JPH06505143A - マイコバクテリウム・ツベルクローシスの検出に有用な核酸プローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 マイコバクテリウム・ラベルクローシスの検出に宵月な核酸プローブ本発明は一 般に医療診断の分野に関し、さらに詳しくはポリペプチド類、およびＤＮＡまた はＲＮＡのハイブリッド形成プローブ類を製造するのに適当なりＮＡ配列、なら びに生物試料中のマイコバクテリ同定する方法に関する。

発明の背景 結核症は古代から人類が冒されている感染症である。結核症の病因であるマイコ バクテリウム・ラベルクローシスは１００年以上も前に発見され、それ以来この 疾患を診断し治療するために多くの研究努力がなされている。それにもかかわら ず、今日でも、結核症は特に発展途上国では問題になっている。世界保険機関は 少なくとも３０００万人が結核症に冒されていると推定している。その上、毎年 約１０００万人の新しい患者が発生し、死亡者は年間約３００万人である。

結核症の原因微生物であるマイコバクテリウム・ラベルクローシスは、細長い直 線状もしくはわずかに曲がった末端が丸い桿菌である。この桿菌は長さが１〜４ μｍで幅が０．２〜０．５μｍで、抗酸性、非運動性および非胞子形成性でまた 莢膜で包まれてはいない。一般にマイコバクテリア（マイコバクテリウム属の細 菌）は抗酸性が特徴であり、これは脂質の含量が高いことと細胞壁の物理的保全 性が高いことが原因である。マイコバクテリアは、チール・ネールゼン（Ｚｉｅ ｈｌ−Ｎｅｅｌｓｅｎ）、キニョン（Ｋｉｎｙｏｕｎ）またはオーラミン−〇（ Ａｔ汀ａｍｉｎｅ　Ｏ）の＋籾のよ・うな抗酸性の染料で染色した後顕微鏡：” ’Ｃ確認することができる。しかし、抗酸性桿菌に一ついて染色後に行う顕微鏡 検査では、Ｍ・ラベルクローシスと他の抗酸性マイコバクテリＴとを識別夕る５ 二とができない。この障害を克服し結核症を正確に診断するため、試料か通常、 ５％〜ｌＯ％ＣＯ，インキコベーター中で３５゛Ｃにで約４−６週間培養される 。その後培養された試料は一連の生化学試験かなされ、エム・ラベルクローシス の判別同定か行われる（Ｚｉｎｓｓｅｒ　Ｍｉｅｒｏｈｉｏｌｏｇｙ、　Ｊｏｋ ｌｉｋら編集、　Ａｐｐｌｅｔｏｎ−Ｃｅｎｔｕｒｙ−Ｃｒａｆｃｓ社、ニュー ヨーク、　１９８０年６７７頁参照）ａＭ・ラベルクローシスを同定するのに要 する時間は、ＢＡＣＴＥＣの放射測定法（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ　Ｌａｈｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、米国、メリーランド州。

１・−ソン）で短縮することができる。ＢＡＣＴＥＣ放射測定血液培養装置は、 マイコバクテリアを検出するよう構成されている。要約すると、マイクバクテリ ア以外の細菌は、２％Ｎａ０Ｈ−Ｎ−アセチレート−システィンによって試料か ら除去される。次いで試料は、＋４０バルミチン酸を含有するＭｉｄｄｌｅｂｒ ｏｏｋ　７ＨＩ２培地で増殖させる。同時に、もうひとつの部分の臨床試料はＭ ・ラベルクローシスの増殖を阻害するＮＡＰ（ｐ−ニトロ−α−アセチルアミノ −β−ヒドロキシプロピオフェノン）が入っているＢＡＣＴＥＣびん内に接種す る。試料は、ＢＡＣＴＥＣ４６０で一週間に２回測定され、この装置は、＋４０ バルミチン酸の代謝による”ｃｏ２の産生を検出し、かつ増殖指数（ｇｒｏｗｔ ｈ　１ｎｄｅｘ、　Ｇｌ）も計算する。Ｇ４か１００に達すると、バイアルびん 内の試料がオーラミン−Ｏで染色されて抗酸性桿菌の存在が確認される。したか って、Ｍ・ラベルクローシスが存在することは、Ｇｌに基づいたＢＡＣＴＥＣ法 を用いて、ＮＡＰ中では増殖せずしかも抗酸性桿菌が存在していることが確認さ れる。この方法は通常の培養法より速いが、Ｍ・ラベルクローシスの存在を確認 するのに３〜４３日かかるのでまだ不利である。

そのｊ−に、丁の方法は、臨床試験室及び危険な放射性同位元素を使用する必要 かあり、またこれらの試験室は一般にこのような同位元素を扱うのに適切な設備 をもっていないので不利である。

より最近の別のＭ・ラベルクロ・−シス診断法は、米国、カリフォルニア州、サ ンディエゴのＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅ社から入手できる。この方法では、Ｍパソベル クローシスのリボソーＡ　ＲＮＡをコー　ドする遺伝子の配列から作った１２３ １標識オリゴヌクレオチドであるプローブが提供される。試料は、４週齢の培養 物から被検コロニーを取出し、次いで音波処理を行って細胞を破壊して開くこと によって調製される。放射能標識をつけたプローブを添加し、続いて連続洗浄を 行って未結合のプローブを除去する。Ｍ・ラベルクローシスの確認は捕捉された プローブが存在することによって行われるが、捕捉されたプローブはその放射能 標識で検出できる。この試験法の第一の欠点は、最初に試験室培養物を生物試料 から得なければならないことであり、そのために４週間もかかる。第二の欠点は 臨床試験室で放射性ヨウ素を使用することである。

本発明は、放射性同位元素の使用を必要とせずに、試験室培養物または臨床試料 中のＭ・ラベルクローシスの存在を同定する迅速試験法を提供するものである。

その上に他の関連する利点か提供される。

発明の要約 要約すれば、本発明は、図２に示す核酸番号１から３２３までのヌクレオチド配 列の一部分を少なくとも含有する標識付きプローブを提供するものであり、この プローブは、Ｍ・ラベルクローシス由来の核酸と特異的にハイブリッドを形成す ることができる。本発明の目的を達成するため、ヌクレオチド配列の部分は少な くとも１４個のヌクレオチドを有している。本発明の一実施態様では、標識は３ ２ｐ−ｄＣＴＰ、ビオチン−ｄＡＴＰ、およびジゴキシゲニンーｄＵＴＰからな る群から選択される。

本発明の他の態様では、（ａ）生物試料に含有されている細胞を処理して細胞性 核酸を露出させ、（ｂ）上記細胞性核酸を、図２に示す核酸番号１から３２３ま でのヌクレオチドが少なくとも一部分を含有する、Ｍ・ラベルクローシスに対し て特異的な標識プローブとともに、ハイブリッド形成が起こるのに充分な条件下 と時間でインキュベートし二次いで（ｃ）Ｍ・ラベルクローシスに特異的にハイ ブリッドを形成した標識付きプローブの存在を検出する段階を含んでなる、生物 試料中のＭ・ラベルクローシスの存在を検出する方法が提供される。

本発明の他の態様では、（ａ）生物試料に含有されている細胞を処理して細胞性 核酸を露出させ、；　（ｂ）選択された細胞性核酸配列を増幅し、（Ｃ）前記の 増幅された細胞性核酸配列を、図２に示す核酸番号１から３２３までのヌクレオ チド配列の少なくとも一部分を含有する、Ｍ・ラベルクローシスに対して特異的 な標識付きプローブとともに、ハイブリッド形成が起こるのに充分な条件下と時 間でインキュベートシ：次いで（ｄ）Ｍ・ラベルクローシスに特異的でハイブリ ッドを形成した標識付プローブの存在を検出する；段階を含んでなる、生物試料 中のＭ・ラベルクローシスの存在を検出する方法を提供するものである。上記２ つの方法のいずれの実施態様でも、生物試料中に含有されている細胞は、固体支 持体に固定化され、これは好ましくはプリハイブリダイズ（ｐｒｅｈｙｂｒｉｄ ｉｚｅ）される。

