JP2003210199A - 高度ダイナミックレンジを有する定量的多重ｐｃｒ - Google Patents

高度ダイナミックレンジを有する定量的多重ｐｃｒ

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、リアルタイムPCRの分野に関す
る。特に、本発明は特定の細胞内mRNAにおける核酸の定
量に関する。 【解決手段】 本発明は、少なくとも0.5ユニット/μ
lの最終濃度で熱安定性DNAポリメラーゼが使用されるこ
とを特徴とする、高ダイナミックレンジを有する定量的
多重PCRのための方法およびキットを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、リアルタイムPCR
の分野に関する。特に、本発明は特定の細胞内mRNAにお
ける核酸の定量の分野に関する。
【０００２】
【従来の技術】対象とする特定の遺伝子の発現について
情報を得るために、mRNAの定量は、分子生物学の分野に
おいて未解決の課題であった。従来、これは半定量的な
ノーザンブロット分析または半定量的なリボヌクレアー
ゼプロテクションアッセイのいずれかによって行われて
きた。
【０００３】加えて、PCR技術の有用性、特に逆転写酵
素PCR（RT-PCR）の有用性は、少ないサンプルから少量
のmRNAのより高感度な定量的検出を可能にした。RT-PCR
では、逆転写酵素を用いて分析されるため、最初にmRNA
から一本鎖cDNAが産生される。続いて、PCRを用いて、
二本鎖DNA増幅産物が生成される。
【０００４】この方法の異なる２つの改良型の間で識別
がなされる。いわゆる相対的定量では、特定の標的遺伝
子の発現の比率が、各々の生理的状態に関係なくすべて
の細胞で構成的に発現している、いわゆるハウスキーピ
ング遺伝子のRNA量に対して相対的に決定される。ここ
で、該mRNAはすべての細胞内でほぼ同量存在する。この
利点は、様々なサンプル材料の異なる内部特性およびRN
A調製の過程が特有な結果に影響を持たないことであ
る。しかし、絶対的定量はこの方法では不可能である。
【０００５】代替方法として、使用されるRNAの絶対量
は、既知のコピー数の標準核酸を用いて、この標準核酸
の対応する希釈列を増幅させることを用いて決定するこ
とができる。内部標準を用いる場合、すなわち、1つの
反応槽内で標準および標的核酸が増幅される場合、標準
核酸および標的核酸の増幅間で識別が可能となるよう、
分析される標的核酸と比較して異なる配列を有する標準
物を用いなければならない。
【０００６】増幅反応の動態観測を可能にし、従って、
特定の標的分子のより正確な定量を可能にする、キネテ
ィックリアルタイムPCRの方法を応用することによっ
て、更なる発展が達成され得た。
【０００７】この場合、PCR産物の形成はPCRの各サイク
ルで観測される。その増幅は通常、増幅反応中の蛍光シ
グナルを測定するための付加的な装置を持つサーモサイ
クラーで測定される。この代表的な例としては、Roche
Molecular Biochemicals LightCycler（カタログ番号2
0110468）が挙げられる。増幅産物は、例えば、標的核
酸に結合した場合のみに蛍光シグナルを放射する蛍光標
識ハイブリダイゼーションプローブを用いて検出され、
または、特定の場合には二本鎖DNAに結合する蛍光色素
によっても検出される。
【０００８】分析されるすべての反応に対して明確なシ
グナルの閾値が決定され、標準またはハウスキーピング
遺伝子などの基準核酸に対してと同様に標的核酸に対し
て、この閾値に達するために必要なサイクル数Cpが決定
される。標的分子の絶対的または相対的コピー数は、標
的核酸および基準核酸について得られたCp値に基づいて
決定されうる（Gibson, U. E.,ら、Genome Res 6 (199
6) 995-1001.; Bieche,I.,ら、Cancer Res 59 (1999) 2
759-65.; WO 97/46707）。このような方法もまたリアル
タイムPCRと呼ばれる。
【０００９】要約すると、PCRによる核酸の定量のため
に記述されたすべての方法において、増幅反応中に形成
されるコピー数は、常に、標準またはハウスキーピング
遺伝子のRNAのいずれかである基準核酸の形成されるコ
ピー数に関連している。
【００１０】多くの場合、いわゆる多重アプローチにお
いて、1つの反応槽内で1つ以上の標的を定量すること
が、大きな関心事である。これは、例えば、あるmRNAの
発現レベルが一般的なハウスキーピング遺伝子の発現レ
ベルとの比較として決定されるような、相対的定量の実
施形態についての場合である（Meijerink J.,ら、J Mol
Diag 3 (2001) 55-61）。また、複雑な細胞内プロセス
を研究または分析するために、より複雑な発現パターン
が分析される必要がある場合、異なるmRNA分子種の同時
定量が関心事となるかも知れない。
【００１１】多重PCRの有する主要な欠点は、多くの場
合、第2の核酸標的分子種と比較して少量の核酸標的分
子種が適切な効率で増幅され得ず、少量の核酸標的に対
応する各増幅シグナルが検出されないことである（例え
ば、Bercovich, D.,ら、Biotechniques 27 (1999) 762-
770）。言い換えると、多くの場合、多重アプローチで
検出されうる核酸量のダイナミックレンジは非常に限定
されている。
【００１２】この状況において、多重アプローチのダイ
ナミックレンジは通常、検出される異なる標的核酸の絶
対値に依存しないが、ほとんどもっぱら分析されるサン
プル中に存在する異なる標的核酸のモル比のみに依存し
ていることに注目することが重要である。
【００１３】しかし意外にも、得られるダイナミックレ
ンジはアッセイおよび標的に依存するらしく、Vet, J.
