JPH05501652A - 複製連鎖反応を利用してｂ．ブルグドルフエリを検出するためのｄｎａプローブおよびプライマー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 複製連鎖反応を利用してＢ、プルグドルフエリを検出するためのＤＮＡプローブ およびプライマ一 本出願は、１９９０年６月１５日に出願された小生の係属中の先願第７１５３Ｂ 、’９５７号の部分継続出願である。

発明が属する分野 本発明は、生体由来試料中に微量に存在する感染因子を検出するための核酸プロ ーブアッセイ法に関する。

本発明の背景 ライム病は、ダニ媒介スピロヘータＢｇｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒ　。

ｇｄｏｒｆｅｒｉがひき起こす臨床患者の一群である。それは、北米および欧州 で最も普通の節足動物媒介疾患である。この感染症独特の病形としては、慢性遊 走性紅斑、慢性萎縮性先端皮膚炎、リンパ球性背髄神経根炎およびライム関節炎 がある。この疾患の第２期および第３期には、重篤な神経系または心臓への達人 が観察される、臨床提示の多様性と周知の通りこの疾患が他の神経障害、リウマ チ性障害に似ていることとが、正確な診断を困難にしている。ライム病の臨床お よび病因の面からの総説については、５ｔｅｅｒｅら、Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅ ｄ、３０８　：　７３３およびＤｕｒａｙ。

Ｒｅｖ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、１１２：５１４８７を参照されたい、ライム病 の極めて重篤な臨床経過にもかかわらず、診断と適切な治療を早期に実施できれ ば、ライム病は抗生物質療法に極めてよく反応する。しかし、早期診断は、感染 後の最初の何日間あるｂｔｃよ何週間のうちに信頼すべき鑑別診断を可能にする 試験法がないために、できないことである。現在用いられている診断用試験はい ずれも血清学的なもので、間接免疫蛍光法（ＩＦＡ）、酵素結合免疫吸着剤検定 （ＥＬＩＳＡ）および免疫プロッティングを包含する。このような免疫学的試験 は、所期疾患の患者の約５０〜６０％しか、感染後の最初の３〜６週間の間にＩ ＦＡやＥＬＩＳＡによって測定可能で診断に役立つ値を持たないので、信頬でき ないものである。

その上、Ｔ、ｐａ　１１　ｉｄｕｍが惹起する梅毒およびＢｏｒｒｅＩｉａ　ｈ ｅｒｍｓｉｉが惹起する回帰熱の患者で、ＩＦＡおよびＥＬＩＳＡでの偽陽性反 応が報告されている。Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの血清依拠アッセイで偽陽性 が多いのは、病原性スピロヘータ間で遺伝的相互関係が高度な結果、主要構造決 定基の血清学的交差反応性が生じることに帰しうる。たとえば、Ｍａｇｎａｒｅ ｌｌｉら、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、、１５６：１８３　（１９８７）参照。

血清学的アッセイに代るものとして、核酸プローブが極めて特定された標的配列 に結合するという性質に基いた試験がある。ライム病では、微生物自体が感染中 極めて少数存在するだけであるので、まず標的核酸配列を増幅して、シグナル発 生分子を結合させたプローブが十分な数だけハイブリダイズして、検出可能なシ グナルを発生するようにすることが必要である。かかるプローブ依存アアセイ法 の戦略は、検出しようとする微生物種のついて標的配列が特異性をもち、標的配 列の認識がその種のあらゆるメンバー株に及ぶということにある。

Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの核酸プローブアッセイは、この微生物とそれに密 接に関連する種、とくに回帰熱の諸変種であるＢ。

ｈｅｒｍｓ　ｉ　ｔ、Ｂ、ｐａｒｋｅｒｉ、Ｂ、ｔｕｒ　１ｃａｔｒａｅ、Ｂ、 ｈｉｓｐａｎｉｃａおよびＢ、ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓとを弁別できなければな らない。種々のＢｏｒｒｅｌｉａについてのＤＮＡの相同性の検討により、Ｈｙ ｄｅ　＆　Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｚｂｌ、Ｂａｋｔ、Ｈｙｇ、Ａ、２６３　：１１９ 　（１９８８）において報告されているように、種々の程度の相同性が示され、 Ｂ、ｈｅｒｍｓｉｉが５８〜６３％という最大の相同性を示す。北米の３つの種 、Ｂ、ｈｅｒｍｓｉｉ、、Ｂ、ｔｕｒｉｃａｔａｅおよびＢ、ｐａｒｋｅｒｉは ７７〜１００％の相同性を共有するが、欧州と北米の諸株の比較により、実質的 な種内変動が示されている。

核酸プローブアッセイによるＢ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの検出に当っては、０ ｓｐＡおよびＯｓ　ｐＢ表面蛋白抗原に対するプローブ゛が注目されてきた。Ｎ １ｅｌｓｏｎら、Ｍｏ１．Ｃｅ１．Ｐｒ。

ｂｅｓ、４ニア３　（１９９０）は、増幅された１４５塩基対の０３ｐＡセグメ ントを成功裏にプローブ探査して、スピロベータ５０抗凝固剤に相当するＢ、ｂ ｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ　ＤＮＡわずか５０ｆｇを検出したことを報告している。

プローブは、Ｂ、ｈｅｒｍｓｉｉ、Ｔ、ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｔ、ｄｅｎｔｉｃｏ ｌａあるいはＳ、ａｕｒｅｕｓとの交差反応性が認められなかったことから、Ｂ 。

ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉに対し特異的であることが見出された。しかし、Ｐｅｒ ｓｉｎｇら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏ、、２８：５６６　（１９９０）は、多 数の真正なり、ｂｕｒｇｄｏｒｆｒｅｉ分離株の０ＳＰＡＳＩ域をプローブ探査 し、それらのプローブが分離株の全てを断定的に同定できるわけではないことを 見出した。この結果の分子レベルでの根拠は、Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉが株 によっては大きく異なる０ｓｐＡ蛋白を有したり、Ｏｓ　ｐＡ蛋白を全くもたず 、代りに、より小さいｐＣという蛋白を持つという知見であった。それゆえ、現 在のところ、Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉに対する決定的なアッセイ法はない。

