PL237232B1 - Zestaw starterów do powielania sekwencji nukleotydowej Borrelia burgdorferi, sposób wykrywania Borrelia burgdorferi, sposób diagnostyki boreliozy i zestaw do diagnostyki boreliozy - Google Patents
Zestaw starterów do powielania sekwencji nukleotydowej Borrelia burgdorferi, sposób wykrywania Borrelia burgdorferi, sposób diagnostyki boreliozy i zestaw do diagnostyki boreliozy Download PDFInfo
- Publication number
- PL237232B1 PL237232B1 PL423217A PL42321717A PL237232B1 PL 237232 B1 PL237232 B1 PL 237232B1 PL 423217 A PL423217 A PL 423217A PL 42321717 A PL42321717 A PL 42321717A PL 237232 B1 PL237232 B1 PL 237232B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- sequence
- borrelia burgdorferi
- reverse
- nucleic
- detection
- Prior art date
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest zestaw starterów do powielania sekwencji nukleotydowej Borrelia burgdorferi, sposób wykrywania Borrelia burgdorferi, sposób diagnostyki boreliozy i zestaw do diagnostyki boreliozy. Wynalazek ma zastosowanie w diagnostyce medycznej.
Zgłoszenie dotyczy opracowania sekwencji specyficznych oligonukleotydów dedykowanych detekcji kwasu nukleinowego Borrelia burgdorferi, jego genu RecA (GenBank NC_001318.1; gene ID 1194966) z wykorzystaniem technologii LAMP (loop mediated isothermal amplification), która to metoda została przykładowo ujawniona w opisach patentowych WO0028082, WO0224902. Zgłoszenie dotyczy także opracowania metody detekcji, składu mieszaniny reakcyjnej, warunków temperaturowych oraz warunków liofilizacji reagentów. Borrelia burgdorferi należy do spiralnie zwiniętych, Gram-ujemnych bakterii. Krętki Borrelia burgdorferi stanowią jeden z gatunków należących do Borrelia sensu lato, wywołujących boreliozę (chorobę z Lyme). Kleszcze z rodzaju lxodes znane są jako wektory choroby z Lyme. Typowymi objawami boreliozy są gorączka, bóle głowy, zmęczenie i charakterystyczne zmiany skórne w postaci rumienia wędrującego. Nieleczona infekcja może rozprzestrzeniać się obejmując stawy, serce czy układ nerwowy. Diagnostyka infekcji wywołanych przez Borrelia burgdorferi opiera się na analizie objawów ogólnoustrojowych i zmian skórnych oraz możliwości kontaktu z zainfekowanym kleszczem. Z chińskich zgłoszeń patentowych CN101967513, CN102703587; CN101967513 znane jest wykorzystanie starterów w metodzie LAMP do diagnozy Borelli. Wspomniane zgłoszenia patentowe dotyczą genu 23S RNA. Gen ten występuje u każdej z bakterii, różniąc się sekwencją. Jednak ze względu na jego stosunkową wysoką konserwatywność mogącą skutkować obniżeniem specyficzności.
Nadal więc istnieje potrzeba zapewnienia takiego zestawu starterów oraz składu mieszaniny reakcyjnej wykorzystywanych w metodzie diagnostycznej do wykrywania Borrelii z wykorzystaniem metody LAMP, które będą skutkowały niskim limitem detekcji patogenu uzyskiwanym w krótkim czasie. Nieoczekiwanie problem rozwiązał prezentowany wynalazek.
Pierwszym przedmiotem wynalazku jest zestaw starterów zdolnych do powielania sekwencji nukleotydowej Borrelia burgdorferi charakteryzujący się tym, że zawiera zestaw starterów wewnętrznych zawierający następujące sekwencje nukleotydowe a) i b) oraz zestaw starterów zewnętrznych zawierający następujące sekwencje nukleotydowe c) i d):
a)5' CCTCAGCAATCGCTTGAAGAGTTA.3’(sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 5 lub sekwencja odwrotna i komplementarna) połączona, korzystnie mostkiem TTTT, z sekwencją 5' CGCATAATAGAAATTTTTGGCC3(sekwencja nukleinowa SEQ ID NO 3 lub lub sekwencja odwrotna i komplementarna)
b) 51, TGGGATAGCTGCTTTTATTGATGC3(sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 6 lub sekwencja odwrotna i komplementarna połączona, korzystnie mostkiem TTTT, z sekwencją 5' GTTCTGCAACATTAACACCTAA3(sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 4 lub sekwencja odwrotna i komplementarna)
c) 5' GCATTGGCGGATATCCTAG3r sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 1 lub sekwencja odwrotna i komplementarna oraz
d) 5' TTGCTCTCCGGTATCAGG3'sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 2 lub sekwencja odwrotna i komplementarna. Równie korzystnie zestaw według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera dodatkowo zestaw sekwencji nukleinowych starterów loop zawierający sekwencje nukleinowe o numerach SEQ ID NO: 7-
5' TCTTGCCAGACGACTCGG3' i 8: 5'AGCATGCTCTTGATCCTGTTTATG3' lub sekwencje odwrotne i komplementarne.