A.,ら、Proc Natl Acad Sci U S A 96 (1999) 6394-9
は、ダイナミックレンジが104の、Molecular Beaconを
用いた4つの病原性レトロウイルスの検出のための洗練
された多重アッセイを発表している。同様に、Director
-Myska, A. E.,ら、Environ Mol Mutagen 37 (2001) 14
7-154は、蛍光発生性5'ヌクレアーゼ形式（TaqMan形
式）を用いた特異的定量プラスミド混合物分析を発表
し、そこでは103から104のダイナミックレンジが実現さ
れている。
【００１４】Tucker, R. A., et al., Mol Diagn 6 (20
01) 39-47は、β-アクチンmRNAに対するHPV 16の相対的
定量のためのTaqManリアルタイムPCRアッセイを発表し
ており、そこでは、5 x 104のアクチンコピーの増幅はH
PV 16 RNAの増幅に影響を与えないが、一方、100倍以上
のHPV 16 mRNA鋳型はβ-アクチンの増幅を阻害する。特
にこの例から、妥当な多重PCRのダイナミックレンジを
得るための問題に対する分子的基礎は、理解されるには
程遠いと結論することができる。
【００１５】適切なプライマー濃度の調整によってこの
問題を克服するために、当技術分野で試みが為された。
Halminen, M.,ら、Cytokine 11 (1999) 87-93は、β-ア
クチンの発現と比較したインターフェロン-ガンマmRNA
およびインターフェロン-4 mRNAの相対的定量を発表し
ており、そこでは、限定された量のβ-アクチンプライ
マーが使用される。同様に、Bercovich, D.,ら、Biotec
hniques 27 (1999) 762-770は、下位に相当する標的核
酸のプライマー量が増加されて含まれていること、また
は、代替として、このような多重反応のアニーリング温
度を低くすることを推奨している。
【００１６】しかし、当技術分野において発表されたす
べての方法は、核酸濃度の適切で正確な測定の必須条件
として、広範にわたるPCR条件の最適化を必要とする。
従って、当技術分野には、標的の性質または使用される
プライマーの濃度について固有の最適化なしで妥当な広
いダイナミックレンジを提供する、標準化された多重PC
Rプロトコールの必要性がある。
【００１７】
【特許文献１】米国特許第5,118,801号
【００１８】
【特許文献２】米国特許第5,677,152号
【００１９】
【特許文献３】米国特許第5,693,502号
【００２０】
【特許文献４】米国特許第6,174,670号
【００２１】
【特許文献５】米国特許第6,303,305号
【００２２】
【特許文献６】WO 97/46706
【００２３】
【特許文献７】WO 97/46707
【００２４】
【特許文献８】WO 97/46712
【００２５】
【非特許文献１】Bernard, P. S.,ら、Anal Biochem 25
5 (1998) 101-7
【００２６】
【非特許文献２】Bercovich, D.,ら、Biotechniques 27
(1999) 762-770
【００２７】
【非特許文献３】Bieche, I.,ら、Cancer Res 59 (199
9) 2759-65
【００２８】
【非特許文献４】Director-Myska, A. E.,ら、Environ
Mol Mutagen 37 (2001) 147-54
【００２９】
【非特許文献５】Gibson, U. E.,ら、Genome Res 6 (19
96) 995-1001
【００３０】
【非特許文献６】Halminen, M.,ら、Cytokine 11 (199
9) 87-93
【００３１】
【非特許文献７】Kainz, P.,ら、Biotechniques 28 (20
00) 278-82
【００３２】
【非特許文献８】Kellogg, D. E.,ら、Biotechniques 1
6 (1994) 1134-7
【００３３】
【非特許文献９】Lin, Y. Jayasena, S. D., J Mol Bio
l 271 (1997) 100-11Meijerink, J.,ら、J Mol Diagn 3
(2001) 55-61
【００３４】
【非特許文献１０】Moretti, T.,ら、Biotechniques 25
(1998) 716-22
【００３５】
【非特許文献１１】Sharkey, D. J.,ら、Biotechnology
(N Y) 12 (1994) 506-9
【００３６】
【非特許文献１２】Tucker, R, A.,ら、Mol Diagn 6 (2
001) 39-47
【００３７】
【非特許文献１３】Vet, J. A.,ら、Proc Natl Acad Sc
i U S A 96 (1999) 6394-9
【００３８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、リアルタイ
ムPCRの分野に関する。特に、本発明は特定の細胞内mRN
Aにおける核酸の定量の分野に関する。
【００３９】
【課題を解決するための手段】従って、新しい本発明は
少なくとも102のダイナミックレンジを有する定量的多
重PCRの方法を提供し、そこでは、少なくとも0.5ユニッ
ト/μlの最終濃度で熱安定性DNAポリメラーゼが使用さ
れる。好ましくは、少なくとも103のダイナミックレン
ジが、より好ましくは、少なくとも104のダイナミック
レンジが得られる。
【００４０】
【発明の実施の形態】より具体的には、本発明は、サン
プル中の少なくとも第1および第2核酸を定量するための
PCRを用いた方法に関し、該方法は、サンプル中の第1核
酸のもとの濃度は、第2核酸のもとの濃度と比較して100
倍より高く、第1核酸増幅用の第1プライマー対を添加す
ること、第2核酸増幅用の第2プライマー対を添加するこ
と、熱安定性DNAポリメラーゼによって2つの核酸を増幅
することを包含する。本発明によると、熱安定性DNAポ
リメラーゼは少なくとも反応液中に0.5ユニット/μlの
濃度で存在し、第2核酸の増幅は、第1プライマー対の非
存在下における第2プライマー対による第2核酸の増幅と
比較して10％以下には阻害されない。
【００４１】本発明に従ったPCRが高温開始によって行
われた場合、すなわち、プライマーダイマーの形成が適
切に阻害された場合、更なる利点を持つことも証明され
ている。この場合、本発明に従ったDNAポリメラーゼ
は、少なくとも0.25ユニット/μlの濃度で存在する。
【００４２】PCR増幅がリアルタイムで観測される場
合、本発明の方法は特に適用できる。好ましくは、得ら
れる増幅産物は各々、少なくとも1つの蛍光標識ハイブ
リダイゼーションプローブによって検出される。
【００４３】特殊な実施形態では、各標的核酸に対して
2つの隣接するハイブリダイゼーションプローブが用い
られ、各プローブはハイブリダイゼーションによって蛍
光共鳴エネルギー移動を起こすことができる蛍光成分に
よって適切に標識されている（FRET-ハイブリダイゼー
ションプローブ）。
【００４４】リアルタイム観測をも含みうる他の好まし
い実施形態では、増幅反応は高速熱サイクルによって行
われ、そこでは1サイクルが1分間以下である。
【００４５】更なる態様では、本発明は、本発明の方法
を実行するための試薬を含むキットを対象にする。この
ようなキットは、少なくとも最終濃度0.5ユニット/μl
の熱安定性DNAポリメラーゼ、または少なくとも0.25ユ
ニット/μlの熱安定性DNAポリメラーゼおよび高温開始
増幅プロトコールに必要とされる付加的な化合物を提供
するために、充分な濃度で熱安定性DNAポリメラーゼを
含むマスター混液を含むことが好ましい。