本発明の他の態様では、図１に示す核酸番号ｌから９５９までのヌクレオチドの 少なくとも一部分を含有し、Ｍ・ラベルクローシス由来の核酸と特異的にハイブ リッドを形成できる標識付きプローブが提供される。このプローブは、上記のよ うに本発明の種々の態様で利用することができる。

本発明の上記のおよびその外の態様は以下の詳細な説明と添付図面から明らかに なるであろう。

図面の簡単な説明 図１はクローンＡＫＳ−５８由来の９５９個の塩基対の挿入断片のヌクレオチド 配列を示す。

図２はクローンＡＫＳ−５８−４由来の３２３個の塩基対の挿入断片のヌクレオ チド配列を示す。

発明の詳細な説明 本発明は、ポリペプチド類、およびＤＮＡもしくはＲＮＡのハイブリッド形成プ ローブ類を製造するのに適したＤＮＡ配列と、生物試料中の２種類のような少数 のＭ・ラベルクローシス微生物を迅速に検出する方法を提供するものである。本 発明によれば、Ｍ・ラベルクローシスにほぼ１００％相同のＭ・ラベルクローシ ス群の微生物〔Ｍ・ミクロティ（Ｍ、　ｍ１ｃｒｏｔｉ）　、エム・アフリカヌ ム（Ｍ、　ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、エム・ボビス（Ｍ、　ｂｏｖｉｓ）およびエ ム・ボビスＢＣＧを含む〕を検出することかできる。さらに本発明において、生 物試料には、細胞培養物と、とりわけ痰、尿、胃液、脳を髄液、外科手術で切取 った組織および組織学的組織断片を含む臨床試料とが含まれる。

本発明の努力によって、ＤＮＡ配列はＭ・ラベルクローシスに独得の配列から選 択された。これらのＤＮＡ配列を得るために、ＤＮＡをまずＭ・ラベルクローシ スの培養物から精製する。Ｍ・ラベルクローシスは、中でも、Ａｍｅｒｉｃａｎ 　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣＸ米国、メリ ーランド州、ロックビル）を含む多くの起源からの培養物として得ることができ る。Ｍ・ラベルクローシスは、鶏卵−ジャガイモベースの培地（例えばＬｏｗｅ ｎｓｔｅｉｎ−Ｊｅｎｓｅｎ培地）または寒天ベースの培地（例えばＭｉｄｄｌ ｅｂｒｏｏｋ　７Ｈ−１０培地）を含むマイコバクテリアを増殖できる当該技術 分野で公知の培地で培養することができる。

これらの培地はＰＭＬ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社（米国、オレゴン 州、Ｔｕａｌａｔｉｎ）から入手できる。その培養物は約５〜１０％ＣＯ１の雰 囲気で増殖させなければならない。Ｍ・ラベルクローシスを増殖させるのに特に 好ましい条件には、オレイン酸、アルブミン、デキストロースおよびカタラーゼ （“０ＡＤＣ”、　Ｄｉｆｃｏ社、米国、ミズーリ州、ガイサーバーグ）を補充 したＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ　７Ｈ−９ブロス内での増殖と、約５％Ｃ０２の雰 囲気下約３７°Ｃの温度でのインキュベーションが含まれる。その増殖速度が非 常に遅いために、Ｍ・ラベルクローシスの培養物を増殖させるには３〜６週間必 要である。

次に、マイコバクテリアを培養物から取出し、処理してＤＮＡを放出させる。マ イコバクテリアをブロス中で増殖させる場合には、シクロセリンを、収穫する２ ４時間前に添加する。その培養物は加熱して不活性化し次いで遠心分離してマイ コバクテリアをペレットにする。ＤＮＡを放出させるため、その細胞を再懸濁さ せ、次いで当該技術分野の当業者にはよく知られている多くの方法のいずれかで 溶解させる（　Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　： 　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ第２版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　１３４〜１３９頁、１９ ８９年参照）。特に好ましいのは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）とリゾチ ームを用いて細菌を溶菌し、続いてフェノールで押出し、エタノールで沈澱させ 、次にＴｆ　ＲＮアーゼとＲＮＮアーゼで処理してＤＮＡを精製する方法である 。

得られたマイコバクテリアのＤＮＡを次に分画する。特に好ましいのは、ＤＮＡ を消化できる当該技術分野で公知の制限酵素例えばＥｃｏ　Ｒ１を使用すること である。マイコバクテリアのＤＮＡは消化されると、アガロースゲルの電気泳動 法と続いて電気溶出法を用いることによって適当な大きさのＤＮＡの画分を選択 することができる。マイコバクテリアのＤＮＡ画分は長さが約２００〜４，００ ０　ｂｐのものが好ましく、より理想的なのは長さが約５００〜３．０００　ｂ ｐのものである。マイコバクテリアＤＮＡを消化するのに使用するのと同じ制限 酵素は、プラスミドＤＮＡを消化するのにも使用され、マイコバクテリアのＤＮ Ａを、付着末端を使用することによってプラスミドに挿入および連結させること ができる。消化されたプラスミドと、適当な大きさのマイコバクテリアのＤＮＡ 画分とをＴ４リガーゼで連結して、次に当該技術分野で公知の方法を用いて大腸 菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）にトランスフェクトすることができる。当該技術分野で公 知のいずれのプラスミドでもＭ・ラベルクローシスの消化物のベクターとして使 用できるが、プラスミドｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ、社、米国、ニューシャーシー州、ビス力タウ エイ）が特に好ましい。このプラスミドはアンピシリン耐性とβ−ガラクトシダ ーゼの遺伝子、Ｔ３とＴ７の転写プロモーター、および二本鎖ＤＮＡの配列決定 を可能にする普遍プライマーと逆プライマーの配列をもっている。さらにこのプ ラスミドは、バクテリオファージＭ１３とＦ１起源（Ｐｉ　ｏｒｉｇｉｎ）のポ リクローニング部位をもっているので、そのプラスミドから配列決定が可能な一 本鎖ＤＮＡを作ることができる。大腸菌をこのプラスミドでトランスフェクトす ると、アンピシリンを含有する培地で増殖可能なコロニーが得られる。さらにＤ ＮＡ挿入断片を有するプラスミドをもっている、トランスフェクトされた大腸菌 は、ＩＰＴＧとＢｌｕｅＧａｌを含有する２倍の（ｔｗｏ　ｔｉｍｅｓ）酵母ト リプトン培地（２ＹＴ）上に白色のコロニーを生成することによって同定するこ とができる。このプラスミドのポリクローニング部位に異種のＤＮＡフラグメン トを挿入すると、α−相補ができないアミノ末端フラグメントが生成するために 、２ＹＴのプレート上に白色コロニーが生成する（　Ｓａｍｂｒｏｏｋらの上記 文献の１．８５〜１．８６頁参照）次に、適当な挿入断片を有するプラスミドを 含有するコロニーを通常の方法を用いてスクリーニングする。当該技術分野で公 知の方法によってハイブリッド形成を行うことが特に好ましい（例えばＳａｍｂ ｒｏｏｋらの上記文献の１．９０〜ｉ、　１０４頁参照）。要約すると、白色コ ロニーは、レプリカ平板法によって、陽性については切断修復によって３２Ｐで 標識をつけたＭ・ラベルクロースＤＮＡでスクリーニングし、陰性については、 Ｍ・アビウムーイントラセルラーレ（Ｍ。

のマイコバクテリア（ＭＯＴＴ）由来の切断修復（ｍｉｃｋ　ｔｒａｎｓｌａｔ ｅｄ）によってｘｔｐで標識をつけたＤＮＡでスクリーニングする。ラベルクロ ーシス種以外のこれらマイコバクテリアは、当該技術分野で公知の培地を用いて 増殖させることができ、そのＤＮＡはＭ・ラベルクローシスについて先に述べた 方法を用いて精製することができる。

