブライマーの塩基数は結核菌ＤＮＡに対する特
異性を保持するのに充分な数であるが、特異性を損なわ
ない範囲で減らすことも可能である。
使用する同定用試薬キットに関する．更に詳しくは、結
核菌に特異的なＤＮＡ（デオキシリボ核酸）の一部を増
幅し、検出同定する方法及びキットに関するものである
．〔従来の技術〕 結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕ
ｌｏｓｉｓ）はヒト結核の病原体であり、その検出と同
定は治療及び予防対策上、きわめて重要である．検査材
料としては喀痰が用いられることが多いが、病状に応じ
てうがい水、胃洗浄液、大便、尿、すい液、臓器片等も
用いられる。結核菌は発育が遅く、ス他の抗酸菌と形態
学的に区別がつかないので、通常の細菌学的方法では時
には数ケ月に及ぶ培養期間と比較的繁雑な同定操作を必
要とし、より簡便迅速な同定方法の開発が切望されてい
た． 一方、近年の分子生物学の進展は目覚ましく、ウイルス
や細菌等の感染症診断にも遺伝子工学的手法が導入され
つつある。遺伝子工学的手法による結核菌の同定法とし
ては、結核菌に特異的なりボゾーマルＲＮＡ （ ｒ−
ＲＮＡ ）に着目し、これと相補的に結合するＤＮＡブ
ローブを用いて同定する方法が開発されている．〔発明
が解決しようとする課題〕 しかしながら、遺伝子工学的手法を用いた場合でも、前
述の細菌学的方法と同様、一定期間培養して増菌した集
落から検査材料を得なければならず、喀痰等を直接に検
査材料とするには不向きであり、迅速性に欠けるという
難点があった． 本発明は結核菌を短時間で特異的に検出、同定し得る方
法及びそれに使用するキットを提供することを目的とす
る． 〔課題を解決するための手段〕 上記目的を達成するために、本発明の同定方法では、結
核菌に特異的な塩基配列をＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェ
イン・リアクション〉法にて増幅し、特異的目的塩基配
列を検出、同定するようにした． 本発明の同定方法に用いられる検査材料としては喀痰、
うがい水、胃洗浄液、大便、尿、すい液、臓器片等であ
り、これらの検査材料中に含まれる結核菌を慣用的方法
で破壊し、ＤＮＡを遊離させる． ＰＣＲ法としてはサイエンス（ Ｓｃ ｉｅｎｃｅ ）
１９８８年、２３９巻、４８７〜４９１．頁（Ｓａｉ
ｋｉ， Ｒ． Ｋ．等〉に記載されている方法があるが
、これ以外にも公知の方法が適用できる． 特異的な塩基配列は、第５図に示す結核菌ＤＮＡの１９
キロダルトン（ＫＤａ）を中心とする遺伝子領域から任
意に選択することができる．例えばセンスプライマーと
して５’−ＧＴＧ ＡＡＧＣＧＴ ＧＧＡ ＣＴＧ Ａ
ＣＧ ＧＴＣ−３’を、アンチセンスプライマーとして
５’一ＧＴＣ ＧＴＧ ＧＴＣ ＴＣＡ ＣＣＧ ＣＴ
ＴＣＣＴ−３’、又は５゜−ＣＣＧ ＴＣＧ ＡＴＧ
ＡＣＧ ＡＣＣ ＴＴＣ ＴＧＣ−３’、更には５’−
ＡＴＧ ＴＴＧ ＡＣＡ ＴＴＧ ＣＣＧ ＧＣＣＧＣ
Ｇ−３’を使用することにより選択することができる．
これらのブライマーの塩基数は結核菌ＤＮＡに対する特
異性を保持するのに充分な数であるが、特異性を損なわ
ない範囲で減らすことも可能である。
ＰＣＲ産物中の特異的目的塩基配列は、電気泳動後の染
色バンドの有無によって確認することができる。又、放
射性同位元素、螢光色素、酵素、ビオチン等の標識剤で
標識した５′−ＡＡＡＧＡＣ Ｃ丁Ｇ ＣＧＡ ＣＣＡ
ＧＡＡ ＴＧ−３’ （ Ｔｂｃオリゴヌクレオチド
・プローブ）をプローブとしてサザーン・プロット・ハ
イブリダイゼイション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ
ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法等の公知の方法で検出
することができる． 上記のＴｂｃオリゴヌクレオチドは一例であり、前述の
センスプライマーとアンチセンスプライマーとにＪ：り
規定されて増幅される特異的目的塩基配列中の複数の塩
基から任意に選択することが可能である。
色バンドの有無によって確認することができる。又、放
射性同位元素、螢光色素、酵素、ビオチン等の標識剤で
標識した５′−ＡＡＡＧＡＣ Ｃ丁Ｇ ＣＧＡ ＣＣＡ
