CN101886113B

CN101886113B - 蜱体内检测莱姆病病原的检测试剂盒

Info

Publication number: CN101886113B
Application number: CN200910005012A
Authority: CN
Inventors: 殷宏; 罗建勋; 关贵全; 杨吉飞; 牛庆丽; 马米玲; 高金亮; 刘志杰; 李有全; 刘军龙; 任巧云
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2009-05-13
Filing date: 2009-05-13
Publication date: 2012-10-17
Anticipated expiration: 2029-05-13
Also published as: CN101886113A

Abstract

本发明涉及一种用于检测蜱体内莱姆病病原的LAMP检测方法。本发明的方法是：以16S rRNA基因为靶基因，用专用软件设计出用环介导的恒温扩增技术用于蜱体内检测莱姆病病原伯氏疏螺旋体的引物，再从中选出莱姆病病原特异性区段的引物，将侍检蜱刺破后提取DNA，将所得DNA与反应缓冲液、所选出的特异性区段的引物反应混合物及DNA聚合酶混匀，进行扩增，扩增产物灭活后加入上样缓冲液，再置于含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中，进行电泳检测，根据电泳后是否出现特定条带后即可得出被检蜱是否带有莱姆病病原。

Description

蜱体内检测莱姆病病原的检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种病原体检测技术，特别是用于检测蜱体内莱姆病病原的LAMP检测方法。

背景技术

莱姆病(Lyme disease)又称莱姆包柔体病或莱姆疏螺旋体病，是一种蜱传性的自然疫源性人兽共患螺旋体病，因首次在美国康涅狄格州的莱姆镇发现而得名。病原体为伯氏疏螺旋体，可分为10个基因型或组，我国已发现报道的莱姆病螺旋体有狭义伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi sensus stricto)、伽氏疏螺旋体(B.garinii)和嘎氏疏螺旋体(B.afzelii)三个基因型。目前已在全球30多个国家和地区报告有本病和自然疫源地存在，年发病人数在30万左右，仍有不断增多的趋势，在美国有“第二爱滋病”之称(Gratz N.Emerging and resurgingvector-borne disease.Ann Rev Entomol，1999，44：51)。1992年，世界卫生组织(WHO)将此病列为重点防治研究对象。我国于1986年首次在黑龙江省海林县林区发现了该病，到目前，我国29个省(区、市)均已发现有莱姆病分布，每年新发病例高达万余例，某些省份林区的发病率在1-40％。

人感染后的临床症状主要表现为慢性炎症性多系统损伤，除皮肤慢性游走性红斑、关节炎和慢性萎缩性肢皮炎外，常常会伴有心脏和神经系统的损伤，从而引起脑膜炎、路神经炎、运动及感觉神经根炎、神经丛炎、多发单神经炎小脑共济失调等等症状。严重影响人类健康。

由于本病是一类蜱传性疾病，所以探明媒介蜱的种类，为切断传播途径，控制本病的流行是十分重要的。现已发现，在北美主要的媒介蜱是肩突硬蜱、新节硬蜱和太平洋硬蜱，其中肩突硬蜱是主要的传播媒介，带菌率在12-100％；欧洲的传播媒介是篦子硬蜱和全沟硬蜱，篦子硬蜱的带菌率可达到40％；在我国，在全沟硬蜱、粒形硬蜱、锐跗硬蜱、长角血蜱、二棘血蜱、嗜群血蜱、台湾血蜱、微小牛蜱和森林革蜱等9种硬蜱体内分离到病原，其中全沟硬蜱、二棘血蜱和粒形硬蜱的带菌率最高，分别达到20-45％、16-40％和24％。研究证实在我国北方林区主要是全沟硬蜱，南方林区为二棘血蜱和粒形硬蜱传播本病。

到目前为止，在蜱体内检测本病病原的方法主要以聚合酶链式反应(PCR)和反向线状印迹(RLB)方法为主，但是PCR在检测本病原时常常表现为敏感性较低，同时需要复杂的操作系统——PCR仪；RLB虽然具有较好的敏感性，但是其操作复杂，对操作实验室的要求高。难以满足进行本病原的大规模调查的需要，参见Rauter C，Meuller M，Diterich I，et al.Critical evaluation ofurine-based PCR assay for diagnosis of Lyme borreliosis.Clin Diag Lab Immunol，2005，12：910-917；Morán-Cadenas F，Schneider H，et al.，A comparison of two DNAextraction approaches in the detection of Borrelia burgdorferi sensu lato from liveIxodes ricinus ticks by PCR and reverse line blotting.Vector Borne Zoonotic Dis.2007；7(4)：555-561)。