Ｍ・ラベルクローシスとはハイブリッドを形成し他のマイコバクテリアとはハイ ブリッドを形成しないコロニーからのプラスミドの単離は、挿入断片の大きさを 確認しかつその特異性を保証するために行う。特にミニブレツブアルカリ法（ｍ ｉｎｉｐｒｅｐ　ａｌｋａｌｉ　ｍｅｔｈｏｄ）が好ましい（Ｓａｍｂｒｏｏｋ の前記文献１．２５〜１．２８頁参照）。要約すると、プラスミドを、挿入に使 用したのと同じ制限酵素で消化し次いて挿入断片の大きさを測定できるようにゲ ル上に泳動させる。そのＤＮＡを、Ｖａｃｕ　Ｇｅｎｅ（登録商標）装置（ＬＫ Ｂ−Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ社、スエーデン、ブロンマ）で転写アルカリ法を用い て、ナイロン膜に転写する。ナイロン膜に結合されているＤＮＡ挿入断片を、標 識付きのＭ・ラベルクローシスＤＮＡとラベルクローシス種以外のマイコバクテ リア（ＭＯＴＴ）とのハイブリッド形成について試験する。Ｍ・ラベルクローシ スのＤＮＡとはハイブリッドを形成しＭＯＴＴとはハイブリッドを形成しない挿 入断片は、ハイブリッド形成プローブに適したＤＮＡ配列を製造するのに使用で きる。さらに以下で考察するように、そのＤＮＡ配列の読取り枠はポリペプチド 類を製造するのに利用できる。

さらに特異性を確認するために、挿入断片を含有するクローンはさらに特性決定 がなされる。要約すると、Ｍ・ラベルクローシスとＭＯＴＴのＤＮＡは、さきに 使用したのと同じ制限酵素、好ましくはＥｃ。

Ｒｒで消化される。次に、その消化されたマイコバクテリアのＤＮＡは、アガロ ースゲルの電気泳動法で分析される。そのＤＮＡを次にゲルかるナイロン膜に転 写し、放射能標識付き挿入断片とのハイブリッド形成について試験される。

次に陽性のクローンを、大量のプラスミドを製造するために大規模に増殖させる 。プラスミドＤＮＡを大規模に製造する方法は当該技術分野で公知である（例え ば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの上記文献の１．３３〜１．３９頁参照）。要約すれば 、大腸菌が、この細菌の増殖を維持できるいずれかの培地を用いて増殖させる。

特に好ましいのはＴｅｒｒｉｆｉｃ　Ｂｒｏｔｈである（　Ｓａｍｂｒｏｏｋら の上記文献のＡ、２頁、１９８９年参照）。次に細胞は溶解され、ＤＮＡか上記 のようにして抽出精製される。

次にプラスミド中の挿入断片の検索が行われる。プラスミドは、Ｍ・ラベルクロ ーシスＤＮＡを分画してプラスミドに挿入するのに最初に用いたのと同じ制限酵 素で消化される。次にその挿入断片は、アガロースゲル電気泳動法によって他の プラスミド系ＤＮＡから単離する。

単離されたＤＮＡ挿入断片は、さらに、Ｂａｍ　ＨＩのような異なる制限酵素を 用いて分画し、上記のハイブリッド形成法とクローン化法によってＭ・ラベルク ローシスに対する特異性についてもう一度選択される。さらに挿入断片のＭ・ラ ベルクローシスに対する特異性は上記のようにして確認される。

ＤＮＡ挿入断片は単離されると、当該技術分野で公知の方法を用いて配列を決定 することかできる。特に好ましいのは、Ｓａｎｇｅｒらの酵素法（ＤＮＡ　Ｓｅ ｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｗｉｔｈ　Ｃｈａｉｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ　Ｉｎｈｉ ｂｉｔｏｒｓ”　。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、、７４巻、５４６３頁、１９ ７７年）とＭａｘａｍとＧ１１ｂｅｒｔの化学的分解法（”Ａ　Ｎｅｗ　Ｍｅｔ ｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＤＮＡ　”　。

Ｐｒｏｃ、、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、、７４巻、５６０頁、１９ ７７年）である。

挿入断片のＤＮＡ配列は、（Ｉ）ポリペプチド類の製造：または（ＩＩ）生物試 料中のＭ・ラベルクローシスのＤＮＡもしくはＲＮＡを検出するのに適したハイ ブリッド形成プローブと増幅プライマーの製造に利用できる。

■　ポリペプチドの製造 挿入断片のＤＮＡ配列は読取り枠について分析する。読取り枠は、ＤＮＡ配列を 、ＡＵＧのような開始コドンについてサーチすることによって測定される。開始 コドンに続く配列は、細胞によって転写され次いで翻訳されてポリペプチドを発 現する。したがって読取り枠内に見られるＤＮＡ配列は、ポリペプチドを合成法 で構築するかまたは宿主細胞からポリペプチドを組換え法で発現することによっ て、ポリペプチドを製造するのに利用できる。得られたペプチドは、高圧液体ク ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ような当該技術分野で公知の方法を用いて精製す ることができる。その精製されたポリペプチドはい（つもの目的に利用できる。

例えば、そのポリペプチドは、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ） で用いるため、当該技術分野で公知の方法で、モノクローナル抗体もしくはポリ クローナル抗体を生成する抗原の起源として使用できる。このような検定法は、 Ｍ・ラベルクローシス抗原に対する抗体の存在について個体の血清を試験するの に用いることかできる。

もう一つの用途は、Ｍ・ラベルクローシスに対する事前の免疫学的暴露について 試験するために、精製ポリペプチドを内皮注射に用いる用途である。この方法で 用いる場合、ポリペプチドは、当該技術分野で公知の方法を用いて皮肉投与用に 精製し製造される。ＰＰＤ試験法と同様に、皮内注射部位の周囲の領域に発生す る紅疹がポリペプチドに対する免疫応答を示す。したかって陽性反応は、Ｍ・ラ ベルクローシスに対して事前に免疫学的に暴露されたことを示している。

■　ハイブリッド形成プローブ またＭ・ラベルクローシス由来のＤＮＡ配列は、増幅に用いるプライマー、およ びＭ・ラベルクローシスのＤＮＡもしくはＲＮＡを検出するのに用いるプローブ を製造するのに用いることかできる。上記のように、当該技術分野の当業者は、 Ｍ・ラベルクローシス由来の核酸配列と特異的にハイブリッドを形成できるＲＮ ＡもしくはＤＮＡのプローブを構築するのに、本発明のＤＮＡ配列を使用するこ とができる。

本発明の目的を達成するために、プローブは、約５〜６倍のＳＳＣの条件下でか つ６４°Ｃ〜６８°Ｃの温度でハイブリッドを形成する場合、“Ｍ・ラベルクロ ーシスＤＮＡと特異的にハイブリッドを形成できる“。

特に好ましい条件は約６　ｘ　５ＳＣ（Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１）で６５°Ｃの条件で ある。

これらのプローブは、ハイブリッドを形成するＭ・ラベルクローシスの配列に対 して完全に相補的である必要はない。プローブの約３０％はどは、Ｍ・ラベルク ローシスの核酸配列に比べて誤対合であってもよく、それにもかかわらずＭ・ラ ベルクローシスの存在を検出することができる。Ｑβレブリカーゼまたはポリメ ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅系が用いられる場合、プローブは増幅の ために用いられる２つのプライマーの間に位置するように選択される。

そのプローブが有するヌクレオチドは、約１４個はどの少数でもよいが、通常は 約２４個であり、３２３個以上の多数でもよい。プローブは、図２に示す核酸番 号１から３２３までのヌクレオチドの一部分から選択するか、またはかわりに図 １に示す９５９　ｂｐの挿入断片の一部分から選択される。

これらのプローブ類は、当該技術分野で公知の方法を用いて構築し標識をつける ことができる。例えば２４個の塩基の短かいプローブは合成法で製造することが できる。約７５〜約２８３個の塩基の長いプローブは、’　２Ｐ　−ｄＣＴＰ、 ジゴキシゲニンーｄＵＴＰまｔ；はビオチン−ｄＡＴＰのようなｆｆ識をつけた 前駆物質の存在下でＱβレブリカーゼまたはＰＣＲ増幅増幅用いて製造すること が好ましい。３２３個以上の塩基対のプローブは、トランスフェクトされた細胞 を増殖させ、関連配列を精製し、次いでランダムプライマー法でプライマーに標 識を付けることによって直接製造することができる。