ＧＡＡ ＴＧ−３’ （ Ｔｂｃオリゴヌクレオチド
・プローブ）をプローブとしてサザーン・プロット・ハ
イブリダイゼイション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ
ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法等の公知の方法で検出
することができる． 上記のＴｂｃオリゴヌクレオチドは一例であり、前述の
センスプライマーとアンチセンスプライマーとにＪ：り
規定されて増幅される特異的目的塩基配列中の複数の塩
基から任意に選択することが可能である。
喀痰等の検査材料中の種々の細菌は破壊されＤＮＡが遊
離される．検査材利中に結核菌が存在する場合は、遊離
された結核菌のＤＮＡの特異的目的塩基配列の上流及び
下流に、センスプライマー例えば５’−ＧＴＧ ＡＡＧ
ＣＧＴ ＧＧＡ ＣＴＧＡＣＧ ＧＴＣ−３’とアン
チセンスプライマー５’−ＧＴＣＣＴＧ ＧＴＣ 丁Ｃ
Ａ ＣＯＧ ＣＴＴ ＣＣＴ−３’とが結合し、丁ａｇ
ＤＮＡポリメラーゼにより適当な温度条件下にｎサイク
ルのＰＣＲ反応で約２゛個の特異的目的塩基配列が生成
される． ＰＣＲ産物を電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色
すると、増幅された特異的塩基配列は１０７塩基位のバ
ンドとして確認することができる． 又、ＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動した後ニト
ロセルロース膜に転写し、次いで放射性同位元素、螢光
色素、酵素、ビオチン等で標識した５゜−ＡＡＡ ＧＡ
Ｃ ＣＴＧ ＣＧＡ ＣＣＡ ＧＡＡ ＴＧ−３′をプ
ローブとしてハイブリダイゼイションすると特異的目的
塩基配列の泳動部にプローブが相補的に結合し、標識剤
に対応したオートラジオグラフィー等の検出手段により
検出することができる。
離される．検査材利中に結核菌が存在する場合は、遊離
された結核菌のＤＮＡの特異的目的塩基配列の上流及び
下流に、センスプライマー例えば５’−ＧＴＧ ＡＡＧ
ＣＧＴ ＧＧＡ ＣＴＧＡＣＧ ＧＴＣ−３’とアン
チセンスプライマー５’−ＧＴＣＣＴＧ ＧＴＣ 丁Ｃ
Ａ ＣＯＧ ＣＴＴ ＣＣＴ−３’とが結合し、丁ａｇ
ＤＮＡポリメラーゼにより適当な温度条件下にｎサイク
ルのＰＣＲ反応で約２゛個の特異的目的塩基配列が生成
される． ＰＣＲ産物を電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色
すると、増幅された特異的塩基配列は１０７塩基位のバ
ンドとして確認することができる． 又、ＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動した後ニト
ロセルロース膜に転写し、次いで放射性同位元素、螢光
色素、酵素、ビオチン等で標識した５゜−ＡＡＡ ＧＡ
Ｃ ＣＴＧ ＣＧＡ ＣＣＡ ＧＡＡ ＴＧ−３′をプ
ローブとしてハイブリダイゼイションすると特異的目的
塩基配列の泳動部にプローブが相補的に結合し、標識剤
に対応したオートラジオグラフィー等の検出手段により
検出することができる。
なお、前述の範囲以内でセンスプライマーとアンチセン
スプライマーとの組み合わせを変えることにより増幅さ
れる特異的目的塩基配列の塩基数も変わるが、同様の手
段で検出される． 〔実施例〕 実施例１ （１） Ｐ Ｃ Ｒ １０ｎＭ／Ｉ１１１の両ブライマー、２．５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌｚ、５０ｍＭ ＫＣＩ、０．０１％ゼラチン、２０
０１ＭのｄＮＴＰを含む１０ｍｌｌｌＩトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８．３） ５ｈＱに、１単位のＴａｑ ＤＮＡ
ポリメラーゼ（Ａｒ＊ｐｌｉ ＴａｑＵＳＢ社）を加え
、これにＭ．ツベルクローシス（ ｔｕｂｅｒｃｕ ｌ
ｏｓ ｉｓ ）の標準菌株を破壊して得られたサンプ
ルＤＮＡを加える． サーマル・サイクラ−（パーキン・エルマ−社）を用い
て９４℃３０秒間、５５℃３０秒間７２℃ｌ分間を１サ
イクルとして、３ｏサイクルの反応を行った。
スプライマーとの組み合わせを変えることにより増幅さ
れる特異的目的塩基配列の塩基数も変わるが、同様の手