Drugim przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania Borrelia burgdorferi charakteryzujący się tym, że obejmuje powielanie wybranego regionu sekwencji nukleinowej Borrelia burgdorferi z wykorzystaniem zestawu starterów jak zdefiniowano w pierwszym przedmiocie wynalazku przy czym metodą powielania jest metoda LAMP, korzystnie o następującym profilu temperaturowym:
- wstępna denaturacja 98°C, 5 min. bez polimerazy
- 65°C, 30 min.
- korzystnie przy reakcjach typu end-point 80°C, 5 min.
Trzecim przedmiotem wynalazku jest sposób diagnostyki boreliozy charakteryzujący się tym, że obejmuje sposób wykrywania zdefiniowany w drugim przedmiocie wynalazku.
Czwartym przedmiotem wynalazku jest zestaw do diagnostyki boreliozy charakteryzujący się tym, że zawiera zestaw starterów zdefiniowany w pierwszym przedmiocie wynalazku oraz korzystnie 20 mM
PL 237 232 Β1
Tris-HCI, pH 8,8, 10 mM (NH^SCU, 150 mM KCI, 6 mM MgSO4, 0.1% Tween® 20, 0,8 mM dNTP mix (NEB), 0,4 mM Betaina (Lucigen), przy czym poszczególne startery mają następujące stężenia 0,1 μΜ F3, 0,1 μΜ B3, 0,8 μΜ FIP, 0,8 μΜ BIP, 0,2 μΜ LoopF, 0,2 μΜ LoopB, 0,32 U/μΙ Bst 3.0 Polimeraza (NEB) oraz znacznik fluorescencyjny oddziałujący z dwuniciowym DNA - GreenFluorescent Dye (Lucigen) w ilości <1 μΙ lub EvaGreen < 1X lub Syto-13 < 16 μΜ lub SYTO-82 < 16 μΜ lub inny barwnik fluorescencyjny oddziałujący z dwuniciowym DNA w stężeniu niewykazującym inhibicji reakcji amplifikacji.
Przykładowe realizacje wynalazku przedstawiono na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia charakterystykę specyficzności oraz czułości metody, gdzie specyficzny sygnał uzyskano z matrycą bakterii Borrelia bulgdorferi szczep B31 (Quantitative Genomie DNA from Borrelia burgdorferi (ATCC® 35210DQ™), brak natomiast produktu w NTC; Linia 1.: marker mas (Quick-Load® Purple 100 bp DNA Ladder, NewEngland Biolabs); linia 2.: NTC; linia 3.: 5 kopii B. bulgdorferi; linia 4.: 10 kopii B. bulgdorferi; linia: 25 kopii B. bulgdorferi; linia 6.: 50 kopii B. bulgdorferi; Linia 7.: 100 kopii B. bulgdorferi; linia 8.: 1000 kopii B. bulgdorferi; linia 9.: 10000 kopii B. bulgdorferi; linia 10.: 100000 kopii B. bulgdorferi a fig. 2 ilustruje czułość metody wg wynalazku mierzonej przez nastawienie serii rozcieńczeń standardu Borrelia bulgdorferi szczep B31 (Quantitative Genomie DNA from Borrelia burgdorferi (ATCC® 35210DQ™) z minimalną ilością bakterii 5 kopii/μΙ, gdzie przyrost produktu mierzono w czasie rzeczywistym.
Przykład 1 Sekwencje starterów
Sekwencje specyficznych oligonukleotydów wykorzystywanych do detekcji materiału genetycznego Borrelia burgdorferi z wykorzystaniem technologii LAMP przedstawiono i scharakteryzowano poniżej.