プローブは、とりわけ放射性マーカー、蛍光マーカー、酵素マーカーおよび色素 原マーカーを含む当該技術分野で公知の検出系のいずれかで標識を付けることが できる。好ましい標識としては３２Ｐ−ｄＣＴＰ、ジゴキシゲニンーｄＵＴＰお よびビオチン−ｄＡＴＰがある。ジゴキシゲニンーｄｔＪＴＰは、その感受性と 、標的の配列を放射性標識なしで検出できることから特に好ましい。好ましい態 様では、ジゴキシゲニンーｄＵＴＰは、ターミナルデオキシヌクレオチジルトラ ンスフエラーゼを用いて２４塩基のオリゴヌクレオチドに組込まれる。

本発明のハイブリッド形成プローブは、当該技術分野の当業者にとって公知の方 法を用いて、試験室の細胞培養物中のＭ・ラベルクローシスのＤＮＡまたはＲＮ Ａの存在を直接確認するのに用いることができる。一つまり、細胞は上記のよう に処理されて細胞核酸を露出させる。次にその細胞核酸は、標識を付けたＭ・ラ ベルクローシス特異的プローブとともに、ハイブリッド形成が起こるのに充分な 条件下と時間でインキュベートされ、次いでＭ・ラベルクローシスに特異的でハ イブリッドを形成した標識付きプローブか検出される。

細胞培養物以外の例えば痰のような生物試料中には、Ｍ・ラベルクローシスは比 較的少数しか存在していない。したがって、検出を強化するために、増幅系を使 用してＭ・ラベルクローシスのＤＮＡもしくはＲＮＡの量を増大することが好ま しい。当該技術分野には各種の方法が知られており、ＲＮＡ増幅法（Ｌｉｚａｒ ｄｉら、Ｂｉｏ／Ｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ。

６巻、１１９７〜１２０２頁、１９８８年参照）およびＰＣＨによるＤＮＡ増幅 法（Ｍｕｉｌｉｓら、米国特許第４．６８３．１９５号；　Ｍｕｌｌｉｓら、米 国特許第４，６８３、２０２号およびＭｕｌｌｉｓら米国特許第４．８００．１ ５９号参照。これらは本願に援用するものとする）がある。

ＴａｑポリメラーゼでＤＮＡ増幅を行うのに用いるプライマーは（ポリメラーゼ 連鎖反応すなわち“ＰＣＲ″）、標的配列に対して高度に特異的でかつ標的配列 と安定な二本鎖を形成するＤＮＡ配列から選択しなければならない。またプライ マーは非相補的でなければならばならず特に３′末端でそうでなければならず、 それ自身または他のプライマーと二量体を形成してはならずおよびそのＤＮＡの 他の領域と二次構造もしくは二本鎖を形成してはならない。一般に長さが約２４ 個のヌクレオチドであるプライマーが好ましく、当該技術分野で公知の方法を用 いて容易に合成することができる。選択された細胞核酸配列を増幅するために、 プライマーは配列の両端から選択され、好ましくは図２に示す核酸番号ｌから３ ２３までのヌクレオチド配列の一部分から選択される。しかしプライマーは、図 １に示す９５９　ｂｐのフラグメント内の他の配列から選択することもできる。

ＤＮＡのプライマーとプローブが選択され構築されると、痰もしくは試験室の培 養物のような生物試料はＭ・ラベルクローシスの存在について試験することがで きる。

生物試料が例えば痰のような臨床試料の場合、第一試料は、まず液化、汚染除去 、濃縮が行われ（ＲａｔｎａｍおよびＭａｒｃｈ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＣｌ ｉｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　２３（３）巻、５８２〜５８５頁 、１９８６年参照）、次いで多数の確立された方法のいずれかを用いてＤＮＡの 抽出が行われる。一つの方法では、濃縮された痰はＴＥ緩衝液で容積を３００μ ｌまで増大して、続いて直径が２００ミクロンのガラスピース（ＳｉｇｍａＣｈ ｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、社、米国、ミヅーリ州、セントルイス）を添加する。

１■のりゾチームを添加し、次いで充分なＳＤＳを加えて試料を最終濃度１％に する。その試料を３７°Ｃで６０分間インキュベートし、次に７０°Ｃで１５分 間音波処理を行う。その試料をフェノールで抽出し、エタノールで沈澱させ、Ｔ Ｉ　ＲＮアーゼとＲＮＮアーゼで処理する。２回目のフェノール抽出とエタノー ルによる沈澱を、純度を保証するために行ってもよい。

第二の方法では、汚染除去と濃縮を行った痰１００μｆ、ＴＥ緩衝液２２μ！お よび３３％リゾチーム５０μｌを９５℃で１５分間インキュベートする。次に２ ０％ＳＤＳ　３０μｌを添加し、６５℃で１５分間インキュベートし、続いて５ Ｍ過塩素酸ナトリウム１０ｏμｌを加えて室温で５分間インキュベートする。そ の試料をクロロホルム／イソアミルアルコールで抽出しエタノールで沈澱させる 。

第３の方法では、汚染除去と濃縮を行った痰を０．１　Ｍ　Ｎａｐ！（、２ＭＮ ａＣｌおよび０．５％ＳＤＳの最終濃度の液中に懸濁させ、９５℃で１５分間イ ンキュベートする。フェノールで抽出した後、ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、 水に再び溶解した。

次に、精製した試料由来の選択された細胞核酸配列を、当該技術分野で公知の方 法を用いて上記のプライマーで増幅する。要約−するＥ　と、ポリメラーゼ連鎖 反応は、９５℃で耐熱性のテルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕ ａｔｉｃｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメー　ラーゼ）を使用す ることに基づいている。ＤＮＡ試料は一本Ｍ　ＤＮＡを生成させるために９５℃ で変性される。上記のような特異的なプライマーは、プライマーのＡＴ／ＧＣ比 率によって３７°Ｃ〜７０’Ｃでアニールさ）　れる。プライマーは、反対側の ストワンドを鋳型にするため、Ｔａｑポリメラーゼを用いて７２℃で伸長される 。これらの３ステツプが１サイクルを構成している。各サイクルを終ったときに 標的ＤＮＡは２倍になり、ＤＮＡは２５サイクルを終ったときに少なくとも１０ “倍増大している。

増幅した試料は、次にナイロン膜のような固体支持体に転写して、上記のように 特異的な標識をつけたプローブを用いて、ハイブリッｊ　ド形成について試験す る。一つの実施態様では、試料は、Ｂｉｏ−Ｄｏｔ（商標）装置（Ｂｉｏ−Ｒａ ｃ１社、米国、カリフォルニア州、リッチセント）を用いてナイロンフィルター に転写される。次にこのフィルターは当該技術分野で公知の方法を用いて１時間 、ブリハイブリダイズを行い（Ｓａｍｂｒｏｏｋらの前記文献のＡ１．１０２頁 参照）、次にジゴキシゲニンーｄＵＴＰで標識を付けた２４塩基のオリゴヌクレ オチドのプローブと一夜ハイブリッドを形成させた。上記フィルターを一夜イン キユベートし洗浄した後、陽性のドツトプロットがアルカリホスファターゼ接合 抗ジゴキシゲニン抗体で検出され、続いてフィルターを一回洗い、ＢＣＩＰ／Ｎ ＢＴ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルボスフェート／ニトロブルーテ トラゾリウム）のような色素原基質を添加する。

上記のＤＮＡベースのＰｃｔ？増幅／ハイブリッド形成法に代わるものとして、 ＲＮＡベースの増幅法がある（Ｌｉｚａｒｄｉ　ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｙ。

６巻、１１９７〜１２０２頁、１９８８年；　Ｋｒａｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、 　３３９巻、４０１〜４０２頁、■９８９年；およびＬａｍｅ　Ｉ　ｉら、Ｃ１ １ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　３５（９）巻、幅用は、いくつかのＲＮ Ａバクテリオファージ（特にＱβ）がＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの作用で 複製するということに基づいている。