段で検出される． 〔実施例〕 実施例１ （１） Ｐ Ｃ Ｒ １０ｎＭ／Ｉ１１１の両ブライマー、２．５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌｚ、５０ｍＭ ＫＣＩ、０．０１％ゼラチン、２０
０１ＭのｄＮＴＰを含む１０ｍｌｌｌＩトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８．３） ５ｈＱに、１単位のＴａｑ ＤＮＡ
ポリメラーゼ（Ａｒ＊ｐｌｉ ＴａｑＵＳＢ社）を加え
、これにＭ．ツベルクローシス（ ｔｕｂｅｒｃｕ ｌ
ｏｓ ｉｓ ）の標準菌株を破壊して得られたサンプ
ルＤＮＡを加える． サーマル・サイクラ−（パーキン・エルマ−社）を用い
て９４℃３０秒間、５５℃３０秒間７２℃ｌ分間を１サ
イクルとして、３ｏサイクルの反応を行った。
■ＰＣＲ産物の同定
（１）のＰＣＲ産物５μＱを２％アガロースゲルで電気
泳動し、エチジウムブロマイドで染色したところ１０７
塩基位のシャープなバンドが観察された（第１図）． ■サザーン・プロット・ハイブリダイゼイション （Ｌ）のＰＣＲ産物５μＱを２％アガロースゲルで電気
泳動した後、ニトロセルロース膜に転写し、Ｔ４ボリヌ
クレオチドキナーゼ（Ｔ４ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅ ｋｉｎａｓｅ）と７−’２Ｆ ＡＴＰで末端ラベル
したＴｂｃオリゴヌクレオチド・プローブを使用して、
常法の如くサザーン・プロット・ハイブリダイゼイショ
ンを実施した．オートラジオグラフィーにより１０７塩
基位に放射活性を認めたく第２図〉。
泳動し、エチジウムブロマイドで染色したところ１０７
塩基位のシャープなバンドが観察された（第１図）． ■サザーン・プロット・ハイブリダイゼイション （Ｌ）のＰＣＲ産物５μＱを２％アガロースゲルで電気
泳動した後、ニトロセルロース膜に転写し、Ｔ４ボリヌ
クレオチドキナーゼ（Ｔ４ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅ ｋｉｎａｓｅ）と７−’２Ｆ ＡＴＰで末端ラベル
したＴｂｃオリゴヌクレオチド・プローブを使用して、
常法の如くサザーン・プロット・ハイブリダイゼイショ
ンを実施した．オートラジオグラフィーにより１０７塩
基位に放射活性を認めたく第２図〉。
比較例１
■Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ．■Ｍ． ｉｎｔｒａｃｅｌｌ
ｕｌａｒｅ，■Ｍ． ｆｏｕｔｕｉｔｕｍ，■Ｍ． ｓ
ｃｒｏｆｕ ｌａｃｅｕｍ、の標準菌株並びに■ｓｓＤ
ＮＡ％＠Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｒｎｉｃ １ｉｖｅｒＤ
ＮＡ、■λｇｔｌｌ ＤＮＡを使用して、前記実施ｆｆ
ｉ １ （１）■と同様の損作を行ったところ、いずれ
のサンプルＤＮＡとも１０７塩基位のバンドは見られな
かった（第１図）． また、前記実施例１（１）（３）と同様の操作を行った
ところ、いずれのサンプルＤＮＡとも陽性反応は認めら
れなかった（第２図）．実施例２ 細菌学的方法で結核菌陽性と判定された喀痰から常法に
よりサンプルＤＮＡを得て、前記実施例１と同様の操作
を行ったところエチジウムブロマイド染色で１０７塩基
位にシャープなバンドが認められ、又サザーン・プロッ
ト・ハイブリダイゼイションにより陽性反応が認められ
た。
ｕｌａｒｅ，■Ｍ． ｆｏｕｔｕｉｔｕｍ，■Ｍ． ｓ
ｃｒｏｆｕ ｌａｃｅｕｍ、の標準菌株並びに■ｓｓＤ
ＮＡ％＠Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｒｎｉｃ １ｉｖｅｒＤ
ＮＡ、■λｇｔｌｌ ＤＮＡを使用して、前記実施ｆｆ
ｉ １ （１）■と同様の損作を行ったところ、いずれ
のサンプルＤＮＡとも１０７塩基位のバンドは見られな
かった（第１図）． また、前記実施例１（１）（３）と同様の操作を行った
ところ、いずれのサンプルＤＮＡとも陽性反応は認めら
れなかった（第２図）．実施例２ 細菌学的方法で結核菌陽性と判定された喀痰から常法に
よりサンプルＤＮＡを得て、前記実施例１と同様の操作
を行ったところエチジウムブロマイド染色で１０７塩基
位にシャープなバンドが認められ、又サザーン・プロッ