1. Sekwencja oligonukleotydu Borrelia burgdorferi RecAF3:
5’ GCATTGGCGGATATCCTAG 3 ' stanowi sekwencję identyczną z genem RecA Borrelia burgdorferi (nić 5'-3'), który od strony 3' końca sąsiaduje ze starterem Borrelia burgdorferi F2.
2. Sekwencja oligonukleotydu Borrelia burgdorferi RecAB3:
5’ TTGCTCTCCGGTATCAGG 3 ’stanowi komplementarny fragment genu RecA Borrelia burgdorferi (nić 5’-3’) oddalona o 181 nukleotydów od końca 3' oligonukleotydu 1, który od strony 5' sąsiaduje ze starterem B2.
3. Sekwencja oligonukleotydu Borrelia burgdorferi RecAF2:
5'CGCATAATAGAAATTTTTGGCC 3 'stanowi sekwencję identyczną z genem RecA Borrelia burgdorferi (nić 5'-3') oddalona o 4 nukleotydy od końca 3' oligonukleotydu 1, który sąsiaduje ze starterem F3 od strony 5'.
4. Sekwencja oligonukleotydu Borrelia burgdorferi RecAB2: 5'GTTCTGCAACATTAACACCTAA 3 'stanowi komplementarny fragment genu RecA Borrelia burgdorferi (nić 5'-3') oddalona o 145 nukleotydów od końca 3' oligonukleotydu 1, który od końca 3' sąsiaduje ze starterem B3.
5. Sekwencja oligonukleotydu Borrelia burgdorferi RecAFIc:
5' CCTCAGCAATCGCTTGAAGAGTTA 3 ' stanowi komplementarny fragment genu RecA Borrelia burgdorferi (nić 5 '-3') oddalona o 50 nukleotydów od końca 3' oligonukleotydu 1.
6. Sekwencja oligonukleotydu Borrelia burgdirferi RecABIc·.
5' IGGGATAGCTGCTTTTATTGATGC 3 ' stanowi sekwencję identyczną z genem RecA Borrelia burgdorferi (nić 5'-3') oddalona o 87 nukleotydów od końca 3' oligonukleotydu 1.
Sekwencja oligonukleotydu Borrelia burgdorferi RecALoopF:
5'TCTTGCCAGACGACTCGG3'
Sekwencje oligonukleotydów F1c i F2 zostały połączone mostkiem TTTT i wykorzystane w postaci FIP. Sekwencje oligonukleotydów B1 c i B2 zostały połączone mostkiem TTTT i wykorzystane w postaci BIP Przykład 2
Metoda amplifikacji genu RecA Borrelia burgdorferi z wykorzystaniem oligonukleotydów scharakteryzowanych w przykładzie 1 w technologii LAMP o następującym składzie mieszaniny reakcyjnej.
mM Tris-HCI, pH 8,8 mM (NH4)2SO4
PL 237 232 B1
150 mM KCI mM MgSQ4
0,1% Tween® 20
0,8 mM dNTP mix (NEB)
0,4 mM Betaina (Lucigen)
0,1 μM F3
0,1 μM B3
0,8 μM FIP
0,8 μM BIP
0,2 μM LoopF
0,2 μM LoopB
0,32 U/μΙ Bst 3.0 Polimeraza (NEB)
Znacznik fluorescencyjny oddziałujący z dwuniciowym DNA - GreenFluorescent Dye (Lucigen) w ilości < 1 ul lub EvaGreen < 1 μΙ lub Syto-13 <16 μM lub SYTO-82 <16 μM lub inny barwnik fluorescencyjny oddziałujący z dwuniciowym DNA w stężeniu niewykazującym inhibicji reakcji amplifikacji.
Matryca DNA > 1 kopia/reakcję
Całkowita objętość reakcyjna dopełniona do 25 μl wodą wolną od DNaz i RNaz.
P r z y k ł a d 3
Metoda amplifikacji genu RecA dla Borrelia burgdorferi z wykorzystaniem oligonukleotydów scharakteryzowanych w przykładzie 1 w technologii LAMP o składzie mieszaniny reakcyjnej scharakteryzowanej w przykładzie 2 o następującym profilu temperaturowym:
1) wstępna denaturacja 98°C, 5 min. bez polimerazy
2) 65°C, 30 min.