このポリメラーゼ、“Ｑβレプリカーゼ“は、長さが追加されてい輻する方法は 、当該技術分野の当業者にとって公知である。要約すると、生物試料内の細胞を 処理して細胞核酸を露出させる。次に、選択された細胞核酸配列をＱβレプリカ ーゼで増幅させる。上記のように、その配列は、図２に示す核酸番号ｌから３２ ３までのヌクレオチド配列の一部分または図１に示す９５９　ｂｐのフラグメン トの配列から選択される。次に放射能標識を付けたプローブは上記のような方法 を用いて増幅ＲＮＡの存在を検出するのに用いられる。

上記の増幅／ハイブリッド形成法に代わる方法として、Ｄｕｃｋらが述べている ような切断可能な結合を有する核酸組成物を使用する方法がある（米国特許第４ ．８７６、１８７号、この特許は本願に援用するものとする）。要約すると、図 ２に示す核酸配列の一部分から選択される標的ヌクレオチド配列に相補的なプロ ーブが製造される。好ましい態様では、その標的はＤＮＡであり、そのプローブ は、その一方の末端に標識を付けたＤＮＡを含有し、その中央の近くに１〜４の ＲＮＡヌクレオチドを有し、他方の末端には固体支持体に結合しつるＤＮＡを含 有している。次にそのプローブは、試料とハイブリッドを形成する条件下でイン キュベートされると、標的配列が存在すれば標的配列はプローブに結合する。次 に反応混合物は、ＲＮＡの中心を開裂するエンドヌクレアーゼＨのような複合体 で処理される。プローブが標的配列とハイブリッドを形成しなかったならば、標 識を付けたＤＮＡは、固体支持体に連結されたＤＮＡから分離するであろう。

したがって、固体支持体を反応混合物から取出したとき、標識の喪失は検出する ことができる。

当該技術分野の当業者にとって明らかなことであるが、現在開発中の他の増幅法 も本発明に利用できる（例えばＨｏｒｎら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ、　１７（１７）巻、６９５９〜６９６７頁、１９８９年；　Ｃ１ｙｖ ｅら、Ｊ。

ｏｆ　Ｂｆｏｔｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　＆　Ｃｈｅｗ、、４巻、３５７〜３６ ６頁、１９８９年；およびＩＪｒｄｅｎら、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ、　３５（８）巻、１５７１〜１５７５頁、１９８９年参照）。

以下の実施例は例示を目的として提供するものであり本発明を限定するものでは ない。

ＤＮＡプライマーおよびＤＮＡプローブとして使用するのに適したマイコバクテ リウム・ラベルクローシスのＤＮＡ配列の決定Ｍ・ラベルクローシスＤＮＡのク ローニングマイコバクテリウム・ラベルクローシスＨ３７Ｒｖ菌株ＴＭＣ１をｔ ｈｅＴｒｕｄｅａｕ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ（米国、ニューヨーク州、サラナック ）から入手した。このマイコバクテリアを、０ＡＤＣ強化剤を補充したＭｉｄｄ ｌｅｔ＋ｒｏｏｋ７）１９プロス中（２００−づつのバッチ）、静置培養で、５ ％二酸化炭素の雰囲気下、３７°Ｃにて約６週間増殖させた。シクロセリンを添 加しく１■／−）次いで２４時間後、培養物を７０″Ｃで１５分間加熱し、Ｓｏ ｒ　Ｖａｌ　５３３４０−ターを使用し、６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を 行った。生成したベレットを、ＴＥ緩衝液と新しく調製したリゾチーム（１■／ ｍｊ）中に再懸濁させ３７℃で６０分間インキュベートした。

ＳＤＳを加えて溶液の濃度を１％にし、さらに１時間インキュベートした。溶解 したマイコバクテリア由来のＤＮＡをフェノールで２回抽出しエタノールで沈澱 させた。そのＤＮＡをＴＩ　ＲＮアーゼ（１単位１０、Ｄ、）　＋ＲＮアーゼＡ （１００μｇ／−）で処理し、３０分間３７℃でインキュベートした。得られた ＤＮＡ溶液をＬ５Ｍ酢酸アンモニウムとエタノールで沈澱させた。生成したＤＮ Ａを１５．ＯＯＯＸｇで遠心分離させることによって沈澱させ、ＴＥ緩衝液中に 再懸濁させて最終濃度を１■／−とした。

上記の精製されたＭ・ラベルクローシスＤＮＡをＩＯＵ／μｇのＥｃ。

ＲＩで消化し、０．７％アガロースゲル上を泳動させた。２００〜４０００ｂｌ ）間のフラグメントを電気溶出させ、Ｇｅｎｅｃ　１ｅａｎ　（登録商標ＸＢｉ ｏ　１０１゜米国、カリフォルニア州、う・ジョラ）を使って精製した。プラス ミドｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）もＥｃｏ　Ｒ１で消化し、細菌 アルカリホスファターゼで脱リン酸を行い、全体もしくは強化した、Ｅｃｏ　Ｒ Ｉ消化Ｍ・ラベルクローシスと、３：ｌのモル比で混合した。試料を、Ｔ４リガ ーゼを用い、２６°Ｃで４時間かけて連結し、次いで大腸菌ＭＮ５２２中にトラ ンスフェクトした。その細胞をＩＰＴＧとＢｌｕｅ　Ｇａｌを含有するアンピシ リンプレート上に広げた。白色コロニーを取出し、Ｍ・ラベルクローシスの挿入 断片についてスクリーニングした。

Ｍ・ラベルクローシス挿入断片のスクリーニング約ｉｏ、　ｏｏｏ個の組換え体 （白色コロニー）を上記クローン化試験から得た。３．０００個のコロニーをひ ろい上げて、ランダムプライマーによって”Ｐ−ｄＣＴＰで標識をつけた全Ｍ・ ラベルクローシスＤＮＡとハイブリッドを形成させるために、ニトロセルロース フィルターに転写した。

コロニーハイブリッド形成フィルター装ｆｆ１ＭＶＯ３２１０（Ｓｅｂｌｅｊｃ ｈｅｒ＆　５ｃｈｕｅ１１社）を用いて、白色コロニーの７枚のレプリカプレー トをニトロセルロース上に作製した。そのニトロセルロースのブ、リハイブリダ イズ処理を、１０×デンハート溶液、６　Ｘ５ＳＰＥ、　１．２５％ＳＤＳおよ び５０Ｕｇ／−サケ精巣ＤＮＡを用い６５°Ｃで３時間行った。マイコバクテリ アのＤＮＡは、Ｍ・ラベルクローシスの培養物およびラベルクローシス種以外の マイコバクテリア（ＭＯＴＴ）の培養物から、ハイブリッド形成用に調製した。

ＭＯＴＴは負の対照として機能し、エム・アビウムーイントラセルラーレ、エム ・カンサシ−、エム・ケローネ、エム・マリナム、エム・シミエ（Ｍ、　５１ｍ １ａｅ）およびエム・アビウムーイントラセルラーレ／エム・スクロフラセウム （ＭＡＩＳ）が含まれる。ＤＮＡは上記精製法で調製し次にそのＤＮＡにランダ ムプライマー法により”Ｐ−ｄＣＴＰで標識を付けた。ＤＮＡグレードの５ｅｐ ｈａｄｅｘＧ−５０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、スエーデン、アブサラ）を用いる スパンカラム（５ｐｕｎｅｏ　ｌｕｍｎ）カラムクロマトグラフィーによって、 オリゴヌクレオチド類を標識ＤＮＡから分離した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌ ｅｅｕｌａｙＣｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ、　４６６頁、　１９８２年参照）。