より最近の研究は、Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉが１群より多くの微生物を包含 しているかもしれないことを示している。Ｐｏ５ｔｉｃら、Ｒｅｓ、Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌ、、１４１　：４６５　（１９９０）は、種々の出所からの１３株をＤ ＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションによって分析し、４株からなる亜群を９参 照株から区別できることを見出した。Ｒｏｓａら、Ｊ、ＣＩｉｎ９ＭｉｃＣｌ１ ｎ９！、、２９：５２４　（１９９１）も、ゲノムの未知部分からのＢ、ｂｕｒ ｇｄｏｒｆｅｒｉ特異性標的配列を用いてのＤＮＡ増幅パターンにより、Ｂ、ｂ ｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの２亜群を識別できることを見出した。これら２グループ の結果の間には大きな矛盾があって、これらの系が満足できるほどに特異性のあ る診断上の価値をもっていないかもしれないことを示している点を注記しておく べきであろう。

発明の要約 Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉおよびＢ、ｈｅｒｍｓｉｉからの、高保存性フラジ ェリン遺伝子をコードするＤＮＡ配列を比較すると、短い欠失を含めて、５０〜 ７０％の食い違い（ミスマツチ）塩基を含む相対的に非相同性の小さい領域が明 らかになる。この領域から選んだプライマーは、Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉに 特異的なプライマー間配列の増幅を指示することが見出された。このプライマー 間領域のために構築されたプローブは、Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉを特異的に 同定する。

本発明によれば、かかるプライマーおよびプローブを用いて生体由来試料中のＢ 、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉを特異的に検出するためのバイオアッセイ法は、 該試料から核酸画分を抽出し、 鞭毛の開放型読み枠をコードする核酸の生保存領域のフランキング（隣りの）配 列に対して相補鎖特異性プライマ一対を加え、それらプライマーを相補鎖配列と ハイブリダイズさせ、核酸増幅技法によって該生保存領域を増幅させ、増幅され た生保存領域を、プライマー間配列から構築されたシグナル発生プローブとハイ ブリダイズさせ、ハイブリダイズされたプローブが発生するシグナルを検出する こと からなる。

本発明の他の一面では、鞭毛の開放型読み枠領域においてＢ、ｂｕｒｇｄｏｒｆ ｅｒｉに特異的であるオリゴヌクレオチドプライマ一対を選ぶが、第一のかかる プライマーは、鞭毛の開放型読み枠の３９０番〜７７０番ヌクレオチドからの約 ８〜３２個の連続した塩基の配列からなり、第二のかかるオリゴヌクレオチドプ ライマーは、第一のプライマーの５°末端から少なくとも５０ヌクレオチドの間 隔を置いて相補鎖上にあり、Ｂ、ｈｅｒｍｓｉｉの対応する配列との相同性が７ ０％以下である８〜３２個の実質的に連続した塩基を含む配列からなる。

本発明のさらに別の一面は、フラジェリン遺伝子の開放型読み枠の非相同領域か ら増幅された核酸を特異的に検出するためのプローブの選択を含む、これらのプ ローブは、Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの鞭毛の開放型読み枠の配列に対しては 実質的に相同であるが、Ｂ、ｈｅｒｍｓｉｉの対応する配列に対しては約７０％ した相同でないシグナル発生性オリゴヌクレオチドトレーサーからなる。トレー サーに結合されるシグナル発生手段は、放射性標識、蛍光標識またはビオチニル 化標識であってよい。

配列　ＣＴＣＴＧＧ　ＴＧＡ　ＧＧＧ　ＡＧＣＴＣＡ　ＡＡＣＴＧＣＴＣＡ　Ｇ ＧＣＴＧＣＡＣＣＧＯＴ　ＴＣＡＡＧＡ　ＧＧＧ　Ｔのオリゴヌクレオチドを含 むプローブを用いて、プライマー間配列の増幅を行っておいて多数のＢ、ｂｕｒ ｇｄ。

ｒｆｅｒｉ株のスクリーニングを行った。このプローブはいくつかの増幅された 核酸を検出したが、他のものは検出しなかった。従って、本発明のさらに別の一 面は、これらのプライマー間領域の配列を、Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの亜群 を検出するための標的として利用することである。Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ フラジェリン遺伝子の開放型読み枠の、５１７番ヌクレオチドから７４２番ヌク レオチドに至る高可変領域の一変異配列は、５３１５４９．５５２．６１２．６ １３．６８４．６９３位でのグアノシン、５３９．５９１．６０３．６２２．６ ３９．６５１．６６６位でのアデノシン、５４０．５７３．６３０．６９６位で のチミジンおよび７３５位でのシトシンによる塩基置換を含む。Ｂ、ｂｕｒｇｄ ｏｒｆｅｒｉフラジェリン遺伝子の開放型読み枠の、５１７番ヌクレオチドから ７２４番ヌクレオチドに至る高可変領域の他の一変異配列は、５３１．５９５． ６１２．６４９および６６３位でのグアノシン、５３９．５５２．６５１．６６ ６．６７０および６８８位でのアデノシン、５４０．５７１．５９４．６３０お よび６９６位でのチミジンならびに６４４および７２６位でのシトシンによる塩 基置換を含む。最後に、標的配列の一部に対して相補性のプローブの１セツトは 、ＣＴＣＴＧＧ　ＴＧＴ　ＧＧＧ　ＡＧＣＴＣＡ　ＡＡＣＴＧＣＴＣＡ　ＧＧＣ ＴＧＣＡＣＣＧＣ；Ｔ　ＴＣＡ　ＡＧＡ　ＧＧＣ；　Ｔ、ＣＴＣＴＧＧ　ＴＧＡ 　ＡＧＧ　ＡＧＣＴＣＡ　ＧＧＣＴＧＣＴＣＡ　ＧＡＣＴＧＣＡＣＣＴＧＴＴＣ Ａ　ＡＧＡ　ＡＧＯおよびＴＧＣＴＯＯＧＧＧ　ＡＧＣＴＣＡ　ＡＧＣＴＣ；Ｃ ＴＣＡ　Ｃ，ＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＴ　ＴＣＡ　ＡＧＡ　ＧＧＧ　ＴＧＣからな る群から選ばれた選ばれた配列をもつオリゴヌクレオチドプローブと該プローブ に結合されたシグナル手段とからなるＢ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ亜群検出用オ リゴヌクレオチドトレーサーを包含する。