3) opcjonalnie przy reakcjach typu end-point 80°C, 5 min.
P r z y k ł a d 4
Metoda amplifikacji i detekcji genu RecA dla Borrelia burgdorferi z wykorzystaniem oligonukleotydów scharakteryzowanych w przykładzie 1 w technologii LAMP o składzie mieszaniny reakcyjnej scharakteryzowanej w przykładzie 2 o profilu temperaturowym scharakteryzowanym w przykładzie 3 i sposobie detekcji opisanym poniżej.
Użyty barwnik fluorescencyjny wykazujący zdolność odziaływania z dwuniciowym DNA dodany do mieszaniny reakcyjnej w ilości 0,5 μl lub stężeniu <1X; <16 μM odpowiednio dla barwnika GreenFluorescent Dye (Lucigen); EvaGreen; SYTO-13 i SYTO-82 przed rozpoczęciem reakcji, pomiar w czasie rzeczywistym i/lub typu end-point. Długość fali wzbudzenia w zakresie zbliżonym do barwnika FAM 490-500 nm (optymalnie 494 nm) dla barwników GreenFluorescent Dye (Lucigen); EvaGreen; SYTO13 oraz dla barwnika SYTO-82 535 nm (optymalnie 541 nm) długość fali emisji w zakresie 509-530 nm (optymalnie 518 nm) dla barwników GreenFluorescent Dye (Lucigen); EvaGreen; SYTO-13 oraz dla barwnika SYTO-82 556 nm (optymalnie 560 nm), sposób detekcji, czas rejestracji zmian w 13 minucie od rozpoczęcia reakcji dla Borrelia bulgdorferi oraz kontroli negatywnej.
P r z y k ł a d 5 Metoda przygotowania i liofilizacji odczynników do detekcji amplifikacji i detekcji genu RecA bakterii Borrelia bulgdorferi z wykorzystaniem oligonukleotydów scharakteryzowanych w przykładzie 1 w technologii LAMP o składzie mieszaniny reakcyjnej scharakteryzowanej w przykładzie 2 o profilu temperaturowym scharakteryzowanym w przykładzie 3 i sposobie detekcji opisanym w przykładzie 4.
P r z y k ł a d 6 Opis procesu liofilizacji
Komponenty reakcji mieszano zgodnie ze składem opisanym w przykładzie 2, poza matrycą DNA, do całkowitej objętości 25 μl. Mieszaninę przeniesiono do probówek o pojemności 0,2 ml i poddano procesowi liofilizacji zgodnie z poniższymi parametrami.
Mieszanina umieszczona w probówkach została wstępnie schłodzona do -25°C. Następnie prowadzono proces liofilizacji w temperaturze -80°C przez 3-8 godzin pod ciśnieniem 5-2 mBar.
P r z y k ł a d 7 Czułość metody
Czułość określono przez nastawienie serii rozcieńczeń standardu Borrelia bulgdorferi szczep B31 (Quantitative Genomic DNA from Borrelia burgdorferi (ATCC® 35210DQ™) z minimalną ilością bakterii 5 kopii/μl, gdzie przyrost produktu mierzono w czasie rzeczywistym - Figura 2 (RealTime-LAMP dla serii rozcieńczeń Borrelia burgdorferi).
PL 237 232 Β1
Czas, po którym możliwa jest detekcja emitowanej fluorescencji dla poszczególnych próbek przedstawiono w tabeli 1. Scharakteryzowane startery umożliwiają detekcję Borrelia burgdoferi przy minimalnej ilości 5 kopii/μΙ.
Tabela 1
Czas niezbędny do detekcji fluorescencji dla poszczególnych stężeń Borrelia bulgdorferi
Czas przekroczenia linii
Próbka bazowej fluorescencji [min]
B. bulgdorferi NTC Nieokreślony
B. bulgdorferi 5 kopii 24,60907
B. bulgdorferi 10 kopii 23,072092
B. bulgdorferi 25 kopii 28,597315
B. bulgdorferi 50 kopii 21,267418
B. bulgdorferi 100 kopii 21,876034
B. bulgdorferi 1000 kopii 17,512388
B. bulgdorferi 10000 kopii 15,219044
B. bulgdorferi 100000 kopii 14,369184
Wyższość metody amplifikacji oraz oligonukleotydów scharakteryzowanych w niniejszym opisie patentowym nad bazującymi na technologii RealTime-LAMP polega na znacznie wyższej czułości, którą przedstawiono na figurze 1 skróceniu czasu analiz przedstawionego na figurze 2 oraz tabeli 1.