標識付きＤＮＡを、１００°Ｃで１０分間インキュベートすることによって変性 させて一本鎖形にした。標識付きＤＮＡを１０＠ＣＰＭ／ｍｉの濃度で用い、次 いで１６０μＥづつをフィルターの各ｄに対して使用した。ハイブリッド形成は 、１０％のデキストラン硫酸、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１，１％ＳＤＳおよびＩ００μＩ Ｉ／ｒｄの変性サケ精巣ＤＮＡを含有する溶液中、６５℃のインキュベーション 温度で１６時間行った。ハイブリッド形成を行った後、フィルターは、６　Ｘ５ ＳＰＥ、　０．５％ＳＤＳで室温にて１５分間洗浄し、次に第２洗浄をｌＸ５Ｓ ＰＥ、１％ＳＤＳで３７℃にて３０分間行い、次いで最終洗浄を０．　Ｉ　Ｎ５ ＳＰＥ、１％ＳＤＳで６５℃にて３０分間行った。これらの洗浄を終ってから、 フィルターを室温で乾燥させた。次にそのフィルターは、Ｋｏｄａｋ　Ｘ−Ｏｍ ａｔ　ＲＰ（登録商標）フィルム（ＥａｓｔｍａｎＫｏｄａｋ社、米国、ニュー ヨーク州、ロチニスター）と２枚の増感紙（Ｄｕｐｏｎ　Ｃｒｏｎｅｘ　（登録 商標）　、Ｈｉ−Ｐｌｕｓ　Ｄｕｐｏｎｔ、米国、プラウエア州、ウィルミント ン〕を使って一７０°Ｃて２４時間オートラジオグラフィに付した。

Ｍ・ラベルクローシスに対して陽性がＭＯＴＴに対して陰性であったコロニーを 、アンピシリン含有の２ＹＴ培地で増殖させた。次に、プラスミドをミニブレツ ブアルカリ液法を用いて単離しく　Ｓａｍｂｒｏｏｋの上記文献の１．２５〜１ ．２８頁参照）。Ｅｃｏ　Ｒｆで消化し、０．７％アガロースゲル中で分析して 挿入断片の存在を測定した。その挿入断片をナイロン膜に転写し、ランダムプラ イマー法により”Ｐ−ｄＣＴＰで標識を付けたＭ・ラベルクローシスＤＮＡとハ イブリッドを形成させた。

ハイブリッドを形成させた後、プローブを除き、フィルターをエム・アビウムー イントラセルラーレとエム・スクロフラセウムの混合物と再びハイブリッドを形 成させた。

Ｍ・ラベルクローシスＤＮＡとハイブリッドを形成するがＭＯＴＴとはハイブリ ッドを形成しない挿入断片を有するクローナルコロニーを選択した。このクロー ン（ＡＳＫ−５８）の配列を決定し、図１に示す。

ＡＳＫ−５８はＡＴＣＣに受託番号６８１９７で寄託されている。

ＡＳＫ−５８の特異性を試験するため、Ｍ・ラベルクローシスとＭＯＴＴ由来の ＤＮＡ　１０ＵｇづつをＩＯＵ／μｇのＥｅｏ　ＲＩで、３７℃にて２時間消化 した。得られた試料を０．７％アガロースゲルに加え、ＴＨＥ緩衝液中７０ボル トで泳動させた。電気泳動を終了し、ゲルを０．５μｇ／−の臭化エチジウムで 染色した。そのゲルを０．２５Ｎ　ＨＣＩで４分間処理した。得られたＤＮＡは 、０．４　Ｎ　ＮａＯＨ，１，５Ｍ　ＮａＣ１を用い、Ｖａｃｕｇｅｎｅ装置（ ＬＫＢ−Ｐｈａｒｍａｅ　ｉａ社、スエーデン、ブロンマ）で、５０ａｏ水柱の 圧力下４５分間かけて、ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ　（登録商標）　、Ａｍ ｅｒｓｈａｍ社）に転写した。その膜を室温で乾燥し、次に真空オーブンで８０ °Ｃにて２０分間乾燥した。その膜を、クローンの精製挿入断片とハイブリッド を形成させた。なおこの挿入断片はランダムプライマー法により”Ｐ−ｄＣＴＰ で標識を付けである。Ｍ・ラベルクローシスＤＮＡの試料だけが、９５９　ｂｐ ｆｆＪｉ域のレベルでバンドを生成するが一方残りのＭＯＴＴ試料は陰性であっ た。

短かい挿入断片の製造 上記のＡＳＫ−５８クローンをＴｅｒｒｉｆｉｃブロス（Ｆｏｃｕｓ　９　：　 ２）を用いＩＬ容積で増殖させた。細胞をアルカリ法で溶解し、フェノールで押 出し、次にエタノールで沈澱させた。次にその試料をＴＩ　ＲＮアーゼ、膵ＲＮ アーゼ、および３．５Ｍ酢酸アンモニウムで処理した。最終濃度を１μｇ／μｌ に調節した。クローンＡＳＫ−５８の９５９　ｂｌ）の挿入断片をＢａｍＨＩで 消化して、長さが約１２０．３２３および４６０　ｂｐの３種のフラグメントを 調製した。これらの各フラグメントにランダムプライマー法により”Ｐ−ｄＣＴ Ｐで標識を付けて、Ｍ・ラベルクローシス、Ｍ・アビウムーイントラセルラーレ 、ならびに暗発色面（ｓｅｏｔｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）および光発色歯（ｐｈｏ ｔｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）のグループのマイコバクテリアを含むマイコバクテリ アに対するハイブリッド形成について試験した。３２３　ｂｐのフラグメントは 、Ｍ・ラベルクローシスとだけハイブリッドを形成した。

上記の３２３　ｂｌ）フラグメントを、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ中のＥｃｏ　ＲＩ、　 Ｂａｍ　Ｈｒ部位にサブクローニングし、サブクローンＡＳＫ−５８−４を製造 した。Ｍ・ラベルクローシスおよびＭＯＴＴから精製したＤＮＡをＢａｍ　ＩＩ ＩとＥｃｏ　Ｒ１で消化し次いで０．７％アガロースゲル中で電気泳動を行った 。サザンプロットを調製し、クローンＡＳＫ−５８−４（３２３ｂｐ）由来のラ ンダムプライマー標識挿入断片とハイブリッドを形成させたが、Ｍ・ラベルクロ ーシスだけがハイブリッドを形成し、９５９　ｌａｐの領域に単一のバンドを生 成した。

クローンＡＳＫ−５８−４の特異性を試験するために、培養物から精製した２１ ６個のＤＮＡ試料（表Ｉ参照）を、クローンＡＳＫ−５８−４の挿入断片をプロ ーブとして用いてハイブリッドを形成させることによって分＊　ＭＡＩＳ　＝マ イコバクテリア　アビウムーイントラセルラーレースクロフラセウム群 下記の表■に示すように、Ｍ・ラベルクローシスの１０３個の全試料が陽性シグ ナルを示したが、残りの１１３の試料はハイブリッドを形成しなかった。標識試 薬として”Ｐ−ｄＣＴＰまたはジゴキシゲニン−ｄｔＪＴＰを用いた場合も同様 の結果が得られた。

表■ Ｍ・ラベルクローシス群　ＭＯＴＴ ＤＮＡプローブ＋　１０３　０ ＤＮＡブローブー　Ｏ１１３ 特異性　１００％ 感受性　１００％ プライマーとプローブの構築 ＡＳＫ−５８−４（３２３ｂｐ）のＤＮＡ配列を、チェーンターミネーション法 と５ｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）　ｖｅｒｓｉｏｎ　２．、　Ｏ（修飾Ｔ７　 ＤＮＡポリメラーゼ）またはＴａｑポリメラーゼ（登録商標）　（Ｔａｑ　Ｔｒ ａｃｋ（登録商標）配列決定システム、Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃａｒｐ、社、米国、 ウィスコンシン州、マディソン〕を用いて決定した。

クローンＡＳＫ−５８−４のＤＮＡ配列が決定されると、Ｍ・ラベルクローシス ＤＮＡを増幅するのに適したプライマーを合成で製造することができる。長さが ２８３塩基対のフラグメントを増幅するために、そのフラグメントの開始部位に 配置されるプライマー１　：　５　’　ＣＡＡＧＧＣＴＴＣＡＡＴＴＣＣＧＧＴ ＧＡＴＧＣＣと、該フラグメントの終止部に配置されるプライマー２　：　５　 ’　ＴＧＧＴＣＣＧＧＴＴＣＡＴＡＣＴＣＧＧＧＣＴＧＧを作った。プライマー ３：５　’　ＴＣＡＣＣＧＣＧＡＴＡＡＣＣＧＴＧＣＧＣＧＡＣＧを構築すると 、フラグメントをプライマー１からプライマー３へ長さを１４１塩基対増幅でき る。プライマー４　：　５　’　ＴＴＣＡＣＣＧＧＣＴＣＴＣＣＧＣＴＧＡＡＧ ＧＡＡを構築すると、フラグメントをプライマー１からプライマー４へ長さを合 計７６塩基対増幅できる。