好ましい実施様の詳細な説明 Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの増幅された標的配列に対するプローブ依存アッセ イ法を開発しようとする従来の試みでは、０ｓｐＡおよびＰｓｐＢ遺伝子から発 現される主要表面抗原蛋白が選択された。全ての真正なり、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅ ｒｉ株がこれらの抗原をコードしているわけではないことが判明しているので、 異なる配列を選択しなければならないことは明らかである。

スピロヘータでは、内鞭毛は、単一のサブユニットからなるアッセイブリーによ り構成されている。Ｗ　ｉ　ｌ　ｓ　ｋ　ｅら、Ｚｂｌ、Ｂａｋｔ、Ｈｙｇ、Ａ ２６３　：９２　（１９８６）は、Ｂ、ｂｕｒｇｄ。

ｒｆｅｒｉのフラジェリン蛋白質に対して単離されたモノクローナル抗体がＢ、 ｈｅｒｍｓｉｉ、、Ｂ、ｄｕｔｔｏｎｉ、Ｂ、ｔｕｒｉｃａｔａｅおよびＢ、ｐ ａｒｋｅｒｉとも反応することを報告した。その単一サブユニット構造、抗原相 同性の証拠および同一分子内での構造上および生理学上の制約のため、フラジェ リン遺伝子は高度に保存されえて、それゆえ、プローブ依拠アッセイにおける標 的として、種の各メンノ≧゛−を同定しそうに思われる。しかし、同じ抗血清に 対する数種の種の交差反応は、これらの遺伝子が同じ属内の諸種の間で高度に保 存されうろことも示唆している。

事実、Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉに最も密接に関連する種であるＢ、ｈｅｒｍ ｓｉｉについてのフラジェリン遺伝子の単離および配列決定は、Ｂ、ｂｕｒｇｄ ｏｒｆｅｒｉと相同性の大きい領域を明らかにした。しかし、思いがけないこと に、フラジェリン遺伝子の開放型読み枠内に、相対的に非相同の配列を含むおよ そ４８０塩基対の領域もあった。本発明では、相対的に非相同のこれら配列が、 Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの増幅、検出においては特異的であるが、他の密接 に関連した種は識別するところのプライマーおよびプローブを構築するための基 礎を与えてくれる。

第１図は、Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉおよびＢ、ｈｅｒｍｓｉｉからのフラジ ェリン遺伝子のヌクレオチド配列の相同性の比較を示す。ヌクレオチドの整列に は、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、。

１２　：１２６　（１９８Ｂ）に引用されている通り、ＵＷＧＣＧＴ分析プログ ラムＢＥＳＴＦ　ＩＴの助けを借りた。１３．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの配列を Ｂ、ｈｅｒｍｓｉｉの配列の上方に位置させである。この比較から、非相同性の 領域がおよそ３９０位および７１２位のヌクレオチドによってはさまれているこ とがわかる。約４７５位のヌクレオチドから約７７０位のヌクレオチドまでの領 域が、それがＢ、ｈｅｒｍｓｉｉの配列における少なくとも２つの小さい欠失を 含んでいるため、プライマーおよびプローブの構築に好ましいプライマー配列の 選択に当たっては、好ましくは約８〜３２ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを 利用するのが望ましい。８個未満のヌクレオチドを使用すると、特異性が低下し 、結合親和性が減少する。約３２個より多いヌクレオチドを使用しても、プライ マー機能や特異性が増すことにはならず、顕著なミスマツチ領域での結合の確率 が増すかもしれない。しかし、６または７個のあるいは３２個より多くのヌクレ オチドからなるプライマーを使用できる配列が非相同領域内にあるであろうし、 それらは、好ましい配列長の均等物であると考えるべきである。

プライマー選択における戦略は、Ｂ、ｈｅｒｍｓｉｉの対応する配列に対して最 大限非相同の、Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ本来の短い配列を同定することであ る。増幅反応では、プライマーはＢ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの鋳型とのみアニ ールし、Ｂ、ｈｅｒｍｓｉｉのＤＮＡとはアニールしないので、シグナル発生プ ローブとハイブリダイズされうる諸配列の特異的増幅は起こらない。さらに、プ ライマーは、向かい合った鏡上で標的領域の隣にくるよう選択する。この標的領 域は、それがハイブリダイズするプローブと少なくとも同じ長さであるべきで、 好ましくは約５０ヌクレオチドの長さであるべきである。かくして、鞭毛遺伝子 の開放型読み枠の３９０〜７１２番ヌクレオチドからの実質的に連続した約８〜 ３２塩基を含む配列からなる群から選ばれた第一のオリゴヌクレオチドと、第一 のプライマーの５゛末端から約５０ヌクレオチドの間隔を置いて相補鎖上にある 配列であって、Ｂ、ｈｅｒｍｓｉｉの対応する配列の７０％以上の相同性しかも たない実質的に連続した８〜３２塩基を含む配列からなる群より選ばれた第二の オリゴヌクレオチドとからなるプライマ一対を選択する。

選んだプライマーは、相補鎖上での鎖伸長のために変性核酸鋳型上の開始点とし て利用する。核酸の増幅は、米国特許第４，６８３．１９５号および同第４，６ ８３，２０２号（Ｍｕｆｔｉｓ）中に記載されている通りの複製連鎖反応（ＰＣ Ｒ）を用いて行うのが便利である。この方法では、標的ＤＮＡが変性され、プラ イマーが、それぞれの向かい合った鎖の上の増幅されるべき標的領域に隣る相補 配列とハイブリダイズされる。ヌクレオチド三リン酸類と共にＤＮＡポリメラー ゼを加えると、プライマーから新しいＤＮＡが合成される。反応が完了すると、 ＤＮＡを再び変性し、さらにポリメラーゼを加えると、次のラウンドのＤＮＡ合 成が起こる。これを何回も繰り返すことにより、５〜５ｆｆｏｇオーダーの高度 の増幅を達成できる。ハイブリダイゼーションおよび重合はできるだけ厳格な条 件組合せのものとで、すなわち、プライマーの結合に、正確な配列への一層高い 忠実度がめられる高昇温度下で、行うことが望ましい。好ましい温度は６５゛Ｃ で、これには、米国特許第４，８８９゜８１９号（Ｇｅｌｆａｎｄら）に記載の ものなどの耐熱性ポリメラーゼの使用が必要である。