PL 237 232 Β1
Lista sekwencji <110> Genomtec S.A.
<120> Zestaw starterów do wykrywania Borrelia burgdorferi, sposób wykrywania i diagnostyki Borrelia burgdorferi z wykorzystaniem zestawu starterów oraz zestaw do wykrywania Borrelia burgdorferi <170> Patentln version 3.5 <210> 1 RecAF3 <211>24 <212> DNA <213> artificial <223> primer <400>1
GCATTGGCGG ATATCCTAG19 <210> 2 RecAB3 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <223> primer <400>2
TTGCTCTCCG GTATCAGG18 <210> 3 RecAF2: 5' <211>24 <212> DNA <213> artificial
PL 237 232 Β1 <223> primer <400>3
CGCATAATAG AAATTTTTGG CC22
| <210> | 4 RecAB2 |
| <211> 24 <212> DNA <213> artificial <223> primer <400> 4 GTTCTGCAAC ATTAACACCT AA | 22 |
| <210> | 5 RecAFlc |
| <211> | 24 |
| <212> | DNA |
| <213> | artificial |
| <223> | primer |
<400>5
CCTCAGCAAT CGCTTGAAGA GTTA 24 <210> RecABlc <211>24 <212> DNA <213> artificial <223> primer <400>6
PL 237 232 Β1
TGGGATAGCT GCTTTTATTG ATGC 24
| <210> | 7 RecALoopF |
| <211> | 24 |
| <212> | DNA |
| <213> | artificial |
<223> primer <400> 7
TCTTGCCAGA CGACTCGG 18 <210> 8 RecALoopB <211> 24 <212> DNA <213> artificial <223> primer <400> 8
AGCATGCTCT TGATCCTGTT TATG 24 <210> 9 RecA <211> 24 <212> DNA <213>
<223> gen <400> 9
| atgtcaaagt | taaaggaaaa aagagaaaaa | gctgttgttg | gcatagaaag | ggcaagtaaa | 60 |
| gaggaagcta | ttgagcttgc aagagttcaa | atagaaaaag | cttttggaaa | gggaagtctt | 120 |
| attaagatgg | gggaatctcc tgttggacaa | ggtataaaaa | gtatgtcaag | tggatctatt | 180 |
PL 237 232 Β1 cttagaaaaa gtattagatg ggccccgagt gaaggtggga gctttaggtg cttgagattg gtagcggctt cttcaagcaa aatacttgca cctgagacca cgaaagatcg agagttaaga tattttggga ttaatacaaa gagagtgtta
| aggctctcgg | cattggcgga | tatcctaggg | ggcgcataat | agaaattttt | 240 |
| cgtctggcaa | gactacttta | actcttcaag | cgattgctga | ggtgcaaaaa | 300 |
| tagctgcttt | tattgatgct | gagcatgctc | ttgatcctgt | ttatgcaaaa | 360 |
| ttaatgttgc | agaactttgg | cttagtcagc | ctgataccgg | agagcaagct | 420 |
| ctgagcattt | aatcagaagt | ggtggtgttg | atttgattgt | agttgattct | 480 |
| taacccctaa | attagagata | gatggagaaa | tgggagattc | tcagattggt | 540 |
| ggctaatgag | caaagctctt | agaaagatta | ccggtatact | ttctaaatcc | 600 |
| ttatgtttat | taatcaaata | aggatgagga | ttggtgttat | gtttggcaat | 660 |
| ctaccggtgg | gaatgcttta | aaattttatt | catctcttag | acttgaggtt | 720 |
| aacaagtaac | tagatcgggc | tcaagcgatg | atgttattgg | caataagatt | 780 |
| ttgtaaagaa | caaggttgct | ccaccttttc | gtaaagtaga | attgataatt | 840 |
| aaggtatttc | aagagaagct | ggcattttag | atgctgctat | taagcataat | 900 |
| aaacaggctc | atggtattca | ttgggagata | ataagttggg | acaggggaga | 960 |
| ttgagtatct | tagcaaagaa | gtagaacttg | caaataattt | ggataagagg | 1020 |
| taatttttaa | taattttgat | caagagaatg | ataattttat | tgaatttaaa | 1080 |
gaagatgaat ctgagtaa
Claims (5)
1) wstępna denaturacja 98°C, 5 min. bez polimerazy
1. Zestaw starterów zdolnych do powielania sekwencji nukleotydowej Borrelia burgdorferi znamienny tym, że zawiera zestaw starterów wewnętrznych zawierający następujące sekwencje nukleotydowe a) i b) oraz zestaw starterów zewnętrznych zawierający następujące sekwencje nukleotydowe c) i d):
a) 5' CCTCAGCAATCGCTTGAAGAGTTA3'sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 5 lub sekwencja odwrotna i komplementarna) - połączona, korzystnie mostkiem TTTT, z sekwencją
