JPH04503454A - 結核菌の検出及び分化のためのプローブ，キット及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 の　び　のだめのプローブ、 土ユ上及ｌ五五 狭五立！ 本発明は、結核菌の検出及び分化のための遺伝子プローブ、キット及び方法に関 する。特に、本発明は、結核症の診断のための及び／又はＭ　ツベルキュロシス （Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体のメンバーにより引き起こされる感 染の進行を調べるための疫学的研究手段のための遺伝子プローブ、キット及び方 法に関する。

及五！量 連合王国に含まれるいくつかの進行国において、結核症は主な法定伝染病の１つ であり、そしてさらに、Ｍ、ツベルキュロシスの病原性の機構はほとんど理解さ れていない。進行国又は第三次間において、この病気は積大な割合の風土健康問 題であり、そしてそれによって、抗生物質の組合せによる長期の処理を包含する 。結核症における主な問題の１つは単純で信幀できる血清診断又は遺伝子プロー ブアッセイの欠除であることが十分に理解される。これらは、現在の診断試験、 たとえば技術的に進歩した富国において入手できるものでさえ、不十分に特異的 であり、そして鈍く、比較的未熟な症候学及び放射線写真術の組合せに基づかれ 、そして抗酸性へチリス及び細菌培養物についての染色に基づかれているので、 必要である。初めの２つは、広く変わりやすい特徴を有し、そして２番目の２つ は非常に信顛できない。特に、現在利用できる試験に関して、明確な結果を得る ために数週間を要し、そしてひじょうに汚染されたサンプルにおける少数のＭ　 ツベルキュロシス細菌の検出はしばしば困難である。結核菌の特異的同定もまた 困難であり、そして特に、Ｍ　”、１＜ｌＬｉ土」１０シス複合体：Ｍ、ツベル キュロシス自体、ウシ菌株Ｍ、ポ旦Ｚ　（Ｍ、　ｂｏｖｔｓ）　、Ｍ　アワ１カ 　ム（Ｍ、ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、Ｌミクロチ（Ｍ、　ｍ１ｃｒｏｔｉ）及びワ クチン株ＢＣＧ（免疫学的に抑制された個人に病気を引き起こすことができる） のメンバー間の差別の同定は困難である。結核症のための新しい実験室試験を開 発する試みがなされて来たが、しかしすべては、低い特異性及び／又は感度を存 した。生物の特異的ＤＮＡ配列のための遺伝子プローブは、長い培養段階又は染 色された痰スミアの訓練されたスタッフによる困難な実験を必要としない方法に より、少量の結核菌ゲノムを確実に検出することができる。遺伝子プローブ分析 は、他の生物の存在における少数の特定の細菌の早い検出のための敏悪な方法を 提供する。

ヒトにおいて有意な健康問題が存在するように、結核菌により引き起こされる感 染はまた、家畜、シカ、羊及びアナグマにおける有意な健康問題でもあり、そし てここで提供されるプローブはまた、これらの種に対して使用するための診断／ 疫学的研究手段のためにも有用である。

Ｍ　ツベルキエロシス複合体の株を同定するための遺伝子プローブは市販されて いるが、しかしリポソームＲＮＡの検出に依存し、そしてまず細菌の培養を必要 とする。これらの遺伝子プローブは、Ｍ　ツベルキュロシス複合体を同定するこ とができるけれども、それらは痰の検体における細菌を検出するために適切でな い、培養段階はまた、試験時間を長くし、そしてこれは欠点である。

Ｍ　ツベルキュロシス複合体に対して特異的な反復要素を含む−Ｍ−二７＜）Ｉ −先２ゴＬ２ノ、ＤＮＡのフラグメントの単離及びクローニングがここに記載さ れている。このフラグメントは、ｙ−ズ丘土土王三之スの種々の単離物における 複数の多量制限フラグメントにハイブリッドし、そして従って、結核症の伝達の 研究のための単離物をフィンガープリントすることができる。単に少ないハイブ リダイジングバンドがＭ、ボビス（Ｍ、　ｂｏｖｉｓ）又はＢＣＧ　ＤＮＡの消 化物に検出され、そして従って、そのプローブは、Ｍ、ツベルキュロシス複合体 のこれらの種々のメンバー間を急速に区別するユニークな能力を有する。

いくつかの反復要素が結核菌種から単離されており、たとえばＭ、Ｌ≦乙乞ｘ　 （チー匡■ｌσ（Ｃ１ａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ、　Ｊ、　Ｅ、　＆Ｗａｌｓｈ、 　Ｇ、　Ｐ、　（１９８９）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ ｙ　１７Ｌ　４８４４−４８５１　；　Ｃ１ａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ、　Ｊ、　 Ｅ、　＆　Ｄｏｃｈｅｒｔｙ、　Ｍ、　Ａ、（１９８９）　Ｊ。

ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　１５飢７−１５ 　；　及びＧｒｏｓｓｋｉｎｓｋｙ、　Ｃ，Ｍ、　Ｊａｃｏｂｓ、　Ｗ、　Ｒ， Ｃ１ａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ、　Ｊ、　Ｅ、　＆　Ｂｌｏｏｍ。

Ｂ、　Ｒ，（１９８９）　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｔａｕｎ４ｔｙ　 ５７．１５３５〜１５４１）から１種及びＭ、バラツベルキュロシスから挿入配 列ｌ５９００　（Ｇｒｅｅｎ、Ｅ、Ｐ、Ｔｉｚａｒｄ、Ｍ、Ｌ、Ｖ、Ｍｏ５ｓ、 Ｍ、Ｔ、　Ｔｈｏｓｐｓｏｎ。

Ｊ、、Ｗｉｎｔｅｒｂｏｕｒｎｅ、Ｄ、Ｊｌ　ＭｃＦａｄｄｅｎ、Ｊ、Ｊ、＆　 Ｈｅｒｅｏｎ−Ｔａｙｌｏｒ、Ｊ、（１９８Ｂ）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１７．９０６３〜９０７２）が単離された。しかしながら 、これらの反復要素は、両者とも種特異性であり、そして種々の源からの菌株に よる一定のハイブリダイゼーシッンパターンを付与するように見える。

本発明は、反復要素の特徴化及び配列分析を記載し、それは挿入配列のＩＳ３種 のメンバーとしてその要素を同定し、ここでそれらのメンバーのうちいくつかの メンバーはこれまでに、腸内細菌の種から特徴づけられている。

結核菌の一般的な診断及び結核症の特定の診断に対して可能性ある適用を有する ＤＮＡプローブは、天然に存在するプラスミドに存在するこれらの配列とハイブ リダイズすることができるデオキシリボヌクレオチド配列に由来することができ ることが見出された。

耐抗生物質の研究の一部として、Ｍ　ツベルキュロシスにおけるプラスミドの存 在が、Ｍ、フォルライ　ム（Ｍ、　ｆｏｒｔｕ」）に存在することが知られてい る天然に存在するプラスミドからのＤＮＡと３種の臨床的単離物からの完全なり ＮＡとをハイブリダイズすることによって調べられた（Ａ、　Ｌａｂｉｄｉ。

Ｃ，Ｄａｕｇｕｅｔ＋　Ｋ、Ｓ、　Ｇｏｂ　＆　Ｈ，Ｌ、　Ｄａｖｉｄ、　１９ ８４．　Ｐｌａｓｍｉｄ　ｐｒ。

ｆｉｌｅｓ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ　ｃｏｓ ＋ｐｌｅｘ　１ｓｏｌｅｔｅｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　 １１　：　２３５〜２４０）。プラスミドはＭエニ７＜ルキュロシスにこれまで 見出されておらず、そして所望には、それらはプローブとしてのＭ　フォルライ 　ムプラスミドＤＮＡの使用により表わされた。驚くべき事には、これがＬツベ ルキュロシスにおけるいづれかのプラスミドの存在を表わさない場合、それは、 プラスミドＤＮＡとハイブリダイズすることができるＭ　ツベルキュロシスの染 色体ＤＮＡフラグメントが存在することを示した。さらに、制限エンドヌクレア ーゼＢａｍＨＩ又はＰｖｕＩＩにより消化された３種の臨床的単離物からの全体 のＤＮＡにおいて、ハイブリダイズするフラグメントの大きさは個々の株のため に同じではなかった。

結核菌感染の検出のための遺伝子プローブは、細菌ゲノムにおける、それらが検 出する遺伝子配列が与えられた科、属、種又は株に対していかにユニークである かに依存して、種々の程度の特異性を有することができる。異なった特異性のプ ローブが、必要とされる臨床学的分析に依存して使用され得る。従って、１つの プローブは、与えられた属（たとえば結核菌）内の多くの異なった種（たとえば Ｍ、ツベルキュロシ困及びＭ、ボビス）に見出される配列パターンを検出するこ とができる。他の場合、遺伝子プローブは、特定の種に対して、及びその種の異 なった株に対してさえ特異的であり得る。