【００４６】発明の詳細な説明 新しい本発明は、少なくとも最終濃度0.5ユニット/μl
で熱安定性DNAポリメラーゼを使用する、少なくとも102
のダイナミックレンジを有する定量的多重PCRのための
方法を提供する。好ましくは、少なくとも103のダイナ
ミックレンジ、より好ましくは少なくとも104のダイナ
ミックレンジが得られる。
【００４７】本発明の方法が多様な異なる標的濃度に適
用できることに注目することも重要である。このような
背景において、少なくとも多重アッセイで増幅される標
的核酸が102から108の間のコピー数で存在する場合に
は、本発明に従って同じダイナミックレンジが得られる
ことも、実施例の中に示されている。
【００４８】本発明において、1ユニットの熱安定性DNA
ポリメラーゼとは、標準的アッセイ条件下で、65℃、60
分間で、酸沈殿性DNA内に20 nmolの全デオキシリボヌク
レオシド3リン酸を取り込む酵素量として定義される。
【００４９】これらの条件は、67 mM Tris/HCl、pH8.3/
25℃、5mM MgCl2、10 mMメルカプトエタノール、0.2%ポ
リドカノール、0.2mg/mlゼラチン、各0.2mMのdATP、dGT
P、dTTP、および0.1 mM dCTP、pH8.3/25℃である。
【００５０】活性は、50 μlのインキュベーションバッ
ファーで適切に希釈したTaqポリメラーゼと、M13mp9s
s、M13プライマー（17mer）、および1μCi（α-32-P) d
CTPを65℃、60分間で保温することによって測定するこ
とができる。取り込まれたdNTP量は、その後、トリクロ
ロ酢酸沈殿によって決定される。
【００５１】先行技術において開示されたものと同様
に、本発明の多重PCRは、1つの反応槽内で1つ以上の核
酸標的配列が、1つ以上の（少なくとも2つの）増幅プラ
イマー対の存在下で増幅されるPCRアッセイとして定義
される。
【００５２】本発明は、明確に、PCRを用いてサンプル
中の少なくとも第1および第2核酸を定量するための方法
を対象にしている。多くの応用例において、分析される
標的核酸は細胞の全RNAまたは全ポリA RNA（mRNA）に由
来する。このようなRT-PCR分析においては、定量は、そ
れ自体の増幅反応前にRNA依存的cDNA合成を行うことに
よって達成される。cDNA合成反応は特殊な逆転写酵素を
用いて行われ、続いて汎用の熱安定性DNAポリメラーゼ
を用いた増幅が行われてもよく、あるいは、cDNA合成お
よびRT-PCRはRNA依存性逆転写酵素とDNA依存性DNAポリ
メラーゼの両方の活性を持つ熱安定性酵素を用いて行わ
れてもよい。
【００５３】上記に限らず、例えば遺伝子量または反復
配列数の決定のために、ゲノムDNAもまた本発明の多重
アプローチで分析できる。
【００５４】本発明において、「核酸の定量」という用
語は、絶対的な対照標準と比較した場合のサンプル中に
存在する複数の核酸のコピー数の絶対評価、あるいは、
同一サンプル中に見られる他の核酸と比較した場合の相
対値の評価などの異なる可能性を含む場合がある。
【００５５】当然、2つだけでなく多数の標的核酸が増
幅される場合も、本発明の範囲内である。分析される核
酸数に関して、上限はまだ実験的に決定されていない。
しかし、実験を行う際、本発明の方法は、異なる増幅断
片の検出に対して可能な数によってのみ限定される。
【００５６】本発明によると、対象とする異なる標的核
酸のもとの濃度は、互いに少なくとも100倍まで異なっ
てもよい。更に、新しい方法は、異なる標的核酸の開始
濃度が互いに1000倍または10000倍にまで異なるような
状況に幅広く適用されることも、発明者によって証明さ
れている。各々のデータは後述の実施例において示され
る。
【００５７】本発明による典型的なアッセイは、定量さ
れる各標的核酸に対する増幅プライマー対、適切なバッ
ファー、デオキシヌクレオシド3リン酸、および、少な
くとも反応液中0.5ユニット/μlの濃度で熱安定性DNAポ
リメラーゼを含むであろう。定量される増幅標的の種類
および数に関係なく、高濃度の酵素は、単一アプローチ
における少量の核酸標的の増幅と比較して、他の増幅さ
れる標的の存在によって、少量の標的の増幅が多くとも
10％しか阻害されないことを保証するであろう。
【００５８】一方、用いることのできるポリメラーゼの
最高濃度は通常10ユニット/μlである。約5ユニット/μ
l、すなわち3〜7ユニット/μlの間、好ましくは約2ユニ
ット/μl、すなわち1〜3ユニット/μlの間の濃度でも、
大抵の場合、非常によく機能する。
【００５９】更に、増幅は、増幅産物を検出するための
手段を提供する物質の存在下で行われてもよい。例え
ば、反応槽は予め増幅産物の均質リアルタイム検出のた
めに適切なハイブリダイゼーションプローブを含んでい
てもよい。これらのプローブは蛍光成分によって適切に
標識されていることが好ましい。
【００６０】本発明に従ったPCRが高温開始によって行
われた場合、すなわち、プライマーダイマーの形成が適
切に阻害された場合、更なる利点を持つことも証明され
ている。このようなプライマーダイマーの形成は、主と
して、熱サイクル反応自体に先立つ室温での残存ポリメ
ラーゼ活性に帰因している。標準的な増幅プロトコール
とは対照的に、高温開始プロトコールの中では、ポリメ
ラーゼ活性は、最初の加熱後しか活性化されず、従っ
て、非特異的産物（例えば、プライマーダイマー）のア
ニーリングまたは増幅を引き起こす低温におけるいかな
る活性をも排除される。この段階は、同一反応槽に更な
るオリゴヌクレオチド（プライマー、蛍光プローブ、増
幅産物）の添加がある場合の多重PCRにおいて、より重
要であることが判明した。
【００６１】任意に選択された高温開始技術の適用は、
過剰量の熱安定性ポリメラーゼの所要量を約２分の１に
まで減少させることが、発明者によって証明されてい
る。
【００６２】従って、本発明によると、少なくとも102
のダイナミックレンジを有する信頼性のある多重PCRプ
ロトコールは、任意の高温開始技術を併用した、少なく
とも最終濃度0.25ユニット/μlのDNAポリメラーゼの使
用を含む。
【００６３】従って、本発明はまた、サンプル中の少な
くとも第1および第2核酸の定量のためのPCRを用いた方
法であって、サンプル中の第1核酸のもとの濃度は第2核
酸のもとの濃度と比較して100倍より高く、第1核酸増幅
用の第1プライマー対を添加すること、第2核酸増幅用の
第2プライマー対を添加すること、熱安定性DNAポリメラ
ーゼによる2つの核酸を増幅させることを含む方法をも
対象とする。ここでは、高温開始PCRが行われ、熱安定
性DNAポリメラーゼは反応液中に少なくとも0.25ユニッ
ト/μlの濃度で存在し、第2核酸の増幅は第1プライマー
対の非存在下で第2プライマー対を用いた第2核酸の増幅
と比較して、10％未満までは阻害されない。
【００６４】従って、プライマーダイマーの形成は、当
技術分野において既知のいくつかの方法によって阻害さ
れ得る。
【００６５】例えば、DNAポリメラーゼは化学修飾を受
けて可逆的に不活性化される。より正確には、熱不安定
性の阻害基がTaq DNAポリメラーゼに導入され、酵素を
室温で不活性にしている。これらの阻害基はPCR前段階
での高温で除去され、酵素は活性化される。このような
熱不安定性の修飾は、例えば、酵素のリジン残基へのシ
トラコン酸無水物またはアコニット酸無水物カップリン
グによって得られうる（US 5,677,152）。一方、このよ
うな修飾を持つ酵素はAmplitaq Gold（Moretti, T.,
ら、Biotechniques 25 (1998) 716-22、またはFastStar
t DNA Polymerase（Roche Molecular Biochemicals）と