发明内容

本发明针对现有技术检测蜱体内莱姆病病原伯氏疏螺旋体时需要复杂的仪器和敏感性低的缺点，提供一种只需要常规的水浴锅就可以具有高敏感性的分子检测方法，这种方法的检测敏感性高于PCR方法，同时不需要复杂的操作系统，可以在普通实验室条件下实施检测，并具有操作简单、敏感性高、快速等特点。本发明同时提供这种应用检测方法的检测试剂盒。

本发明的蜱体内检测莱姆病病原检测方法是：以16S rRNA基因为靶基因，用专用软件设计出用环介导的恒温扩增技术用于蜱体内检测莱姆病病原伯氏疏螺旋体的引物，再从中选出莱姆病病原特异性区段的引物，将侍检蜱刺破后提取DNA，将所得DNA与反应缓冲液、所选出的特异性区段的引物反应混合物及DNA聚合酶混匀，进行扩增，扩增产物灭活后加入上样缓冲液，再置于含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中，进行电泳检测，根据电泳后是否出现特定条带后即可得出被检蜱是否带有莱姆病病原。

在本发明的检测方法中所用的上样缓冲液为：质量/体积比为0.25％的溴酚蓝，质量/体积比为0.25％的二甲苯青，质量/体积比为40％的蔗糖水溶液，所用的含溴化乙锭的琼脂糖凝胶为由0.04M Tris-乙酸和0.001M EDTA组成的TAE 缓冲液配制的其中含0.5ug/mL的溴化乙锭质量/体积比为2％琼脂糖。

本发明的检测方法中所用的莱姆病病原特异性引物为：

正向外部上游引物F3：5’-ttccccgtttggggtcta-3’

反向外部下游引物B3：5’-gggccatgatgatttgacgt-3’

正向内部引物FIP：5’-cgttgcgggacttaacccaacattttatacaggtgctgcatggttg-3’

反向内部引物BIP：5’-accagcatgtaatggtggggactttttcctcaccttcctccgac-3’

本发明的试剂盒内有：

a.标准伯氏疏螺旋体阳性基因组DNA；

b.标准伯氏疏螺旋体阴性蜱基因组DNA；

c.LAMP反应缓冲液；

d.DNA聚合酶；

e.特异引物混合物。

本发明实际上是一种采用环介导的恒温扩增技术的检测方法，这种方法是日本科学家Notomi T.等于2000年发明的敏感性很高的DNA扩增技术(Loop-mediated isotheral amplification method，LAMP)(Notomi，T.，Okayama，H.，Masubuchi，H.，Yonekawa，T.，Watanabe，K.，Amino，N.，Hase，T.，2000.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Research 28，E63.)。

采用本发明的方法检测蜱体内莱姆病病原伯氏疏螺旋体时不需要复杂的仪器设备，只需要常规的水浴锅就可以完成检测，可在普通的实验室进行蜱体内莱姆病病原的检测和莱姆病的流行病学调查，而且可得到具有高敏感性的检测结果。

附图说明

图1为采用本发明方法经扩增后电泳检测的结果，其中：M为DNA标准分子量DL2000，Bb为狭义伯氏疏螺旋体，Ba为阿氏疏螺旋体，Bg为嘎氏疏螺旋体，W为灭菌超纯水。图2为田间样品的检测结果，其中：M为100bp DNA标准分子量；Ba为阿氏疏螺旋体基因组DNA标准阳性；Bb为狭义伯氏疏螺旋体基因组DNA标准阳性；Bg为嘎氏疏螺旋体基因组DNA标准阳性；1-5为田间样品的检测结果；6为伯氏疏螺旋体阴性的蜱基因组DNA；7为超纯水的空白对照。

具体实施方式

以下提供本发明的具体实施方式，本发明的检测方法在1.5mL的离心管中进行，所使用的引物及试剂如下：

1)特异引物

正向外部上游引物F3：5’-ttccccgtttggggtcta-3’

反向外部下游引物B3：5’-gggccatgatgatttgacgt-3’

反向内部引物BIP：5’-accagcatgtaatggtggggactttttcctcaccttcctccgac-3’

2)特异性引物反应混合物(40pmol的FIP和BIP，5pmol的F3和B3)。

3)2×LAMP反应缓冲液(40mM Tris-HCl(pH8.8)，20mM KCl，169 16mMMgSO4，20mM(NH4)2SO4，0.2％Tween 20，1.6M betaine和2.5mM dNTP)。

4)Bst DNA聚合酶(M0275L，BioLabs)。

5)标准伯氏疏螺旋体阳性基因组DNA。

6)标准伯氏疏螺旋体阴性蜱基因组DNA。

7)6×上样缓冲液(0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青，40％蔗糖水溶液)。

8)1×TAE缓冲液(0.04M Tris-乙酸，0.001M EDTA)。

9)2％琼脂糖(用1×TAE缓冲液配制)