ト・ハイブリダイゼイションにより陽性反応が認められ
た。
実施例３
結核患者５例の喀痰０．５ｍＱにそれぞれグアニジウム
イソシアネート緩衝液を加え、これにフェノール／クロ
ロホルム混液を加えて遠心分離し、水層に再度フェノー
ル／クロロホルム混液を加えて遠心分離し、次いで水層
にクロロホルム／イアソミルアルコール混液を加えて遠
心分離する。水層にエタノールを加えて−２０゜Ｃ以下
に３０分静置し、生戒した沈殿を遠心分離した後乾燥す
る。
イソシアネート緩衝液を加え、これにフェノール／クロ
ロホルム混液を加えて遠心分離し、水層に再度フェノー
ル／クロロホルム混液を加えて遠心分離し、次いで水層
にクロロホルム／イアソミルアルコール混液を加えて遠
心分離する。水層にエタノールを加えて−２０゜Ｃ以下
に３０分静置し、生戒した沈殿を遠心分離した後乾燥す
る。
得られたサンプルＤＮＡを水１０μｑに溶解し、そのう
ちの１μＱを用いて、前記実施例ｌと同様の操作を行っ
たところ、エチジウムブロマイド染色で試料■■■のサ
ンプルＤＮＡに１０７潮基泣のバンドが認められ（第３
図）、同様にサザーン・プロット・ハイブリダゼイショ
ンにより試料■■■のサンプルＤＮＡに陽性反応が認め
られた（第４図）。
ちの１μＱを用いて、前記実施例ｌと同様の操作を行っ
たところ、エチジウムブロマイド染色で試料■■■のサ
ンプルＤＮＡに１０７潮基泣のバンドが認められ（第３
図）、同様にサザーン・プロット・ハイブリダゼイショ
ンにより試料■■■のサンプルＤＮＡに陽性反応が認め
られた（第４図）。
なお試料■■■はガフキー陰性であり、試料■■はそれ
ぞれガフキー数４号、３号であった． 従って、本発明の方法によって従来の 細菌学的方法よりも高感度にしかも培養期間を必要とす
ることなく迅速に結核菌を検出同定することができる． 〔発明の効果〕 以上述べたように本発明の同定方法によれば、試料より
得たサンプルＤＮＡをＰＣＲ法により結核菌の特異的目
的塩基配列を増幅するので特異的目的塩基配列の濃度を
短時間で高めることができ、検出同定が著しく容易とな
る．従って、電気泳動後染色することにより同定するこ
とができる． 結核菌の特異的目的塩基配列として結核菌ＤＮＡの１９
ＫＤａを中心とする遺伝子領域を選択することにより、
特異性が高められ、更に前記両ブライマーを用いること
により、結核菌ＤＮＡのうち結核菌に特異性の高い目的
塩基配列が選択的に増幅されるため、高い特異性が得ら
れる。
ぞれガフキー数４号、３号であった． 従って、本発明の方法によって従来の 細菌学的方法よりも高感度にしかも培養期間を必要とす
ることなく迅速に結核菌を検出同定することができる． 〔発明の効果〕 以上述べたように本発明の同定方法によれば、試料より
得たサンプルＤＮＡをＰＣＲ法により結核菌の特異的目
的塩基配列を増幅するので特異的目的塩基配列の濃度を
短時間で高めることができ、検出同定が著しく容易とな
る．従って、電気泳動後染色することにより同定するこ
とができる． 結核菌の特異的目的塩基配列として結核菌ＤＮＡの１９
ＫＤａを中心とする遺伝子領域を選択することにより、
特異性が高められ、更に前記両ブライマーを用いること
により、結核菌ＤＮＡのうち結核菌に特異性の高い目的
塩基配列が選択的に増幅されるため、高い特異性が得ら
れる。
標識剤で標識した５’−ＡＡＡ ＧＡＣ ＣＴＧ ＣＧ
Ａ ＣＣＡＧＡＡ ＴＧ−３’ （ Ｔｂｃオリゴヌク
レオチド・プローブ）をプローブとして用いれば、前記
両プライマーにより規定される範囲よりも広い範囲の塩
基配列でも高感度に検出することができる．前記両プラ
イマーと併用することにより特異性が更に高められる。
Ａ ＣＣＡＧＡＡ ＴＧ−３’ （ Ｔｂｃオリゴヌク
レオチド・プローブ）をプローブとして用いれば、前記
両プライマーにより規定される範囲よりも広い範囲の塩
基配列でも高感度に検出することができる．前記両プラ
イマーと併用することにより特異性が更に高められる。
このように、本発明の同定方法により結核菌の検出同定
を数時間で行うことができ、数ケ月もかかる従来の細菌
学的方法等に比べ著しく迅速である。又、ＰＣＲ法で特
異的目的塩基配列を増幅するので、従来の結核菌に特異
的なｒ−ＲＮＡを検出する方法と同等の特異性が得られ
る． 従って、検体の判定に期間を要しないため治療の開始、