して市販されている。
【００６６】代替方法として、非特異的にアニーリング
されたプライマーの伸長は、短い二本鎖DNA断片の添加
によって阻害されることが示されている（Kainz, P.,
ら、Biotechniques 28 (2000) 278-82.）。この場合、
プライマーの伸長は、短い二本鎖DNA断片の融点より低
い温度で阻害されるが、競合的DNA自体の配列とは無関
係である。より一層特異的には、定義された二次構造を
とる特異的配列を有する、オリゴヌクレオチドアプタマ
ーが用いられてもよい。このようなアプタマーは、DNA
ポリメラーゼへの非常に高い親和性のために、SELEX技
術を用いて選択されている（US 5,693,502）、（Lin,
Y. Jayasena, S. D., J Mol Biol 271 (1997) 100-1
1）。実際の熱サイクル過程自体の前に増幅混合物中の
このようなアプタマーが存在することは、再びDNAポリ
メラーゼに高親和性結合を生じ、その結果、その活性の
熱不安定性阻害を生じる。
【００６７】Taq DNAポリメラーゼの熱不安定性阻害を
成立させるための別のアプローチは、精製酵素に対して
作成されたモノクローナル抗体の添加である（Kellogg,
D.E.,ら、Biotechniques 16 (1994) 1134-7; Sharkey,
D. J.,ら、Biotechnology(N Y) 12 (1994) 506- 9）。
オリゴヌクレオチドアプタマーのように、抗体は、阻害
様式において、室温で高い親和性でTaq DNAポリメラー
ゼに結合する。複合体は、熱サイクル過程自体の前の予
熱段階で分解される。特に高速熱サイクルのためのプロ
トコール（WO 97/46706）を適用する場合、これは全体
として増幅の実質的な時間消費の延長になる。
【００６８】高温開始技術を適用するまたはしないに関
わらず、本発明の方法は、PCR増幅がリアルタイムで観
測され均質検出形式となる場合、特に適用できる。従っ
て、得られる増幅産物は、少なくとも1つの蛍光標識ハ
イブリダイゼーションプローブによって検出されること
が好ましい。このようなリアルタイム観測のための計測
基盤は、Roche Light Cycler（Roche Molecular Bioche
micals）、ABI Prism7700（Perkin Elmer）、または、i
Cycler（BioRad）のような市販の機器によって提供され
る。
【００６９】示されたように、蛍光標識ハイブリダイゼ
ーションプローブはリアルタイム観測のために使用され
うる。本発明による本発明の方法に使用されるこれらの
ハイブリダイゼーションプローブは、通常、増幅反応の
アニーリング温度で標的核酸にハイブリダイズする、一
本鎖DNAもしくはRNAなどの一本鎖核酸、またはその誘導
体、或いはPNAである。これらのオリゴヌクレオチド
は、通常20から100ヌクレオチドの長さを持つ。
【００７０】標識化は、特定の検出形式に従って、オリ
ゴヌクレオチドの任意のリボースまたはリン酸基に導入
できる。核酸分子の5'および3'末端での標識が好まし
い。
【００７１】標識の種類は増幅反応のリアルタイムな様
式で検出されるものでなければならない。これは蛍光標
識プローブで可能であるだけでなく、NMRによって検出
されうる標識を用いても可能である。しかし、増幅核酸
は少なくとも1つの蛍光標識ハイブリダイゼーションプ
ローブを用いて検出される方法が特に好ましい。
【００７２】多くの試験方法が可能である。下記の3つ
の検出形式は特に本発明と関連して有用であることが証
明されているが、本発明の範囲を制限するものとして理
解されるべきではない。
【００７３】（i）FRETハイブリダイゼーションプロー
ブ この試験形式のために、増幅される標的核酸の同一鎖の
隣接した部位に相補的である2つの一本鎖ハイブリダイ
ゼーションプローブが、同時に使用される。両プローブ
は異なる蛍光性成分で標識される。適切な波長の光で励
起した場合、蛍光共鳴エネルギー転移の原理によって、
第1成分が吸収したエネルギーを第2成分へ転移させる結
果、両ハイブリダイゼーションプローブが検出される標
的分子の隣接した位置に結合する場合、第2成分の蛍光
放射を測定することができる。
【００７４】本発明の範囲内で可能な全ての検出形式の
中で、この「FRET-ハイブリダイゼーションプローブ」
は、高感度、正確、かつ信頼性の高いものであるという
ことが証明されている。
【００７５】代替方法として、蛍光標識プライマーおよ
び1つだけの標識オリゴヌクレオチドプローブを用いる
こともまた可能である（Bernard, P. S.,ら、Anal Bioc
hem255 (1998) 101-7.）。
【００７６】（ii）TaqManハイブリダイゼーションプロ
ーブ 一本鎖ハイブリダイゼーションプローブが2つの成分で
標識される。第1成分が適切な波長の光で励起される場
合、吸収されたエネルギーは蛍光共鳴エネルギー移動の
原理に従って第2成分、いわゆる消光剤に転移される。P
CR反応のアニーリング段階の間に、ハイブリダイゼーシ
ョンプローブは標的DNAに結合し、続く伸長段階の間
に、Taqポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性に
よって分解される。その結果、励起された蛍光性成分お
よび消光剤は空間的に互いから分離されるため、第1成
分の蛍光放射を測定することができる。
【００７７】（iii）分子ビーコン（Molecular Beacon
s） これらのハイブリダイゼーションプローブもまた、第1
成分および消光剤で標識されており、標識はプローブの
両末端に位置することが好ましい。プローブの二次構造
によって、両成分は溶液中で空間的に近傍にある。標的
核酸へのハイブリダイゼーション後、両成分は互いから
分離され、その結果、適切な波長の光による励起後、第
1成分の蛍光放射を測定することができる（US 5,118,80
1）。
【００７８】リアルタイムPCRが二本鎖核酸結合成分を
用いて行われる場合、それもまた発明の範囲内である。
例えば、本発明に従って、各々の増幅産物はまた、適切
な波長の光による励起の後、二本鎖核酸との相互作用に
対応した蛍光シグナルを放射するDNA結合蛍光色素によ
っても検出されることができる。SybrGreenおよびSybrG
old（Molecular Probes）色素は、この応用例に特に適
していることが証明されている。代替としてインターカ
レーション型色素も使用することができる。しかし、こ
の形式では、異なる増幅産物を識別するために、それぞ
れのメルティングカーブ分析を行うことが必要である
（US 6,174,670）。
【００７９】リアルタイム観測をも含みうる別の好まし
い実施形態では、増幅反応は、1サイクルが1分未満であ
る高速熱サイクルによって行われる。このような高速熱
サイクルのための計測基盤は、例えばLightCycler（Roc
he Molecular Biochemicals）によって提供され、WO 97
/46707およびWO 97/46712で公開されている。本発明に
よれば、プライマーのアニーリングは、少量でしかサン
プル中に存在しない標的核酸の定量的増幅の律速段階で
はない。従って、少量の要素を増幅するための各々の多
重熱サイクルプロトコールの時間変数は、当技術分野に
おいて既知のいかなる熱サイクルプロトコールと比較し
ても修正される必要はない。
【００８０】更なる態様において、本発明は、本発明の
方法を行うための試薬を含むキットを対象とする。より
具体的には、このようなキットは、熱サイクル反応自体
に先立って、分析されるサンプル、適切なプライマー、
および反応容量を調整するための水だけを添加すればよ
いだけの様式で増幅に使用できる、マスター混液を含ん