遺伝子プローブのこの種々の特異性は、実質的に使用される。たとえば、診断の 第１路として、一般的な結核菌感染を検出するプローブを使用し、そして次に、 必要なら、結核菌の種が関与される診断に適切に同調されたプローブを使用する ことがより適切である。

発ｙ坏８４丞 本発明は、Ｍ　フォルライ　ムのプラスミドのＤＮＡによりＭ　ツベルキュロシ スのゲノムライブラリーをスクリーンすることによって得られるＭ　ツベルキュ ロシスのゲノムＤＮＡとハイブリダイズする、結核菌感染の診断及び／又は疫病 学的研究のためのヌクレオチドプローブを提供する。

本発明はまた、Ｍ　ツベルキュロシスのゲノムＤＮＡ及びＭ、フォルライ　ムの プラスミドのＤＮＡとハイブリダイズする、結核菌感染の診断及び／又は疫病学 的研究のためのヌクレオチドプローブを提供する。

本発明はまた、本明細書の第２図に示されるヌクレオチド配列又はその相補的配 列を含み、又はそれをハイブリダイズし、又はＭ　ツベルキュロシス複合体の生 物のゲノムライブラリーから得られるヌクレオチド配列を含み又は本明細書の第 ２図に示されるヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションによりハイブリダ イズし、そしてお互いから又は複合体でない他の細菌からＭ、ツベルキュロシス 複合体の細菌メンバーを区別し、そして特徴づけることができる、結核菌感染の 診断及び／又は疫病学的研究のためのヌクレオチドプローブを提供する。

また、ゲノムライブラリーがＭ、ツベルキュロシス株５０４１０から得られる、 結核菌感染の診断及び／又は疫病学的研究のためのヌクレオチドプローブが提供 される。

本発明はまた、第２図又は第４図のいづれかに示されるヌクレオチド配列又はそ の相補的配列の一部又はすべてを含み、又はそれとハイブリダイズする、結核菌 感染の診断及び／又は疫病学的研究のためのヌクレオチドプローブを提供する。

ヌクレオチドプローブは、Ｍ　ツベルキュロシス株５０４１０のゲノムにおいて 、２種の逆方向反復配列により結合され、そして第２図に同定されるヌクレオチ ドコード配列を含む挿入要素のヌクレオチド配列の一部又はすべてを含み、又は それとハイブリダイズすることができる。

本発明はまた、Ｍ　ツベルキュロシス株５０４１０のゲノムにおいて、２種の逆 方向反復配列により結合され、そして第２図に同定されるヌクレオチドコード配 列を含む挿入要素のヌクレオチド配列に隣接して存在するヌクレオチドのフラン キング配列を含み又はそれとハイブリダイズする、結核菌感染の診断及び／又は 疫病学的研究のためのヌクレオチドプローブを提供する。

たとえば、ヌクレオチドプローブは、第２図の塩基８９６の３′末端の下流で存 在するヌクレオチドのフランキング配列の一部又はすべてを含み又はそれとハイ ブリダイズすることができる。

本発明はまた、Ｍ、ツベルキュロシス株５０４１０のゲノムにおいて、第２図に 示される配列の３′末端のすぐ下流で存在する約１．９　ｋｂのヌクレオチド配 列の一部又はすべてを含み、又はそれとハイブリダイズする、結核菌感染の診断 及び／又は疫病学的研究のだめのヌクレオチドプローブを提供する。

本発明はまた、Ｍ　ツベルキュロシス株５０４１０のゲノムに存在し、そして第 １図に示されるような制限地図により特徴づけられるヌクレオチド配列の一部又 はすべてを含み又はそれと強くハイブリダイズする、結核菌感染の診断及び／又 は疫病学的研究のためのヌクレオチドプローブを提供する。

本発明のヌクレオチドプローブは、結核菌感染の診断及び／又は疫病学的研究の ために使用され得る。本発明のヌクレオチドプローブは、Ｍ　ツベルキュロシス の種々の株間を区別することができる。本発明のヌクレオチドプローブは、Ｍ＝ ツベルキュロシス、Ｍ　ボビス及びＢＣＧ間を区別することができる。そのヌク レオチドプローブは、Ｍ、バラツベルキ（Ｍ、　ｃｈｅｌｏｎｅｉ）　、　Ｍ、 カンサシイ　（Ｍ、　ｋａｎｓａｓｉｉ）、Ｍエヱ見（Ｍ、ｏｒｄｏｎａｅ）　 との有意なハイブリダイゼーションを示すことができない。

本発明のヌクレオチドプローブは、ドツトプロット分析、溶液ハイブリダイゼー ション、サザンプロット分析又はポリマラーゼ鎖反応の技法により臨床サンプル 中の結核菌の検出のために使用され得る。その臨床サンプルは、痰、尿、を髄液 、組織サンプル、血液及び他の体液を含んで成る。

本発明はまた、上記ヌクレオチド配列を含んで成る診断用キットを含んで成る。

本発明はまた、上記ヌクレオチドプローブを用いることを含んで成る疫病学的研 究のために臨床サンプル中の結核菌を検出し、区別し、そして／又は特徴づける ための方法を提供する。

本発明はまた、前記ヌクレオチドプローブの生成方法を提供する。

本発明はまた、Ｍ　ツベルキュロシス複合体の細菌メンバーをお互いから及びそ の複合体以外の他の細菌から区別し、そして特徴づけるための方法を提供し、こ こで前記方法は、１）特定の制限酵素により細菌のサンプルからＤＮＡを消化し ；そしてｉｉ）上記ヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイゼーション分析 を実施することを含んで成る。

遺伝子プローブを含んで成るヌクレオチド配列は、制限酵素のための制限部位を 必ずしも含まない。

口Ｉ■１１隻Ｒ更 本発明をより明確に理解するために、実施態様が例により及び添付図面により、 より詳しく説明されるであろう。

第１図は、プローブ５の制限地図を示し；第２図は、プローブ５からのフラグメ ン）５ＣのＤＮＡ配列及び大きな読み取り枠の翻訳生成物を示し；第３図は、Ｅ 　コリの挿入配列１３３及びｌ５３４１１と比較しての５０の一部の一次ＤＮＡ 構造の比較を示し；第４図は、プローブ５のフラグメント５Ｂの一部及びフラグ メン）５Ｃの一部をオーバラップするＤＮＡ配列、すなわちＭ　ツベルキュロシ スの５ｋｂのＤＮＡフラグメントからの挿入配列（ＩＳ９８６）を示し； 第５図は、企画された読み取り枠の位置を示し；第６図は、他のＩ３３株要素の 推定上のトランスポザーゼとｌ５９８６０ＲＦｂの可能性ある翻訳された生成物 との整合を示し； 第７図は、他のＩＳａ株要素の対応する領域と０ＲＦａｌ及び０ＲＦａ　２の可 能性ある翻訳された生成物との整合を示し； 第８図は、ｌ５ＴＢ及びｌ５３４１１の逆方向反復端の比較を示し； 第９図は、５Ｃ及びｌ５３４１１の大きな読み取り枠の可能性ある翻訳された生 成物の整合を示し；第１０図は、５Ｃ及びＩＳ３の大きな読み取り枠の可能性あ る翻訳された生成物の整合を示し； 第１１図は、５Ｃ，ｌ５３４１１及びＩＳ３の大きな読み取り枠の可能性ある翻 訳された生成物の整合を示し；第１２図は、Ｍ、ツベルキュロシスの５ｋｂのＤ ＮＡフラグメントからの挿入配列（ＩＳ９８６）の大きな読み取り枠の可能性あ る翻訳された生成物と１３３４１１及びＩＳ３のそれらとの整合を示し； 第１３図は、Ｍ、ツベルキュロシスの５ｋｂのＤＮＡフラグメントからの挿入配 列（ＩＳ９８６）の大きな読み取り枠の可能性ある翻訳された生成物とｌ５３４ １１及びＩＳ３のそれらとの整合を示し、ここでｌ５３４１１配列（ＩＳ３４１ １′）のＣ−末端領域はｌ５３４１１配列の残りに関して、−１フレームから読 み取られ； 第１４図は、プローブ９の制限地図を示し；そして第１５図は、プローブ５と１ ２Ｊ−Ｂとの間の関係を図的に示す。