継続、終了を的確に決定することができ、患者の精神的
及び経済的負担を著しく軽減することができる。
を数時間で行うことができ、数ケ月もかかる従来の細菌
学的方法等に比べ著しく迅速である。又、ＰＣＲ法で特
異的目的塩基配列を増幅するので、従来の結核菌に特異
的なｒ−ＲＮＡを検出する方法と同等の特異性が得られ
る． 従って、検体の判定に期間を要しないため治療の開始、
継続、終了を的確に決定することができ、患者の精神的
及び経済的負担を著しく軽減することができる。
両プライマー、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ等をＰＣＲ
法用試薬とし、目的塩基配列の検出用試薬を備えてキッ
トとすることにより、試薬の調製の手間もかからず、再
現性の高い同定結果が短時間で得られる。
法用試薬とし、目的塩基配列の検出用試薬を備えてキッ
トとすることにより、試薬の調製の手間もかからず、再
現性の高い同定結果が短時間で得られる。
第１図は実施例１及び比較例１で説明したサンプルＤＮ
Ａの本発明の同定方法による同定結果を示す図、第２図
は実施例１及び比較例１で説明したサンプルＤＮＡの本
発明の同定方法による他の同定結果を示す図、第３図は
実施ＰＡ３で説明した本発明の同定方法による試料から
のサンプルＤＮＡの同定結果を示す図、第４図は実施Ｐ
！ＡＩ ３で説明した本発明の同定方法による試料から
のサンプルＤＮＡの他の同定結果を示す図、第５図は結
核菌ＤＮＡの１９キロダルトン部分の塩基配列を示す図
である。
Ａの本発明の同定方法による同定結果を示す図、第２図
は実施例１及び比較例１で説明したサンプルＤＮＡの本
発明の同定方法による他の同定結果を示す図、第３図は
実施ＰＡ３で説明した本発明の同定方法による試料から
のサンプルＤＮＡの同定結果を示す図、第４図は実施Ｐ
！ＡＩ ３で説明した本発明の同定方法による試料から
のサンプルＤＮＡの他の同定結果を示す図、第５図は結
核菌ＤＮＡの１９キロダルトン部分の塩基配列を示す図
である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション：
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）法
を用いて結核菌の特異的目的塩基配列を 増幅し、検出同定することを特徴とする結核菌の迅速同
定方法。 ２、第１項記載の方法において、結核菌の特異的目的塩
基配列が結核菌ＤＮＡの１９キロダルトン（ｋＤａ）由
来の遺伝子である結核菌の迅速同定方法。 ３、第１項記載の方法において、センスプライマーとし
て５−ＧＴＧＡＡＧＣＧＴＧＧＡＣＴＧＡＣＧＧＴＣ−
３’を、アンチセンスプライマーとして５−ＧＴＣＧＴ
ＧＧＴＣＴＣＡＣＣＧＣＴＴＣＣＴ−３’を使用する結
核菌の迅速同定方法。 ４、第１項記載の方法において、センスプライマーとし
て５−ＧＴＧＡＡＧＣＧＴＧＧＡＣＴＧＡＣＧＧＴＣ−
３’を、アンチセンスプライマーとして５−ＣＣＧＴＣ
ＧＡＴＧＡＣＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣ−３’を使用する結
核菌の迅速同定方法。 ５、第１項記載の方法において、センスプライマーとし
て５’−ＧＴＧＡＡＧＣＧＴＧＧＡＣＴＧＡＣＧＧＴＣ
−３’を、アンチセンスプライマーとして５−ＡＴＧＴ
ＴＧＡＣＡＴＴＧＣＣＧＧＣＣＧＣＧ−３’を使用する
結核菌の迅速同定方法。 ６、第１項乃至第５項記載のいずれかの方法において、
増幅した特異的目的塩基配列を電気泳動後、染色するこ
とにより検出する結核菌の迅速同定方法。 ７、第１項及至第５項記載のいずれかの方法において、
増幅した目的塩基配列を、センスプライマーとアンチセ
ンスプライマーとの間に位置する複数の塩基と相補的に
結合可能な塩基配列に標識剤で標識してなる特異的プロ
ーブを用いて検出する結核菌の迅速同定方法。 ８、第７項記載の方法において、特異的プローブが標識
した５’−ＡＡＡＧＡＣＣＴＧＣＧＡＣＣＡＧＡＡＴＧ
−３’である結核菌の迅速同定方法。 ９、第７項又は第８項記載の方法において、標識剤が放
射性同位元素、螢光色素、酵素、ビオチンである結核菌
の迅速同定方法。 １０、センスプライマーとして５’−ＧＴＧＡＡＧＣＧ
ＴＧＧＡＣＴＧＡＣＧＧＴＣ−３’、アンチセンスプラ