当業者に既知の他の核酸増幅プロトコールをＰＣＲに替えてもよい。３ＳＲと呼 ばれるかかる一方法は、逆転写酵素を利用してＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドをつ くり出し、これより、Ｔ７または他の適当な転写プロモーターを含有する二重Ｄ ＮＡ構造を製出する。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを系に加え、標的配列に 特異的な転写物を多数合成させる。これらの増幅された転写物をつぎに適当なシ グナル発生性オリゴヌクレオチドでプローブ探査し、特定の標的を検出する。３ ＳＲあるいはＴＡＳと呼ばれる関連した増幅法のためのプライマーを構築するに 当っては、プロモーター配列がプライマーの５”末端に結合されなければならな い。配列ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡをもつＴ７プロモーター が好ましいプローブ配列は、非相同性開放型読み枠領域内の任意のプライマー間 配列から選択すればよい。最良のプローブは、ミスマツチ極大の配列を組入れて いるものである。この領域では、約５８５番の塩基から約６５０番の塩基までの 配列が、欠失を含む領域にかかっていて、全体としておよそ５０％のミスマツチ 率をもつので、とくに有効である。この好ましい実施ＵＳで、１つまたは２つの プライマーよりもむしろプローブをこの領域から選択するのは、高度ミスマツチ のプローブは増幅が低レベルの標的とは有意にハイブリダイズせず、その結果実 質的に定量的アッセイが行えるという観察に基いている。

プローブの長さは、数ないし数百塩基対という、可能性として広い範囲にわたっ て変えうる。しかし、プローブの特異性とその安定性との間でバランスをとらな ければならない。相対的に短いプローブ、と（に高度非相同性領域から選ばれた ものは、相対的に長いものよりは特異性がより高いが、ハイブリダイゼーション の厳格さが良好となる温度で不安定な蛍光がある。長いプローブは、より多数の ミスマツチを許容しうるために、一般に特異性が低い。好ましいプローブは、相 対的非相同の開城から選ばれたもので、ＧＣ含量が比較的高く、約３５〜５５ヌ クレオチド長である。

フラジェリン遺伝子の開放型読み枠の、ミスマツチおよび非相同性が最高度の、 ５９４〜６４２位ヌクレオチドに囲まれた領域から選ばれたオリゴヌクレオチド 、すなわちＣＴＣＴＧＧ　ＴＧＡＧＧＧ　ＡＧＣＴＣＡ　ＡＡＣＴＧＣＴＣＡ　 ＧＧＣＴＧＣＡＣＣＧＯＴ　ＴＣＡ　ＡＧＡ　ＧＧＧ　Ｔを用いて、３２ｐ結合 プローブを構築した。多数のＢ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉと推定される菌株を、 上記プライマーがアニールするフラジェリン遺伝子内部位間にわたる標的領域（ プライマー間増幅領域）をまず増幅させることにより、スクリーニングした。

増幅された核酸類をつぎに、サザンブロフトアッセイで上記プローブを用いて探 査した。驚くべきことに、真正なり、ｂｕｒｇｄ。

ｒｆｅｒｉ株のなかに、プローブとのハイブリダイゼーションを示すものと、示 さないものとがあった。増幅された配列の配列分析を行った。それらの配列を第 ６図に示す。

これらの配列は、いくつかの位置のミスマツチ塩基を含んでいる。最少５個のミ スマツチ塩基を含む１領域を選ぶことにより、プライマー間領域をまず増幅し、 つぎに増幅されたプローブを特定配列のプローブで探査するところのアッセイ法 においてＢ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの３つの亜群を区別できる３種のプローブ を得た。３種のプローブの配列は次の通りであるニブローブ１：ＣＴＣＴＧＧ　 ＴＧＡ　ＧＣＧ　ＡＧＣＴＣＡ　ＡＡＣＴＧＣＴＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＣＧＧＴ 　ＴＣＡ　ＡＧＡ　ＧＧＧ　Ｔ。

プローブ２：ｃＴｃ　ＴＧＧ　ＴＧＡ　ＡＧＧ　ＡＧＣＴＣＡＧＧＣＴＧＣＴＣ Ａ　ＧＡＣＴＧＣＡＣＣＴＧＴ　ＴＣＡ　ＡＧＡ　ＡＧＧ、プローブ３：ＴＧＣ ’ｒｃｃ　ＴＧＡ　ＧＧＧ　ＡＧＣＴＣＡ　ＡＧＣＴＧＣＴＣＡ　ＧＧＣＴＧＣ ＡＣＣＴＣ；Ｔ　ＴＣＡ　ＡＧＡ　ＧＧＧ　ｒＧＣ。