るた　の ブ」よ≦乙１及ブ」− Ｍ、ツベルキュロシスの臨床的単離物におけるプラスミドの可能性ある存在の研 究の一部として、３種のそのような単離物からの完全なりＮＡを、サザンプロッ トにゆだね、そしてＭ、フォルライ　ムからの天然に存在するプラスミドにより プローブした。ｐＵｓ３００として言及されるこのプラスミドは、Ｃｏ１１ｅｃ ｔｉｏｎ　ｄｅ　Ｉ’Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ　Ｐａ５ｔｅｕｒ＋　Ｔｕｂｅｒｃｕｌ ｏｓｅ。

Ｐａｒｉｓ、　ＦｒａｎｃｅにおけるＭ、フォルライ　ム株ＣＩＰＴ１４−０４ １−０００３　（１９９０年２月２１日、ＮＣＴＣ１２３８１として、Ｎａｔｉ ｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ、　Ｃ。

１ｉｎｄａｌｅ＋　Ｌｏｎｄｏｎ　ＵＫ　ＮＨ３５ＨＴに寄託される）から得ら れた。

その結果は、このＭ、フォルライ　ムプラスミドにハイブリダイズすることがで きるＭ、ツベルキュロシスの株において染色体ＤＮＡフラグメントが存在し、そ してまた、ＢａｍＨＩ又はＰｖｕ　Ｕにより消化された材料において、ハイブリ ダイズするフラグメントの大きさは個々の株のために同じでないことを示した。

これらのハイブリダイズするフラグメントを単離するために、Ｍ　ツベルキュロ シス（Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋　Ｄｕｌｎｉｃｈ 、　Ｌｏｎｄｏｎ、　Ｅｎｇｌａｎｄから得られた５０４１０株）の臨床的単離 物からの完全なりＮＡライブラリーを、ＢａｍＨＩ−消化されたＥＭＢＬ４によ るＭ　ツベルキュロシスの５ａｕ３Ａ１部分消化物の連結によりλファージベク ターＥＭＢ　Ｌ４において構成した。そのライブラリーは、組換えプラスミドｐ Ｕｓ３０１をラベリングすることによって誘導されるＤＮＡプローブによりスク リーンされた。このプラスミドは、ＵプラスミドベクターｐＵｃ１９のＥｃ　ｏ Ｒｌ消化物によるプラスミドｐＵｓ３００のＥｏＲＩ消化物の連結により構成さ れた。陽性プラークを、プラークスクリーニングの追加の循環を通して精製した 。下記のプローブは、この方法により得られた陽性プラークの１つのＥＭＢＬ４ ／Ａ−３クローン（１９９０年２月２１日、ＮＣＴＣ第１２３８０としてＮａｔ ｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ＋　Ｃｏ １１ａｄａｌｅ、　Ｌｏｎｄｏｎ　ＵＫ　ＮＨ３５ＨＴに寄託された）として言 及される組換えファージから得られた。

この組換え体ファージＥＭＢＬ４／Ａ−３クローンからのＤＮＡを抽出し、そし てＥｃｏＲＩにより消化した。アガロースゲル電気泳動及びサザンプロットは、 ＥｏＲＩ消化ＥＭＢＬ４／Ａ３が、約９００個の塩基対（９ｋｂ）の１つ及び約 ５０００個の塩基対（５ｋｂ）　（プラスミドｐＵｓ３００とハイブリダイズす る）を含む一連のフラグメントを含むことを示した。これらのフラグメントをそ れぞれゲルから切断し、−プ５（５ｋｂのフラグメント）として言及する。Ｍ　 フォルエエＬ人のプラスミドｐＵｓ３００とのハイブリダイゼーションによるプ ローブ５の単離は、Ｚａｉｎｕｄｄｉｎ　ａｎｄ　Ｄａｌｅ＋　Ｊ。

Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏ、　（１９８９）　１３５．２３４７〜２３５５ページに より詳しく説明される。

λクローンＡ　３　（Ｚａｉｎｕｄｄｉｎ、　Ｚ、　Ｆ、　＆　Ｄａｌｅ、　Ｊ 、　Ｗ、（１９８９）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌｏｇｙ　１３５＋２３４７〜２３５５ページ）からの５ｋｂのＥｃ　ｏＲＩ フラグメントを、プラスミドヘクタ−ｐＡＴ１５３を用いてクローンし、プラス ミドｐＲＰ５０００を生成した。ｐＲＰ５０００からの挿入体フラグメントのＰ ｖｕＩＩによる消化は、プラント末端化されたフラグメントに転換され、そして ＰｖｕｌＴにより消化されたｐＡＴ１５３と共に連結され、そしてそれぞれｐＲ Ｐ５１００．ＰＲＰ５２００及びｐＲＰ５３００を生成する３種のフラグメント ５Ａ、５Ｂ及び５Ｃ（第１図）を生成した。

ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＴ、ＨｉｎｄＩ［［及び５ａｌＩを用いて生成されたｐＲＰ ５０００．ｐＲＰ５２００及びｐＲＰ５３００からの特定のサブフラグメント（ 第１図）を、Ｍ１３クローニングキット（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｕ ｂｓ）を用いてＭ１３ｍｐ１Ｂ及びＭｌ　３ｍｐ　１９にクローン化した。ｐＲ Ｐ５０００からのより小さなＥｃｏＲｉ−ＢａｍＨＩフラグメントをＢｌｕｅｓ ｃｒｊｐｔ　ｐｕｓ中にクローン化し、そしてネスティド（ｎｅｓｔｅｄ）欠失 をＥｒａｓｅ−ａ−Ｂａｓｅ技法（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行なった。配列決 定を、Ｔａｑ及びＴ７ポリマラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び５ｅｑｕｅｎａｓｅ 　Ｖｅｒｓｉｏｎ　２　（ＵＳ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ　Ｉｓ）により、３７０ 　Ａｕｔｏｍａｔｅｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅｒ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ ｔｅｍｓ）を用いて行なった。少なくとも５０ｂｐのオーバラップを有するフラ グメントを両方向に配列決定した。

ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＭＢＲＦ及び５ｗ１ｓｓＰｒｏｔデータバンクの調 査を、ＵＷＧＣＧパッケージ及びＷ。

ｒｄＳｅａｒｃｈプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、　Ｊ、、　Ｈａｅｂｅｒｌｉ 、　ｐ。

＆　Ｓｍ１ｔｈｉｅｓ、　Ｏ，（１９８４）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ　１２．３８７〜３９５；及び−１１ｂｕｒ、　Ｌ　Ｊ、＆　Ｌ ｉｐｗａｎ、　Ｄ、　Ｊ、　（１９８３）　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔ ｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅａ＋ｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　ＵＳＡ 　８０＋　７２６〜７３０）及びＰｒｏｔｅｉｎ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏ ｎ　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅからのＮＡＱプログラムにより、Ｄａ　ｒ　ｅ　ｓ　ｂｕ 　ｒ　３Ｆでの５ＥＲＣ施設で５ＥＱＮＥＴコードを用いて行なった。配列分析 を、Ｌツベルキュロシスにおける好ましいコドン使用法の表（Ｄａｌｅ。

Ｊ、　Ｗ、　ａｎｄ　Ｐａｔｋｉ、　Ａ、　（１９９０）、　Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ　（ＭｃＦａｄｄ ｅｎ、　Ｊ、　Ｊ、　Ｅｄ、　））に基づいてのコドン選択分析（Ｓｔａｄｅｎ 、　Ｒ，＆　ＭｃＬａｃｈｌａｎ、　Ａ、　Ｄ、　（１９８２）　Ｎｕｃｌｅｉ ｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１（Ｌ　１４１〜１５６　）の使用により補 足されて、配列比較のためにはＤ　Ｉ　Ａ　Ｇ　ＯＮ　（Ｓｔａｄｅｎ、　Ｒ， （１９８２）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１０．２９５ １〜２９６１）及び読み取り枠の同定のためにはＰｏ５ｉｔｉｏｎａｌ　Ｂａ５ ｅ　Ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　（Ｓｔａｄｅｎ、　Ｒ，（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１２＋　５５１〜５６７　）及び５ｈｅｐ ｈｅｒｄ　ＲＮＹ　（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ、　Ｊ、　Ｃ，Ｗ、　（１９８１）　Ｐ ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏ ｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　ＵＳＡ　７８．１５９６〜１６００）の両方法を用いて 、５ｔａｄｅｎ−Ｐｌｕｓパッケージ（Ａｍｅｒｓｈａｓ）により行なった。複 数の配列の整合を、マニュアル調整により補足されるＣＬＵＳＴＡＬソフトウェ ア−（Ｈｉｇｇｉｎｓ、　Ｄ、　Ｇ、　＆　５ｈａｒｐ。