イマーとして５’−ＧＴＣＧＴＧＧＴＣＴＣＡＣＣＧＣ
ＴＴＣＣＴ−３’、５’−ＣＣＧＴＣＧＡＴＧＡＣＧＡ
ＣＣＴＴＣＧＧＣ−３’、５’−ＡＴＧＴＴＧＡＣＡＴ
ＴＧＣＣＧＧＣＣＧＣＧ−３’のいずれか、及びＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼを含有するＰＣＲ法用試薬からなる
ことを特徴とする結核菌の同定用試薬キット。 １１、第１０項記載のＰＣＲ法用試薬と増幅した目的塩
基配列の検出用試薬からなることを特徴とする結核菌の
同定用試薬キット。 １２、第１１項記載のキットにおいて、検出用試薬が、
電気泳動用試薬と染色用試薬からなる結核菌の同定用試
薬キット。 １３、第１１項記載のキットにおいて、目的塩基配列の
検出用試薬が少なくとも、特異的プローブとして標識し
た５’−ＡＡＡＧＡＣＣＴＧＣＧＡＣＣＡＧＡＡＴＧ−
３’を含む試薬である結核菌の同定用試薬キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25077789A JPH03164199A (ja) | 1989-08-09 | 1989-09-28 | 結核菌の迅速同定方法及び同定用試薬キット |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1-204747 | 1989-08-09 | ||
| JP20474789 | 1989-08-09 | ||
| JP25077789A JPH03164199A (ja) | 1989-08-09 | 1989-09-28 | 結核菌の迅速同定方法及び同定用試薬キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03164199A true JPH03164199A (ja) | 1991-07-16 |
Family
ID=26514623
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25077789A Pending JPH03164199A (ja) | 1989-08-09 | 1989-09-28 | 結核菌の迅速同定方法及び同定用試薬キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03164199A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06261757A (ja) * | 1991-08-15 | 1994-09-20 | F Hoffmann La Roche Ag | マイコバクテリア属細菌の核酸の検出およびマイコバクテリア属細菌の同定のための試薬および方法 |
| US5370998A (en) * | 1990-09-28 | 1994-12-06 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Repetitive DNA sequence specific for mycobacterium tuberculosis to be used for the diagnosis of tuberculosis |
-
1989
- 1989-09-28 JP JP25077789A patent/JPH03164199A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5370998A (en) * | 1990-09-28 | 1994-12-06 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Repetitive DNA sequence specific for mycobacterium tuberculosis to be used for the diagnosis of tuberculosis |
| JPH06261757A (ja) * | 1991-08-15 | 1994-09-20 | F Hoffmann La Roche Ag | マイコバクテリア属細菌の核酸の検出およびマイコバクテリア属細菌の同定のための試薬および方法 |
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