でもよい。
【００８１】発明によれば、マスター混液は、少なくと
も0.5ユニット/μlの最終濃度の熱安定性DNAポリメラー
ゼを供給するために十分な濃度の熱安定性DNAポリメラ
ーゼを含む。パラメータ特異的なキットは、更に、各々
の配列を有するプライマーを含みうる。これらのオリゴ
ヌクレオチドはマスター混液に含まれてもよい。
【００８２】更に、このようなキットは、リアルタイム
PCRによって生成される産物の均質検出に適切な試薬、
例えば、蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブまた
は、二本鎖DNA結合体を含んでもよい。各々のプライマ
ーのように、いくつかの場合では、それらもまたマスタ
ー混液に含まれるようになるかもしれない。
【００８３】代替として、本発明のキットは、高温開始
PCRのためのマスター混液を含み得る。このようなマス
ター混液は、少なくとも0.25ユニット/μlの最終濃度の
熱安定性DNAポリメラーゼを供給するために十分な濃度
で、熱安定性DNAポリメラーゼを含み、かつ、高温開始P
CRを可能にするためのさらなる物質をみ得る。ポリメラ
ーゼ活性を室温で不活性化し得るこのような物質は、例
えば、抗ポリメラーゼ抗体、または、ポリメラーゼ結合
性核酸アプタマーであってもよい。
【００８４】更に別の実施形態では、本発明のキット
は、化学的に修飾されていることによって、化学的修飾
を除去するためにポリメラーゼが加熱されない限り室温
で不活性な熱安定性DNAポリメラーゼを、少なくとも0.2
5ユニット/μlの最終濃度の熱安定性DNAポリメラーゼを
供給するのに十分な濃度で含む、高温開始PCRのための
マスター混液を包含し得る。
【００８５】そのキットが、標準曲線のために希釈系列
を作成するための既知量の標準DNA、または代替とし
て、ある特定の増幅反応の効率を決定するために使用さ
れうる補正サンプルのいずれかを含む場合、 それもま
た有利であることも証明されている。
【００８６】以下の実施例、参照、配列表および図は、
本発明の理解を助けるために提供され、本発明の正確な
範囲は添付の請求項において述べられる。本発明の精神
から逸脱することなく記載した手順に改良がなされ得る
ことが理解される。
【００８７】
【実施例】実施例１ CK20およびPBGDプラスミドDNAのリアルタイムPCR 本発明の有効性を実証するために、すなわち播種性腫瘍
細胞の検出のために研究された遺伝子であるサイトケラ
チン20（CK20）、およびハウスキーピング遺伝子として
一般に用いられる、ポルフォリンビリノーゲンデアミナ
ーゼ（PBGD）を増幅標的として選択した。
【００８８】サイトケラチン20（CK20）およびポルフォ
リンビリノーゲンデアミナーゼ（PBGD）遺伝子の部分的
断片は、別々のpT3T7プラスミドベクター（Roche Molec
ularBiochemicals）にクローニングされた。直鎖状にし
たプラスミドDNAのコピー数は、1モルが6 x l023コピー
に等しいという仮定を用いて、分光光度法で概算され
た。CK20およびPBGDプラスミドDNA混合物は、10mM Tris
-HCl、pH 8.5中のMS2RNA（10ng/μl）から成る希釈液を
用いた希釈によって調製された。
【００８９】キネティックPCRはLightCycler機器（Roch
e Molecular Biochemicals）で行われた。標準的なPCR
アッセイは、1μlのDNA、1 x 検出混合物、1 x 反応バ
ッファー、4mMの塩化マグネシウム、および様々な量のT
aqポリメラーゼから成り（すべてRoche Diagnostics, M
annheim, Germanyによる）、1つの反応キャピラリー中1
0μlの容量に水で調節する。
【００９０】通常の単一および多重PCRのために、Light
Cycler - DNA Master Hybridisation Probes Kit (Roch
e Molecular Biochemical, カタログ番号2015 102）か
らの反応バッファーおよび修飾されていないTaqポリメ
ラーゼを使用した。
【００９１】CK20およびPEGDのための10 x検出混合物
は、それぞれ、10mMのTris-HCl、pH 8.5バッファー中、
各5μMのプライマー（フォワードおよびリバース）、各
2μMの（フルオレセインおよびLC-Red640、または、フ
ルオレセインおよびLcred705で標識された）ハイブリダ
イゼーションプローブ、0.05% Brij-35から成る。多重P
CRのために、反応キャピラリー内には更なる1x検出混合
物が含まれた。
【００９２】以下のプライマーおよびハイブリダイゼー
ションプローブ配列が用いられた。
【００９３】CK20フォワードプライマー: 5'ATCAAGCAGTGGTACGAAAC-3'（配列番号：１） CK20リバースプライマー: 5'-AGGACACACCGAGCATTT-3'（配列番号：２） CK20プローブ1: 5'-ATTACAGACAAATTGAAGAGCTGCG-フルオレセイン-3' （配列番号:３） CK20プローブ2: 5'-LCRed640AGTCAGATTAAGGATGCTCAACTGCリン酸-3' （配列番号:４） PBGDフォワードプライマー: 5'-GCGGAGCCATGTCTGGTAA-3'（配列番号:５） PBGDリバースプライマー: 5'- CCAGGGTACGAGGCTTTCAA-3'（配列番号:６） PBGDプローブ1: 5'-GAGAGTGATTCGCGTGGGTACCCG.フルオレセイン-3' （配列番号:７） PBGDプローブ2: 5'-LCRed705.AGAGCCAGCTTGCTCGCATACAGAC.リン酸-3' （配列番号:８）LCRed640を用いたCK20 PCRのための、
および、LCRed705を用いたPBGD PCRのためのハイブリダ
イゼーションプローブの標識化は、別々のチャネルでの
各反応の同時観測を可能にする。チャネル2（LCRed64
0）および3（LCRed705）間の蛍光のクロストークは、Li
ghtCycler - Color Compensation Set（Roche Molecula
r Biochemicals）を用いることによって補正された。
【００９４】通常のPCRサイクル条件は、最初に94℃1分
間の保温、続いて94℃0秒間、55℃10秒間および72℃10
秒間の50サイクルから成り、40℃30秒間で完了する。
【００９５】各反応についての交差ポイント（crossing
point）は、計算による基準線の設定による二次微分最
大関数を用いてLightCycler分析ソフトウェアによって
決定された。
【００９６】実施例２ 過剰なポリメラーゼは単一PCRアッセイの性能を増大さ
せない102、104および106コピーのCK 20のリアルタイム
PCRは、実施例１に従って、量を増加させて0,0825 U/μ
l、0,165 U/μl、0,33 U/μl、または、0,66 Uμlのい
ずれかの量のFast Start Polymerase（Roche Molecular
Biochemicals）を含む単一構成で行われた。結果は、
図１に示す。そこで見られるように、同定される各コピ
ー数に対する蛍光シグナル曲線は、用いられる酵素濃度
に関係なく基本的に同一であったため、酵素濃度の増加
により低いCp値を生じることはない（左：106コピー、
中央：104コピー、右：102コピー）。単一PCR、すなわ
ち1つの標的核酸だけの増幅では、標的核酸が初めに高
いコピー数で存在したとしても、過剰な増幅反応はポリ
メラーゼによって増強されないと判断されるべきであ
る。
【００９７】実施例３ 多重PCRアプローチでは比較的少量の標的は定量的に増
幅されない