Ｐ、　Ｍ、（１９８８）　Ｇｅｎｅ　７３．２３７〜２４４　）により行なった 。

プローブ９ プローブ９を、Ｍｕｌｔｉｐｒｉｍｅ　Ｒａｎｄｏｍ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅｘｔｅ ｎｓｉｏｎ法（Ａｓｅｒｓｂａｍ）を用いて３：Ｐによりラベルし、そしてＭ　 ツベルキュロシス（単離番号５０４１０．６０９２５．６１０６６．６１１０４ ．６１１２５．６１２６７．６１３７７．６１５１３）並びにＭ　ボビス（野生 株、Ｇｅｎｔｒａｌ　ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）及びＢＣＧ 　（ＮＣＴＣ５６９２）の８個の臨床的単離物からのＰｖｕ　■消化された完全 なりＮＡのサザンプロットにハイブリダイズした。アガロースゲル電気泳動の後 、ＤＮＡフラグメントを、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎフィルターに移し、そして８０°Ｃ で１時間のベーキングにより固定した。そのフィルターを、ハイブリダイゼーシ ョン緩衝液中において６８°Ｃでプレハイブリダイズした。プローブによるハイ ブリダイゼーションを、６８℃で一晩、同じ緩衝液中で行なった。

ハイブリダイゼーション緩衝液は、５ＸＤｅｎｈａ　ｒｄ　を溶液、５ＸＳＳＰ Ｅ緩衝液、０．２％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び１００μｇ／ｍｌ の音波処理されたサケ精子ＤＮＡから成った。Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液及びＳ　Ｓ 　Ｐ　Ｅｉ衝液を、次のようにして原溶液として製造した：５０Ｘ　Ｄｅｎｈａ ｒｄｔ”　：　０．５ｇのＦｉｃｏｌｌ（ｍｍ４００，０００）、０．５ｇのポ リビニルピロリドン（ｍｍ４０．　ＯＯＯ）　、０．５　ｇのウシ血清アルブミ ンを、滅菌された脱イオン蒸留水に溶解し、５０−１の最終体積にし、これをア リコートに分配し、そして−２０°Ｃで貯蔵した。

２０ｘ　５ＳＰＥ　−’　：　３．６ＭのＮａＣ１，２０５Ｍのエチレンジアミ シテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）　、０．２ＭのＮａＨｚＰＯ，／Ｎａｇ　ＨＰＯ，（ ｐＨ７，７）を、脱イオンされた蒸留水に溶解し、そしてオートクレーブ処理し た。

次に、フィルターを２ｘｓｓｃにより２度洗浄した（０．１％のＳＤＳを含む２ ＸＳＳＣ及び０．１％（７）ＳＤＳを含む０．１ｘｓｓｃにより）。すべての洗 浄は６８℃で行なわれた。ＳＳＣを、次のようにして原液として製造した：２０ Ｘ　ＳＳＣ：　３ＭのＮａＣ１，０，３Ｍのクエン酸ナトリウムを、蒸留水に溶 解し、そしてｐＨを７．０に調整した後、オートクレーブ処理した。

フィルターを、サランラップにより被覆し、そして室温で１６時間ＸＸ綿線ィル ム（ＲＸ、Ｆｕｊｉ）に露出した。

プローブ９にハイブリダイズされたＭ、ツベルキュロシスの個々の株は、いくつ かのハイブリダイジングバンドを示した：このパターンのい（つかの要素は、株 から株に異なり、そして他のものは一定に存続した。Ｍ　ボビス及びＢＣＧはま た、Ｍ、ツベルキュロシスパターンのこの保存特徴を保持するパターンでプロー ブ９にハイブリダイズした。

結核菌の次の種（示される場合、それぞれ１つの株）は、いづれの有意な程度に もプローブ９とハイブリダイズしなか（３種の株）、Ｍ　カンサシイ、Ｍ　アビ ウム、Ｍ、マルニオエンセ、Ｍ　フラグメント、Ｍ４≦ＱＬＬ九互及びＸ２欠従 って、プローブ９は、株間を区別するある能力を伴って、Ｍ　’／ごワと土、」 シ２２２複合体（Ｍ　ボビス及びＢＣＧを含ム）に対して特異的である。

プローブ９の制限地図は第１４図に示される。そのプローブは２種のＥｃ　ｏＲ ■部位により結合され、そして４種のＰｖｕ１１部位により、約３．５ｋｂ、ｌ ｋｂ、４ｋｂ及び０．５　ｋｂのフラグメントに分割される。

プローブ５ プローブ５に対する研究は、それが、Ｍ　ツベルキュロシス複合体のＭ、ツベル キュロシス、Ｍ、ボビス、Ｍ、アフリカナム、Ｍ、ミクロチ及びＭ、ボビスＢＣ Ｇにおける種々の数のコピー（約１５個まで）に存在すると思われる挿入要素（ ＩＳ９８６）をコードする配列を含んで成ることを示した。

その挿入要素を、Ｅ　コリに見出される前記の挿入要素ＩＳ３及びｌ５３４１１ に比較した。プローブ５の挿入要素は、たぶんトランスポーザセをコードするｌ ５３４１１にほぼ相同である。

プローブ５の制限地図は第１図に示される。そのプローブは、２つのＰｖｕ［部 位で示されるようなフラグメンｌ−５Ａ。

５Ｂ及び５Ｃに分割され得る。

５Ｃの配列は第２図に示される。有用な制限部位はボックスでかこまれ、そして ｌ５３４１１からの左側の逆方向反復体（ＩＲ）を有する２９／４０及び１３３ からの逆方向反復体を有する２　０／４０の配列は下線が引かれている（Ｉｓｈ ｉｇｕｒｏ　＆　５ａｔｏ　１９８８．　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　１ ７０　１９０２〜１９０６；　Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ　＆　Ｙｕ　１９８５．　Ｎ ｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｉ？ｅｓ、１３．　２１２７〜２１３９）　。　ＩＳ３及 び１５３４１１と比較される５Ｃの一部の一次ＤＮＡ構造体を比較する線図が第 ３図に示される。

第４図は、プローブ５のフラグメン）５Ｂ及び５Ｃの一部をオーバラップするＤ ＮＡ配列を示す。第２図におけるように、有用な制限部位はボックスでかこまれ る。ＰｖｕｌＩ制限部位は、フラグメント５Ｂと５０との間の連結部を定義する 。

このＤＮＡ配列は、第４図において下線を引かれた２つの逆方向反復体配列（２ ７／３０塩基マツチング）を含んで成る。

左側ノ逆方向反復体ＣＣＴＧＡＡＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＡＴＧＴＣＣＧＧＡＧＡ ｃＴＣは、第１ＡｃｃＩ［Ｉ部位の５′側に向かってフラグメン）５Ｂ内に位置 し、そして右側の逆復単位ＧＡＧＴＣＴＣＣＧＧＡＣＴＡＣＣＧＧＧＧＣＧＧＴ ＴＣＡＧＧは、第２Ａｃｃｌ［［部位の３′側に向かってフラグメント５Ｃ内に 位置する。これらの逆方向反復単位配列の間の配列は、Ｍ、ツベルキュロシス複 合体のメンバーにおける種々の数のコピーに存在する挿入要素ｌ５９８６　（約 １３５８ｂｐ）を含んで成る。

前記挿入要素の試験は、位置４７８で可能性ある翻訳開始コドン（ＧＵＧ）を存 する１−′）の長い読み取り枠（ＯＲＦｂ：塩基２７４〜１３１１）及び逆方向 にもう１つ（１１０７〜６２２）を示した（第５図）。位置する好ましい塩基分 析は、２つの短い０ＲＦｓ　（６〜２７５及び１６４〜３７６）の部分と共に、 可能性ある翻訳された領域としてこれらの両者を示した。（下記に論ぜられるた めには、後者の２つは一緒に考慮され、そしてそれぞれ０ＲＦａｌ及び０ＲＦａ ２と命名され；たぶん翻訳されるべき領域は第５図に示されている。）ＯＲＦｂ 及びそれよりも少ない程度の０ＲＦｃのコバン使用法は、結核菌遺伝子により通 常水される高い程度のコドンバイアスと合致する（Ｄａｌｅ、　Ｊ、Ｗ、　ａｎ ｄ　Ｐａｔｋｉ、　Ａ、（１９９０）、　ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ ｏｇｙ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ（ＦｃＦａｄｄｅｎ、　ＪＪ、＋版） 出版）。これはまた、０ＲＦａｌ及び０ＲＦａ２　（第２図）の指摘された領域 のためにも真実であるが、但し、これらの０ＲＦｓ（下記に示される）の残りの ためにはそうでなかった。