第１表は、上記の対応するプローブの各々によって特異的に検出されるＢ、ｂｕ ｒｇｄｏｒｆｅｒｉ株の個々の亜群を示す。第２表は、３亜群プローブの配列を 示す。

（以下余白） ＩＲ５［＾ＴＣＣ３５２１１］スイス＋＋−−Ｖｉｒｕｌｅｎｔ　？ＩＭ１　ミ ネソタ　＋　十−−ＶｉｒｕｌｅｎｔＭＭＴ１　ｓ　＋　＋　−−Ｖｉｒｕｌｅ ｎｔｌ、ｐａｃｉｆｉｃｕｓｋリフｔｌｋ二ｙ＋＋−−Ｎ４０ニューヨ→＋＋− 一 ５ｏｎ３２８かｊ７ｔｌニア＋＋−− ＤＮ１２７　〃＋　＋　−− ＭｉｎｎｅｓｏｔａＭｏｕｓｅミネソタ＋＋−−しａｋａ３３９力ｎｔルニ７＋ ＋−− Ｆｒａｎｃｅ２０００１フランス＋＋−一２５０１５ニ１−ヨ→＋＋−− Ｂ、ｈｅｎｕｉｉ　Ｈ５１［ＡＴＣＣ３５２０９１Ｆｒｏｇｎｅｒ ＹＯＲ−１カリ７オルニｙ−−−− ＭＡＮ−１’　−−−− Ｂ、ｃｒｏｃｉｄｕｒａｅ　−−−− 第２表 Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの３群を特異的に検出するためのプ ローブオリゴヌクレオチドプローブ１．Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ　Ｂ５１Ｃ ＴＣＴＧＧＴＧＡＧ　ＧＧＡＧＣＴＣＡＡＡ　ＣＴＧＣ：ｒＣＡＧＧＣＴＧＣＡ ＣＣＧＧＴ　ＣＡＡＧＡＧＧＧＴプローブ２．Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ　Ｐ ／Ｓｔｏ群ＴＧＣＴＧＧＴＧＡＧ　ＧＧＡＧＣＴＣＡＡＧ　ＣＴＧＣＴＣＡＧＧ ＣＴＧＣＡＣＣＴＧＴＴ　ＣＡＡＧＡＧＧＧＴＧ　ＣＴプローブ３．Ｂ、ｂｕｒ ｇｄｏｒｆｅｒｉ　Ｐ／Ｂｉ群ＣＴＣＴＧＧＴＧＡＡ　ＧＧＡＧＣＴＣＡＧＧ　 ＣＴＧＣＴＣＡＧＡＣＴＧＣＡＣＣＴＧＴＴ　ＣＡＡＧＡＡＧＧ出願人（発明者 ）らは、上記特定の諸配列が、フラジェリン遺（ｉ子の実質的に対応する各領域 についてミスマツチ塩基の度合が極メとなって、得られるアッセイが厳格なもの となるため、とくに好ましいことを見出している。しかし、アッセイの特異性を 悪影響を与えないような僅かな、重要でない塩基置換を行ってもよいことは明ら かであろう。かかる微細な配列変更は、本明細書で開示した配Ｊ１１と均等であ ると、出願人らは考える。

これらプローブを、分子として、シグナル発生手段と組合せると、それらが結合 する標的配列にタグ（標ｍ）を付けることのできる、すなわち直接的にあるいは 間接的にシグナルを発しうるオリゴヌクレオチドトレーサーとなる。かかるトレ ーサーは、放射性分子あるいは酵素に結合されたプローブであってもよく、それ が便利でおる。トレーサーが標的にハイブリダイズすると、その二Ｍ鎖デュープ レンクスは、慣用の分離手法によってハイブリダイズしていないトレーサーから 分離でき、結合放射能の量はシンチレーシゴンカウンターまたはガンマ−カウン ターで測定できる。ハイブリダイズした酵素結合トレーサーの分離にも、同様の 慣用の分離手法を用いうる。酵素結合デユープレックスが分離されると、比色用 または蛍光測定用の基質を加え、慣用の機器によってシグナルを検出する。当業 者に既知の他のシグナル発生系としては、ＭｃＣａｐｒａら、Ｃｈｅｍｉｌｕｍ ｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、Ｐｌｅｎｕｍ 　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ、Ｙ、（１９７３）に記載されているごとき、アクリジニウム エステル類またはジオキセタン類を用いる化学発光法、蛍光アッセイなどの蛍光 標識（タグ）あるいはビオチン結合プローブが挙げられる。

とくに興味があるのは、フルオレセイン標識プローブがその標的にハイブリダイ ズしたときの偏光の増加を測定する蛍光偏光法（ＦＰ）の応用である。この検出 系の重要性は、未結合のトレーサーをまず分離することなく、トレーサーが標的 にアニールすると直ちに検出を行えることである。この検出法は、後記の実施例 ２により詳細に記載されている。

本発明のプライマーおよびプローブを使用して、生体由来試料中のＢ、ｂｕｒｇ ｄｏｒｆｅｒｉの診断検出法を都合よく構成する。

かかるハイオアンセイ法では、適切な配列の精製、クローニングされた遺伝子断 片を採用してもよいが、最良のプライマーおよびプライマー源は慣用のオリゴヌ クレオチド合成法によるものである。関心の持たれる生体由来試料としては、ラ イム病症候群に関係あるとされた皮膚バンチバイオプシー検体、血液および血液 画分、脳背髄液、身体組織画分がある。バンチバイオプシー試料のための諸手法 はＢｅｒｇｅｒら、Ｊ、Ａｍ、Ａｃａｄ、Ｄｅｒｍａｔｏｌ、、１３　：　４４ ４　（１９８６）に記載されている。血液からのスピロヘータの分離は、Ｂｅｎ ａｃｈら、Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、、３０８ニア４０　（１９８３）に記載さ れている。脳背髄液からのスピロヘータの分離は、Ｋａｒｌｓｏｎら、Ｊ、Ｃｌ １ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｆ、、２８：４７３　（１９９０）に記載されている。

他の組織からの分離も文献に記載されている。

トレーサーハイブリダイゼーションに先立つ増幅段階を実施するためには、核酸 を抽出して、それらを利用できるようにすることが必要である。生体由来試料か ら核酸を得るための抽出法は当該技術分野で周知であり、本発明のバイオアッセ イの実施に当っては常法と考えられる。たとえば、Ｋｅｌｌｅｒ　＆　Ｍａｎａ ｋ、ＤＮＡＰｒｏｂｅＳ、第２章”Ｓａｍｐｌｅ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ”が 、オリジナル文献の引用を含めて、多くの標準的方法を極めて詳細に提示してい る。さらに変性によって核酸を標準することも通常のもので、ｐＨまたは塩濃度 の操作あるいは加熱によって行いうる。

鋳型配列とハイブリダイズすると、ポリメラーゼ媒介鎖伸張の基質として働くと ころのプライマーは、変性の前または後に反応混合物に加えてよく、再生条件ヘ シフトさせるとき、アニールされる。

つぎにポリメラーゼを加え、順次鎖伸張サイクルを起こさせる。ＰＣＲでは、Ｄ ＮＡｔａｑポリメラーゼが好ましい、３ＳＲでは、逆転写酵素がまずＲＮＡ／Ｄ ＮＡハイプリントを作り出し、これが、ＲＮＡ５ｅＨ消化およびＤＮＡｔａｑポ リメラーゼによる再重合を行うとき、ＤＮＡ依存生ＲＮＡポリメラーゼにより反 復的に転写される。増幅されプローブ探査された核酸の検出法は既に記載した。