【００９８】図２は、それぞれ実施例１に従ったCK20お
よびPBGDの単一PCRの代表的な結果を、0,0825 U/μlのT
aqポリメラーゼを用いて実施例1に従った単一PCR中に2
つの個別のPCRのプライマーセットおよびキネティックP
CRのための蛍光プローブセットを単に混合することによ
る多重アプローチ（多重PCR）と比較して示す。
【００９９】反応のための異なる鋳型核酸は、それぞれ
102/104、104/104および106/104のCK20/PBGDコピー量を
含んでいる3つのプラスミド混合物を含む。同一PCR実行
中に、競合反応のない個別PCR（図２a）、および同一反
応槽で起こるバックグラウンドPBGD PCRを伴った多重PC
Rにおける、CK20増幅の反応効率は、チャネル2で観測さ
れる（図２a）。同時に、個別および多重PCRにおけるPB
GD増幅に対する反応効率は、チャネル3で観測される
（図２b）。
【０１００】その結果は、特にバックグラウンド反応の
ための鋳型のコピー数が標的反応のそれを100倍上回る
場合、個別PCRと比較した、多重PCRにおける標的PCRの
対数期曲線の勾配が有意に減少することを示す。これは
すなわち、増幅されているPBGD104コピー存在下ではCK2
0 102コピーの増幅、および、増幅されているCK20 106
コピー存在下ではPBGD 104コピーの増幅ということであ
る。
【０１０１】当技術分野において既知の方法に従って得
られたこれらの結果は、当技術分野において既知の標準
的PCR条件下では、ダイナミックレンジが明かに100倍未
満であることを示唆する。
【０１０２】実施例４ 過剰なポリメラーゼは多重PCRにおいて比較的少量の標
的の増幅を増強する。
【０１０３】実施例１に従ったアッセイをポリメラーゼ
濃度を増加させて行った。PBGD 104コピーのバックグラ
ウンドPCRを伴うCK20 102コピー（図３a）、または、CK
20 106コピーのバックグラウンドPCRを伴うPBGD 104コ
ピー（図３b）のいずれかが定量した。
【０１０４】図に示されるように、ポリメラーゼ濃度の
増加は、多重PCRのPCR対数期勾配を増加させる。これ
は、相当する単一構成においてすでに観察されたこと
（上記の実施例２を参照）と驚くべき対照をなしてい
る。
【０１０５】更に、その結果は、0.33ユニット/μlのポ
リメラーゼ濃度が、多重PCRの対数期勾配を個別PCRのそ
れを同等と見なすにはまだ十分ではないことを示す。こ
の実験では、単一対照に相当する性能をもたらすのは、
0.66ユニット/μlの「過剰な」ポリメラーゼ量だけであ
る。
【０１０６】一般的な真正のポリメラーゼ濃度の改良に
関する更なる実験は（データは示されない）、多重PCR
曲線の勾配が個別PCRのそれと等しくなるために、少な
くとも約0.5ユニット/μl反応容量のポリメラーゼ濃度
が必要とされることを示した（データは示されない）。
【０１０７】実施例５ 通常のPCR増幅を越える高温開始プロトコールの向上し
た性能
【０１０８】多重PCRと同様に単一PCRにも、LightCycle
r - FastStart DNA Master Hybridization Probes Kit
（Roche Molecular Biochemicals, カタログ番号 3 003
248）からの反応バッファーおよび修飾Taqポリメラー
ゼを比較のために用いた以外は実施例１に従って高温開
始PCRサイクルを行った。104コピーのPBGDの増幅は、CK
20 106コピーのバックグラウンドPCRとともに、0,0825
U/μl、0,165 U/μl、0.33のU/μl、または、0.66U/μ
lのいずれかのポリメラーゼ酵素濃度（最終濃度）にて
分析された。熱サイクルプロトコールは、最初の加熱は
94℃ 10分間に、およびサイクル中の94℃は10秒間に修
正した。
【０１０９】図４は、酵素およびそれに対応しているバ
ッファー以外同一の漸増条件下で、通常のポリメラーゼ
と比べた高温開始ポリメラーゼに必要な酵素量の比較を
示す。ポリメラーゼ0.66ユニット/μl（反応容量）の通
常のポリメラーゼが、個別のPCRに等しい多重PCRの対数
期勾配を生じる一方（図４a）、高温開始ポリメラーゼ
の使用は、約半分にまで所要量を減少させる（図４
b）。
【０１１０】実施例６ 過剰ポリメラーゼ多重PCR（高温開始）についての可能
性のあるダイナミックレンジ 図5は、実施例１に従ってFastStartポリメラーゼを用い
た多重実験を示す。PBGD 102コピーのPCR増幅は、それ
ぞれ102、104、106および108コピーのCK 20バックグラ
ウンド、および0.55ユニット/μl反応容量の過剰量のFa
stStartポリメラーゼを用いて行われた。図に見られる
ように、PBGD PCR対数期曲線勾配（図５b）と交差ポイ
ントは、バックグラウンドCK20 PCR（図５a）に関わら
ず、互いに類似している。CK20 PCR増幅について、正確
なPCR定量に不可欠な交差ポイントとlog濃度との間の線
形関係は維持されている（R2=-1）（図５c）。
【０１１１】従って、これらのデータは、本発明のPBGD
およびCK20の多重増幅に対して、ホットスタートの実施
形態によって106のダイナミックレンジが得られること
を示す。
【０１１２】実施例７ 過剰ポリメラーゼ多重PCR（高温開始）についての可能
性のあるダイナミックレンジ 異なる増幅標的としてHer2/neuおよびβグロビンを用い
た同様の実験において、同一の結果が得られている。増
幅条件は、実施例１のそれらと基本的に同一であった。
しかし、この場合には、PCRは、製造メーカーの使用説
明書に従った高温開始増幅のための手段として、供給元
によって示される条件下で、KlenTaq Antibody（Clonte
ch）と併用して、1UのKlentaq Polymerase（Clontech、
6Uの標準ポリメラーゼに相当する）を用いて行った。
【０１１３】Her2/neuに対しては配列番号９-１０、お
よびβグロビンに対しては配列番号１１-１２に従った
以下のプライマーが用いられた。
【０１１４】Her2/neuフォワードプライマー： 5'-CCTCTGACGTCCATCGTCTC -3'（配列番号：９） Her2/neuリバースプライマー： 5'-CGGATCTTCTGCTGCCGTCG-3'（配列番号：１０） β-グロビンフォワードプライマー： 5'-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3'（配列番号：１１） β-グロビンリバースプライマー: 5'-CAACCTCATCCACGTTCACC-3'（配列番号：１２） Her2/neuのためのハイブリダイゼーションプローブは、
LC-Red 640で5'標識された配列番号１３、およびフルオ
レセインで3'標識された配列番号１４に従った配列を含
むオリゴヌクレオチドであった。βグロビンのためのハ
イブリダイゼーションプローブは、LC-Red 705で5'標識
された配列番号１５、およびフルオレセインで3'標識さ
れた配列番号１６に従った配列を含むオリゴヌクレオチ
ドであった。
【０１１５】Her2neu: 5'-Red 640-ACCAGCAGAATGCCAACCA-リン酸-3' （配列番号１３） 5'-CTTGATGAGGATCCCAAAGACCACCCCCAAGACCAC-フルオレセ
イン-3' （配列番号１４） β-グロビン: 5'-Red 705-AGACTTCTCCTCAGGAGTCAGGTGCACCATG-リン酸-
3' （配列番号１５） 5'-CCACAGGGCAGTAACGG-フルオレセイン-3 （配列番号１６）この実験では、10コピーのHer2/neuプ
ラスミドDNAは、βグロビンプラスミドDNAの10〜107コ