０ＲＦｂの仮説に基づく翻訳生成物の配列を、ＮＢＲＦ及び５ｗ１ｓｓ　Ｐｒｏ ｔデータバンクに対してスクリーンした。１つの配列は、バックグラウンドより も有意に高い相同性により同定され、これはＥ　コリからの挿入配列ｌ５３４１ １の推定上のトランスポザーゼタンパク質であり（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ　ａｎｄ　 ５ａｔｏ　；　１９８８．　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　１７０．１９０ ２〜１９０６）；低い程度の類似性は、シゲラ　ソンネイ（Ｓｈｉ　ｅｌｌａ　 ５ｏｎｎｅｉ）からの２つの他の挿入配列、ｌ５６００及びＴＳ６２６の配列か ら翻訳された仮説に基づくタンパク質により見出された（Ｍａｔｓｕｔａｎｉ、 　Ｓ、、　０ｈｔｓｕｂｏ、　Ｈ，、Ｍａｅｄａ　Ｙ、　＆　０ｈｔｓｕｂｏ、 　Ｅ。

（１９８７）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　 １９６．４４５〜４５５）。これらのすべての配列は１５３の種類に属する。

これらの配列及びＩＳ３トランスポザーゼの複数の整合（Ｔｉｍｍｅｒｎ＋ａｎ 、　Ｋ、Ｐ、　＆　Ｔｕ、　Ｃ−Ｐ、Ｄ、（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１３．２１２７〜２１３９）は、著しい程度の類似性 （但し、■５３４１１タンパク質のＣ−末端部分を除く）を示す、ｌ５３４１１ のこの領域の異なった構造はまた、Ｉｓｈｉｇｕｒｏ　＆　ｓａｔ。

（１９８Ｂ）により示されるようなＩＳ３及びｌ５３４１１の推定上のトランス ボザーゼ（逆方向反復体により結合される挿入要素を含んで成るＤＮＡセグメン トのゲノムの他の部分での切断及び挿入を可能にするタンパク質）の整合から明 らかである。しかしながら、ＩＳ３．ｌ５３４１１及び１３９８６の完全な配列 のすべての３種の読み取り枠の生成物の比較は、ｌ５３４１１の−１読み取り枠 とｌ５９８６０ＲＦｂのＣ−末端部分との相同性を示した。仮説に基づくフレー ムシフト（第６図）を有するｌ５３４１１生成物を用いての複数の整合（配列は ｌ５３４１１における推定上のフレームシフトに対応する点で分裂し；その２つ の部分は別々に整合し、そして手動的に再び組合された。ｌ５３４１１の配列は 、その配列の第１部分に対して−１読み取り枠から読み取られる）は、ｌ５９８ ６０ＲＦｂ生成物の２７％のアミノ酸残基がまた、比較のために使用される他の ３種の配列の中の少なくとも２種の配列に存在し、そしてこれらの約半分がすべ ての４種の配列において同一であることを示す。同一の残基群が、保存さレタ特 徴、Ｌ／ＶＷＶ／ＡＡＤＬＴＹＶ、ＩＨＨＴ／５ＤＲＧＳＱＹ及びＣ／５ＹＤＮ Ａを含む３種の領域に見出され得る。これらの領域の保存の程度は、それらがこ のタンパク質の機能のために必須であることを示す。

０ＲＦｂ　（ＧＵＧ４ｔ＊）における可能性ある出発コドンの前の配列は、たぶ ん有意ではないコンセンサスＳｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎ。

配列に対して弱い類似性のみを示す。従って、０ＲＦｂの可能性ある翻訳開始の 性質が、その上流領域の試験により調べられた。ＩＳ３．ｌ５３４１１及びｌ５ ９８６の翻訳生成物の３種の読み取り枠の比較は、さらに、この領域において類 似性を示した。ＩＳ３及びｌ５３４１１の両者において、その推定上のトランス ボザーゼ遺伝子（ＯＲＦｂ）の先に、良好な翻訳開始シグナルを有する、約３０ ０塩基対の読み取り枠が存在する（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ、　Ｎ、　＆　５ａｔｏ、 　Ｇ、（１９８８）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　１７０ ＋　１９０２〜１９０６　；及びＭａｔｓｕｔａｎｉ、　Ｓ、、０ｈｔｓｕｂｏ 、　Ｈ，、門ａｅｄａ、　Ｙ、　＆　０ｈｔｓｕｂｏ、　Ｅ（１９８７）　Ｊｏ ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１９６．４４５〜４ ５５）。これらの○ＲＦｓの適切な領域の仮説に基づく生成物は、１３９８６配 列における可能性あるフレームシフトを示す０ＲＦａｌ及び０ＲＦａ　（第７図 ）（示唆されたフレームシフトの位置まで及びそれから出発する０ＲＦａｌ及び ０ＲＦａ２の翻訳された生成物は、他の要素の対応する読み取り枠の生成物と連 合された。０ＲＦａ２を除くすべての配列は、推定されるＡＵＧ開始コドンから 出発した）の生成物と十分に整合する。他方、第７図に示される配列中に５個の アミノ酸の可能性ある出発コドン（ＧＵＧ２゜。）が存在し；その結果、たぶん ０ＲＦａ２は独立して翻訳される。第７図に示される可能性あるリポソーム結合 部位は、単一の塩基によりＧＵＧコドンから単に分離され、そして従って、確か でない有意性のものである。組合された０ＲＦａｌ及び○ＲＦａ２生成物のうち 、２９％の残基が、示される他の３種の配列のうち２種の配列に見出される。対 の比較は、その整合を確証し；たとえば、５０％残基がｌ５３４１１の０ＲＦａ 生成物とマツチする。第７図に示される整合は、１３３種類のいくつかの要素の ０ＲＦａ生成物が単に限界に近い相同性を示すＳｃｈｗａｒｔｚなど（Ｓｃｈｗ ａｒＬｚ、　Ｅ、＋　Ｋｒｏｇｅｒ、　Ｍ、　＆Ｒａｋ＋　Ｂ、（１９８Ｂ）　 Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１３＋　２１２７〜２１３９ ）の発見とは著しく異なっている。

ｌ５９８６の０ＲＦａｌは、位置５４で可能性ある開始コドン（ＡＵＧ）を有し 、その先に、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏコンセンサス配列とマツチする７個 の塩基のうち５個の塩基を示す配列のいくつかの可能な割り当てを伴ってプリン に冨む領域が存在する。１３３種類のいくつかの他のメンバーに関して、推定上 のトランスポザーゼ（ＯＲＦｂ）の翻訳は、０ＲＦａからの読み取りにより生じ ると思われる。ｌ５３４１１及びＩＳ３の両者において、翻訳停止シグナルで終 る０ＲＦａは、配列ＡＵＧＡを伴って、０ＲＦｂのための推定上の出発コドンと オーバラップする。従って、この点で終結するリポソームは、オーバラップする ＡＵＧコドンで再開始することができる。しかしながら、ｌ５９８６においては 、０ＲＦａ２は０ＲＦｂとオーバラップするが、０ＲＦｂのオーバラップ領域に おいて可能性ある出発コドンは存在しない。

融合タンパク質を生成するリポソームフレームシフトは、たぶん配列ＵＬＩＩＪ ＡＡＡＡＡＣで、２種の０ＲＦｓがオーバラップする領域におけるＩ　Ｓ　１　 （Ｓｅｋｉｎｅ、　Ｙ、　＆　０ｈｔｓｕｂｏ、　Ｅ、（１９８９）Ｐｒｏｃｅ ｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉ ｅｎｃｅｓ　ＵＳＡ　８６＋Ｓ３及びｌ５６００のすべては、２種の０ＲＦｓ間 のオーバラップ領域において５〜７個のＡ残基の種類を含む。ｌ５９８６におけ る０ＲＦａ　２と０ＲＦｂとの間のオーバラップ領域は、そのような長い種類の アデニンを含まないが、しかし配列ＵＵＩＪＬＩＡＡＡＧ　（３２４〜３３１） はそのようなフレームシフトの出来事のための候補体であり得る。−１の方向に おける翻訳フレームシフトはまた、共通する配列を有すると思われない他の原核 生物の遺伝子にも生じる（Ａｔｋｉｎｓ、　Ｊ、　Ｆ、　Ｇｅ５ｔｅｌａｎｄ、 　Ｒ。