5' CGCATAATAGAAATTTTTGGCC3(sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 3 lub sekwencja odwrotna i komplementarna)
b) 5' TGGGATAGCTGCTTTTATTGATGC3'_ (sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 6 lub sekwencja odwrotna i komplementarna) połączona, korzystnie mostkiem TTTT, z sekwencją 5 ' AGCATGCTCTTGATCCTGTTTATG3 ' _ (sekwencja nakteinowa SEQ |D NO: 4 lub sekwencja odwrotna i komplementarna
c) 5' GCATTGGCGGATATCCTAG3' sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 1 lub sekwencja odwrotna i komplementarna
d) 5' TTGCTCTCCGGTATCAGG3' sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 2 lub sekwencja odwrotna i komplementarna.
2) 65°C, 30 min.
2. Zestaw według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera dodatkowo zestaw sekwencji nukleinowych starterów loop zawierający sekwencje nukleinowe o numerach SEQ ID NO 7:
5'TCTTGCCAGACGACTCGG3' i 8: 5'AGCATGCTCTTGATCCTGTTTATG3' lub sekwencje odwrotne i komplementarne
3) opcjonalnie przy reakcjach typu end-point 80°C, 5 min.
3. Sposób wykrywania Borrelia burgdorferi znamienny tym, że obejmuje powielanie wybranego regionu sekwencji nukleinowej Borrelia burgdorferi z wykorzystaniem zestawu starterów jak zdefiniowano w zastrz. 1 albo 2 przy czym metodą powielania jest metoda LAMP, korzystnie o następującym profilu temperaturowym:
4. Sposób diagnostyki boreliozy, znamienny tym, że obejmuje sposób wykrywania zdefiniowany w zastrz. 3.
5. Zestaw do diagnostyki boreliozy, znamienny tym, że zawiera zestaw starterów jak zdefiniowano w zastrz. 1 albo 2 oraz korzystnie 20 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10 mM (NH^SCM, 150 mM KCI, 6 mM MgSO4, 0,1% Tween® 20, 0,8 mM dNTP mix (NEB), 0,4 mM Betaina (Lucigen), przy czym poszczególne startery mają następujące stężenia 0,1 μΜ F3, 0,1 μΜ B3, 0,8 μΜ FIP, 0,8 μΜ BIP, 0,2 μΜ LoopF, 0,2 μΜ LoopB, 0,32 U/μΙ Bst 3.0 Polimeraza (NEB) oraz znacznik fluorescencyjny oddziałujący z dwuniciowym DNA - GreenFluorescent Dye (Lucigen) w ilości < 1 μΙ lub EvaGreen <1X lub Syto-13 <16 μΜ lub SYTO-82 < 16 μΜ lub inny barwnik fluorescencyjny oddziałujący z dwuniciowym DNA w stężeniu niewykazującym inhibicji reakcji amplifikacji.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL423217A PL237232B1 (pl) | 2017-10-20 | 2017-10-20 | Zestaw starterów do powielania sekwencji nukleotydowej Borrelia burgdorferi, sposób wykrywania Borrelia burgdorferi, sposób diagnostyki boreliozy i zestaw do diagnostyki boreliozy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL423217A PL237232B1 (pl) | 2017-10-20 | 2017-10-20 | Zestaw starterów do powielania sekwencji nukleotydowej Borrelia burgdorferi, sposób wykrywania Borrelia burgdorferi, sposób diagnostyki boreliozy i zestaw do diagnostyki boreliozy |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL423217A1 PL423217A1 (pl) | 2019-04-23 |
| PL237232B1 true PL237232B1 (pl) | 2021-03-22 |
Family
ID=66167915
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL423217A PL237232B1 (pl) | 2017-10-20 | 2017-10-20 | Zestaw starterów do powielania sekwencji nukleotydowej Borrelia burgdorferi, sposób wykrywania Borrelia burgdorferi, sposób diagnostyki boreliozy i zestaw do diagnostyki boreliozy |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL237232B1 (pl) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101886113B (zh) * | 2009-05-13 | 2012-10-17 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 蜱体内检测莱姆病病原的检测试剂盒 |