ピーのバックグラウンドにかかわらず、106のダイナミ
ックレンジに対応して、同一の効率で増幅され得た。
【０１１６】実施例８ 過剰ポリメラーゼの添加によって得られるダイナミック
レンジの、絶対標的コピー数に対する独立性 過剰ポリメラーゼの多重高温開始PCRの許容性を評価す
るため、更に、絶対標的濃度からダイナミックレンジの
依存の可能性を除外するために、いくつかの小さな変更
を伴う基本的に実施例１で示された条件に従った実験が
行われた。
【０１１７】より正確には、102コピーのPBGDは、様々
な量のFastStartポリメラーゼを用いて、102、104、106
および108コピーのCK20のバックグラウンドPCRとともに
増幅され、同じ条件下で分析された。
【０１１８】PBGDの定量的増幅のための指標として、Ro
cheLightCyclerマニュアル（RocheMolecular Biochemic
als）に従い、いわゆる「二次微分アルゴリズム」（US
6,303,305）を用いて、交差ポイント（cp値）が決定さ
れた。本発明の酵素濃度が用いられた場合、二次微分デ
ータ処理アルゴリズムを用いて、予想される統計的許容
誤差範囲内で、加えられた過剰なCK 20とは独立して、
所与の標的濃度に対して同一のcp値が得られた。
【０１１９】得られたPBGDに対するcp値は、以下の表に
示される。
【０１２０】
【表１】 これらの結果から、以下の結論を引き出すことが妥当で
ある。
【０１２１】第一に、本発明によって得られた酵素濃度
についてのデータ（表１、右側カラム、0,3300 U/μl）
は、多重アッセイ内で増幅されるべき標的核酸が102〜1
08の間のコピー数で存在するならば、この場合、本発明
による多重PCRが、全体で106のダイナミックレンジを生
じるということを実証する。
【０１２２】第二に、同一の実験条件下で104コピーのP
BGDが、102コピーのPBGDの場合と同様に、同じ増幅効率
で増幅されることになったのは、些少なことである。従
って、106コピーのCK20バックグラウンドで102コピーの
PBGDを増幅する結果が、108コピーのCK20バックグラウ
ンドでの104コピーの増幅と比較される場合（データは
示さない）、本発明の過剰量のポリメラーゼの使用によ
るダイナミックレンジの増加の効果は、本来サンプル中
に存在する標的DNAの絶対的なコピー数から独立してい
るということもまた、結論付けることができる。
【０１２３】引用文献リスト Bernard, P. S.,ら、Anal Biochem 255 (1998) 101-7 Bercovich, D.,ら、Biotechniques 27 (1999) 762-770 Bieche, I.,ら、Cancer Res 59 (1999) 2759-65 Director-Myska, A. E.,ら、Environ Mol Mutagen 37
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6394-9 US 5,118,801 US 5,677,152 US 5,693,502 US 6,174,670 US 6,303,305 WO 97/46706 WO 97/46707 WO 97/46712
【０１２４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG Idaho Technology Inc. <120> Quantitative Multiplex PCR with high dynamic range <130> 21027 US <140> <141> <160> 16 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:CK20 forward primer <400> 1 atcaagcagt ggtacgaaac 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:CK20 reverse primer <400> 2 aggacacacc gagcattt 18 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:CK20 probe1 <400> 3 attacagaca aattgaagag ctgcg 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:CK20 probe 2 <400> 4 agtcagatta aggatgctca actgc 25 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PBGD forward primer <400> 5 gcggagccat gtctggtaa 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PBGD reverse primer <400> 6 ccagggtacg aggctttcaa 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PBGD probe 1 <400> 7 gagagtgatt cgcgtgggta cccg 24 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PBGD probe 2 <400> 8 agagccagct tgctcgcata cagac 25 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Her2/neu forward primer <400> 9 cctctgacgt ccatcgtctc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Her2/neu reverse primer <400> 10 cggatcttct gctgccgtcg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:゜-globin forward primer <400> 11 acacaactgt gttcactagc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:゜-globin reverse primer <400> 12 caacctcatc cacgttcacc 20 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:hybridization probe <400> 13 accagcagaa tgccaacca 19 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:hybridization probe <400> 14 cttgatgagg atcccaaaga ccacccccaa gaccac 36 <210> 15 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:hybridization probe <400> 15 agacttctcc tcaggagtca ggtgcaccat g 31 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:hybridization probe <400> 16 ccacagggca gtaacgg 17
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、単一増幅の結果を示す。102、104、お
よび106コピー数のCK 20はそれぞれ、0,0825 U/μl、0,