Ｆ、、　Ｒｅ１ｄ、　Ｂ、　Ｒ，＆　Ａｕｄｅｒｓｏｎ、　Ｃ，Ｗ、（１９７９ ）　Ｃｅ１ｌ　１８．１１１９〜１１３１）。

逆方向鎖上での０ＲＦｃの有意性は不明確である。最初の可能性ある出発コドン （Ａ　Ｕ　Ｇ　＋ｏｏｚ）の先に、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏ配列に類似す るいづれのものも存在しない。０ＲＦｃの分析は翻訳された配列と調和するが、 他方、それは０ＲＦｂと整合して存在し、そしてそれらの２種の鎖に対する分析 方法は無関係でない。Ｓｃｈｗａｒ　ｔｚなど（Ｓｃｈｗａｒｔｚ、　Ｅ、、　 Ｋｒｕｇｅｒ、　Ｍ。

＆　Ｒａｋ、　Ｈ，（１９８８）ＮａｃＪｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ　１４＋　６７８９〜６８０２）は、Ｅ、コリ要素ｌ５１５０において類似す るＯＲＦを同定し、これはコード機能を有すると思われる。逆方向鎖上での０Ｒ Ｆｓの存在は、他のＩｓ要素の共通する特徴であり、そしてＩｓ要素が外部転写 により不必要に活性化されないことを確保する両タンパク質のための必要条件に よる可能性ある染色体上の遺伝子の移動の調節に包含されると思われる（ＧａＩ ａｓ、　Ｄ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｃｈａｎｄｌｅｒ＋　Ｍ、（１９８９）Ｍｏｂｉ ｌｅ　ＤＮＡ（Ｂｅｒｇ、　Ｄ、　Ｂ。

ａｎｄ　Ｈｏｗｅ、　Ｍ、　Ｍ、　１　版）、　１０９〜１６２ページ、　Ａｍ ｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｗａｓ ｈｉｎｇｔｏｎ　）　ｅ追加の研究が、Ｘ−ツベルキュロシスにおいて作用する 翻訳（及び転写）制御シグナルの実際の性質を定義するために必要とされる。

ｌ５９８６の塩基組成は、６４％のＧｔｃで、Ｍ　ツベルキュロシスの典型であ る。従って、タンパク質レベルでそのように判断される、１３３種類の他のメン バーとの相同性がＤＮＡレベル（データーは示されていない）でほとんど目だた ないことは驚きにあたいしない。しかしながら、１３３種類の他のメンバー、特 にＩＲ端がｌ５９８６の端と７８％同一である１３３４１１（第８図）と逆方向 反復棒端との著しい程の類似性が存在する。

第９図は、５Ｃからの大きな読み取り枠が、旦−且ユからの挿入要素ｌ５３４１ １の大きな読み取り枠に対して強い相同性を有することを示す。それはまた、ｌ からの）Ｓ３に対しても相同である（第１０図）。すべての３種の配列の整合が 第１１図に示される。１３３４１１及びＩＳ３の配列と共に、Ｍ、ツベルキュロ シス（ＩＳ９８６）の５　ｋｂｏ）ＤＮＡフラグメントからの挿入配列の大きな 読み取り枠の可能性ある翻訳された生成物の整合が第１２図に示される。第１３ 図においては、類似する比較が行なわれるが、しかしｌ５３４１１配列のＣ−末 端領域（Ｉ３３４１１’）は、ｌ５３４１１配列の残りに対して−ｌの読みをり 枠から読み取られる。

プローブ５を、Ｍ、ツベルキュロシス並びにＭ、ボビス及びＢＣＧの２２個の単 離体により、プローブ９について記載されているような実質的なハイブリダイゼ ーション実験により試験した。その条件はプローブ９について上記で記載される のと同じであるが、但し、オートラジオグラフ法は、室温で６．５時間であった 。

個々のＭ　ツベルキュロシス株は、５〜１５の強くハイブリダイズするフラグメ ント並びに多くのより弱いバンドを示した。バンドの数及びシグナルの強さ、並 びに株間の変興は、それらの鎖の染色体におけるランダムに挿入された反復ＤＮ Ａ要素の存在を示した。

Ｍ、ボビス及びＢＣＧは、それぞれ２及び３個の主要バンドの類似するパターン を示した。従って、これらの生物は、工Ｙ−二乙”：　）ｋ　＋　ｘ　Ｃ７−７ ノ、から及びお互いから容易に区別され得ない。

次の種の結核菌（示される場合を除き、それぞれ１種の鎖）は、プローブ５とハ イブリダイズしなかった：Ｍ、パラッペルキュロシス、Ｍ、インド−ｉｉ上止上 上Ｌフクロフニ左、ｙ−ム２ヱ、Ｍ、フ亡昼（３種の株）１．Ｙ−丸ンザシイ、 Ｍ、アビウム、Ｍ、マルニオエン７［−ＳＭ、ヱ旦丘スセンス、Ｍ、：ｒ／１ｚ ＦＩ工及びＭ、ケロネイ（２種の株）。

従って、プローブ５は、Ｍ、ツベルキュロシス複合体に対して特異的であり、そ してさらにＭ　ツベルキュロシス、Ｌボビス及び８００間を区別し、そしてＭ　 ツベルキュロシスの株間を区別することができた。

サザンプロット上でのフラグメント５Ａは、お互い２．１及び０．６５ｋｂｐで の同一のバンドを付与する、Ｍ　ツベルキュロシスＨｚｔＲｖ及びＨｓｒＲａ及 びＭ　ボビスＢＣＧからのＤＮＡと強く且つ特異的にハイブリダイズし、但し、 それはＭ　ツベルキュロシスのいづれかの株によるこれらの大きさのバンドを必 ずしも付与しない。

■呈上二盪厘箪 同定され、そしてプローブ５の一部又はすべてを含んで成る配列の一部又はすべ てが、遺伝子プローブとして使用され得る。特に、挿入要素を構成するような、 ５Ｃ及び５Ｂにおいて同定される配列の一部又はすべてが遺伝子プローブとして 使用され得る。そのようなプローブがＭ、ツベルキュロシス複合体の細菌検体か らの切断されたゲノムＤＮＡに基づくハイブリダイゼーション研究に使用される 場合、特徴的なバンドパターンが生成され、そして従って、そのようなプローブ は、診断及び疫病学的手段として有用である。異なった種のみでなく、また種内 の異なった株が特異的なハンドパターンを生成する。これは、特に、Ｍ、ボビス 及び他の種からのＭ　ポくムＢＣＧ並びに実際、Ｍ、ポ旦スＢＣＧからＭ、ボ１ ？７．を区別するために有用である。プローブ５Ａは、Ｍ、ツベルキュロシス複 合体のすべてのメンバーを検出するために、一般的なプローブとして使用され得 る。

プローブ５又はそのフラグメントの診断用手段としての有用さは、次の特徴によ り十分である。

ａ）挿入要素は、単に、Ｍ　ツベルキュロシス複合体（Ｌッベルキュロシス、Ｍ 工ｉｅｘ、Ｍ、アワ１カ　ム及びＬミクロチ）のメンバーにおいて見出され、そ して非病原性環境結核菌又は−Ｍ　−１−ｘのいづれにも見出されなかった。

ｂ）プローブとしてプローブ５（又は５における挿入要素の一部）を用いてのサ ザンプロット分析を用いて、種々のパターンのバンドが、試験された個々のＭ　 ツベルキュロシス単離体により見出される。これは、結核症の伝達を試験するた めに疫病学的研究において有用な手段である。

ｃ）Ｍ−−ノごジと±ユ０−＞！、とＭ、ボビスとの間及びたぶんより重要には Ｍ　ボビスとＭ　ボビスＢＣＣとの間の差異を示すことが最初のプローブの１つ である。

ｄ）Ｍエニｆｌ？７．及ヒＭ、ツベルキュロシスからＭ、ボビスＢＣＧを区別す るためにプローブとしての挿入要素の使用は、ワクチン化又は免疫抑制の後、播 種性のＢＣＧ感染を有する患者において有用である。

ｅ）挿入要素（２つの挿入配列を両端に有する）は、未知の遺伝子を特徴づける ことにおいて有用な遺伝的手段である。

従って、本発明は、Ｍ、ツベルキュロシス複合体の細菌メンバーをお互いから及 び複合体でない他の細菌から区別し、そして特徴づける多くの手段を提供する。

たとえば、細菌のサンプルからのＤＮＡが、特定の制限酵素により消化され、そ してハイブリダイゼーション分析が、ここに開示されるＤＮＡのフラグメントを プローブとして使用して行なわれ（標準技法に従って）、ここで前記フラグメン トは、サンプルＤＮＡを切断するために使用される制限部れのＰｖｕＩ［部位も 含まないプローブ５１５Ｃ（第１図及び第２図の塩基４２０〜８１０を参照のこ と）のＢａｍＨＩ〜Ｘｈｏｌフラグメント（又はその一部が、Ｍ　ボビスＢＣＧ ＤＮＡのＰｖｕｌｌ消化物をプローブするために使用された。