| CN101967513B (zh) * | 2009-12-10 | 2013-03-20 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 区分莱姆病病原基因型的试剂 |
| CN102703587B (zh) * | 2012-05-18 | 2013-11-27 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 用于检测莱姆病螺旋体的环介导等温扩增法 |
| CN105861727B (zh) * | 2016-06-08 | 2019-06-18 | 首都医科大学附属北京朝阳医院 | 用于检测3种眼科感染螺旋体的lamp引物组合及应用 |
-
2017
- 2017-10-20 PL PL423217A patent/PL237232B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL423217A1 (pl) | 2019-04-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6983201B2 (ja) | 核酸プローブ | |
| EP3134553B1 (en) | Colorimetric detection of nucleic acid amplification | |
| DE102010049607A1 (de) | Konjugate von Nukleotiden und Methoden zu deren Anwendung | |
| WO2007024706A1 (en) | Detecting pathogens in companion animals | |
| JP2003210199A (ja) | 高度ダイナミックレンジを有する定量的多重ｐｃｒ | |
| US20220025434A1 (en) | Composition for determining false positives using a unique artificial nucleotide sequence and method for determining false positives using the same | |
| US20230002839A1 (en) | Primer sets for the detection of human papillomavirus type 16 (hpv16) and human papillomavirus type 18 (hpv18), the method of detecting hpv16 and hpv18 infections, the use of a primer set for the detection of hpv16 and hpv18 infections | |
| Kusumawati et al. | Use of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification combined with lateral flow dipstick for an easy and rapid detection of Jembrana disease virus | |
| KR102258934B1 (ko) | 라임병 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트 | |
| KR102030245B1 (ko) | 치쿤군야 바이러스 검출용 올리고뉴클레오티드 세트 및 이의 용도 | |
| PL237232B1 (pl) | Zestaw starterów do powielania sekwencji nukleotydowej Borrelia burgdorferi, sposób wykrywania Borrelia burgdorferi, sposób diagnostyki boreliozy i zestaw do diagnostyki boreliozy | |
| KR102219895B1 (ko) | 쯔쯔가무시병 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트 | |
| JP3449961B2 (ja) | マルチプライマーｐｃｒ法による病原生物検出法 | |
| JP2020065488A (ja) | 重症熱性血小板減少症候群（ｓｆｔｓ）ウイルス検出用プライマーセット | |
| CN116348614A (zh) | 开关寡核苷酸 | |
| WO2022046900A1 (en) | Methods and reagents for rapid detection of pathogens in biological samples | |
| KR20210073220A (ko) | 중증열성혈소판감소증후군 및 쯔쯔가무시증 동시 검출용 프라이머 및 프로브 세트 | |
| KR20200048076A (ko) | 중증 열성 혈소판 감소 증후군(sfts) 바이러스 감염 질환 진단용 키트 | |
| US20230125922A1 (en) | Primer sets for detection of mycoplasma pneumoniae bacteria, method for detection of mycoplasma pneumoaniae infection, use of a primer set for detection of mycoplasma pneumoniae infection | |
| KR102291584B1 (ko) | 반려동물 및 가축의 질병진단을 위한 분자진단 방법 | |
| KR101911017B1 (ko) | 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출용 조성물, 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단용 조성물, 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출방법, 및 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단방법 | |
| JP7176682B2 (ja) | 白癬菌の遺伝子をｌａｍｐ法により検出するためのプライマーセット及びそれを含むキット並びにそれらを用いて白癬菌を検出する方法 | |
| WO2023109668A1 (en) | Universal fluorescent nanoprobes for one-step isothermal nucleic acid amplification assay | |
| JP2023552797A (ja) | プライマーセット、試薬の組成物および非定型細菌を検出する方法 | |
| JP2024509603A (ja) | 増幅プライマーのキット、性感染症を検出する方法、および該感染を検出するキット |