165 U/μ1、0,33 U/μl、または、0,66 Uμlのポリメラ
ーゼのいずれかで増幅された。
【図２】図２は、0,0825 U/μl Taq DNAポリメラーゼに
よる、様々な比率のCK20およびPBGDの単一および多重増
幅の結果を示す。図２aは、CK20の増幅 - 単一アッセイ
および多重構成の結果である。図２bは、PBGDの増幅 -
単一アッセイおよび多重構成の結果である。
【図３】図３は、Taqポリメラーゼの量を増加させて用
いたCK20/PBGDの多重増幅の結果を示す。図３aは、CK20
についてである。図３bは、PBGDについてである。
【図４】ポリメラーゼの量を増加させて用いた、高温開
始PCRを伴う多重増幅および伴わない多重増幅の結果で
ある。図４aは、Taq DNAポリメラーゼである。図４b
は、FastStart DNAポリメラーゼである。
【図５】図５は、過剰な高温開始ポリメラーゼを用いて
得られるダイナミックレンジの拡大を示す。図５aは、1
00コピーのPBGDをバックグランドとした様々なコピー数
のCK20の増幅である。図５bは、様々なコピー数のCK20
をバックグランドとした100コピーのPBGDの増幅であ
る。図５cは、CK20増幅の回帰分析の結果である。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年１１月２２日（２００２．１１．
２２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項６】 熱安定性DNAポリメラーゼを、その最終
濃度が少なくとも0.25ユニット/μlとなるように供給す
るマスター混液を含む、高温開始PCR増幅を実施するた
めのキット。 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１４年１２月１１日（２００２．１２．
１１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図５】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 502420379 アイダホ テクノロジー インコーポレー テッド アメリカ合衆国 84108 ユタ，ソルト レイク シティー，ワカラ ウェイ 390 (72)発明者 カリム タビチ ドイツ連邦共和国 82343 ペーキング, ガルテンシュトラーセ 26 ツェー (72)発明者 ギーゼラ ベッツル ドイツ連邦共和国 82346 アンデックス, ムースウエグ ２ツェー (72)発明者 リッチー スーン オーストラリア国 0820 パラップ エヌ ティー，グレゴリー ストリート 66 (72)発明者 ランディー ラスムッセン アメリカ合衆国 84108 ユタ，ソルト レイク シティー，イー．レーンヴュー コート 4347 (72)発明者 ディーピカ マリーン デシルバ アメリカ合衆国 84103 ユタ，ソルト レイク シティー，ダブリュ．ギラルド プレイス 137 (72)発明者 ジョン ジー． ワード アメリカ合衆国 84108 ユタ，ソルト レイク シティー，ダウイントン アヴェ ニュー 1870 イー. (72)発明者 ハリー ペイジ ミルワード アメリカ合衆国 84065 ユタ，リバート ン，ウエスト 1510 サウス 12480 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 BB41 BB51 CB01 DA13 FB02 4B024 AA20 CA04 CA05 CA09 CA12 HA14 HA19 4B063 QA13 QQ28 QQ42 QR08 QR32 QR55 QR62 QS25 QS34 QX02

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 熱安定性DNAポリメラーゼを少なくとも
    0.5ユニット/μlの最終濃度で用いる、少なくとも102の
    ダイナミックレンジを有する定量的多重PCRの方法。
  2. 【請求項２】 少なくとも103のダイナミックレンジを
    有する、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 少なくとも104のダイナミックレンジを
    有する、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 サンプル中の少なくとも第1および第2の
    核酸をPCR手段によって定量するための方法であって、 サンプル中の第1核酸のもとの濃度が第2核酸のもとの濃
    度に比べて100倍より高く、第1核酸増幅用の第1プライ
    マー対を添加すること、第2核酸増幅用の第2プライマー
    対を添加すること、熱安定性ポリメラーゼによって２つ
    の核酸を増幅させることを含み、 ここで、熱安定性DNAポリメラーゼは、反応液中に少な
    くとも0.5ユニット/μlの濃度で存在し、第2核酸の増幅
    は、第1プライマー対の非存在下における第2プライマー
    対による第2核酸の増幅と比較して10％未満までは阻害
    されないことを特徴とする、上記方法。
  5. 【請求項５】 サンプル中の少なくとも第1および第2の
    核酸を高温開始PCR法によって定量するための方法であ
    って、 サンプル中の第1核酸のもとの濃度が第2核酸のもとの濃
    度に比べて100倍より高く、第1核酸増幅用の第1プライ
    マー対を添加すること、第2核酸増幅用の第2プライマー
    対を添加すること、熱安定性DNAポリメラーゼによって
    ２つの核酸を増幅させることを含み、 ここで、熱安定性DNAポリメラーゼは、反応液中に少な
    くとも0.25ユニット/μlの濃度で存在し、第2核酸の増
    幅は、第1プライマー対の非存在下における第2プライマ
    ー対による第2核酸の増幅と比較して10％未満までは阻
    害されないことを特徴とする、上記方法。
  6. 【請求項６】 リアルタイムで増幅をモニターする、請
    求項1〜５のいずれか1項記載の方法。
  7. 【請求項７】 2つの核酸の増幅で得られる増幅産物の
    各々が、少なくとも1つの蛍光標識ハイブリダイゼーシ
    ョンプローブによって検出される、請求項６記載の方
    法。
  8. 【請求項８】 各標的核酸について2つの隣り合うハイ
    ブリダイゼーションプローブを用い、各プローブは、ハ
    イブリダイゼーションによる蛍光共鳴エネルギー転移
    （FRET-ハイブリダイゼーション）を起こすことができ
    る蛍光成分で適切に標識されていることを特徴とする、
    請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】 1回の増幅サイクルが1分より短いことを
    特徴とする、請求項１〜８のいずれか1項記載の方法。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜９のいずれか1項記載の方
    法を実施するための試薬を含むキット。
  11. 【請求項１１】 熱安定性DNAポリメラーゼを、その最
    終濃度が少なくとも0.5ユニット/μlとなるように含有
    するマスター混液を含む、PCR増幅を実施するためのキ
    ット。
  12. 【請求項１２】 熱安定性DNAポリメラーゼを、その最
    終濃度が少なくとも0.25ユニット/μlとなるように供給
    するマスター混液を含む、高温開始PCR増幅を実施する
    ためのキット。
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