これが行なわれる場合、単一バンドに対する強いハイブリダイゼーションが観察 され、これは、試験されるＭ、ボビスＢＣＧ株において、挿入要素が単一コピー で存在することを示す。

サンプルＤＮＡを切断するために使用される制限部位を含むプローブを使用すれ ば、サンプルＤＮＡが、たとえば挿入要素の複数コピーを含む場合にまた生じる であろうように、すなわちＭ　ツベルキュロシス複合体のほとんどのメンバーに 良く存在するように、複数のバンドハイブリダイゼーションが生じるであろう。

それにもかかわらず、そのバンドハイブリダイゼーションパターンは、同じ種の 異なった株間を及びＭ　ツベルキュロシス複合体の異なった種間を区別するため に使用され得る。Ｍ、ツベルキュロシス複合体のすべてのメンバーを検出するた めの一般的なプローブは、挿入配列からのＤＮＡを含む必要はないが、しかしフ ランキングＤＮＡ、たとえば上記のようにＰｖｕＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント ５ＡからのＤＮＡを独占的に含む必要がある。腸内細菌からの特徴づけられたＩ Ｓ要素に密接に関連する挿入配列のＭ、ツベルキュロシスにおける存在は、いく つかの観点から相当に有意なものである。検出される複数の制限フラグメントの 長さの多型現象（Ｚａｉｎｕｄｄｉｎ、　Ｚ、　Ｆ、　＆　Ｄａｌｅ、　Ｊ、　 Ｗ、　（１９８９）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌｏｇｙ　１３５＋　２３４７〜２３５５）　は、ｌ５９８６の複数のコピー がＭ　ツベルキュロシスの異なった単離体における異なった部位で挿入されるこ とを示す。この点において、それは、種々の単離体に関して同一のサザンプロッ トパターンを付与する、結核菌からの他の最近記載された反復要素とは異なる（ Ｃ１ａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ、　Ｊ、　Ｅ、　＆　Ｗａｌｓｈ、　Ｇ、　Ｐ、（ １９８９）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　１７１．４８４ ４〜４８５１　；Ｃ１ａｒｋ−ＣｕｒＬｉｓｓ、　Ｊ、　Ｅ、　＆　Ｄｏｃｈｅ ｒｔｙ、　Ｍ、＾、　（１９８９）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏ ｕｓ　Ｄｔｓｅａｓｅｓ　１５９＋　７〜１５　；及びＧｒｅｅｎ、　Ｅ、　ｐ 、ｌ　Ｔｉｚａｒｄ。

９、Ｌ、ν、、　Ｍｏ５ｓ、　Ｍ、　Ｔ、、　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｊ、、　Ｗｉ ｎｔｅｒｂｏｕｒｎｅ＋　Ｄ、　Ｊ、。

ＭｃＦａｄｄｅｎ、　Ｊ、　Ｊ、　＆　Ｈｅｒｗ＋ｏｎ−Ｔａｙｌｏｒ＋　Ｊ、 　（１９８９）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｊｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１７．９０ ６３〜９０７２）　、これは、ｌ５９８６が、結核菌種のトランスポゾン突然変 異誘発のための重要な値のものである、結核菌における機能的な転位要素であり 得ることを示唆する。ｌ５９８６の転位能力は、ＪＳＩについて確立されたよう に（Ｓｅｋｉｎｓ、　Ｙ、　＆　０ｈｔｓｕｂｏ、　Ｅ、　（１９８９）　Ｐｒ ｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　 ５ｃｉｅｎｃｅｓ　ＬＩＳＡ　８６＋　４６０９〜４６１３）、０ＲＦａと０Ｒ Ｆｂとの間のオーバランプにおけるリポソームフレームシフトにより調節され得 る。

広範囲の種類の源からのＭ、ツベルキュロシスの臨床的に単離された株における ｌ５９８６の存在（Ｚａｉｎｕｄｄｉｎ、　Ｚ、　Ｆ。

＆　Ｄａｌｅ、　Ｊ、　Ｗ、　（１９８９）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ ｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１３５、２３４７〜２３５５）及びｌ−ユニ 及びＭ、ソンネイからのＩｓ要素との関係は、Ｍ、ツヘルキュロシス株の間の遺 伝子材料のトランスファーの可能性及びグラム陰性細菌の獲得を示す。Ｍ　ツベ ルキュロシスの少なくともいくつかの臨床株はプラスミドを担持し、そしてこれ らはそのような要素の播種に役割を演じることが示され（Ｚａｉｎｕｄｄｉｎ、 　Ｚ、　Ｆ、　＆　Ｄａｌｅ。

Ｊ、　Ｗ、（１９９０）　Ｔｕｂｅｒｃｌｅ　７１）；結核菌において複製する イクツかのＥ、コリプラスミドの能力（Ｚａｉｎｕｄｄｉｎ、　Ｚ、、　Ｋｕｎ ｚｅ、　Ｚ。

＆　Ｄａｌｅ、　Ｊ、　Ｗ、　（１９８９）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌｏｇｙ、２９〜３４）は、挿入配列の旦−シ史からＭ　ツベルキュロシ スへの広がりを可能にする。しかしながら、接合は；Ｍ、ツベルキュロシスにお いて決して決定的に示されておらず、そしてその生物は、通常、たとえば腸にお ける他の生物との偶発的な遭遇とは別として単独の存在性を有する。従って、挿 入配列を担持するプラスミドの伝達は、たぶんまれな出来事であろう。

ＩＳ要素の高いＧ＋Ｃ組成は、Ｍ、ツベルキュロシスによるその獲得が最近の出 来事ではないことを示唆する。これらの問題は、実験棟及び臨床的な単離体にお けるこの挿入配列の挙動の研究により解決され得る。

ｌ５９８６は、Ｍ、ツベルキュロシス複合体のすべての種に見出されるが、但し 、そのコピー数は異なり、そして他の結核菌種には見出されない（Ｚａｉｎｕｄ ｄｉｎ、　Ｚ−Ｆ、　＆　Ｄａｌｅ、　Ｊ、　Ｗ。

（１９８９）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ ｇｙ　１３５．２３４７〜２３５５）。

従って、ｌ５９８６に基づくプローブは、病原性結核菌に対して高い特異性を有 するであろう。ポリマラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）の使用と結合される場合、これは 臨床学的検体におけるＭ　ツベルキュロシスの検出及び特定化のためにひじょう に感受性のシステムを提供するであろう。このプローブによリ試験されたＭ　ツ ベルキュロシス単離体の広範な多量現象（Ｚａｉｎｕｄｄｉｎ、　Ｚ、　Ｆ、　 ＆　Ｄａｌｅ、　Ｊ、　Ｗ、　（１９８９）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ ｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｔｏｌｏｇｙ　１３５．２３４７〜２３５５）は、臨床学 的単離体をフィンガープリントすることによって、ひじょうに正確な疫病学的研 究の実施を可能にする。このシステムに関して、すべてではないが、しかしほと んどの密接に関係する単離体は、種々のパターンのハイブリダイズ制限フラグメ ントを生成し、そして従って、社会を通してＸ−２丘土本王旦之スの種々の株の 広がりを追跡することが可能であろう。

プローブ１２ “″プローブ１２”は、厳格な条件下で、ＥｃｏＲＩにより消化されたＨ、、Ｒ ｖのライブラリーをＨ：＋７ＲｖＤＮＡによりスクリーニングし、そして強くハ イブリダイズするクローンを単離することによって得られる、Ｍ、ツベルキュロ シスＮ　ＣＴ　Ｃ７４１６Ｈ３７Ｒｖからの約２５．２ｋｂのＥｃｏＲＴフラグ メントである。その２５．２ｋｂのＥｃ　ｏＲｌフラグメントは、約８．　９ｋ ｂ、３．　８ｋｂ、３．　５ｋｂ、３．　０ｋｂ（フラグメント１２Ｊ）、１． ８ｋｂ（フラグメント１２Ｂ）、１゜６ｋｂ、１．４ｋｂ及び１．２ｋｂ（フラ グメント１２Ａ）のフラグメントにＰｖｕＩＩにより消化される。１．２ｋｂの １２Ａフラグメントは、プローブ５又は９に対して特異的であり、そしてそれに 関連しないＭ、ツベルキュロシス複合体である。