ハイブリダイズされた放射活性トレーサーを検出するとくに有力な方法は、核酸 増幅の生成物をアガロース電気泳動に付し、Ｐａ１ｌ　Ｂｉｏｄｙｎｅ　Ｂなど のナイロン膜の核酸バンドを移行させ、続いてシグナル発生プローブとハイブリ ダイズさせるもので、標準的サザンプロットアンセイにおけるものである（Ｓｏ ｕｔｈｅｒｎ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、９８：５０３　（１９７５））、特異 的ハイブリダイゼーションの領域をつぎに、プロローブ探査された核酸のオート ラジオグラフィーによって可視化する。

かくして、本発明のバイオアッセイでは、Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ核酸と疑 われる配列を含有する生体由来試料から核酸を抽出し、鞭毛の開放型読み枠をコ ードする核酸の生保存領域のフランキング（隣りの）配列に対して相補鎖特異体 をもつプライマ一対の存在下に変性して、プライマーを相補鎖配列にハイブリダ イズさせ、核酸増幅技法によって該生保存領域を増幅し、増幅された生保存領域 を、Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの鞭毛遺伝子の開放型読み枠の一配列と実質的 に相同であるが、Ｂ、ｈｅｒｍｓｉｉの対応する配列とは最大７０％しか相同で はない配列を有するオリゴヌクレオチドトレーサーとハイブリダイズさせ、該ト レーサーのシグナル発生手段を発するシグナルを検出する。

本発明のその他の利点は、以下の実施例から明らかになるであろ実施例Ｉ Ｂ、ｈｅｒｍｓｉｉおよびＢ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｌは、アメリカンタイプカ ルチャーコレクションから、それぞれ受入れ番号ＡＴＣＣ３５２０９およびＡＴ ＣＣ３５２１０のものを入手した。細菌を増殖させ、回収し、常法によってＤＮ Ａを抽出した。染色体ＤＮＡを制限酵素５ａｕ３Ａを用いて部分消化し、断片を アガロースゲル電気泳動により特性決定した。９〜２３ｂＰの適当な大きさの断 片の付着端を、ｄＧＴＰおよびｄＡＴＰの存在下に部分的に埋め（フィルインし ）だ。この材料をつぎにそのまま、制限酵素Ｘｈ。

Ｉで消化しかつｄＴＴＰおよびｄＣＴＰで部分的にフィルインしたラムダＧＥＭ ＩＩヘクターに、クローン化した。

つぎに、ラムダライブラリーを、Ｅ、ｃｏｌｊ　ＬＥ３９２を宿り、ハイブリダ イゼーションによってスクリーニングした。Ｇａｓｓｍａｎら、Ｎｕｃ、Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅｓ、、１７：３５９０（１９８９）が報告している通りのＢ、ｂｕｒ ｇｄｏｒｆｅｒｉの既知１　の配列からランダムに調製した合成プライマーを用 いて、Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉおよびＢ、ｈｅｒｍｓｉｉから導いた鋳型を 増幅させた。−例では、Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉがらの３００ｂｐ断片を生 じさせるのに用いたープライマ一対が、予期しないことに、Ｂ、ｈｒｅｍｓ　ｉ 　ｉの増幅に用いたときには、３００ｂｐのがすかなバンドを生じた。このかす かなバンドは、フラジェリン遺伝子内の、その他の点ではＢ、ｂｕｒｇｄｏｒｆ ｅｒｉとは比較的非相同の領域がわずかに増幅されたことを証明した。この断片 をプローブとして用いると、遺伝子のこの部分を含むラムダクローンを同定する ことができた。これらのクローンから制限地図を作成し、構築物の配列を決定し て、第１図に示す非相同配列の正しい配列が得られた。

代表的な一実験で、第１図に示したプライマーを用いて、３ｏサイクルのＰＣＨ によってプライマー間領域の増幅を行った。つぎに増幅生成物を次の通り分析し た：アガロースゲルで電気泳動し、続いてサザンプロット分析を行った。第２図 において、左のパネルは、アガロースゲル電気泳動のパターンを示す。中央下方 に一緒に見られる２つのハンドは、０ｓｐＡ遺伝子の増幅を利用する増幅試験で は陰性であった１菌株を含むＢ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの独立した２株の増幅 生成物に対応している。各々の場合に、分子の大きさが、標的とした正しい領域 の増幅に対して予期される大きさに相当していることが明らかである。対照は全 て陰性である。対照にっいてゲルの他のセグメントで見られる小さいハンドが非 特異性増幅を表わしていることを確認するために、第２図の右のパネルに示した ように、ゲルをサザンプロット分析に付した。移行させた核酸を、第１図に示し た配列を含むトレーサーによって探査した。結果はのハイブリダイゼーションに よる均質アッセイにおいて蛍光偏光法により分析した。プローブ混合物は、Ｓ　 Ｓ　Ｐ　Ｅ１ｉｌｉ衝液（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ ｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ第２版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８９）　〕１．４ａｆ、３ ゜２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　１ｇｌ、プローブ結合物２５０ｆｍｏｌおよびボル ムアミド２００ｕｆを含有していた。別の試験管で、ＰＣＲにより増幅された材 料の試料のＯ，ＬＭ　ＮａＯＨ中、５５℃で１５分間変性した。つぎに試料をプ ローブ混合物に加え、蛍光偏３５２１１と呼ぶ）について特異偏光が定性的に検 出されることをソトにおいて、増幅された標的配列を特異的に同定できることが 明らかである。

実施例２ 第１表に列挙した一連のＢ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ株からＤＮＡを抽出した。

複製連鎖反応（ＰＣＲ）を、実施例１に述べたプライマーを用いて、上記の通り に行った。第１表に示したＢ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの亜群ＩをＢ３１と名付 ける。亜群２をＰ／Ｂｉ、亜群３をＰ／Ｓｔｏと呼ぶ。上記の配列をもつプロー ブ１〜３は、それぞれ亜群Ｂ３１、Ｐ／ＳｔａおよびＰ／Ｂｉに特異的である、 ハイブリダイゼーション生成物をゲル電気泳動により分析した。