クローンＡＳＫ−５８−４を増幅させ、その挿入断片をアガロースゲルで精製す ることによって３２３　ｂｐのプローブを製造した。その挿入断片をゲルから溶 出させ、ランダムプライマー法により、ジゴキシゲニンーｄＵＴＰで標識を付け た。２４塩基のオリゴヌクレオチドのプローブ（上記プライマー４の配列に対応 する）を、合成法で構築し、続いてターミナルデオキシヌクレオチジルトランス フエラーゼを用いてジゴキシゲニンーｄＵＴＰで標識をつけることによって製造 した。

実施例２ Ａ、　３２３塩基対のプローブによる生物試料の分析結核症に罹っている疑いが ある患者の痰試料を入手し、既定の方法を用いて、液化、汚染除去および濃縮を 行った。要約すると、痰試料は、Ｒａｔｎａｍら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃ１ １ｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　２３巻、５８２〜５８５頁、１９ ８６年の方法にしたがって汚染除去と濃縮を行い、続いて９５°Ｃで１０分間加 熱して熱失活させた。次に、この処理した痰１００μ１ＳＴＥ緩衝液２２０μｌ および３．３％リゾチーム５０μｌをエッペンドルフ管に移し６５°Ｃで１５分 間インキュベートした。２ｏ％５ＤＳ３０μ！を添加して６５°Ｃで１５分間イ ンキュベートし、続いて５Ｍ過塩素酸ナトリウム１００μｌを添加し室温で５分 間インキュベートした。

得られた試料をクロロホルム／イソアミルアルコールで抽出しエタノールで沈澱 させ、ＴＥ緩衝液２５μｌに再懸濁させた。

２００　ｍＭのｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰ、２μＭのＭ ｇＣ１＊　、各々１μＭの前記プライマーｌと２、ならびに２．５０のＴａｑポ リメラーゼを含有する１００μｌの容積中でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を 行った。反応液を鉱油１００μｌで覆い、９５℃で７分間変性した。プライマー は７０°Ｃで１，５分間加熱してアニールした。伸長反応は７２℃で１分間行っ た。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒサーモサイクラ−（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ） で２５サイクル行った。

ＰＣＨによる生成物の百分率を２％アガロースゲル中で分析した。

そのゲルは約２８３　ｂｐのバンドが存在するのを確認するために臭化エチジウ ムで染色した。

ＰＣＲ生成物の残りに、ＮａＯＨを添加して０．２Ｎにして室温で１０分間室温 でインキュベートした。次に試料をＢｉｏ−Ｄｏｔ装置のナイロン膜に転写し、 プリハイブリダイズ処理を１時間行った。次に３２３塩基対のプローブを上記の ようにして製造し、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用 いてジゴキシゲニンーｄＵＴＰで標識を付けた。プローブに、−夜６５°Ｃでハ イブリッドを形成させた。

フィルターを６ＸＳＳＰＥで２０分間室温で洗浄し、続いて６ＸＳＳＰＥ緩衝液 で４０°Ｃにて３回洗浄した。フィルターをアルカリホスファターゼ接合抗ジゴ キシゲニンと３０分間反応させて洗浄した。そのフィルターをＢＣ［Ｐ／ＮＴＢ と反応させた。陽性試料は紫色を呈した。

１３９個の庚の試料と１４０個の培養試料を上記のＰＣＲ法で試験し、伝統的な 培養ベースの方法で確認した。試験結果を下記の表■と■培養法によって十　培 養法によって− ＰＣＲ法によって＋　５０　０ ＰＣＲ法によって−０９０ 特異性　１００％ 表■ 痰由来Ｍ・ラベルクローシスのＤＮＡ配列の増幅培養法によって十　培養法によ って− ＰＣＲ法によって＋　３８　０ ＰＣＲ法によって−１１００ 特異性　１００％ 痰の試料と生物培養物を、上記パート八に記載したようにして精製し増幅した。

ＰＣＲ産物を、上記のようにして、ジゴキシゲニンーｄＵＴＰで標識をつけた、 ２４塩基のプローブ５　’　ＴＴＣＡＣＣＧＧＣＴＣＴＣＣＧＣＴＧＡＡＧＧＡ Ａとハイブリッドを形成させた。陽性の試料を、上記のように、アルカリホスフ ァターゼ接合抗ジコキシゲニン抗体で検出し、続いて洗浄し、ＢＣＩＰ／ＮＴＢ を添加した。ＰＣＲと培養の分析結果は完全な相関関係にあった。被検痰試料１ ４個のうち１１個の試料かＰＣＲと培養の両方で陽性であり、３個の試料はＰＣ Ｒと培養の両方で陰性であった。

試験された細胞培養物１６個のうち３個の培養物（Ｍ・ラベルクローシス）はＰ ＣＲと培養の両方によってＭ・ラベルクローシスに対して陽性であり、試験され たＭＯＴＴ由来の１３個の細胞培養物はＰＣＲと培養の両方で、Ｍ・ラベルクロ ーシスに対して陰性てあった。

実施例３ 使い捨て精密濾過ユニットを使用するマイコバクテリウム・ラベル　クローシス のハイブリット形成と検出陽性と陰性の試料を１０個づつ前記のようにして製造 した。要約すると、試料をまず９５°Ｃで１０分間加熱して失活させた。処理し た試料１００μＡ、ＴＥ緩衝液２２０μ！、および３．３％リゾチーム液５０μ ｌをエッペンドルフ管に入れて６５°Ｃて１５分間インキュベートし、続いて５ Ｍ過塩素酸ナトリウム溶液を添加し、室温で５分間インキュベートした。次に試 料をクロロホルム／イソアミルアルコールで抽出しエタノールで沈澱させ、ＴＥ 緩衝液２５μ！中に再懸濁させた。

２００　ｍＭのｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰ、２μＭのＭ ｇＣ１、各々ｌμＭの前記プライマー１と２、ならびに２．５ＵのＴａｑポリメ ラーゼを含有する１００μβの容積中でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行っ た。

反応液を鉱油１００μｌで覆い、９５°Ｃで７分間加熱して変性させた。

プライマーは７０°Ｃで１．５分間加熱してアニールした。伸長反応は７２°Ｃ で１分間行った。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒサーモサイクラ−で３５サイクルを 完了した。

ＰＣＲ生成物の百分率を２％アガロース中で分析した。約２８３　ｂｐのバンド が存在するのを確認するために臭化エチジウムで染色した。

残りのＰＣＲ生成物にＮａＯＨを添加して０．２Ｎにし、室温で１５分間インキ ュベー１−　した。試料を精密濾過ユニット（ＣＥＮＴＲＥＸ　Ｄｉｓｐｏｓａ ｂｌｅＭｉｃｒｏｆｉｌｔｅｒ　Ｕｎｉｔ　（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃ ｈｕｅｌ１社、米国、ニューノ＼ンブシャー＝州、キーネ）またはＵｌｔｒｆｒ ｅｅ　ＭＣ（登録商標）フィルターユニット０．４　μＡ！　Ｄｕｒａｐｏｒｅ 　（０，４５μｍＸＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社、米国、マサチューセッツ州、ベッド フォード）〕中に添加し、次に１０分間２０００ｒｐｍで遠心分離を行った。フ ィルターユニットを減圧オーブン中８０°Ｃで１０分間乾燥した。

プリハイブリダイズ処理を行った溶液（Ｍａｎｉａｔｉｓの前記文献参照）３０ ０μｌを微量遠心分離管に入れ１５分間６５°Ｃでインキュベートした。

３２３　ｂｐのプローブ（上記のようにして製造した）を９５°Ｃで８分間加熱 し氷上に２分間置き、次いで精密濾過ユニットに移し６５°Ｃで６０分間インキ ュベートした。