第１５図は、プローブ５に関する１２Ｊ及び１２Ｂフラグメントの配置を示す。

挿入配列を両端に有するＤＮＡは、挿入要素がゲノムにおける多くの位置で挿入 する事実のために、それがプローブ５におけるフランキングＤＮＡに同一でない 場合、波状の線より示される。プローブ１２ＪのフランキングＤＮＡは、結核菌 の多くの異なった種とハイブリダイズする。フラグメン）１２Ｊは、広範囲の結 核菌を検出するために診断用プローブとしての価値を有する。

プローブ８ これは、Ｈ３？ＲＶのＥｃｏＲＶライブラリーをスクリーンするハイブリダイゼ ーションにより単離される約１６．１ｋｂのＥｃｏＲＶフラグメントを記載する 。

ＬツベルキュロシスからのＤＮＡによりサザンブロ・シト上でのプローブとして 使用される場合、それは多くのフラグメントに結合する。ｐｖｕＩＩ消化に基づ いて、それは約５゜６ｋｂ、４．８ｋｂ、２．１ｋｂ、２．０ｋｂ、０．９ｋｂ 及び０．７ｋｂの大きさのフラグメントを生成する。それは、プローブ５及び１ ２に関連するとは思えない。

ｌ５３ ＡＴｒ　ＡＴＴ ＳＣ（ＤＮＡＩ−８４９１ ■ＩＲ −０ＲＦ ←１００ｂｐ ９１ｏ　９２ｏ　９３０　９４０　９５０ＧＣＴＴＣＣＡＣＧＡ　ＴＧＧＣＣＡ ＣＣＴＣＣＡＴＧＧＴＣＣＴＣＧＡＣＧＣＧＡＴＣＧ　ＡＧＣＭＧＣＣＡＴＣＴ ＣＧＡＣＣＣＧＣＣＡＡＣＡＡＧＡＡＧ　ＧＣＧＴＡＣＴＣＧＡ　ＣＣｒＧＡＡ ＡＧＡＣＧＴＴＡＴＣＣＡＣＣｌｏｌｏ　１０２０　１０３０　１０４０　１０ ５０ＡＴＡＣＧＧＡＴＡＧ　ＧＧＧＡＴＣＴＣＡＧ　ＴＡＣＡＣＡＴＣＧＡ　Ｔ ＣＣＧＧＴＴＣＡＧ　ＣＧＡＧＣＧＧＣＴＣ１０６０１０７０１０Ｂ０　１０９ ０　１１００ＧＣＣＧＡＧＧＣＡＧ　ＧＣＡＴＣＣＡＡＣＣＧＴＣＧＧＴＣＧＧ Ａ　ＧＣＧＧＴＣＧＧＡＡ　ＧＣＴＣＣＴＡＴＧＡｌｌｌｏ　１１２０　１１３ ０　１１４０　１１５０ＣＭＴＧＣＡＣＴＡ　ＧＣＣＧＡＧＡＣＧＡ　ＴＣＭＣ ＧＧＣＣＴ　ＡＴＡＣＡＡＧＡＣＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＡ１１６０　ｍ１７０　 １１８０　１１９０　１２００二＋にｉ −１すべての４種の配列において同一であるＩＣＰＡＡＧ エミコ４１１　−−−− 国際調査報告 １哨−ム―−・齢−ＰＣＴ／ＧＢ　９０１００２７６−２−

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．マイコバクテリウムフォルツイタムのプラスミドのＤＮＡによりマイコバク テリウムツベルキュロシスのゲノムライブラリーをスクリーンすることによって 得られるマイユバクテリウムツベルキュロシスのゲノムＤＮＡとハイブリダイズ する、結核菌感染の診断及び／又は疫病学的研究のためのヌクレオチドプローブ 。
2. ２．マイコバクテリウムツベルキュロシスのゲノムＤＮＡ及びマイコバクテリウ ムフォルツイタムのプラスミドとハイブリダイズする、結核菌感染の診断及び／ 又は疫病学的研究のためのヌクレオチドプローブ。
3. ３．本明細書の第２図に示されるヌクレオチド配列、又はその相補的配列を含み 、又はそれとハイブリダイズし、又は本明細書の第２図に示されるヌクレオチド 配列とのハイブリダイゼーションによるマイコバクテリウムツベルキュロシス複 合体の生物のゲノムライブラリーから得られるヌクレオチド配列を含み、又はそ れとハイブリダイズし、そしてマイユバクテリウムツベルキュロシス複合体の細 菌メンバーを、お互いから又はその複合体以外の細菌から区別し、そして特徴づ けることができる、結核菌感染の診断及び／又は疫病学的研究のためのヌクレオ チドプローブ。
4. ４．前記ゲノムライブラリーがマイコバクテリウムツベルキュロシス株５０４１ ０から得られる請求の範囲第１項記載のヌクレオチドプローブ。
5. ５．図面の第２図又は第４図のいづれかに示されるヌクレオチド配列又はその相 補的配列の一部又はすべてを含み、又はそれとハイブリダイズする、結核菌感染 の診断及び／又は疫病学的研究のためのヌクレオチドプローブ。
6. ６．マイコバクテリウムツベルキュロシス株５０４１０のゲノムにおいて、２種 の逆方向反復体配列により結合され、そして図面の第２図に同定されるヌクレオ チドコード配列を含む挿入要素のヌクレオチド配列の一部又はすべてを含み、又 はそれとハイブリダイズする、結核菌感染の診断及び／又は疫病学的研究のため のヌクレオチドプローブ。
7. ７．マイコバクテリウムツベルキュロシス株５０４１０のゲノムにおいて、２種 の逆方向反復体配列により結合され、そして図面の第２図に固定されるヌクレオ チドコード配列を含む挿入要素ヌクレオチド配列に隣接して存在するヌクレオチ ドのフランキング配列を含み、又はそれとハイブリダイズする、結核菌感染の診 断及び／又は疫病学的研究のためのヌクレオチドプローブ。
8. ８．図面の第２図における塩基８９６の３′末端の下流に存在するヌクレオチド のブランキング配列の一部又はすべてを含み、又はそれとハイブリダイズする請 求の範囲第７項記載のヌクレオチドプローブ。
9. ９．マイコバクテリウムツベルキュロシス株５０４１０のゲノムにおいて、図面 の第２図に示されるヌクレオチド配列の３′末端の下流に存在する約１．９ｋｂ のヌクレオチド配列の一部又はすべてを含み、又はそれとハイブリダイズする、 結核菌感染の診断及び／又は疫病学的研究のためのヌクレオチドプローブ。
10. １０．マイコバクテリウムツベルキュロシス、マイコバクテリウムボビス及びＢ ＣＧ間を区別することができる請求の範囲第１〜９項のいづれか１項記載のヌク レオチドプローブ。
11. １１．マイコバクテリウムツベルキュロシスの種々の株又は単離体間を区別する ことができる請求の範囲第１〜１０項のいづれか１項記載のヌクレオチドプロー ブ。
12. １２．マイコバクテリウムバラツベルキュロシス、マイコバクテリウムイントラ セルラレ、マイコバクテリウムスクロフラセウム、マイコバクテリウムフレイ、 マイコバクテリウムフォルツイタム、マイコバクテリウムカンサシイ、マイコバ クテリウムアビウム、マイコバクテリウムマルニオエンセ、マイコバクテリウム フラベスセンス、マイコバクテリウムゴルドナエ及びマイコバクテリウムケロネ イからの核酸に対して有意なハイブリダイゼーションを示さない請求の範囲第１ 〜１０のいづれか１項記載のヌクレオチドプローブ。
13. １３．請求の範囲第１〜１０のいづれか１項記載のヌクレオチドプローブを含ん で成るキット。
14. １４．請求の範囲第１〜１０のいづれか１項記載のヌクレオチドプローブを用い ることを含んで成る、疫病学的研究のために臨床学的サンプルにおける結核菌を 検出し、区別し、そして／又は特徴づけるための方法。
15. １５．マイコバクテリウムツベルキュロシス複合体の細菌メンバーをお互いから 又は複合体以外の細菌から区別し、そして特徴づけるための方法であって： 特定の制限酵素により細菌のサンプルからのＤＮＡを消化し；そして 請求の範囲第１〜１０のいづれか１項記載のヌクレオチドプローブを用いてハイ ブリダイゼーション分析を行なうことを含んで成る方法。
16. １６．実質的に図面に記載されるようなヌクレオチドプローブ。
17. １７．図面に実質的に記載されるような結核菌を検出し、区別し、そして特徴づ けるための方法。