第５図Ａ図は、各々の増幅され電気泳動された試料に対応するパン’Ｃ（Ｐ／Ｓ ｔｏ群プローブ）、６５．８°Ｃ（Ｐ／Ｂｉ群プローブ）であった。サザンブロ ソト法のそれ以上の詳細は、Ｐｉｃｋｅｎ。

ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｎｅ、９：４１２　（１９９０）に述べられている。第５ ８．ＣおよびＤ図に示した結果は、各プローブが、第１表に示したＢ、ｂｕｒｇ ｄｏｒｆｅｒｉの対応する亜群に対して完全な特異性をもつことを示している。

実施例３ さらに一連の実験において、Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉについて記載したもの に相当する位置でＢ、ｈｅｒｍｓｉｉの一配列に隣る相補鎖特異性プライマ一対 を用いて、１群のＢｏｒｒｅｌｉａからＤＮＡを増幅させた。第一のオリゴヌク レオチドプライマーは、フラジェリン遺伝子の開放型読み枠の３９０〜７７０番 ヌクレオチドからの実質的に連続した約８〜３２塩基を含む配列よりなる群から 選んだ。第二のオリゴヌクレオチドプライマーは、第一のプライマーの５′末端 から約３５〜５５ヌクレオチドの間隔を置いて相補鎖上にあり、Ｂ、ｂｕｒｇｄ ｏｒｆｅｒｉの対応する配列とは７０％以下の相同性しかもたない約８〜３２ヌ クレオチドを含む配列よりなる群から選んだ。

これらの実験に用いたプライマーを第９図に示す。

これらのプライマーは、Ｂ、ｐａｒｋｅｒｉおよびＢ、ｔｕｒｉｃａｔａｅに加 えて、試験した全てのＢ、ｈｅｒｍｓｉｉ株を増幅させた。Ｂ、ｐａｒｋｅｒｉ およびＢ、ｔｕｒｉｃａｔａｅの増幅されたＤＮＡの配列を血清したところ、こ れらの微生物については、Ｂ、ｈｅｒｍｓ　ｉ　ｉと比較して、プライマー間配 列に差が認められた。これらの差を第７図に示す。第７図で太字で示した配列を 選んでプローブを構築した。ゲル電気泳動後、増幅されたハンドを膜ムこ移し、 このプローブを用いてサザンブロソティングを行った。全ての操作は前記両実施 例に示した通りであったが、Ｂ、ｈｅｒｍｓｉｉプローブの場合の洗浄温度は５ ７．７°Ｃ，Ｂ、ｐａｒｋｅｒ　ｉ／　ｒ　ｕ　ｒ　ｉ　ｃ　ａ　ｔ　ａ　ｅプ ローブ（第７図に、Ｂ、ｈｅｒｍｓ　ｉ　ｉ　（Ｈ５Ｉ）の太字で示されており 、これらの株（ｐａｒｋおよびｔｒｉ）がＨ３Ｉと異なるヌクレオチドの位置で は太字で置換しであるこのプローブの配列は、本質的に、６０６〜６３３番ヌク レオチドからのコア配列を含んでいるが、ハイブリッド形成を安定化するために 、あるいは洗浄操作の厳格さを調整するために、各末端に塩基を府下してもよい 。かくして、好ましいプローブは、ｚｚｐなとのシグナル発生手段に結合された 配列ＴＧＣＡＧＧ　ＴＧＡ　ＡＧＧ　ＣＧＣＴＣＡ　ＧＧＣＴＧＣＴ　ＣＣＡ　 ＧＴＧ　ＣＡＡ　ＧＡＧ　ＡＴＡのオリゴヌクレオチドを包含する。

第７図で太字で示したＢ、ｈｅｒｍｓｉｉのヌクレオチド配列を用いるとき、Ｂ 、ｈｅｒｍｓｉｉの鑑別同定が可能であった。第８図に示したサザンブロソト分 析は、このプローブの高い特異性を確証している。このことは、回帰熱を惹起す るＢ、ｈｅｒｍｓｉｉをライム病の原因因子から、また動物疾患を惹起するＢｏ ｒｒｅｌｉａ菌から、区別できるという点で、臨床上重要である。

第５図の説明の索引 Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉｌ、＊　Ｂ３１　ＣＡＴＣＣ＃３５ ２１０）２、　ＩＲ３［ＡＴＣＣ＃３５２１１）３、毒性　ＭＭＩ ４、　毒性　ＭＭＴ　１ ５、毒性　１．ｐａｃｉｆｉｃｕｓ ｌｏ、　Ｌａｋｅ　３３９ ジエリン遺伝子配列から誘導したオリゴヌクレオチドプローブで探査後の、第８ Ａ図に示したゲルのサザンブロソト。

第８図の説明の索引 ｌ、＊　Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ　Ｂ５１２、　Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒ ｉ　Ｐ／Ｓｔ。

３、　Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ　Ｐ／Ｂｉ４、　Ｂ、ｈｅｒｍｓｉｉ　Ｈ３ Ｉ ５、　Ｂ、ｈｅｒｍｓｉｉ　Ｆｒｏｇｎｅｒ６、　Ｂ、ｈｅｒｍｓｉｉ　ＹＯＲ −１７、Ｂ、ｈｅｒｍｓｉｉ　Ｃ０Ｎ−１ ８、Ｂ、ｈｅｒｍｓｉｉ　ＭＡＮ−１ ９、Ｂ、ｐａｒｋｅｒｉ １０、　Ｂ、ｔｕｒｉｃａｔａｅ ｌｌ、Ｂ、ｃｒｏｃｉｄｕｒａｅ １２、　Ｂ、ａｎｓｅｒｉｎａ １３、　Ｂ、ｃｏｒｉａｃｅａｅ １４、　Ｂ、ｐａｌｌｉｄｕｍ １５、　Ｔ、ｐｈａｇｅｄｅｎｉｓ １６、Ｔ、ｄｅｎｔｉｃｏｌａ １７、　Ｌ、ｉｎｔｅｒｏｇａｎｓ　ＳＶ。

ｉｃｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ１８、　Ｌ、１ｎａｄｅｊ　ＳＶ、ｌｙ ｍｅ１９、　蒸留水対照 ２０、１２３塩基対分子量マーカー ＊　ゲルレーン番号 アガロースゲル　サザンブロソト ＦＩＧ、２ 蛍光偏光（ｍＰ） ＦＩＧ、５Ａ　ＦＩＧ、５８ ＦＩＧ、５０　ＦＩＧ、５Ｄ 要　約　書 Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉフラジェリンの生保存性区域をエンコードする遺伝 子の部分に対する相補配列の核酸プライマーがＬｕｍｅ　ｂｏｒｒｅｌｉｏｓの 感染部位から抽出された核酸の目［１列を増幅するために使用され、次にＢ、ｂ ｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの高度に特異性検出のためシグナル発生分子へ複合した核 酸トレージーでプローブされる。

国際調査報告 １ｉ＋＃Ｌ＃Ｉ１ｗａｌＡｍ−−Ｎｓ　ＯＣＴ／ＩＩｃｏＩ／１１１０ｎ国際調 査報告

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．核酸増幅技法により増幅されるべきＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの一配列に 隣接するところの相補鎖特異性プライマー対であって、 フラジェリン遺伝子の開放型読み粋の３９０番〜７７０番ヌクレオチドからの約 ８〜３２個の実質的に連続した塩基を含む諸配列よりなる群から選ばれた第一の オリゴヌクレオチドおよび該第一のプライマーの５′末端から約３５〜５５ヌク レオチドの間隔を置いて相補鎖上にあり、Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉの対応する配列と の相同性が７０％以下である約８〜３２個の実質的に連続した塩基を含む諸配列 よりなる群からなる第二のオリゴヌクレオチド からなる該プライマー対。
2. ２．Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉのフラジェリン遺伝子の開放型読み枠の配列に 対して実施的に相同であるが、Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉの対応する配列に対しては相 同性が７０％以下であるオリゴヌクレオチドプローブ配列および 該プローブに結合したシグナル手段 よりなるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉターゲット配列検出用オリゴヌクレオチド トレーサー。
3. ３．生体由来試料中のＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉを検出するためのバイオアッ セイ法であって、 核酸画分を抽出し、 フラジェリンの開放型読み枠をコードする核酸の半保存領域のブランキング配列 に対して相補鎖特異性のプライマー対の存在下に核酸類を変性し、 該プライマー対を該相補鎖配列にハイプリダイズさせ、核酸増幅技法によってプ ライマー間配列を増幅させ、増幅されたプライマー間配列を、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏ ｒｆｅｒｉのフラジェリンの開放型読み枠の対応配列に実質的に相同であるが、 Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉの対応配列に対しては約７０％以下の相同性しかもたない配 列をもつプローブとこれに結合されたシグナル発生手段とからなるオリゴヌクレ オチドトレーサーとハイプリダイズさせ、 該ハイプリダイズされたトレーサーに結合されている該シグナル発生手段が発す るシグナルを検出することを特徴とする前記バイオアッセイ法。
4. ４．Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの核酸配列を検出するための実質的な均質アッ セイ法であって、 鞭毛開放型読み枠をコードする核酸の半保存領域のフランキング配列に対して相 補鎖特異性のプライマー対の存在下に核酸配列を変性し、 該プライマーを該相補鎖配列にハイブリダイズさせ、核酸増幅技法によってプラ イマー間配列を増幅し、増幅されたプライマー間配列を、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆ ｅｒｉのフラジェリンの開放型読み枠の対応配列に実質的に相同であるが、Ｂ． ｈｅｒｍｓｉｉの相当する配列とは約７０％以下の相同性しかもたない配列を有 するプローブとこれに結合された蛍光標識とからなるオリゴヌクレオチドトレー サーとハイブリダイズさせ、 蛍光偏光の増加を測定すること を特徴とする前記アッセイ法。
5. ５．５１７番のヌクレオチドから７４２番のヌクレオチドにわたるＢ．ｂｕｒｇ ｄｏｒｆｅｒｉフラジェリン遺伝子の開放型読み枠の高度可変領域の変異配列で あって、５３１、５４９、５５２、６１２、６１３、６８４、６９３位のグアノ シン、５３９、５９１、６０３、６２２、６３９、６５１、６６６位のアデノシ ン、５４０、５７３、６３０、６９６位のチミジンおよび７３５位のシトシンに よる塩基置換を特徴とする前記変異配列。
6. ６．５１７番のヌクレオチドから７２４番のヌクレオチドにわたるＢ．ｂｕｒｇ ｄｏｒｆｅｒｉフラジェリン遺伝子の開放型読み枠の高度可変領域の変異配列で あって、５３１、５９５、６１２、６４９および６６３位のグアノシン、５３９ 、５５２、６５１、６６６、６７０および６８８位のアデノシン、５４０、５７ １、５９４、６３０および６９６位のチミジンならびに６４４および７２６位の シトシンによる塩基置換を特徴とする前記変異配列。
7. ７．【配列があります】 からなる群 より選ばれた配列をもつオリゴヌクレオチドプローブと該プローブに結合された シグナル手段とからなる、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ亜群検出用オリゴヌクレ オチドトレーサー。
8. ８．核酸増幅技法によって増幅されるべきＢ．ｈｅｒｍｓｉｉの一配列に隣接す るところの相補鎖特異性プライマー対であって、フラジェリン遺伝子の開放型読 み枠の３９０番〜７７０番ヌクレオチドからの約８〜３２個の実質的に連続した 塩基を含む諸配列よりなる群から選ばれた第一のオリゴヌクレオチドおよび該第 一のプライマーの５′末端から約３５〜５５ヌクレオチドの間隔を置いて相補鎖 にあり、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの対応する配列との相同性が７０％以下で ある約８〜３２個の実質的に連続した塩基を含む諸配列よりなる群から選ばれた 第二のオリゴヌクレオチド からなる該プライマー対。
9. ９．Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉフラジェリン遺伝子の開放型読み枠の６０６番ヌクレオ チドから６３３番ヌクレオチドにわたるコア配列を有するオリゴヌクレオチドプ ローブと シグナル発生手段と からなる、Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉの特異的検出のためのオリゴヌクレオチドトレー サー。