其具体的操作方法如下：

一、标准试样的检测

(一)阳性基因组DNA的制备过程：

伯氏疏螺旋体的体外培养：接种标准的狭义伯氏、阿氏和嘎氏疏螺旋体菌株于含有5mL SKII(Sigma)培养基的密封的6mL玻璃试管中，置33℃培养箱培养1-3周，每周用暗视野显微镜检测一次。当菌液达到较高浓度时，收集菌液，4000rpm离心20分钟，丢弃上清，沉淀用TBS(20mM Tris-HCl，150mM NaCl)悬浮，同上离心洗涤3次，-20℃保存备用。

基因组DNA的提取：应用基因组提取试剂盒(Gentra)，根据说明书进行三种疏螺旋体基因组DNA的提取。测定所制备的基因组DNA的浓度，并应用稀释液稀释成100ng/mL，-20℃保存备用。

(二)标准伯氏疏螺旋体阴性蜱基因组DNA的制备

筛选伯氏疏螺旋体阴性蜱，应用基因组提取试剂盒(Gentra)根据说明书进行基因组DNA的提取。测定所制备的基因组DNA的浓度，并应用稀释液稀释成100ng/mL，-20℃保存备用。

(三)2×LAMP反应缓冲液的准备：

首先应用灭菌的超纯水按照如下表比例配制无dNTP的2×反应缓冲液储存液，可在4℃保存3个月，-20℃长期保存。

试剂	总体积900mL	总体积90mL
			1M Tris-Cl(pH8.8)stock sol.	40mL	4mL
KCl	1.49g	0.15g
			MgSO₄(MgSO₄·7H₂O)	1.93g(3.94g)	0.19g(0.39g)
(NH4)₂SO₄	2.64g	0.26g
			Tween20	2mL	0.2mL
Betaine	187.4g	18.7g

使用前每900uL的2×反应缓冲液储存液中加入100uL 25mM dNTP，混匀，制备成2×反应缓冲液工作液，-20℃保存备用。

(三)检测过程

在1.5mL的离心管中按如下述比例加入待检样品，同时设立标准阳性、阴性基因组DNA和超纯水的空白的对照：

2×反应缓冲液工作液 12.5uL

引物反应混合物 0.9uL

灭菌的超纯水 8.6uL

DNA样品 2.0uL

Bst DNA聚合酶 1.0uL

总体积 25uL

轻轻混匀，瞬间离心。在60℃水浴锅中扩增50分钟，立刻转入80℃水浴锅中灭活2分钟。取扩增产物5uL，以TAE为缓冲液，在2％的琼脂糖凝胶(含0.5ug/mL溴化乙锭)中，在75电泳中进行检测。

在4个1.5mL的离心管中按如前述比例加入样品，DNA样品分别应用狭义伯氏、阿氏、嘎氏疏螺旋体和灭菌超纯水。轻轻混匀，瞬间离心。在水浴锅中60C扩增50分钟，立刻转入80C水浴锅中灭活2分钟。取扩增产物5uL，以TAE为缓冲液，在2％的琼脂糖凝胶(含0.5ug/mL溴化乙锭)中，在75电泳中进行检测。检测结果见图1，结果表明狭义伯氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、嘎氏疏螺旋体基因组DNA都能被特异性的扩增，而灭菌超纯水的反应管中没有扩增。

二、野外试样的检测

取野外田间捕捉的5个蜱样本，将蜱刺破后提取DNA，在10个1.5mL的离心管中按如前述比例分别加入下列样品，DNA样品分别应用阿氏、狭义伯氏、嘎氏疏螺旋体、1-5号田间样品、伯氏疏螺旋体阴性的蜱基因组DNA和灭菌超纯水。轻轻混匀，瞬间离心。在水浴锅中60℃扩增50分钟，立刻转入80℃水浴锅中灭活2分钟。取扩增产物5uL，以TAE为缓冲液，在2％(质量/体积比)的琼脂糖凝胶(含0.5ug/mL溴化乙锭)中，在75电泳中进行检测。部分检测结果见图2。结果表明野外采集的5号样品为阳性。经序列测定结果显示其为嘎氏疏螺旋体。检测的结果表明应用本方法能够从田间蜱体内检测出莱姆病病原的基因组DNA。

Claims

1.一种用于蜱体内检测莱姆病病原的检测的试剂盒，其特征是试剂盒内有：

a.标准伯氏疏螺旋体阳性基因组DNA；

b.标准伯氏疏螺旋体阴性蜱基因组DNA；

c.LAMP反应缓冲液；

d.DNA聚合酶；

e.特异引物混合物，

其中所用的莱姆病病原特异性引物为：

正向外部上游引物F3：5’-ttccccgtttggggtcta-3’

反向外部下游引物B3：5’-gggccatgatgatttgacgt-3’

反向内部引物BIP：5’-accagcatgtaatggtggggactttttcctcaccttcctccgac-3’ 。