市販の試薬（Ｇｅｎｉｕｓ　（登録商標）　−ｓｙｓｔｅｍ、　Ｂｏｅｈｒｉｎ ｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、米国、インディアナ州、インディアナポリス〕を 使ってプローブの検出を行った。要約すれば次のとおりである。インキュベーシ ョンを行った後、１−の緩衝液Ｉ　（１００ｍＭ）リス−ＨＣｌ、　１５０ｍＭ 　ＮａＣ１゜ｐＨ７，５）で１分間洗浄することによって、プローブを精密濾過 ユニットから除き、次いて緩衝液１１（０，７％プロ・ンキング試薬含有緩衝液 Ｉ）とともに１０分間インキュベートした。精密濾過装置・ソトを再び緩衝液■ て１分間洗浄し、その精密濾過装置に１００μｌの抗体（アルカリホスファター ゼに接合された抗ジゴキシゲニン抗体）を添加して２５分間インキュベートした 。次に精密濾過装置を、緩衝液■で１分間づつ２回洗浄し、緩衝液Ｉ［Ｉ　（１ ００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、　１５０ｄのＮａＣ１，５０ｍＭのＭｇＣ１ｔ　ｐ Ｈ９，５）と２分間平衡させた。プローブの存在は下記の方法のうちのひとつで 検出した。

Ａ、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＴＢ）による検出ＮＴＢ溶液を調 製しくＮＴＢ　１１．２μｌ　、　Ｘ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　８．８　μｊ？お よび緩衝液■２．５μり、精密濾過装置中に入れ、次いて顕色させるために暗所 でインキュベートした。反応は、４５分後に、１０ｍＭ　）リス−ＨＣｌと１　 ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する緩衝液を添加することによって停止させた。着色して いるのは陽性の試料であることを示してし）る。

Ｂ、化学発光による検出 あるいは、プローブの存在（アルカリホスファターゼ接合抗体の検出による）は Ｌｕｍ１−Ｐｈｏｓ　５３０　（Ｌｕｍｉｇｅｎ　Ｉｎｃ、社、米国、ミシガン 州、デトロイト）を利用して測定した。Ｌｕｍ１−Ｐｈｏｓ　５３０は、０．３ ３ｍＭの４−メトキシ−４−（３−ホスフェートフェニル）−スピロ（１゜２− ジオキセタン−３，２′−アダマンチン）ジナトリウム塩、７５０　ｍＭの２− アミノ−２−メチル−１−プロパツール緩衝液（ｐＨ９、６）　、０．８８ｍＭ のＭｇＣＬ、　１．１３　ｍＭのセチルトリメチルアンモニウムプロミド、およ び０．０３５　ｍＭのフルオレセイン界面活性剤を含有している。

要約すると、予め加温しておいたＬｕｍ１−Ｐｈｏｓ　１００μｌを精密濾過装 置に加えて１分間インキュベートした。溶液を除去し、精密濾過ユニットを分解 してフィルター膜を取出した。そのフィルター膜を５ａｒａｎ（登録商標）ラッ プで包み３７°Ｃで３０分間インキュベートした。

ルミネセンスは、膜をＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ　ＸＡＲ）に５分間露出するか 、またはポラロイド高感度フィルム（Ｐｏｌａｒｏｉｄ　６１２）のようなフィ ルムで写真をとることによって検出される。

Ｃ１試験結果 被検試料の１０個が陽性で１０個が陰性であったことから、プローブは１００％ の特異性と感受性をもっていた。

実施例４ ポリペプチドの選択と製造 クローンＡＳＫ−５８−４のＤＮＡ配列を分析して読取り枠の存在を決定した。

１つの読取り枠が図２の核酸番号４５から２０４までに位置していた。この配列 は、５２個のアミノ酸で構成された下記のポリペプチドをコードしている。なお これらのアミノ酸は通常ｌアルファベット文字記号で示した（表■参照）。

ＭＰＡＡＳＲＧＬＲＰ　ＴＦＬＯＲＲＡＧＥＬ　ＶＧＩＧＤＩＰＯＲＡ　ＨＬＳ ＶＡＨＧＹＲＧ　ＤＰＲＲＨＲＰＩＰＶ　ＤＰＧ表Ｖ Ｄ＝アスパラギン酸　Ｎ＝アスパラギンＥ＝グルタミン酸　Ｐ＝プロリン Ｆ＝フェニルアラニン　Ｑ＝グルタミンＧ＝グリシン　Ｒ＝アルギニン Ｈ＝ヒスチジン　Ｓ＝セリン 本明細書には、本発明の特定の実施態様が、例示を目的として記載されているか 、上記のことから、本発明の思想と適用範囲を逸脱することなく、種々の改変を 行うことができることは理解されるであろう。したがって本発明は特許請求の範 囲によってのみ限定される。

ＦＩＧ。ｌＣＱＮＴ 手続補正書（方式） 平成　ケ年１０月ｌｒ日

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．図２に示す核酸番号１から３２３までのヌクレオチド配列の少なくとも一部 分を含有し、Ｍ・ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来の核 酸と特異的にハイプリッドを形成することができる標識付きプローブ。
2. ２．前記標識が、３２Ｐ−ｄＣＴＰ、ビオチン−ｄＡＴＰ、およびジゴキシゲニ ン−ｄＵＴＰからなる群から選択される請求項１記載の標識付きプローブ。
3. ３．（ａ）生物試料に含有されている細胞を処理して細胞核酸を露出させ； （ｂ）上記の細胞核酸を、図２に示す核酸番号１から３２３までのヌクレオチド 配列の少なくとも一部分を含有する、Ｍ・ツベルクローシスに対して特異的な標 識付きプローブとともに、ハイプリッド形成が起こるのに充分な条件下と時間で インキュベートし；次いで（ｃ）Ｍ・ツベルクローシスに特異的でハイプリッド を形成した標識付きプローブの存在を検出する； ことを含んでなる、生物試料中のＭ・ツベルクローシスの存在を検出する方法。
4. ４．（ａ）生物試料中に含有されている細胞を処理して細胞核酸を露出させ； （ｂ）選択された細胞核酸配列を増幅し；（ｃ）上記の増幅された核酸配列を、 図２に示す核酸番号１から３２３までのヌクレオチド配列の少なくとも一部分を 含有する、Ｍ・ツベルクローシスに対して特異的な標識付きプローブとともに、 ハイプリッド形成が起こるのに充分な条件下と時間でインキュベートし；次いで （ｄ）Ｍ・ツベルクローシスに特異的でハイプリッドを形成した標識付きプロー ブの存在を検出する； ことを含んでなる、生物試料中のＭ・ツベルクローシスの存在を検出する方法。
5. ５．処理するステップの前に、生物試料に含有されている細胞を固体支持体に固 定化することを含む請求項３または４に記載の方法。
6. ６．固定化するステップの前に、固体支持体をプリハイプリダイズ処理を行うこ とを含む請求項５記載の方法。
7. ７．標識が、３２Ｐ−ｄＣＴＰ、ビオチン−ｄＡＴＰおよびジゴキシゲニン−ｄ ＵＴＰからなる群から選択される請求項３または４に記載の方法。
8. ８．前記生物試料が、細胞培養物、痰、外科手術で切取った標識、尿、胃液、脳 脊髄液および組織学的組織片からなる群から選択される請求項３または４に記載 の方法。
9. ９．下記アミノ酸配列： 【配列があります】 からなるポリペプチド。
10. １０．図１に示す核酸番号１から９５９までのヌクレオチド配列の少なくとも一 部分を含有し、Ｍ・ツベルクローシス由来の核酸と特異的にハイプリッドを形成 することができる標識付きプローブ。
11. １１．（ａ）生物試料中に含有されている細胞を処理して細胞核酸を露出させ： （ｂ）選択された細胞核酸配列を増幅し；（ｃ）上記の増幅された核酸配列を、 図１に示す核酸番号１から９５９までのヌクレオチド配列の少なくとも一部分を 含有する、Ｍ・ツベルクローシスに対して特異的な標識付きプローブとともに、 ハイプリッド形成が起こるのに充分な条件下と時間でインキュベートし；次いで （ｄ）Ｍ・ツベルクローシスに特異的でハイプリッドを形成した標識付きプロー ブの存在を検出する； ことを含んでなる、生物試料中のＭ・ツベルクローシスの存在を検出する方法。